WO2015079786A1 - 光計測装置及び光計測方法 - Google Patents

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WO2015079786A1
WO2015079786A1 PCT/JP2014/075038 JP2014075038W WO2015079786A1 WO 2015079786 A1 WO2015079786 A1 WO 2015079786A1 JP 2014075038 W JP2014075038 W JP 2014075038W WO 2015079786 A1 WO2015079786 A1 WO 2015079786A1
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light
sample
phase
reflected
stokes
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PCT/JP2014/075038
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学 塩澤
渡辺　康一
白井　正敬
賢太郎 大澤
Original Assignee
株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Publication date
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
    • G—PHYSICS
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    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/063—Illuminating optical parts
    • G01N2201/0638—Refractive parts

Definitions

  • the present invention relates to an optical measurement device and an optical measurement method for acquiring composition and shape information of a measurement target using light.
  • optical measurement technology such as CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) microscope and OCT (Optical Coherence Tomography) has been attracting attention, and it is expected to be applied especially in the fields of biology and medicine due to its non-invasive nature.
  • CARS Coherent Anti-Stokes Raman Scattering
  • OCT Optical Coherence Tomography
  • a method of staining and invading cells using a reagent and observing them with a microscope or the like has been common for cell analysis.
  • continuous analysis of the same cell or the examined cell can be used for medical purposes as it is.
  • CARS is a nonlinear optical phenomenon in which when two lights having different wavelengths are incident on an object, CARS light having a wavelength corresponding to the vibration of molecules constituting the object is obtained.
  • Non-patent document 1 describes the discontinuity of nonlinear constants as a characteristic of reflection type CARS. From the above, it is stated that the CARS light intensity has a large sample size dependency, and the intensity rapidly decreases as the size increases. In addition, it is stated that this feature is advantageous for measurement of a minute sample in a medium such as a culture solution, and that the strength increases at the interface between different media. The experimental data of FIG. 14 where the peak was obtained is shown.
  • OCT is a method in which shape information reflecting a change in refractive index is obtained by interference between reflected light from an object and reference light that is not irradiated onto the object.
  • the CARS microscope can obtain the molecular information of the measurement object, whereas the OCT can obtain the shape information, so that they are in a complementary relationship.
  • Patent Document 3 discloses both multi-modal measurement devices, and provides “a measurement device and a measurement method capable of simultaneously measuring morphological information and molecular information of a subject”.
  • the reflection type CARS described above is suitable for measuring the surface state in terms of signal intensity, but it is difficult to identify the surface position because shape information is not acquired.
  • the thickness of the cell membrane is 10 nm or less, and position adjustment accuracy in the nanometer order is required.
  • Patent Document 3 performs pulse expansion of pump light so that the pulse width of Stokes light is shorter than the pulse width of pump light, uses anti-Stokes light as CARS light, and uses Stokes light as OCT measurement light. Therefore, the optical pulse mismatch in the CARS and OCT composite is avoided to realize the CARS and OCT composite. Adjustment was impossible.
  • An optical measurement apparatus includes a sample stage for holding a sample, a pump light generation unit that generates pump light, a Stokes light generation unit that generates Stokes light having a longer wavelength than the pump light, and pump light or Stokes light.
  • a reference light branching part for branching the reference light, a multiplexing part for coaxially combining the pump light and the Stokes light, and an objective lens for condensing the combined pump light and Stokes light on the sample held on the sample stage
  • a position control unit that controls the relative position between the objective lens and the sample held on the sample stage, and the reflected light from the sample that has passed through the objective lens interferes with the reference light to reflect the intensity of the reflected light or reflect the reference light.
  • a phase sensor that identifies the surface position of the sample by detecting the phase of the light and a detection unit that detects reflected CARS light generated from the sample.
  • the phase sensor detects the surface position of the sample with an accuracy of 3 micrometers or less in the optical axis direction.
  • the objective lens has a numerical aperture of 0.4 or more.
  • the phase sensor includes an interferometer that generates at least three interference lights having different phase differences, and outputs a signal proportional to the intensity of the reflected light and a signal indicating the phase of the reflected light with reference to the reference light.
  • the pump light generation unit includes a short pulse laser light source
  • the Stokes light generation unit includes a wavelength conversion unit that converts the wavelength of light emitted from the short pulse laser light source into Stokes light.
  • the pump light generation unit includes a first short pulse laser light source
  • the Stokes light generation unit includes a second short pulse laser light source
  • the first short pulse laser light source and the second short pulse laser light source and a synchronizing unit that drives the devices in synchronization with each other.
  • the reference light is branched from the pump light
  • the phase sensor is a signal proportional to the intensity of the pump light reflected from the sample and the phase of the pump light reflected from the sample based on the reference light.
  • a signal representing is output.
  • the optical measurement method of the present invention also includes a step of condensing pump light with an objective lens and irradiating the sample, and a phase sensor using interference light of pump light reflected from the sample and pump light not irradiated on the sample. Detecting the surface position of the sample, adjusting the focus position of the objective lens to the detected surface position of the sample, combining the Stokes light having a wavelength longer than the pump light and the pump light, And a step of irradiating the sample via the sample, and a step of detecting the reflected CARS light generated from the sample.
  • the phase sensor generates at least three interference lights having different phase differences from each other, detects the surface position of the sample using an intensity signal proportional to the intensity of the reflected light, and detects the surface position of the sample.
  • the phase of the reflected light with respect to the reference light is obtained. Further, the relative positions of the objective lens and the sample in the optical axis direction are controlled so that the obtained phase is maintained.
  • the surface position of the measurement target can be detected with high accuracy, and surface molecular information can be acquired.
  • the schematic diagram which shows basic embodiment of the optical measuring device by this invention The figure which shows the structural example of the controller of the apparatus by this invention.
  • the schematic diagram in the case of controlling the position of an objective lens.
  • the schematic diagram in the case of using optical path changing means, such as a galvanometer mirror and a spatial phase modulator.
  • the schematic diagram in the case of using Stokes light for a phase sensor.
  • the schematic diagram of the apparatus provided with two short pulse laser light sources.
  • the structural example of the phase detector of a phase sensor The figure which compared the phase sensor by this invention with the conventional OCT.
  • the figure which shows the resolution of the phase sensor by this invention The figure which showed the principle which follows the surface of a cell.
  • the flowchart which showed the operation example of the apparatus by this invention The flowchart which showed the operation example which scans to a xy direction, following the surface of a cell.
  • Energy level diagram of Stokes scattering in normal Raman scattering Energy level diagram in CARS.
  • FIG. 15 shows a process in which Raman scattering occurs using an energy level diagram.
  • Raman scattering includes Stokes scattering and anti-Stokes scattering.
  • FIG. 15 shows only Stokes scattering.
  • 701 represents a ground state of the molecule
  • 702 represents a vibrationally excited state.
  • the molecule is irradiated with pump light having the frequency ⁇ P
  • the light having the frequency ⁇ S is scattered through the intermediate state 703.
  • the molecule results in one of the vibrationally excited states 702.
  • the frequency ⁇ S of the scattered light is Stokes light having a frequency lower than that of the pump light.
  • the initial state is a vibrationally excited state of the molecule, and the state of the molecule returns to the ground state via the intermediate level.
  • ⁇ AS is the frequency of the anti-Stokes light
  • ⁇ P ⁇ AS and the anti-Stokes Raman scattered light has a higher frequency than the pump light.
