WO2013129412A1 - 計測装置及び計測方法 - Google Patents

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昌宏 戸井田
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Definitions

  • the present invention relates to a measuring apparatus and a measuring method for measuring morphological information and molecular information of a subject.
  • the adaptability of light is high among various physical energies.
  • the living body when trying to perform optical measurement while the living body is alive (in vivo), there are difficult problems inherent to the living body.
  • the first is a problem caused by the scattering phenomenon. In other words, light that has been scattered, transmitted, and reflected is hardly held in propagation history information and position information, and thus quantification and imaging are extremely difficult.
  • the second is the problem of obstruction due to in-vivo substances.
  • Spectroscopic measurement is effective for identifying specific molecules in the living body, but there are many fluorescent substances that absorb ultraviolet light to visible light in the living body substances, which causes artifacts. For this reason, it is difficult to discriminate signals specific to the target substance.
  • the third is a wavelength mismatch problem.
  • Biomolecules can be identified by vibrational absorption of C—C, C—H, C—O, etc., but the wavelength band of these vibrational absorptions is in the infrared region. About 60% of the living body is water, and the absorption of water is large in the infrared region, preventing vibrational spectroscopic measurement in the deep part of the living body. On the other hand, a living body has good transparency in the wavelength range of 0.7 ⁇ m to 1.2 ⁇ m, and this wavelength region is also called an optical window of the living body. Thus, when optical measurement is performed while the living body is alive, the mismatch between the optical characteristics of the measurement object and the probe wavelength makes it difficult to acquire information inside the living body.
  • CARS Coherent Anti-Stokes Raman Scattering
  • the molecular distribution itself to be measured is not originally spatially sharp, so the resolution of molecular imaging is generally poor.
  • Detailed elucidation of the spatial position information of the target molecule is indispensable information for elucidating the onset mechanism and the development mechanism of various diseases. That is, molecular imaging supported by morphological information is an important issue.
  • OCT Optical Coherence Tomography
  • in-vivo cell imaging has been reported with a wide-band light source using a short pulse laser.
  • spectroscopic OCT that extracts spectral information of a sample by utilizing a wide band characteristic of a light source has been proposed.
  • the OCT signal reflects the absorption and scattering of the sample.
  • Spectral information that can withstand material identification is increased in a scatterer such as a tissue body, although spectral information can be extracted to some extent in a low-scattering sample. Is difficult to obtain.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a measuring apparatus and a measuring method capable of simultaneously measuring the morphology information and molecular information of a subject. It is in.
  • a measuring device includes: A light source unit for generating pump light and Stokes light for irradiating the subject; Extending a pulse of the pump light, and a pulse extending unit that makes a pulse width of the Stokes light shorter than a pulse width of the pump light; A light splitting section for splitting the Stokes light; An optical scanning unit that scans the subject with the pulse-expanded pump light and one Stokes light divided by the light dividing unit; A first light detection unit that detects anti-Stokes light from the subject and outputs a detection signal; A second light detection unit that detects interference light between the other Stokes light divided by the light division unit and reflected light of the Stokes light from the subject, and outputs a detection signal; And a signal processing unit that performs image generation processing based on the detection signal from the first light detection unit and the detection signal from the second light detection unit.
  • the measurement method includes: A light generation procedure for generating pump light and Stokes light to irradiate the subject; A pulse extension procedure for extending the pulse of the pump light so that the pulse width of the Stokes light is shorter than the pulse width of the pump light; A light splitting procedure for splitting the Stokes light; An optical scanning procedure for scanning the subject with the pulse-extended pump light and one Stokes light divided by the light dividing procedure; A first light detection procedure for detecting anti-Stokes light from the subject and outputting a detection signal; A second light detection procedure for detecting interference light between the other Stokes light divided in the light splitting procedure and the reflected light of the Stokes light from the subject and outputting a detection signal; And a signal processing procedure for performing an image generation process based on the detection signal output in the first light detection procedure and the detection signal output in the second light detection procedure.
  • the S / N ratio of the detection signal of anti-Stokes light is improved by performing pulse extension of pump light to make the pulse width of Stokes light shorter than the pulse width of pump light. be able to. Furthermore, according to the present invention, by using the Stokes light as OCT measurement light, the optical pulse mismatch in the CARS and OCT composite is avoided, and the CARS and OCT composite is realized. Information and form information can be measured simultaneously.
  • the pump light that has been pulse-extended may be picosecond pulse laser light, and the Stokes light may be femtosecond pulse laser light.
  • the pump light is a picosecond pulse laser beam
  • the Stokes beam is a femtosecond pulse laser beam
  • the Stokes beam is an OCT measurement beam.
  • the light source unit is An optical parametric oscillator that uses the second harmonic of the pump light as excitation light may be provided, and idler light of the optical parametric oscillator may be generated as the Stokes light.
  • An idler light of an optical parametric oscillator that uses the second harmonic of the pump light as excitation light may be generated as the Stokes light.
  • An optical modulator that modulates the wavelength of the signal light of the optical parametric oscillator is A detection signal may be output by detecting interference light between the wavelength-modulated signal light and the anti-Stokes light from the subject.
  • An optical modulation procedure for modulating the wavelength of the signal light of the optical parametric oscillator In the first light detection procedure, A detection signal may be output by detecting interference light between the wavelength-modulated signal light and the anti-Stokes light from the subject.
