JP7477933B2 - Ｃａｒｓスペクトルの取得方法およびシステム - Google Patents

Description

本発明は、ＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（分光））スペクトルを取得するシステムおよび方法に関する。

米国公開公報第２０１０／００４６０３９号には、第１の光源、第２の光源、モジュレーターシステム、集光光学系、光ディテクター、およびプロセッサーを含む顕微鏡撮像システムが開示されている。第１の光源は、第１の中心光周波数ω１で第１のパルス列を供給するためのものである。第２の光源は、第２の中心光周波数ω２で第２のパルス列を供給するためのものであり、ω１とω２との差が焦点体積内のサンプルの振動周波数と共鳴する。第２のパルス列は、第１のパルス列と時間的に同期している。モジュレーターシステムは、少なくとも１００ｋＨｚの変調周波数ｆで第２のパルス列のビーム特性を変調する。集光光学系は、第１のパルス列と第２のパルス列とを共通の集光体積に向けて集光するためのものである。光ディテクターは、変調されている第２のパルス列をブロックすることにより、共通の焦点体積を通して送信または反射された第１のパルス列の実質的に全ての光周波数成分の積分された強度を検出するためのものである。プロセッサーは、変調周波数ｆにおいて、共通の焦点体積で第１のパルス列と第２のパルス列との非線形的な相互作用に起因して生成された第１のパルス列の実質的に全ての光周波数成分の積分強度の変調を検出し、顕微鏡撮像システム用の画像の画素を提供するためのものである。

ラマン顕微鏡は、赤外顕微鏡に比べて光学解像度と浸透深度が向上しているが、感度はかなり低い。２つのパルスレーザービーム（ポンプビームとストークスビーム）を使用するＣＡＲＳ顕微鏡では、コヒーレントな（可干渉性の、位相がそろった）励起により散乱信号の絶対的な強度が大幅に増加する。しかしながら、ＣＡＲＳプロセスは、振動する非共鳴のサンプルからの高レベルのバックグラウンドも励起する。このような非共鳴バックグラウンド（ＮＲＢ）は、希釈サンプルからの共鳴信号のＣＡＲＳスペクトルを歪めるだけでなく、レーザーノイズを伝えるため、分光と感度の両方の観点からＣＡＲＳ顕微鏡の応用を著しく制限する。

時間分解コヒーレント反ストークスラマン散乱、あるいは時間遅延コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＴＤ－ＣＡＲＳ）顕微鏡は、ストークス光とポンプ光のパルスに加えてプローブ光パルスを用いるもので、仮想的な電子遷移とラマン遷移の時間応答の差を利用して非共鳴バックグラウンドを抑制する手法としても知られている。プローブ光のパルスは、ストークス光とポンプ光のパルスに対して遅延を持ち、ストークスパルス光とポンプパルス光とによる励起のそれぞれに対しプローブパルスが追従する。プローブパルスを遅延させることにより、ＮＲＢ（非共鳴バックグランド）の強度をなくすことができるが、共鳴特性（レゾナントフィーチャー、共鳴成分）の強度も減少する。

ＣＡＲＳを用いた定量分析にはリファレンス（参照する対象、基準）が必要である。定量結果を得るためには、ＭＥＭ（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｅｎｔｒｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄ、マキシマムエントロピー法）アルゴリズムを適用することができるが、サンプルの変更を含む複数のステップが必要である。ＭＥＭはリファレンスなしで行うこともできるが、これは高濃度の場合のみ可能である。低濃度または最大感度での測定のためには、同じ条件下でのリファレンスが必要である。つまり、サンプル測定（例えばグルコース溶液）に加えて、全く同じ条件下での正規化（ノーマライジング）の手順が必要となるが、正規化処理のために、水を満たした別のキュベットが必要となり、それはサンプルを変更することとなり、ＣＡＲＳ光学系の感度やその他の条件が変更される可能性がある。このため、リファレンスを用いた測定方法を様々なアプリケーションに容易に適用できるシステムが求められている。