  • the above Raman scattering takes time to measure because the intensity of the obtained scattered light is weak.
  • a method for obtaining strong scattered light there is a spectroscopic method using CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) which is nonlinear Raman scattering. With this method, a Raman spectrum can be obtained and the vibrational state of the molecule can be understood.
  • a pulse laser with a high peak power is used to generate CARS.
  • the CARS generated by the pulse laser beam is due to a nonlinear effect, and the intensity thereof is significantly higher than that of Raman scattering as the peak power increases. As a result, a signal with a high signal-to-noise ratio can be obtained, and the measurement time can be significantly shortened.
  • CARS is light emission by third-order polarization, and pump light, Stokes light, and probe light are required to generate CARS.
  • the probe light is substituted with pump light.
  • ⁇ r (3) ( ⁇ AS ) is a resonance term of molecular vibration of the third-order electric susceptibility
  • ⁇ nr (3) having no frequency dependency is a non-resonance term.
  • FIG. 15 shows the resonance term process.
  • 701 represents the ground state of the molecule
  • 702 represents the vibrationally excited state.
  • the pump light having the frequency ⁇ P and the Stokes light having the frequency ⁇ S are simultaneously irradiated.
  • the molecule is excited to a vibration excitation level having 702 through the intermediate state 703.
  • FIG. 17 shows one process related to the non-resonant term ⁇ nr (3) in the third-order polarization.
  • the frequency of the Stokes light is not a vibrationally excited state, but a process through the intermediate state 705.
  • a process through the intermediate state 705. By irradiating pump light of frequency ⁇ P and Stokes light of frequency ⁇ ′ S at the same time, an intermediate state of 705 involving electrons and the like is excited, and further by irradiating probe light of frequency ⁇ P via intermediate state 704.
  • Non-resonant CARS light having a frequency ⁇ AS is generated.
  • broadband laser light is used as Stokes light, spectra corresponding to a plurality of excited states can be acquired as shown in FIG.
  • Multicolor CARS is detected by using a spectroscope as a detector.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a basic embodiment of an optical measuring device according to the present invention.
  • This apparatus includes a reflection type CARS microscope, a phase sensor, and a controller 200 that controls the entire apparatus.
  • the controller 200 includes a laser driver that controls a short pulse laser light source, a position control unit that controls the position of each optical element such as a sample stage, an objective lens, and a mirror, and a signal obtained from a CARS microscope and a phase sensor.
  • Signal processing unit that performs image processing and surface position detection, and a follow-up operation control unit that causes the focused position of the laser light to follow the detected surface position. Note that not all of the components described here are necessarily provided in the optical measurement device, and the configuration may be determined based on necessary functions and accuracy.
  • the short pulse laser light source 201 emits short pulse laser light based on an instruction from the controller 200.
  • the short pulse laser light source 201 is, for example, a titanium sapphire laser or a fiber laser, and the pulse width is nanosecond or less. Further, the peak power is desirably on the order of kilowatts or more capable of inducing a nonlinear optical effect.
  • the wavelength may be selected from the absorption of the object to be measured and the corresponding wavelength of the optical component to be used, for example, 800 nm or 1064 nm.
  • the laser light is split by the beam splitter 202 into two light beams, Stokes light and pump light.
  • the laser beam branched as Stokes light enters the wavelength conversion means 203 and is converted into a long wavelength with respect to the pump light.
  • the wavelength converting means is, for example, a photonic crystal fiber or an OPO (Optical Parametric Oscillator).
  • the photonic crystal fiber is an optical fiber in which a honeycomb-like clad is formed around the core, and the incident light is strongly confined in the core.
  • nonlinear optical phenomena such as self-phase modulation and four-wave mixing are induced, and broadband light having a wide spectrum is generated.
  • a component having a longer wavelength than the pump light may be used for the Stokes light.
  • the OPO has a function of converting the wavelength of incident light by optical parametric generation, and sweeps the wavelength of emitted light by changing the angle of a nonlinear medium provided therein.
  • the Stokes light whose wavelength has been converted passes through the dichroic mirror 204 and the long pass filter 205 that reflect only the pump light wavelength, and enters the ⁇ / 4 plate 220.
  • the ⁇ / 4 plate 220 has an optical axis direction set to about 22.5 degrees with respect to the horizontal direction, and converts the polarization state of transmitted light from linearly polarized light to circularly polarized light.
  • the Stokes light transmitted through the ⁇ / 4 plate 220 is collected on the cell sample 207 by the objective lens 206.
  • the numerical aperture of the objective lens 206 may be selected according to the required spatial resolution. For example, the required spatial resolution can be ensured by using an objective lens having a numerical aperture of 0.4 or more. On the other hand, in order to ensure a working distance, the numerical aperture is preferably 1.33 or less.
  • the condensing position on the sample 207 is controlled from the controller 200 by a sample stage 208 using a piezo or a stepping motor.
  • the laser beam branched as the pump light by the beam splitter 202 is reflected by the mirror 209, and the s-polarized component is reflected by the polarizing beam splitter 210 and the dichroic mirror 204, and is multiplexed coaxially with the Stokes light.
  • the p-polarized component passes through the polarization beam splitter 210 and is branched as reference light for the phase sensor.
  • the pump light reflected by the dichroic mirror 204 passes through the long pass filter 205, becomes a circularly polarized state by the ⁇ / 4 plate 220, and then is condensed on the sample 207 by the objective lens 206.
  • the generated CARS light is collimated by the objective lens 206 and then transmitted again through the ⁇ / 4 plate 220 to change from circularly polarized light to p-polarized light. Since the CARS light has a short wavelength with respect to the pump light and the Stokes light, it reflects the long pass filter and enters the photodetector 213.
  • An example of the photodetector 213 is a spectroscope, but when an OPO is used for the wavelength conversion unit 203, a PD (Photo Diode) may be used.
  • the controller 200 associates the spectral peak position of the CARS light with the resonance frequency of each molecular vibration to obtain molecular information of the sample 207.
  • a spectrum image corresponding to the molecular distribution in the sample 207 can be obtained.
  • the intensity at about 2850 cm ⁇ 1 may be mapped to the sample position.
  • the phase sensor includes a polarizing beam splitter 210, a ⁇ / 4 plate 221, a mirror 211, and a phase detector 214, and detects the surface of the sample 207 using pump light.
  • the pump light condensed on the sample 207 is reflected at an interface having a different refractive index, such as the cell membrane surface.
  • the reflected pump light is collimated by the objective lens 206 as signal light that retains phase information of the interface, and then passes again through the ⁇ / 4 plate 220 to change from circularly polarized light to p-polarized light.
  • the signal light that has passed through the ⁇ / 4 plate 220 passes through the long pass filter 205, is reflected by the dichroic mirror 204, and enters the polarization beam splitter 210.
  • the polarization beam splitter 210 transmits p-polarized signal light and enters the phase detector 214.
  • the reference light is transmitted through the ⁇ / 4 plate 221, the polarization state is converted from p-polarized light to circularly polarized light, is incident on the fixed mirror 211 and reflected, and then passes through the ⁇ / 4 plate 221 again.
  • the polarization state is converted from circularly polarized light to s polarized light.
  • the reference light that has become s-polarized light is reflected by the polarization beam splitter 210, combined with the signal light, and enters the phase detector 214.
  • the phase detector 214 detects the intensity of the signal light and the phase of the signal light based on the reference light. A configuration example of the phase detector 214 will be described later.