  • CARS light anti-Stokes light
  • FIG. 1 is a diagram showing the energy relationship between photons and molecular vibrations in CARS.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the measurement apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a positional relationship between the pump light, the Stokes light, and the objective lens.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating pulse timings of the pump light pulse and the Stokes light pulse irradiated to the subject.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating an example of a configuration of a measurement apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating pulse timing of signal light from the optical parametric oscillator.
  • the measurement apparatus and the measurement method according to the present embodiment provide an OCT (non-invasive living body imaging for a biological sample (solid, organ, tissue) that enables excellent morphological imaging even under light scattering.
  • OCT non-invasive living body imaging for a biological sample (solid, organ, tissue) that enables excellent morphological imaging even under light scattering.
  • Optical Coherence Tomography and CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) that enables molecular imaging by discriminating in vivo molecules by vibration spectroscopy.
  • the combination of OCT and CARS has a problem of optical pulse mismatch.
  • FIG. 1 shows the energy relationship between photons and molecular vibrations in CARS.
  • the synchronism between the pump light and the Stokes light irradiating the subject with the pump light pulse and the Stokes light pulse simultaneously) is essential. It is.
  • the measurement apparatus and measurement method of the present embodiment pay attention to the characteristics of the CARS resonance process and non-resonance process, improve the resonance process / non-resonance process ratio of the CARS signal, and provide Stokes light in the first stage excitation process.
  • ⁇ s as the OCT measurement light, optical pulse mismatching in the CARS and OCT combination is avoided, and the CARS and OCT combination is realized.
  • FIG. 2 shows an example of the configuration of the measurement apparatus according to the first embodiment.
  • the measurement apparatus 1 includes a light source unit 10 that generates pump light and Stokes light that irradiates a subject (sample) S, and an optical delay unit 20 that adjusts irradiation timing of the pump light and Stokes light to the subject S.
  • a pulse extension unit 30 that extends the pulse width of the pump light to make the pulse width of the Stokes light shorter than the pulse width of the pump light, the Stokes light that becomes the OCT reference light, and the reflected light of the Stokes light from the subject S
  • a light interfering unit 40 for causing the pumping light and the Stokes light to scan on the subject S, and an objective lens 60 for condensing the pumping light and the Stokes light on the subject S.
  • the first light detection unit 70 for detecting anti-Stokes light (CARS light) from the subject S, and detecting interference light between the Stokes light as the OCT reference light and the reflected light of the Stokes light from the subject S Comprising a second optical detector 80, a signal processing unit 90, a display unit 92.
  • CARS light anti-Stokes light
  • the light source unit 10 includes a laser light source 12 that generates a fundamental wave and a second harmonic of an f-second pulse, and an optical parametric oscillator 14 (OPO) that uses the second harmonic as excitation light.
  • the laser light source 12 can be composed of, for example, a Yb: YAG laser crystal.
  • the Yb: YAG laser generates a fundamental wave having a wavelength of 1034 nm and a second harmonic having a wavelength of 517 nm.
  • the fundamental wave from the laser light source 12 is extracted as a pump light pulse, and the idler light from the optical parametric oscillator 14 is extracted as a Stokes light pulse.
  • the pump light P from the light source unit 10 is delayed by the optical delay unit 20 including the two mirrors 22 and 24, and enters the pulse extension unit 30 through the mirror 26.
  • the pulse extension unit 30 is made of, for example, an optical material having a negative or positive dispersion characteristic in the refractive index, and extends the pulse width of the pump light P.
  • the pump light P whose pulse width is extended by the pulse extension unit 30 passes through the half mirrors 45 and 42 and enters the optical scanning unit 50.
  • the Stokes beam S T from the light source unit 10 is reflected by the dichroic mirror 16, is split by the half mirror 41 of the optical interference part 40 (corresponding to the light splitting unit of the present invention).
  • a reference beam Stokes beam S S is the optical path length is adjusted by the mirror 43 and enters the second photodetection unit 80 is transmitted through the half mirror 46.
  • the Stokes beam S M is the measurement light is reflected by the half mirror 42 and enters the optical scanning unit 50.
  • each optical path of the pump light P and Stokes light S M is adjusted so as to be symmetrical positions with respect to the optical axis OA of the objective lens 60.
  • the optical path of the anti-Stokes light AS described later is located on the optical axis OA.
  • Stokes light S M scattered and reflected in the subject S travels backward in the optical path, and is half of the objective lens 60, the dichroic mirror 62, the optical scanning unit 50, and the optical interference unit 40.
  • the light enters the second light detection unit 80 via the mirrors 42, 45, and 46.
  • Light reflected Stokes beam S M interferes with a reference beam Stokes beam S S, is detected as interference light by the second light detector 80.
  • the optical path adjustment unit configured by the mirrors 43 and 44 is adjusted so that the optical path length of the reflected light of the Stokes light S M and the optical path length of the Stokes light S S that is the reference light coincide with each other.
  • the second light detection unit 80 is configured by a photodiode, for example, and outputs a detection signal of the interference light to the signal processing unit 90 as an OCT interference signal.
  • the signal processing unit 90 (computer) generates an image based on the detection signal (anti-Stokes signal) from the first light detection unit 70 and the detection signal (OCT interference signal) from the second light detection unit 80. Perform the process. Further, the signal processing unit 90 supplies the scanning signal to the optical scanning unit 50 and the driving unit for the objective lens 60, and performs processing for controlling the driving of the scanning mirrors 52 and 54 and the driving of the objective lens 60.