  • the controller 200 acquires the position and shape information of the cell membrane surface. Further, if necessary, the position of the sample is controlled so that the focused position of the laser light follows the cell membrane surface.
  • the sample stage 208 may be feedback controlled so that the phase detected by the phase sensor falls within a predetermined range.
  • a sample may be fixed and the objective lens 206 may be moved by the actuator 225 or the like.
  • an optical path changing means 401 such as a galvanometer mirror or a spatial phase modulator may be inserted to change the condensing position of the laser light.
  • intensity information may be used instead of the phase.
  • the short pulse laser light source 201 a light source having a coherence length equal to or greater than the distance obtained by multiplying the z-direction spot movement amount by the refractive index of the sample. Since the coherence length increases as the laser pulse width increases, for example, a laser of several picoseconds to several hundred picoseconds may be used. On the other hand, when the position of the sample is changed as shown in FIG. 1, it is only necessary to ensure a coherence length corresponding to the amount of change in the spot position in the z direction generated by the difference in refractive index between air and the sample.
  • the position of the phase sensor is not limited to that shown in FIGS. 1, 3, and 4, and may be installed in any of the optical paths of the pump light.
  • OPO is used for the wavelength conversion means 203
  • FIG. It may be installed in the optical path of Stokes light.
  • the dichroic mirror 501 needs to reflect the Stokes light and transmit the pump light.
  • the dichroic mirror 501 needs to be switched to a wavelength corresponding to the wavelength sweep of the Stokes light. For example, switching may be performed every time the wavelength of Stokes light is changed by 50 nm.
  • the number of short pulse lasers is not limited to one, and a short pulse laser light source 601 may be provided as a Stokes light source as shown in FIG.
  • the short pulse laser light source 601 emits laser light in synchronization with the short pulse laser light source 201 under the control of the controller 200.
  • a laser light source having a broad spectrum with respect to the short pulse laser light source 201 such as a femtosecond laser or a white laser provided with a photonic crystal fiber is desirable, but it is integrated with the excitation light source. Wavelength sweep may be performed using OPO.
  • the configuration using two short pulse laser light sources is particularly effective when the power of the short pulse laser light source 201 is insufficient and Stokes light and pump light cannot be generated by one.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a configuration example of the phase detector 214.
  • the signal light combined with the polarization beam splitter 210 and the reference light are combined from a half beam splitter 713, a ⁇ / 2 plate 714, a ⁇ / 4 plate 719, condenser lenses 715 and 720, and Wollaston prisms 716 and 721.
  • the light enters the interference optical system 712 configured.
  • the combined light is split into transmitted light and reflected light by a half beam splitter 713.
  • the transmitted light passes through a ⁇ / 2 plate 714 whose optical axis is set to about 22.5 degrees with respect to the horizontal direction, and is then collected by a condenser lens 715 and branched by a Wollaston prism 716.
  • a first interference light and a second interference light that are 180 degrees different from each other are generated.
  • the first interference light and the second interference light are detected by a current differential photodetector 717, and a signal 718 proportional to the intensity difference between them is output.
  • the reflected light of the half beam splitter 713 passes through the ⁇ / 4 plate 719 whose optical axis is set to about 45 degrees with respect to the horizontal direction, and is then condensed by the condenser lens 720 and branched by the Wollaston prism 721.
  • third interference light and fourth interference light having a phase relationship of 180 degrees are generated.
  • the third interference light and the fourth interference light are detected by a current differential photodetector 722, and a signal 723 proportional to the intensity difference between them is output.
  • the signals 718 and 723 generated in this way are input to the controller 200 and are calculated to obtain a signal proportional to the intensity of the signal light and a phase of the signal light based on the reference light.
  • the Jones vector of the combined light at the time of incidence on the interference optical system 712 is expressed by [Expression 1]
  • the Jones vector of the combined light after passing through the half beam splitter 713 and further passing through the ⁇ / 2 plate 714 is as follows.
  • the combined light represented by the expression (2) by the Wollaston prism 716 is branched into two parts, the p-polarized component and the s-polarized component, and then differentially detected by the current differential photodetector 717, so that the differential signal 718 Is expressed as follows.
  • ⁇ sig and ⁇ ref are the phases when the complex numbers E sig and E ref are expressed in polar coordinates, respectively.
  • the conversion efficiency of the detector was set to 1.
  • the Jones vector of the combined light after being reflected by the half beam splitter 713 and further passing through the ⁇ / 4 plate 719 is as follows.
  • the Wollaston prism 721 splits the combined light represented by the equation (4) into a p-polarized component and an s-polarized component and then differentially detects the differential signal by the current differential photodetector 722. 723 is expressed as follows.
  • the phase of the signal light based on the reference light can be obtained by performing the following calculation on these outputs by the signal processing unit of the controller 200.
  • a signal proportional to the intensity of the signal light can be obtained by the following calculation. That is, the signal light is amplified by the reference light, and a signal having a high S / N ratio is obtained.
  • the interference optical system 712 generates and detects four interference lights whose phases are different from each other by 90 degrees, so that a phase and intensity signal can be obtained.
  • three or more interference lights are generated. Then, the same signal can be obtained regardless of the number of interference lights. For example, by generating and detecting three interference lights whose phases are different from each other by 120 degrees, the same signal as shown in the equations (6) and (7) can be obtained.
  • FIG. 8 shows a comparison between the phase sensor according to the present method and the conventional OCT.
  • Conventional OCT is classified into a time domain OCT and a Fourier domain OCT according to a scanning method, and the Fourier domain OCT is further divided into a spectral domain OCT and a wavelength scanning OCT according to a light source.
  • the time domain OCT is a method utilizing that an interference signal can be obtained only when the optical path length is changed by moving the mirror of the reference light to match the optical path length of the signal light.
  • the depth resolution of this method directly reflects the coherence length of the light source, and is about 10 ⁇ m.
  • the Fourier domain OCT utilizes the fact that the frequency of the intensity change of the interference signal in the wave number space depends on the optical path length difference between the reference light and the signal light when the wavelength (wave number) of the light source is continuously changed. It is a method. While wavelength scanning OCT actually scans wavelengths, spectral domain OCT differs in that it uses the spectral width of a low-coherence light source and a spectrometer, but the fundamental principles are the same. The resolution of Fourier domain OCT is determined by the spectral width of the light source and the measurement wavelength range of the spectrometer. For example, Opt. Express., Vol.12, 367-376 (2004) describes a spectral domain OCT device with a resolution of 6 ⁇ m. Yes.
  • the phase sensor according to the present invention uses a light source having a coherence length of several hundred ⁇ m or more to collect light with a high numerical aperture objective lens.
  • the resolution depends on the numerical aperture of the objective lens, not the light source.
  • FIG. 9 is a diagram showing the signal intensity obtained from the interface between glass and air by the phase sensor of the present invention (the numerical aperture of the objective lens is 0.5), and achieves a resolution of 2.6 ⁇ m.
  • a resolution of 50 nm or less can be realized.
  • the thickness of the cell membrane was 10 nm or less, and it was impossible to obtain the molecular state of the cell membrane surface with a conventional CARS and OCT multimodal apparatus.
  • the position of the cell membrane surface is detected with high accuracy by the phase sensor, and the molecular information at the surface position is obtained with a high S / N ratio by the reflective CARS having the characteristic that the signal intensity increases on the surface. Obtainable.
  • FIG. 10 is a diagram showing the principle of following the surface of the cell 1001 in the sample 207.
  • the optical path length changes from a to a + b, so that the phase and intensity of the signal light 1002 that is reflected light change.
  • the surface position of the cell 1001 can be followed.
  • FIG. 11 is a diagram showing the principle of scanning in the xy direction while following the surface of the cell 1001.
  • FIG. 12 is an example of an operation flowchart until the apparatus according to the present invention detects a surface position of a cell or the like and acquires molecular information.
  • CARS measurement is performed at one point on the surface.
  • step 11 laser light is emitted from the short pulse laser light source 201 controlled by the controller 200.
  • step 12 the sample is positioned at the xy position of the objective lens.
  • step 13 the intensity information of the signal light is acquired by the phase sensor while moving the sample in the z direction.
  • step 14 the relationship between the sample movement amount and the signal intensity is acquired from the result of step 13, and the surface position is identified. In identifying the surface position, for example, the peak of the signal light corresponding to the surface is detected by a phase sensor, and the position where the intensity is maximum may be set as the surface.
  • step 15 the sample position is controlled so that the laser beam is focused on the identified surface position, and phase information of the signal light from the surface is acquired.
  • step 16 reflection type CARS measurement is performed, and molecular information is obtained by performing spectrum analysis of the obtained CARS light.
  • step 17 the phase or intensity is confirmed by the phase sensor, and if there is a change from the phase or intensity acquired in step 15 or step 14, the sample position is adjusted in step 18 to compensate for it.
  • the z position of the sample is adjusted in step 18 so that the phase acquired in step 17 is the same as the phase acquired in step 15.
  • the intensity information of the signal light is used for adjusting the sample position, the z position of the sample is adjusted so that the intensity of the signal light is maximized.
  • step 16 By repeating the operations from step 16 to step 18, even when the position of the cell in the sample changes, molecular information can be obtained following the desired surface position.
  • the positional accuracy may be improved by one digit or more as compared with the case where intensity information is used. If the change in the position of the cell is small with respect to the required measurement accuracy, the operations in steps 17 and 18 may be omitted.
  • FIG. 13 is a flowchart showing an operation example of scanning in the xy direction while following the surface of the cell.
  • Step 21 to step 26 and step 28 correspond to step 11 to step 16 and step 18 in FIG. 12, and the operation content in each step is the same as in FIG.
  • the sample is moved in the xy direction in step 27, the phase or intensity is acquired by the phase sensor, and is equal to the phase or intensity acquired in step 25 or step 24 in step 28.
  • CARS measurement can be performed at each point on the surface, and the molecular distribution on the surface can be obtained.
  • the objective lens may be moved by the configuration in FIG.
  • the tracking operation may be performed using the signal intensity detected by the phase sensor instead of the phase.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

　表面状態の計測には信号強度の点で反射型ＣＡＲＳが好適であるが、形状情報を取得しないため表面位置の同定が困難であった。　反射型ＣＡＲＳ顕微鏡と高分解能の位相センサを組み合わせる。位相センサによって表面位置を同定し、その表面から発生される反射ＣＡＲＳを検出して組成分析を行う。

Description

光計測装置及び光計測方法
　本発明は、光を用いて測定対象の組成や形状情報を取得する光計測装置及び光計測方法に関する。
　近年、ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）顕微鏡やＯＣＴ（Optical Coherence Tomography）などの光計測技術が注目されており、測定対象への非侵襲性から特に生物学や医療の分野への応用が期待されている。従来、細胞の解析には試薬を用いて細胞を染色・侵襲し、顕微鏡等で観察する方法が一般的であった。しかし上記の光計測技術を用いることで、例えば同一の細胞の継続的な解析や、検査した細胞をそのまま医療向けに用いることが可能となる。