  • the signal processing unit 90 converts the anti-Stokes signal from the first light detection unit 70 into an image (CARS image) synchronized with the scanning signal, and the OCT interference signal from the second light detection unit 80. Processing to make an image (OCT image) synchronized with the scanning signal is performed. Scanning of the pump light P and the Stokes beam S M is to be done in the X-Y plane on the Z axis direction, the two-dimensional image in the X-Y plane of the object S, X-Z plane or Y of the subject S A tomographic image in the -Z plane can be generated.
  • the CARS image (image representing molecular information) and the OCT image (image representing morphological information) generated by the signal processing unit 90 are displayed on the display unit 92 (display).
  • the CARS image and the OCT image may be individually displayed on the display unit 92, or an image in which the CARS image and the OCT image are superimposed may be displayed on the display unit 92.
  • FIG. 4 shows pulse timings of the pump light pulse and the Stokes light pulse applied to the subject S.
  • the Stokes light pulse has a pulse width of f seconds (several tens of seconds to several hundreds of f seconds), and the pump light pulse is obtained by extending the pulse width at the pulse extension unit 30.
  • the pulse width of p seconds severe p seconds to several tens of p seconds.
  • the optical path length of the pump light is adjusted by the optical delay unit 20 so that the rising edges of the Stokes light pulse and the pump light pulse substantially coincide.
  • the vibration energy of the molecule is excited to the virtual level a (see FIG. 1) by simultaneous irradiation of the first Stokes light pulse and the pump light pulse. Furthermore, it becomes difficult to be excited, and the probability that anti-Stokes light is generated decreases. That is, as shown in FIG.
  • the Stokes light and the pump light pulse are made to coincide with each other, and the Stokes light pulse width is made shorter than the pump light pulse width so that the Stokes light is not irradiated in the subsequent pumping process.
  • the resonance process / non-resonance process ratio of the CARS signal that is, the S / N ratio of the CARS signal
  • the Stokes light is an ultrashort pulse of about several tens of fs to several hundreds of fs suitable for OCT measurement, and the Stokes light pulse is used as the OCT measurement light, so that the optical pulse in the combination of CARS and OCT is obtained. Inconsistency can be avoided, and CARS and OCT can be combined.
  • FIG. 5 shows an example of the configuration of the measurement apparatus according to the second embodiment.