　ＣＡＲＳは波長の異なる２つの光を物体に入射したとき、物体を構成する分子の振動に対応した波長のＣＡＲＳ光が得られる非線形光学現象であり、例えば特許文献１に記載されている。透過型や反射型など、ポンプ光及びストークス光の入射方向に対するＣＡＲＳ光の検出方向について異なる方式が複数提案されており、非特許文献１には反射型ＣＡＲＳの特徴として、非線形定数の不連続性からＣＡＲＳ光強度のサンプルサイズ依存性が大きく、サイズの増加に伴い強度が急激に減少することが述べられている。また、この特徴から培養液などの媒質中の微小サンプルの測定に有利であることや、異なる媒質の界面で強度が増加することが述べられており、オイルとガラスの界面で反射型ＣＡＲＳ信号のピークが得られた図１４の実験データが示されている。
　一方、ＯＣＴは物体からの反射光と物体に照射しない参照光との干渉によって屈折率の変化を反映した形状情報が得られる方式であり、例えば特許文献２に記載されている。ＣＡＲＳ顕微鏡では測定対象の分子情報が得られるのに対し、ＯＣＴでは形状情報が得られることから、両者は相補的な関係にある。特許文献３には両者のマルチモーダル計測装置が開示されており、「被検体の形態情報と分子情報を同時に計測することが可能な計測装置及び計測方法」が提供されている。
特開２００９－２２２５３１号公報 特開２０１１－２１８１５５号公報 特開２０１３－１７４５３０号公報
Ji-Xin Cheng and X. Sunney Xie,"Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy: Instrumentation, Theory, and Applications," J. Phys. Chem. B, Vol. 108, 827-840(2004)
　測定対象や目的によっては、測定対象の内部より外部との界面の情報取得が必要とされる場合がある。例えば細胞の解析においては、細胞膜表面に発現している受容体及び受容体と結合している分子の情報取得が重要であり、これによって細胞のがん化などを解析することができる。表面状態の計測には信号強度の点で前述の反射型ＣＡＲＳが好適であるが、形状情報を取得しないため表面位置の同定が困難である。細胞膜の厚みは１０ｎｍ以下であり、ナノメートルオーダでの位置調整精度が要求される。
　上記特許文献３の技術は、ポンプ光のパルス伸長を行ってストークス光のパルス幅をポンプ光のパルス幅よりも短くし、アンチストークス光をCARS光として利用し、ストークス光をＯＣＴ測定光とすることで、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化における光パルスの不整合を回避してＣＡＲＳとＯＣＴの複合化を実現するものであって、表面位置検出を目的とした構成ではなく、そのような精度での調整は不可能であった。
　本発明の光計測装置は、試料を保持する試料ステージと、ポンプ光を発生するポンプ光発生部と、ポンプ光より波長の長いストークス光を発生させるストークス光発生部と、ポンプ光又はストークス光から参照光を分岐させる参照光分岐部と、ポンプ光とストークス光を同軸に合波する合波部と、合波されたポンプ光とストークス光を試料ステージに保持された試料に集光する対物レンズと、対物レンズと試料ステージに保持された試料との相対位置を制御する位置制御部と、対物レンズを通った試料からの反射光と参照光を干渉させて反射光の強度又は参照光に対する反射光の位相を検出することで試料の表面位置を特定する位相センサと、試料から発生した反射ＣＡＲＳ光を検出する検出部と、を有する。
　位相センサは、試料の表面位置を光軸方向に３マイクロメートル以下の精度で検出するものである。
　また、対物レンズは開口数が０．４以上である。
　位相センサは位相差が互いに異なる少なくとも３つの干渉光を生成する干渉計を備え、反射光の強度に比例した信号及び参照光を基準とした反射光の位相を表す信号を出力するものである。
　一例として、ポンプ光発生部は短パルスレーザ光源を備え、ストークス光発生部は、短パルスレーザ光源から出射した光を波長変換してストークス光とする波長変換部を備える。
　また、一例として、ポンプ光発生部は第１の短パルスレーザ光源を備え、ストークス光発生部は第２の短パルスレーザ光源を備え、第１の短パルスレーザ光源と第２の短パルスレーザ光源を同期させて駆動する同期部を有する。
　また、一例として、参照光はポンプ光から分岐されたものであり、位相センサは試料から反射されたポンプ光の強度に比例した信号及び参照光を基準とした試料から反射されたポンプ光の位相を表す信号を出力する。
　また、本発明の光計測方法は、ポンプ光を対物レンズで集光して試料に照射する工程と、試料から反射したポンプ光と試料に照射されないポンプ光の干渉光を用いて位相センサで試料の表面位置を検出する工程と、対物レンズの集光位置を検出された試料の表面位置に調整する工程と、ポンプ光よりも長波長のストークス光とポンプ光との合波光を、対物レンズを介して試料に照射する工程と、試料から発生した反射ＣＡＲＳ光を検出する工程と、を有する。
　ここで、位相センサは、位相差が互いに異なる少なくとも３つの干渉光を生成し、反射光の強度に比例した強度信号を用いて試料の表面位置を検出し、試料の表面位置が検出されたときに参照光を基準とした反射光の位相を求める。
　更に、求めた位相が維持されるように対物レンズと試料の光軸方向の相対位置を制御する。
　本発明によれば、測定対象の表面位置を高精度に検出でき、表面の分子情報の取得が可能となる。
　上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
本発明による光計測装置の基本的な実施形態を示す模式図。 本発明による装置のコントローラの構成例を示す図。 対物レンズの位置を制御する場合の模式図。 ガルバノミラーや空間位相変調器などの光路変更手段を用いる場合の模式図。 位相センサにストークス光を用いる場合の模式図。 短パルスレーザ光源を２台備えた装置の模式図。 位相センサの位相検出器の構成例。 本発明による位相センサと従来のＯＣＴを比較した図。 本発明による位相センサの分解能を示す図。 細胞の表面に追従する原理を示した図。 細胞の表面に追従しながらｘｙ方向にスキャンする原理を示した図。 本発明による装置の動作例を示したフローチャート。 細胞の表面に追従しながらｘｙ方向にスキャンする動作例を示したフローチャート。 非特許文献１記載の、オイルとガラスの界面で反射型ＣＡＲＳ信号のピークが得られることを示す図。 通常のラマン散乱におけるストークス散乱のエネルギー準位図。 ＣＡＲＳにおけるエネルギー準位図。 ＣＡＲＳにおける非共鳴光の一例を説明するエネルギー準位図。 ブロードバンドのレーザ光をストークス光として使用した場合のＣＡＲＳのエネルギー準位図。
　最初に、ラマン散乱とＣＡＲＳについて簡単に説明する。
　図１５にエネルギー準位図を使ってラマン散乱が起こる過程を示す。ラマン散乱にはストークス散乱とアンチストークス散乱とがあるが、図１５ではストークス散乱のみを示した。７０１は分子の基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ωPのポンプ光を分子に照射すると、中間状態７０３を経て、周波数ωSの光を散乱する。このとき、分子は振動励起状態７０２の一つに帰着する。散乱光の周波数ωSはポンプ光より周波数の低いストークス光となっている。分子の振動励起状態の準位は複数あり、分子の種類によって振動励起状態が異なり、また中間状態から振動励起状態の準位への遷移確率が異なるため、分子特有のスペクトルが形成される。ラマンシフト周波数ΩはΩ＝ωP－ωSで表され、ストークス散乱の場合は正の値となる。アンチストークス光の場合は、始状態が分子の振動励起状態であり、中間準位を経て分子の状態が基底状態に帰着する。この場合、ωASをアンチストークス光の周波数とすると、ωP＜ωASとなっており、アンチストークスラマン散乱光の方がポンプ光より周波数が高い。
　上記のラマン散乱は得られる散乱光の強度が弱いため測定に時間がかかる。強い散乱光が得られる方式として、非線形ラマン散乱であるＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）を利用する分光方法がある。この方法でもラマンスペクトルを得ることが可能であり、分子の振動状態が分かる。ＣＡＲＳの発生のためにはピークパワーの高いパルスレーザを用いる。このパルスレーザ光によって発生するＣＡＲＳは非線形効果によるものであり、その強度はピークパワーが大きくなるとラマン散乱と比べて桁違いに強いものとなる。これにより、高い信号雑音比の信号が得られ、計測時間を格段に短くすることができる。
　ＣＡＲＳは３次の分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、ポンプ光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は
　　　PAS (3)(ωAS)=|χr (3)(ωAS)+χnr (3)|EP 2(ωP)E*S(ωS) 
で表される。ここに、χr (3)(ωAS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、周波数依存性のないχnr (3)は非共鳴項である。また、ポンプ光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表している。上式中でＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度は以下のように表される。
　　　ICARS(ωAS)∝|PAS (3)(ωAS)|2
　ＣＡＲＳ光が発生する機構を、図１６に示した分子のエネルギー準位図を用いて説明する。本図は共鳴項のプロセスを示している。図１５と同様に、７０１は分子の基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ωPのポンプ光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は中間状態７０３を介して、７０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、中間状態７０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はωAS＝２・ωP－ωSと表される。
　上記３次の分極のうち非共鳴項χnr (3)に関係する一つのプロセスを図１７に示す。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、中間状態７０５を介したプロセスとなる。周波数ωPのポンプ光と周波数ω’Sのストークス光の同時照射により電子等の関与する７０５の中間状態が励起され、さらに周波数ωPのプローブ光を照射することにより、中間状態７０４を介して周波数ωASの非共鳴のＣＡＲＳ光が発生する。ブロードバンドのレーザ光をストークス光として使用した場合には、図１８に示すように複数の励起状態に対応したスペクトルを取得することが可能になる。検出器に分光器を使用することにより多色ＣＡＲＳが検出される。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
［実施例１］
　図１は、本発明による光計測装置の基本的な実施形態を示す模式図である。本装置は、反射型のＣＡＲＳ顕微鏡と位相センサ、及び装置全体の制御を行うコントローラ２００から構成されている。コントローラ２００は、図２に示すように短パルスレーザ光源を制御するレーザドライバ、試料ステージや対物レンズ及びミラーなど各光学素子の位置制御を行う位置制御部、ＣＡＲＳ顕微鏡と位相センサから得られた信号に対して信号処理を行い、画像生成や表面位置検出を行う信号処理部、検出した表面位置にレーザ光の集光位置を追従させる追従動作制御部からなる。なお、ここで述べた各構成の必ずしも全てが光計測装置に備わっている必要はなく、必要な機能や精度に基づいて構成を決定すればよい。
（ＣＡＲＳ顕微鏡の構成）
　続いてＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明する。短パルスレーザ光源２０１は、コントローラ２００の指示に基づいて短パルスレーザ光を出射する。短パルスレーザ光源２０１は例えばチタンサファイアレーザやファイバレーザなどであり、パルス幅はナノ秒以下である。またピークパワーは非線形光学効果を誘起可能なキロワットオーダ以上が望ましい。また波長については測定対象の吸収や用いる光学部品の対応波長から選定すればよいが、例えば８００ｎｍや１０６４ｎｍなどである。
　レーザ光はビームスプリッタ２０２によってストークス光とポンプ光の２つの光束に分岐される。ストークス光として分岐されたレーザ光は波長変換手段２０３に入射し、ポンプ光に対して長波長に変換される。波長変換手段は、例えばフォトニック結晶ファイバやＯＰＯ（Optical Parametric Oscillator）などである。フォトニック結晶ファイバはコアの周囲に蜂の巣状のクラッドが形成された光ファイバであり、入射光をコアに強く閉じ込める。短パルスレーザ光を入射することによって自己位相変調や四光波混合等の非線形光学現象が誘起され、幅広いスペクトルを有する広帯域光が生成される。ストークス光にはこのうちポンプ光より長波長の成分を用いればよい。一方、ＯＰＯは光パラメトリック発生によって入射光の波長を変換する作用を持ち、内部に備えた非線形媒質の角度変化などによって出射光の波長掃引を行う。
　波長変換されたストークス光は、ポンプ光波長のみを反射するダイクロイックミラー２０４及びロングパスフィルタ２０５を透過し、λ／４板２２０に入射する。λ／４板２２０は光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されており、透過した光の偏光状態を直線偏光から円偏光に変換する。λ／４板２２０を透過したストークス光は対物レンズ２０６によって細胞試料２０７に集光する。対物レンズ２０６の開口数については必要な空間分解能に応じて選定すればよいが、例えば開口数０．４以上の対物レンズを用いることによって必要な空間分解能を確保することができる。一方で、ワーキングディスタンスを確保するため、開口数は１．３３以下が好ましい。試料２０７における集光位置は、ピエゾやステッピングモータなどを用いた試料ステージ２０８にてコントローラ２００から制御される。
　一方、ビームスプリッタ２０２にてポンプ光として分岐されたレーザ光はミラー２０９で反射され、ｓ偏光成分が偏光ビームスプリッタ２１０及びダイクロイックミラー２０４にて反射され、ストークス光と同軸に合波される。なお、ｐ偏光成分は偏光ビームスプリッタ２１０を透過し位相センサの参照光として分岐される。ダイクロイックミラー２０４にて反射されたポンプ光はロングパスフィルタ２０５を透過し、λ／４板２２０によって円偏光状態となった後、対物レンズ２０６によって試料２０７に集光される。
　ストークス光とポンプ光が試料２０７の同一位置に集光することによって両者の差周波に共鳴する分子振動が誘起され、ＣＡＲＳ光が発生する。このとき、ストークス光としてフォトニック結晶ファイバによる広帯域光を用いた場合には複数の分子振動が同時に誘起され、幅広いスペクトルを有するＣＡＲＳ光が得られる。一方、ストークス光としてＯＰＯによって波長変換した光を用いた場合にはＣＡＲＳ光も単一波長の光となるが、ＯＰＯによって波長掃引することで広帯域光を用いた場合と同様なスペクトルを得ることができる。
　発生したＣＡＲＳ光は対物レンズ２０６によってコリメートされた後、λ／４板２２０を再度透過することによって円偏光からｐ偏光となる。ＣＡＲＳ光はポンプ光やストークス光に対して短波長であるため、ロングパスフィルタを反射して光検出器２１３に入射する。光検出器２１３の例としては分光器が挙げられるが、波長変換手段２０３にＯＰＯを用いた場合にはＰＤ（Photo Diode）を用いてもよい。コントローラ２００にてＣＡＲＳ光のスペクトルピーク位置と各分子振動の共振周波数を対応させることによって、試料２０７の分子情報が得られる。またこの処理をレーザ光の集光位置を変化させて行うことによって、試料２０７における分子分布に対応したスペクトルイメージが得られる。例えばＣＨ伸縮の分布であれば約２８５０ｃｍ-1における強度を試料位置に対してマッピングすればよい。
（位相センサの構成）
　次に、位相センサの構成を説明する。位相センサは偏光ビームスプリッタ２１０、λ／４板２２１、ミラー２１１、位相検出器２１４から構成されており、ポンプ光による試料２０７の表面検出を行う。試料２０７に集光したポンプ光は、細胞膜表面など屈折率が異なる界面にて反射する。反射したポンプ光は界面の位相情報を保持した信号光として対物レンズ２０６にてコリメートされた後、λ／４板２２０を再度透過することによって円偏光からｐ偏光となる。λ／４板２２０を透過した信号光は、ロングパスフィルタ２０５を透過しダイクロイックミラー２０４で反射され偏光ビームスプリッタ２１０へ入射する。偏光ビームスプリッタ２１０ではｐ偏光である信号光は透過され、位相検出器２１４へ入射する。一方、参照光はλ／４板２２１を透過し、偏光状態がｐ偏光から円偏光に変換され、位置が固定のミラー２１１に入射し反射された後、再度λ／４板２２１を透過することにより偏光状態を円偏光からｓ偏光へ変換される。ｓ偏光となった参照光は偏光ビームスプリッタ２１０で反射され、信号光と合波されて位相検出器２１４へ入射する。位相検出器２１４では信号光の強度や参照光を基準とした信号光の位相を検出する。なお、位相検出器２１４の構成例については後述する。
　得られた強度や位相情報に基づき、コントローラ２００にて細胞膜表面の位置や形状情報を取得する。また、必要に応じてレーザ光の集光位置が細胞膜表面に追従するよう試料の位置制御を行う。この場合、例えば位相センサで検出した位相が所定の範囲に収まるように試料ステージ２０８をフィードバック制御すればよい。