  • the same components as those shown in FIG. 2 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted as appropriate.
  • the measuring apparatus 1 shown in FIG. 5 further includes mirrors 17 and 18 that adjust the optical path length of the signal light SG from the optical parametric oscillator 14, an optical modulator 19 that modulates the wavelength of the signal light SG, and a half mirror 63.
  • the light modulation unit 19 can be configured by an acousto-optic device (AOM).
  • the signal light SG passes through the dichroic mirror 16 and is incident on the light modulation unit 19 via the mirrors 17 and 18.
  • the signal light SG that has been wavelength-modulated by the light modulator 19 passes through the half mirror 63 and enters the first light detector 70.
  • the anti-Stokes light AS from the subject S is reflected by the half mirror 63 and enters the first light detection unit 70.
  • the mirrors 17 and 18 adjust the pulse timing of the signal light SG to coincide with the pulse timing of the anti-Stokes light AS, and shift the wavelength of the signal light SG by the optical modulator 19. Then, the signal light SG and the anti-Stokes light AS interfere with each other to generate an optical beat, which is detected by the first light detection unit 70.
  • the first light detection unit 70 outputs the detected beat signal of the optical beat to the signal processing unit 90 as an anti-Stokes signal.
  • SYMBOLS 1 Measuring device 10 Light source part, 12 Laser light source, 14 Optical parametric oscillator, 16 Dichroic mirror, 17, 18 mirror, 19 Light modulation part, 20 Optical delay part, 22, 24, 26 mirror, 30 Pulse expansion part 30, 40 Optical interference unit, 41, 42 half mirror, 43, 44 mirror, 45, 46 half mirror, 50 optical scanning unit, 52, 54 scanning mirror, 60 objective lens, 62 dichroic mirror, 63 half mirror, 70 first light detection Part, 80 second light detection part, 90 signal processing part, 92 display part

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Abstract

　ポンプ光Ｐ及びストークス光Ｓを発生する光源部１０と、ポンプ光Ｐのパルスを伸長して、ストークス光Ｓのパルス幅をポンプ光Ｐのパルス幅よりも短くするパルス伸長部３０と、ストークス光Ｓを分割する光分割部４１と、パルス伸長されたポンプ光Ｐと分割された一方のストークス光ＳＭとを被検体Ｓ上で走査させる光走査部５０と、被検体Ｓからのアンチストークス光ＡＳを検出する第１の光検出部７０と、分割された他方のストークス光ＳＳと、被検体Ｓからのストークス光ＳＭの反射光との干渉光を検出する第２の光検出部８０と、第１の光検出部７０からの検出信号と、第２の光検出部８０からの検出信号に基づいて、画像生成処理を行う信号処理部９０とを含む。

Description

計測装置及び計測方法
　本発明は、被検体の形態情報及び分子情報を計測する計測装置及び計測方法に関する。
　生体を対象とした非侵襲的な計測では、各種の物理エネルギーの中で光の適応性が高い。一方、生体を生きたままの状態(in vivo)で光計測しようとすると、生体固有の困難な問題が存在する。第一に散乱現象による問題である。すなわち、散乱透過、散乱反射した光には、伝播履歴情報と位置情報が殆ど保持されないため、定量化と画像化が著しく困難である。第二は生体内在物質による妨害の問題である。生体内の特定分子を識別するには分光計測が有力であるが、生体内在物質には紫外光～可視光を吸収する蛍光物質が多種存在しアーティファクトの原因となる。このため、目的物質固有の信号の弁別が困難である。第三は波長のミスマッチの問題である。生体分子は、Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｈ、Ｃ－Ｏ等の振動吸収で特定可能であるが、これら振動吸収の波長帯は赤外域である。生体は約６０％が水であり、水の吸収は赤外域で大きく、生体深部の振動分光計測を防げる。一方で、生体は０．７μｍ～１．２μｍの波長域で透過性が良く、この波長域は生体の光学的窓とも呼ばれている。このように生体を生きたままの状態で光計測する際、計測対象物の光特性とプローブ波長のミスマッチが生体内部の情報取得を困難にしている。