　なお、ここではレーザ光の集光位置を制御するために試料を移動させる例を示したが、図３に示すように試料を固定し、アクチュエータ２２５などによって対物レンズ２０６を移動させてもよい。また、図４に示すようにガルバノミラーや空間位相変調器などの光路変更手段４０１を挿入してレーザ光の集光位置を変化させてもよい。これらの場合、スポットのｚ方向への移動に伴い信号光と参照光の光路長が変化するため、位相ではなく強度情報を用いればよい。また両者を干渉させるために、ｚ方向のスポット移動量に試料の屈折率を乗算した距離以上のコヒーレンス長をもつ光源を短パルスレーザ光源２０１として用いる必要がある。コヒーレンス長はレーザのパルス幅の増加に伴って増加するため、例えば数ピコ秒から数百ピコ秒のレーザを用いればよい。一方、図１のように試料の位置を変化させる場合には、空気と試料の屈折率差によって発生するｚ方向のスポット位置変化量に相当するコヒーレンス長が確保されていればよい。
　位相センサの設置位置は図１、図３、図４に限ったものではなく、ポンプ光の光路中のいずれに設置してもよいし、波長変換手段２０３にＯＰＯを用いた場合には図５のようにストークス光の光路中に設置してもよい。なお、ダイクロイックミラー５０１はストークス光を反射し、ポンプ光を透過する必要があるため、この場合ストークス光の波長掃引に応じて対応する波長のものに切り替える必要がある。例えばストークス光の波長を５０ｎｍ変化させるごとに切り替えるなどすればよい。
　また短パルスレーザは一台に限ったものではなく、図６に示すようにストークス光の光源として短パルスレーザ光源６０１を備えていてもよい。この場合、短パルスレーザ光源６０１は、コントローラ２００の制御によって短パルスレーザ光源２０１と同期してレーザ光を出射する。短パルスレーザ光源６０１の例としては、フェムト秒レーザやフォトニック結晶ファイバを備えた白色レーザなど、短パルスレーザ光源２０１に対して広いスペクトルを有するレーザ光源が望ましいが、励起光源と一体となったＯＰＯを用いて波長掃引してもよい。短パルスレーザ光源を２台用いる構成は、特に短パルスレーザ光源２０１のパワーが不足しており、ストークス光とポンプ光を１台で生成できない場合などに有効である。
（位相検出器の構成）
　図７は、位相検出器２１４の構成例を示した図である。偏光ビームスプリッタ２１０で合波された信号光と参照光の合波光は、ハーフビームスプリッタ７１３、λ／２板７１４、λ／４板７１９、集光レンズ７１５及び７２０、ウォラストンプリズム７１６及び７２１から構成される干渉光学系７１２へ入射する。合波光はハーフビームスプリッタ７１３によって透過光と反射光に分岐される。透過光は光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板７１４を透過した後、集光レンズ７１５によって集光され、ウォラストンプリズム７１６によって分岐されることにより位相関係が１８０度異なる第一の干渉光と第二の干渉光が生成される。第一の干渉光と第二の干渉光は電流差動型の光検出器７１７によって検出され、それらの強度の差に比例した信号７１８が出力される。
　一方、ハーフビームスプリッタ７１３の反射光は光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板７１９を透過した後、集光レンズ７２０によって集光され、ウォラストンプリズム７２１によって分岐されることにより位相関係が１８０度異なる第三の干渉光と第四の干渉光が生成される。第三の干渉光と第四の干渉光は電流差動型の光検出器７２２によって検出され、それらの強度の差に比例した信号７２３が出力される。このようにして生成された信号７１８、７２３はコントローラ２００に入力され、演算されることにより信号光の強度に比例する信号及び参照光を基準とした信号光の位相が得られる。
（位相検出器の原理）
　ここで、上に述べた動作原理について数式を用いて詳細に説明する。干渉光学系７１２へ入射する時点での合波光のジョーンズベクトルを
［式１］ 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
と表すこととすると、ハーフビームスプリッタ７１３を透過し、さらにλ／２板７１４を透過した後の合波光のジョーンズベクトルは次のようになる。
［式２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　ウォラストンプリズム７１６によって式（２）で示される合波光はｐ偏光成分とｓ偏光成分に２分岐された後、電流差動型の光検出器７１７によって差動検出されるので、差動信号７１８は以下の様に表される。
［式３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　ここで、θsig、θrefはそれぞれ複素数Ｅsig、Ｅrefを極座標表示で表した際の位相である。簡単のため検出器の変換効率は１とした。
　一方、ハーフビームスプリッタ７１３で反射され、さらにλ／４板７１９を透過した後の合波光のジョーンズベクトルは次のようになる。
［式４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ウォラストンプリズム７２１によって、式（４）で示される合波光はｐ偏光成分とｓ偏光成分に２分岐された後、電流差動型の光検出器７２２によって差動検出されるので、差動信号７２３は以下の様に表される。
［式５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　これらの出力に対して、コントローラ２００の信号処理部にて以下の演算を行うことにより、参照光を基準とした信号光の位相が得られる。
［式６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　また、次の演算によって信号光の強度に比例した信号が得られる。すなわち、参照光によって信号光が増幅されていることを示しており、Ｓ／Ｎ比の高い信号が得られる。
［式７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　上記のように干渉光学系７１２で位相が互いに９０度ずつ異なる４つの干渉光を生成して検出することにより位相や強度信号を得られるが、原理的には生成される干渉光が３つ以上であれば干渉光がいくつであっても同様の信号を得ることができる。例えば、位相が互いに１２０度ずつ異なる３つの干渉光を生成して検出することにより、式（６）や（７）に示されるのと同一の信号を得ることができる。
（従来のＯＣＴとの比較）
　図８に本方式による位相センサと、従来のＯＣＴの比較を示す。従来のＯＣＴは走査方法によってタイムドメインＯＣＴとフーリエドメインＯＣＴに分類され、フーリエドメインＯＣＴは更に光源によってスペクトルドメインＯＣＴと波長走査型ＯＣＴに分けられる。タイムドメインＯＣＴは、参照光のミラーを移動させることによって光路長を変化させた際に、信号光の光路長と一致したときのみ干渉信号が得られることを利用した方式である。この方式の深さ分解能は光源のコヒーレンス長が直接反映され、１０μｍ程度となる。
　フーリエドメインＯＣＴは、光源の波長（波数）を連続的に変化させた場合に、波数空間上での干渉信号の強度変化の周波数が参照光と信号光の光路長差に依存することを利用した方式である。波長走査型ＯＣＴが実際に波長を走査するのに対し、スペクトルドメインＯＣＴは低コヒーレンス光源のスペクトル幅と分光器を利用する点で差異があるが、本質的な原理は同様である。フーリエドメインＯＣＴの分解能は光源のスペクトル幅や分光器の測定波長範囲で決定され、例えばOpt. Express., Vol.12, 367-376(2004)には分解能６μｍのスペクトルドメインＯＣＴ装置が記載されている。
　一方、本発明による位相センサは、コヒーレンス長数百μｍ以上の光源を用いて高開口数の対物レンズで集光する方式ある。従来のＯＣＴと異なり、分解能は光源ではなく対物レンズの開口数に依存する。例えば開口数０．４以上の対物レンズを用いることによって、３μｍ以下の深さ分解能を確保することができる。図９は、本発明の位相センサ（対物レンズの開口数０．５）によってガラスと空気の界面から得られる信号強度を示した図であり、分解能２．６μｍを達成している。更に、強度ではなく位相を検出する場合には分解能５０ｎｍ以下を実現可能である。
　細胞膜の厚さは１０ｎｍ以下であり、従来のＣＡＲＳとＯＣＴのマルチモーダル装置では細胞膜表面の分子状態の取得が不可能であった。しかし本発明の構成とすることで、位相センサによって細胞膜表面の位置を高精度に検出し、表面で信号強度が増加する特性をもつ反射型ＣＡＲＳによって表面位置における分子情報を高いＳ／Ｎ比で得ることができる。
（位相センサによる追従動作の原理）
　図１０及び図１１に、位相センサによる表面への追従動作の原理を示す。なお、ここでは説明を分かりやすくするために細胞や対物レンズなどの大きさの関係が実際と異なって表示されている。