　今後の健康医療に資する先端技術を考えるとき、疾病の進行プロセスとそこでの現状技術を対置させると理解しやすい。疾病の発現と進行は、遺伝子変化をトリガーに異常タンパク発現、細胞や組織の機能変化、形態変化、自覚症状発現といったプロセスを辿る。一方、診断技術は、疾病の進行プロセスを遡るように進展してきた。すなわち、医師の五感と経験に依拠した症状の補足から、早期の形態変化を補足する画像診断技術へと発展してきた。
　ところが、近年、遺伝子診断が長足の進歩を遂げ、遺伝的にどのような疾病リスクがあるかは個々に判る時代になってきた。ただし、発生の時期までは判らない。こうした現状を捉えると、今後は疾病の発生をいかにして早期に的確に捉え、より侵襲の少ない治療を実現していくことが重要である。疾病の早期発見には形態変化に至る前段階の機能変化を捉えることが肝要である。すなわち、恒常性を維持した組織構造をそのままに細胞内、組織内の特定タンパクなどの分子イメージングが求められる。
　光を用いた分子イメージングは、蛍光標識薬などのプローブ法と、生体内材物質の特質を活用したノンプローブ法に大別される。ノンプローブ法では、上述の生体計測における波長のミスマッチを解決する方法として、ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）イメージングが知られている（例えば、特開平０７－２９４４３５号公報参照）。しかし計測対象の分子分布自体が元々空間的にメリハリのあるものではないため、分子イメージングの解像度は悪いのが一般的である。各種疾病の発症機構やその進展メカニズムの解明において、ターゲット分子の詳細な空間位置情報は必須の情報である。すなわち、形態情報に裏打ちされた分子イメージングが重要な課題である。
　非侵襲な生体の形態イメージング技術として、ＯＣＴ（Optical Coherence Tomography）が知られている。近年では、短パルスレーザーを用いた光源の広帯域化によるin vivoな細胞イメージングが報告されている。また、光源の広い帯域特性を活かして、試料のスペクトル情報を抽出する分光ＯＣＴも提案されている。しかし、ＯＣＴ信号は試料の吸収と散乱を反映したもので、低散乱試料ではスペクトル情報の抽出がある程度可能なものの、組織体のような散乱体では誤差が大きくなり、物質同定に耐えうる分光情報の取得は困難である。
　このように、生体（固体、器官、組織）を対象としたin vivoな非侵襲的な計測において、形態情報と同時に分子情報を計測することが求められている。
　本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、被検体の形態情報と分子情報を同時に計測することが可能な計測装置及び計測方法を提供することにある。
　（１）本発明に係る計測装置は、
　被検体に照射するポンプ光及びストークス光を発生する光源部と、
　前記ポンプ光のパルスを伸長して、前記ストークス光のパルス幅を前記ポンプ光のパルス幅よりも短くするパルス伸長部と、
　前記ストークス光を分割する光分割部と、
　パルス伸長された前記ポンプ光と前記光分割部で分割された一方のストークス光とを前記被検体上で走査させる光走査部と、
　前記被検体からのアンチストークス光を検出して検出信号を出力する第１の光検出部と、
　前記光分割部で分割された他方のストークス光と、前記被検体からのストークス光の反射光との干渉光を検出して検出信号を出力する第２の光検出部と、
　前記第１の光検出部からの検出信号と、前記第２の光検出部からの検出信号に基づいて、画像生成処理を行う信号処理部とを含むことを特徴とする。
　また本発明に係る計測方法は、
　被検体に照射するポンプ光及びストークス光を発生する光発生手順と、
　前記ポンプ光のパルスを伸長して、前記ストークス光のパルス幅を前記ポンプ光のパルス幅よりも短くするパルス伸長手順と、
　前記ストークス光を分割する光分割手順と、
　パルス伸長された前記ポンプ光と前記光分割手順で分割された一方のストークス光とを前記被検体上で走査させる光走査手順と、
　前記被検体からのアンチストークス光を検出して検出信号を出力する第１の光検出手順と、
　前記光分割手順で分割された他方のストークス光と、前記被検体からのストークス光の反射光との干渉光を検出して検出信号を出力する第２の光検出手順と、
　前記第１の光検出手順で出力した検出信号と、前記第２の光検出手順で出力した検出信号に基づいて、画像生成処理を行う信号処理手順とを含むことを特徴とする。
　本発明によれば、ポンプ光のパルス伸長を行ってストークス光のパルス幅をポンプ光のパルス幅よりも短くすることで、アンチストークス光（ＣＡＲＳ光）の検出信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。更に、本発明によれば、該ストークス光をＯＣＴ測定光とすることで、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化における光パルスの不整合を回避してＣＡＲＳとＯＣＴの複合化を実現し、被検体の分子情報と形態情報とを同時に計測することが可能となる。
　（２）また本発明に係る計測装置及び計測方法では、
　パルス伸長された前記ポンプ光は、ピコ秒パルスレーザー光であり、前記ストークス光は、フェムト秒パルスレーザー光であってもよい。
　本発明によれば、ポンプ光をピコ秒パルスレーザー光として、ストークス光をフェムト秒パルスレーザー光として、該ストークス光をＯＣＴ測定光とすることで、アンチストークス光（ＣＡＲＳ光）の検出信号のＳ／Ｎ比を向上させるとともに、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化における光パルスの不整合を回避してＣＡＲＳとＯＣＴの複合化を実現し、被検体の分子情報と形態情報とを同時に計測することが可能となる。
　（３）また本発明に係る計測装置では、
　前記光源部が、
　前記ポンプ光の第二高調波を励起光とする光パラメトリック発振器を備え、前記光パラメトリック発振器のアイドラー光を前記ストークス光として発生してもよい。
　また本発明に係る計測方法では、
　前記光発生手順では、
　前記ポンプ光の第二高調波を励起光とする光パラメトリック発振器のアイドラー光を前記ストークス光として発生してもよい。
　（４）また本発明に係る計測装置では、
　前記光パラメトリック発振器のシグナル光の波長を変調する光変調部を更に含み、
　前記第１の光検出部が、
　波長変調された前記シグナル光と、前記被検体からのアンチストークス光との干渉光を検出して検出信号を出力してもよい。
　また本発明に係る計測方法では、
　前記光パラメトリック発振器のシグナル光の波長を変調する光変調手順を更に含み、
　前記第１の光検出手順では、
　波長変調された前記シグナル光と、前記被検体からのアンチストークス光との干渉光を検出して検出信号を出力してもよい。
　本発明によれば、光パラメトリック発振器のシグナル光を参照光としたヘテロダイン検波を行うことで、アンチストークス光（ＣＡＲＳ光）の信号を高感度に検出することが可能となる。
図１は、ＣＡＲＳにおける、光子と分子振動のエネルギー関係を示す図である。 図２は、第１の実施の形態に係る計測装置の構成の一例を示す図である。 図３は、ポンプ光、ストークス光及び対物レンズの位置関係を示す図である。 図４は、被検体に照射されるポンプ光パルス及びストークス光パルスのパルスタイミングを示す図である。 図５は、第２の実施の形態に係る計測装置の構成の一例を示す図である。 図６は、光パラメトリック発振器からのシグナル光のパルスタイミングを示す図である。
　以下、本実施形態について説明する。なお、以下に説明する本実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また本実施形態で説明される構成の全てが、本発明の必須構成要件であるとは限らない。
　まず、本実施形態に係る計測装置及び計測方法における計測原理について説明する。
　本実施形態に係る計測装置及び計測方法は、生体試料（固体、器官、組織）を対象とした、非侵襲な生体イメージングにおいて、光散乱下にあっても優れた形態イメージングを可能とするＯＣＴ（Optical Coherence Tomography）と、生体内分子を振動分光により弁別して分子イメージングを可能とするＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）の複合化を実現するものである。
　ＯＣＴとＣＡＲＳでは、それぞれの計測における最適光パルス幅が大きく異なるため、ＯＣＴとＣＡＲＳの複合化は単純には成立しない。ＣＡＲＳでは、分子信号振動のＳ／Ｎ比は非共鳴信号により律速され、十分な共鳴信号／非共鳴信号比と、十分なスペクトル分解能（数ｃｍ－１）を確保するため、数ｐ（ピコ）秒～数十ｐ秒のパルス幅を有するポンプ光及びストークス光が用いられる。一方、ＯＣＴでは、高精細な形態イメージングを実現するため、数十ｆ（フェムト）秒～数百ｆ秒程度のパルス幅を有する超短パルス（スペクトル幅＝１０００ｃｍ－１程度）が用いられる。このように、ＯＣＴとＣＡＲＳの複合化には、光パルスの不整合という課題が存在する。
　図１に、ＣＡＲＳにおける、光子と分子振動のエネルギー関係を示す。ＣＡＲＳ信号には、分子振動のＶ＝１準位を介したアンチストークス光ωａｓ生成によるＶ＝０準位への緩和である共鳴過程と、Ｖ＝１準位を介さない（仮想準位ａを介した）アンチストークス光ωａｓ生成によるＶ＝０準位への緩和である非共鳴過程に基づく２種類がある。非共鳴過程では、Ｖ＝１準位を介さない（仮想準位ａを介する）ため、ポンプ光とストークス光の同時性（ポンプ光パルスとストークス光パルスを同時に被検体に照射すること）が必須である。しかし、共鳴過程では、初段のポンプ光ωｐとストークス光ωｓのミキシングによりＶ＝１準位へ励起された分子が、後段のポンプ光ω’ｐでさらに励起されるため、後段の励起においては、ポンプ光ω’ｐのみあればよくストークス光ωｓを必要としない。
　本実施形態の計測装置及び計測方法は、このようなＣＡＲＳの共鳴過程と非共鳴過程の特質に注目し、ＣＡＲＳ信号の共鳴過程／非共鳴過程比の向上を図るとともに、初段励起過程におけるストークス光ωｓをＯＣＴ計測光とすることで、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化における光パルスの不整合を回避し、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化を実現するものである。
　（第１の実施の形態）
　図２に、第１の実施の形態に係る計測装置の構成の一例を示す。計測装置１は、被検体（試料）Ｓに照射するポンプ光及びストークス光を発生する光源部１０と、ポンプ光及びストークス光の被検体Ｓへの照射タイミングを調整するための光遅延部２０と、ポンプ光のパルス幅を伸長してストークス光のパルス幅をポンプ光のパルス幅よりも短くするパルス伸長部３０と、ＯＣＴ参照光となるストークス光と被検体Ｓからのストークス光の反射光とを干渉させるための光干渉部４０と、ポンプ光とストークス光とを被検体Ｓ上で走査させる光走査部５０と、ポンプ光とストークス光とを被検体Ｓ上に集光させる対物レンズ６０と、被検体Ｓからのアンチストークス光（ＣＡＲＳ光）を検出する第１の光検出部７０と、ＯＣＴ参照光となるストークス光と被検体Ｓからのストークス光の反射光との干渉光を検出する第２の光検出部８０と、信号処理部９０と、表示部９２とを含む。
　光源部１０は、ｆ秒パルスの基本波と第二高調波を発生するレーザー光源１２と、該第二高調波を励起光とする光パラメトリック発振器１４（ＯＰＯ）とを備える。レーザー光源１２は、例えば、Ｙｂ：ＹＡＧレーザー結晶により構成することができる。Ｙｂ：ＹＡＧレーザーは、波長１０３４ｎｍの基本波と、波長５１７ｎｍの第二高調波を発生する。レーザー光源１２からの基本波が、ポンプ光パルスとして取り出され、光パラメトリック発振器１４からのアイドラー光が、ストークス光パルスとして取り出される。光パラメトリック発振器１４は、基本波（ポンプ光）の角周波数ωｐと、アイドラー光（ストークス光）の角周波数ωｓの差が、計測対象分子の振動数ωγと等しくなるように（すなわち、ωγ＝ωｐ－ωｓとなるように）、その結晶軸の角度が調整される。