　図１０は、試料２０７中の細胞１００１の表面に追従する原理を示した図である。観察中に細胞１００１のｚ方向位置がｂだけ変化した場合には光路長がａからａ＋ｂに変化するため、反射光である信号光１００２の位相や強度が変化する。この位相や強度の変化を補償するように試料ステージ２０８を移動させることで、細胞１００１の表面位置に追従することができる。
　図１１は、細胞１００１の表面に追従しながらｘｙ方向にスキャンする原理を示した図である。試料ステージ２０８をｘｙ方向に移動させた場合には、細胞１００１の形状に応じて信号光１００２の位相や強度が変化する。これらの変化を補償するように試料ステージ２０８を移動させることで細胞１００１をｘｙ方向にスキャンしながら表面位置に追従することができる。
　なお、ここでは試料ステージ２０８によって試料２０７を移動させる例を示したが、図３の構成によって対物レンズ２０６を移動させてもよい。この場合には対物レンズの移動に伴い位相が変化するため、強度が所望の範囲内となるよう対物レンズのｚ方向位置を調整すればよい。
（動作フローチャート）
　図１２は、本発明に従う装置が細胞などの表面位置を検出して分子情報を取得するまでの動作フローチャートの例である。ここでは、表面上の１点でＣＡＲＳ測定を行う例を説明する。
　ステップ１１にて、コントローラ２００によって制御された短パルスレーザ光源２０１からレーザ光を発光する。ステップ１２にて、対物レンズのｘｙ位置に試料を位置づける。ステップ１３にて、試料をｚ方向に移動させながら位相センサにて信号光の強度情報を取得する。ステップ１４にて、ステップ１３の結果から試料移動量と信号強度の関係を取得し、表面位置を同定する。表面位置の同定にあたっては、例えば位相センサによって表面に相当する信号光のピークを検出し、強度最大となる位置を表面とすればよい。ステップ１５にて、同定した表面位置にレーザ光が集光するように試料位置を制御し、表面からの信号光の位相情報を取得する。
　ステップ１６にて、反射型ＣＡＲＳ測定を行い、得られたＣＡＲＳ光のスペクトル解析を行うことによって分子情報を取得する。ステップ１７にて、位相センサで位相又は強度を確認し、ステップ１５やステップ１４にて取得した位相や強度から変化がある場合にはステップ１８にてそれを補償するように試料位置を調整する。試料位置の調整に位相センサで取得した位相情報を利用する場合には、ステップ１７で取得した位相がステップ１５で取得した位相と同じになるようにステップ１８で試料のｚ位置を調整する。試料位置の調整に信号光の強度情報を利用する場合には、信号光の強度が最大となるように試料のｚ位置を調整する。ステップ１６からステップ１８までの動作を繰り返すことで、試料内の細胞の位置が変化した場合にも所望の表面位置に追従して分子情報を得ることができる。特に位相情報を用いて追従する場合には、強度情報を用いる場合に対して位置精度が一桁以上向上する場合がある。なお、必要な測定精度に対して細胞の位置の変化が小さい場合にはステップ１７とステップ１８の動作は省略してもよい。
　図１３は、細胞の表面に追従しながらｘｙ方向にスキャンする動作例を示したフローチャートである。ステップ２１からステップ２６及びステップ２８は図１２のステップ１１からステップ１６及びステップ１８に対応し、各ステップでの動作内容は図１２の場合と同じである。図１３に示したフローチャートにおいては、ステップ２７にて試料をｘｙ方向に移動させて位相センサで位相又は強度を取得し、ステップ２８にてステップ２５やステップ２４で取得した位相や強度と等しくなるように試料のｚ位置を調整することによって表面上の各点でＣＡＲＳ測定を行い、表面の分子分布を取得することができる。
　また、図１２と図１３では図１に示した試料をステージ移動させる構成における動作例を説明したが、図３の構成によって対物レンズを移動させてもよい。この場合、位相ではなく位相センサで検出した信号強度を用いて追従動作を行えばよい。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
２００　コントローラ
２０１　短パルスレーザ光源
２０２　ビームスプリッタ
２０３　波長変換手段
２０４　ダイクロイックミラー
２０５　ロングパスフィルタ
２０６　対物レンズ
２０７　試料
２０８　試料ステージ
２０９　ミラー
２１０　偏光ビームスプリッタ
２１１　ミラー
２１３　光検出器
２１４　位相検出器
２２０　λ／４板
２２１　λ／４板
２２５　アクチュエータ
４０１　光路変更手段
５０１　ダイクロイックミラー
６０１　短パルスレーザ光源
７１２　干渉光学系
７１３　ハーフビームスプリッタ
７１４　λ／２板
７１５　集光レンズ
７１６　ウォラストンプリズム
７１７　光検出器
７１８　差動信号
７１９　λ／４板
７２０　集光レンズ
７２１　ウォラストンプリズム
７２２　光検出器
７２３　差動信号
１００１　細胞
１００２　信号光

Claims (10)

  1. 　試料を保持する試料ステージと、
    　ポンプ光を発生するポンプ光発生部と、
    　前記ポンプ光より波長の長いストークス光を発生させるストークス光発生部と、
    　前記ポンプ光又はストークス光から参照光を分岐させる参照光分岐部と、
    　前記ポンプ光と前記ストークス光を同軸に合波する合波部と、
    　前記合波されたポンプ光とストークス光を前記試料ステージに保持された試料に集光する対物レンズと、
    　前記対物レンズと前記試料ステージに保持された試料との相対位置を制御する位置制御部と、
    　前記対物レンズを通った試料からの反射光と前記参照光を干渉させて前記反射光の強度又は前記参照光に対する前記反射光の位相を検出することで試料の表面位置を特定する位相センサと、
    　試料から発生した反射ＣＡＲＳ光を検出する検出部と、
    を有することを特徴とする光計測装置。
  2. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記位相センサは、試料の表面位置を光軸方向に３マイクロメートル以下の精度で検出するものであることを特徴とする光計測装置。
  3. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記対物レンズは開口数が０．４以上であることを特徴とする光計測装置。
  4. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記位相センサは位相差が互いに異なる少なくとも３つの干渉光を生成する干渉計を備え、前記反射光の強度に比例した信号及び前記参照光を基準とした前記反射光の位相を表す信号を出力することを特徴とする光計測装置。
  5. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記ポンプ光発生部は短パルスレーザ光源を備え、
    　前記ストークス光発生部は、前記短パルスレーザ光源から出射した光を波長変換して前記ストークス光とする波長変換部を備えることを特徴とする光計測装置。
  6. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記ポンプ光発生部は第１の短パルスレーザ光源を備え、
    　前記ストークス光発生部は第２の短パルスレーザ光源を備え、
    　前記第１の短パルスレーザ光源と前記第２の短パルスレーザ光源を同期させて駆動する同期部を有することを特徴とする光計測装置。
  7. 　請求項１記載の光計測装置において、
    　前記参照光は前記ポンプ光から分岐されたものであり、前記位相センサは試料から反射されたポンプ光の強度に比例した信号及び前記参照光を基準とした前記試料から反射されたポンプ光の位相を表す信号を出力することを特徴とする光計測装置。
  8. 　ポンプ光を対物レンズで集光して試料に照射する工程と、
    　試料から反射したポンプ光と試料に照射されないポンプ光の干渉光を用いて位相センサで試料の表面位置を検出する工程と、
    　前記対物レンズの集光位置を検出された試料の表面位置に調整する工程と、
    　前記ポンプ光よりも長波長のストークス光と前記ポンプ光との合波光を、前記対物レンズを介して試料に照射する工程と、
    　試料から発生した反射ＣＡＲＳ光を検出する工程と、
    を有することを特徴とする光計測方法。
  9. 　請求項８記載の光計測方法において、
    　前記位相センサは、位相差が互いに異なる少なくとも３つの干渉光を生成し、前記反射光の強度に比例した強度信号を用いて試料の表面位置を検出し、試料の表面位置が検出されたときに前記参照光を基準とした前記反射光の位相を求めることを特徴とする光計測方法。
  10. 　請求項９記載の光計測方法において、
    　前記求めた位相が維持されるように前記対物レンズと試料の光軸方向の相対位置を制御することを特徴とする光計測方法。
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