　光源部１０からのポンプ光Ｐは、２つのミラー２２、２４を備えた光遅延部２０によって遅延させられ、ミラー２６を介してパルス伸長部３０に入射する。パルス伸長部３０は、例えば屈折率に負又は正の分散特性を有する光学材料で構成され、ポンプ光Ｐのパルス幅を伸長する。パルス伸長部３０によってパルス幅が伸ばされたポンプ光Ｐは、ハーフミラー４５、４２を透過して光走査部５０に入射する。
　一方、光源部１０からのストークス光ＳＴは、ダイクロイックミラー１６で反射して、光干渉部４０のハーフミラー４１（本発明の光分割部に対応）で分割される。ハーフミラー４１を透過した一方のストークス光は、測定光（被検体Ｓへの照射光）としてのストークス光ＳＭとなり、ハーフミラー４１で反射した他方のストークス光は、ＯＣＴ参照光としてのストークス光ＳＳとなる。参照光であるストークス光ＳＳは、ミラー４３、４４によって光路長が調整され、ハーフミラー４６を透過して第２の光検出部８０に入射する。一方、測定光であるストークス光ＳＭは、ハーフミラー４２で反射して光走査部５０に入射する。
　ポンプ光Ｐとストークス光ＳＭは、平行ビームに調整され、光走査部５０の走査ミラー５２、５４によって、被検体Ｓ上のＸＹ平面内で光走査される。走査ミラー５２、５４の駆動は、信号処理部９０によって制御される。また、ポンプ光Ｐとストークス光ＳＭは、ダイクロイックミラー６２を透過して、対物レンズ６０によって被検体Ｓ上に集光される。対物レンズ６０は、図示しない駆動部（図示せず）によりＺ軸方向に移動可能に構成され、これにより被検体ＳにおけるＺ軸方向（深さ方向、奥行き方向）の光走査を行う。対物レンズ６０の駆動部は、信号処理部９０によって制御される。
　ポンプ光Ｐ、ストークス光ＳＭ及び対物レンズ６０の位置関係は、図３に示すように調整される。すなわち、ポンプ光Ｐとストークス光ＳＭの各光路が、対物レンズ６０の光軸ＯＡに対して対称な位置となるように調整される。なお、後述するアンチストークス光ＡＳの光路は、光軸ＯＡ上に位置する。
　被検体Ｓ内の集束位置では、ポンプ光Ｐとストークス光ＳＭが重なり合い、その位置の被検体Ｓ内の計測対象分子との相互作用により、アンチストークス光（ＣＡＲＳ光）が発生する。被検体Ｓで発生したアンチストークス光ＡＳは、対物レンズ６０で集束され、ダイクロイックミラー６２によりポンプ光Ｐ及びストークス光ＳＭと分離されて、第１の光検出部７０に入射する。第１の光検出部７０は、例えばフォトダイオードで構成され、アンチストークス光ＡＳを受光して、その検出信号をアンチストークス信号として信号処理部９０に出力する。
　一方、被検体Ｓ内で散乱反射したストークス光ＳＭ（ストークス光ＳＭの反射光）は、光路を逆走し、対物レンズ６０、ダイクロイックミラー６２、光走査部５０、光干渉部４０のハーフミラー４２、４５、４６を介して第２の光検出部８０に入射する。ストークス光ＳＭの反射光は、参照光であるストークス光ＳＳと干渉し、第２の光検出部８０で干渉光として検出される。干渉を発生させるために、ミラー４３、４４で構成される光路調整部は、ストークス光ＳＭの反射光の光路長と、参照光であるストークス光ＳＳの光路長が一致するように調整される。第２の光検出部８０は、例えばフォトダイオードで構成され、当該干渉光の検出信号をＯＣＴ干渉信号として信号処理部９０に出力する。
　信号処理部９０（コンピュータ）は、第１の光検出部７０からの検出信号（アンチストークス信号）と、第２の光検出部８０からの検出信号（ＯＣＴ干渉信号）に基づいて、画像を生成する処理を行う。また、信号処理部９０は、走査信号を、光走査部５０及び対物レンズ６０の駆動部に供給して、走査ミラー５２、５４の駆動と対物レンズ６０の駆動を制御する処理を行う。
　信号処理部９０は、第１の光検出部７０からのアンチストークス信号を、走査信号と同期された画像（ＣＡＲＳ画像）とする処理と、第２の光検出部８０からのＯＣＴ干渉信号を、走査信号と同期された画像（ＯＣＴ画像）とする処理を行う。ポンプ光Ｐ及びストークス光ＳＭの走査は、Ｘ－Ｙ平面上とＺ軸方向において行われるため、被検体ＳのＸ－Ｙ平面における２次元画像と、被検体ＳのＸ－Ｚ平面或いはＹ－Ｚ平面における断層画像とを生成することができる。信号処理部９０で生成されたＣＡＲＳ画像（分子情報を表す画像）及びＯＣＴ画像（形態情報を表す画像）は、表示部９２（ディスプレイ）に表示される。なお、ＣＡＲＳ画像と、ＯＣＴ画像を、個別に表示部９２に表示するようにしてもよいし、ＣＡＲＳ画像とＯＣＴ画像とを重畳した画像を、表示部９２に表示するようにしてもよい。
　図４に、被検体Ｓに照射されるポンプ光パルス及びストークス光パルスのパルスタイミングを示す。図４に示すように、ストークス光パルスは、ｆ秒（数十ｆ秒～数百ｆ秒）のパルス幅を有し、ポンプ光パルスは、パルス伸長部３０でパルス幅が伸長されることで、ｐ秒（数ｐ秒～数十ｐ秒）のパルス幅を有する。また、ストークス光パルスとポンプ光パルスは、パルスの立ち上がりが略一致するように、光遅延部２０でポンプ光の光路長が調整されている。
　ＣＡＲＳの共鳴過程では、分子の振動エネルギーは、初段のストークス光パルスとポンプ光パルスの同時照射によりＶ＝１準位（図１参照）に励起され、後段のポンプ光パルスのみの照射により更に励起され、Ｖ＝０準位への緩和によってアンチストークス光が生成される。一方、非共鳴過程では、分子の振動エネルギーは、初段のストークス光パルスとポンプ光パルスの同時照射により仮想準位ａ（図１参照）に励起されるため、後段のポンプ光パルスのみの照射では更に励起され難くなり、アンチストークス光が生成される確率が低下する。すなわち、図４に示すように、ストークス光とポンプ光のパルスの立ち上がりを一致させつつ、ストークス光のパルス幅をポンプ光のパルス幅よりも短くして、後段の励起過程でストークス光を照射しないようにすることで、ＣＡＲＳ信号の共鳴過程／非共鳴過程比（すなわち、ＣＡＲＳ信号のＳ／Ｎ比）を向上させることができる。
　更に、ストークス光を、ＯＣＴの計測に適した数十ｆ秒～数百ｆ秒程度の超短パルスとし、当該ストークス光パルスをＯＣＴ計測光とすることで、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化における光パルスの不整合を回避し、ＣＡＲＳとＯＣＴの複合化を実現することができる。
　（第２の実施の形態）
　図５に、第２の実施の形態に係る計測装置の構成の一例を示す。なお、図５において、図２に示した構成と同様の構成については同一の符号を付し、その説明を適宜省略する。
　図４に示したように、ＣＡＲＳの初段の励起過程でのパルス幅を数十ｆ秒～数百ｆ秒としているため、Ｖ＝１準位への励起分布（population）が減少し、アンチストークス光の絶対強度が低下する。そこで、図５に示す計測装置１では、光パラメトリック発振器１４からのシグナル光ＳＧを参照光としたヘテロダイン検波を行うことで、アンチストークス信号を高感度に検出する。
　図５に示す計測装置１は、光パラメトリック発振器１４からのシグナル光ＳＧの光路長を調整するミラー１７、１８と、シグナル光ＳＧの波長を変調する光変調部１９と、ハーフミラー６３を更に含む。光変調部１９は、音響光学素子（ＡＯＭ）で構成することができる。
　シグナル光ＳＧは、ダイクロイックミラー１６を透過し、ミラー１７、１８を介して、光変調部１９に入射する。光変調部１９で波長変調されたシグナル光ＳＧは、ハーフミラー６３を透過して第１の光検出部７０に入射する。一方、被検体Ｓからのアンチストークス光ＡＳは、ハーフミラー６３で反射して第１の光検出部７０に入射する。
　ここで、上述したように、光パラメトリック発振器１４の励起光は、ポンプ光（角周波数ωｐ）の第二高調波（角周波数２ωｐ）であり、ポンプ光の角周波数ωｐと、ストークス光（光パラメトリック発振器１４のアイドラー光）の角周波数ωｓは、ωγ＝ωｐ－ωｓとなるように調整されているため、アンチストークス光の角周波数は、ωａｓ＝２ωｐ－ωｓとなり、光パラメトリック発振器１４のシグナル光の角周波数と等しくなる。
　従って、ミラー１７、１８によって、図６に示すように、シグナル光ＳＧのパルスタイミングがアンチストークス光ＡＳのパルスタイミングと一致するように調整し、且つ光変調部１９によりシグナル光ＳＧの波長をシフトすれば、シグナル光ＳＧとアンチストークス光ＡＳとが干渉して光ビートが生じ、第１の光検出部７０で検出される。第１の光検出部７０は、検出した光ビートのビート信号をアンチストークス信号として信号処理部９０に出力する。
　なお、本発明の適用は上述した実施例に限定されず、種々の変形が可能である。
１　計測装置、１０　光源部、１２　レーザー光源、１４　光パラメトリック発振器、１６　ダイクロイックミラー、１７，１８　ミラー、１９　光変調部、２０　光遅延部、２２，２４，２６　ミラー、３０　パルス伸長部３０、４０　光干渉部、４１，４２　ハーフミラー、４３，４４　ミラー、４５，４６　ハーフミラー、５０　光走査部、５２，５４　走査ミラー、６０　対物レンズ、６２　ダイクロイックミラー、６３　ハーフミラー、７０　第１の光検出部、８０　第２の光検出部、９０　信号処理部、９２　表示部

Claims (8)

  1. 　被検体に照射するポンプ光及びストークス光を発生する光源部と、
    　前記ポンプ光のパルスを伸長して、前記ストークス光のパルス幅を前記ポンプ光のパルス幅よりも短くするパルス伸長部と、
    　前記ストークス光を分割する光分割部と、
    　パルス伸長された前記ポンプ光と前記光分割部で分割された一方のストークス光とを前記被検体上で走査させる光走査部と、
    　前記被検体からのアンチストークス光を検出して検出信号を出力する第１の光検出部と、
    　前記光分割部で分割された他方のストークス光と、前記被検体からのストークス光の反射光との干渉光を検出して検出信号を出力する第２の光検出部と、
    　前記第１の光検出部からの検出信号と、前記第２の光検出部からの検出信号に基づいて、画像生成処理を行う信号処理部とを含む、計測装置。
  2. 　請求項１において、
    　パルス伸長された前記ポンプ光は、ピコ秒パルスレーザー光であり、前記ストークス光は、フェムト秒パルスレーザー光である、計測装置。
  3. 　請求項１又は２において、
    　前記光源部が、
    　前記ポンプ光の第二高調波を励起光とする光パラメトリック発振器を備え、前記光パラメトリック発振器のアイドラー光を前記ストークス光として発生する、計測装置。
  4. 　請求項３において、
    　前記光パラメトリック発振器のシグナル光の波長を変調する光変調部を更に含み、
    　前記第１の光検出部が、
    　波長変調された前記シグナル光と、前記被検体からのアンチストークス光との干渉光を検出して検出信号を出力する、計測装置。
  5. 　被検体に照射するポンプ光及びストークス光を発生する光発生手順と、
    　前記ポンプ光のパルスを伸長して、前記ストークス光のパルス幅を前記ポンプ光のパルス幅よりも短くするパルス伸長手順と、
    　前記ストークス光を分割する光分割手順と、
    　パルス伸長された前記ポンプ光と前記光分割手順で分割された一方のストークス光とを前記被検体上で走査させる光走査手順と、
    　前記被検体からのアンチストークス光を検出して検出信号を出力する第１の光検出手順と、
    　前記光分割手順で分割された他方のストークス光と、前記被検体からのストークス光の反射光との干渉光を検出して検出信号を出力する第２の光検出手順と、
    　前記第１の光検出手順で出力した検出信号と、前記第２の光検出手順で出力した検出信号に基づいて、画像生成処理を行う信号処理手順とを含む、計測方法。
  6. 　請求項５において、
    　パルス伸長された前記ポンプ光は、ピコ秒パルスレーザー光であり、前記ストークス光は、フェムト秒パルスレーザー光である、計測方法。
  7. 　請求項５又は６において、
    　前記光発生手順では、
    　前記ポンプ光の第二高調波を励起光とする光パラメトリック発振器のアイドラー光を前記ストークス光として発生する、計測方法。
  8. 　請求項７において、
    　前記光パラメトリック発振器のシグナル光の波長を変調する光変調手順を更に含み、
    　前記第１の光検出手順では、
    　波長変調された前記シグナル光と、前記被検体からのアンチストークス光との干渉光を検出して検出信号を出力する、計測方法。
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