本発明の一態様は、（ｉ）ストークス光およびポンプ光のパルスと、ストークス光およびポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅を有するプローブ光のパルスとをターゲットの一部に照射することにより、第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することであって、ストークス光およびポンプ光を、プローブ光のパルス幅内に照射することにより第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することと、（ｉｉ）上記と同じ条件で、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光のパルスを、ただし、ストークス光およびポンプ光のパルスとプローブ光のパルスの時間関係のみを変化させてターゲットの一部に照射することにより、第１のＣＡＲＳスペクトルのリファレンスとなる第２のＣＡＲＳスペクトルを取得し、第１のＣＡＲＳスペクトルから共鳴成分を抽出することとを有する方法である。

本発明者のシミュレーションの結果によれば、ＮＲＢ（Ｎｏｎ－Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ、非共鳴バックグランド）は瞬時の電子応答であり、共鳴成分（共鳴特徴）は、よりゆっくりと生成され、減衰時間が長いとともに、生成（ビルドアップ）にも時間を要し（線幅が狭くなる）、一方、減衰時間が短いものは応答を生成する時間は短くなる（線幅がより広くなる）。すなわち、ＣＡＲＳ応答信号を得るために、時間的に広いまたは幅の大きいパルス幅のプローブ光のパルスを用い、ターゲット分子の振動を励起するための、プローブ光のパルスとストークス光およびポンプ光のパルスとの時間関係を変化させることのみで、共鳴特性（共鳴成分）と非共鳴特性（非共鳴成分）の両方を持つ第１のＣＡＲＳスペクトルと、ほぼ純粋な非共鳴特性、または非共鳴特性に対して共鳴特性が非常に少なく、非共鳴特性のリファレンスとして十分な第２のＣＡＲＳスペクトルとを含むＣＡＲＳスペクトルのセットを取得できる。そのため、キュベットなどのターゲット（対象サンプル）を変えることなく、ストークス光およびポンプ光のパルスに対するプローブ光のパルスの時間関係を変えるだけで、定量分析用のリファレンススペクトル（基準となるスペクトル）を第２のＣＡＲＳスペクトルとして得ることができる。これにより、ＣＡＲＳを用いた微量分析の精度を大幅に向上させることができ、また、非侵襲的な分析の場合、生体そのものからリファレンススペクトルを得ることができる。

第１のＣＡＲＳスペクトルを取得するステップは、プローブ光のパルスのパルス幅内でストークス光およびポンプ光のパルスと重なるように、ストークス光およびポンプ光のパルスに対して第１の相対的時間関係を有するプローブ光のパルスを照射（出射）することを含み、第２のＣＡＲＳスペクトルを取得するステップは、プローブ光のパルスのパルス幅内でストークス光およびポンプ光のパルスと重なるように、ストークス光およびポンプ光のパルスに対して、第１の相対的時間関係に対して負の遅延を有する第２の相対的時間関係を有するプローブ光のパルスを照射することを含んでもよい。ＴＤ－ＣＡＲＳスペクトルを得るためには正の遅延を有する遅延したプローブパルスが使用されるのに対し、本方法では負の遅延を有する逆に遅延したプローブパルスを使用することができ、これにより共鳴成分のない、またはほとんど共鳴成分のないリファレンススペクトルを得ることができる。

第２のＣＡＲＳスペクトルを取得するステップは、プローブ光のパルスをストークス光およびポンプ光のパルスよりも早いタイミングで照射することを含んでもよい。すなわち、プローブ光のパルスに続いて、励起のためのストークス光のパルスおよびポンプ光のパルスが照射されてもよい。典型的には、第１のＣＡＲＳスペクトルを取得するステップは、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光の各パルスを実質的に、ほぼ同時に照射することを含み、第２のＣＡＲＳスペクトルを取得するステップは、ストークス光およびポンプ光のパルスを、プローブ光のパルスのパルス幅の実質的に、ほぼ最後に照射することを含んでもよい。

本方法は、さらに、２ＤのＣＡＲＳ顕微鏡撮像を生成するために、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光でターゲットを走査し、第１のＣＡＲＳスペクトルおよび第２のＣＡＲＳスペクトルを各ピクセル（画素）で取得することを含んでもよい。本方法は、さらに、３ＤのＣＡＲＳ顕微鏡撮像を生成するために、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光でターゲットを３次元的に走査し、第１のＣＡＲＳスペクトルおよび第２のＣＡＲＳスペクトルを各ボクセル（体積要素）において取得することを含んでもよい。

本発明の異なる態様の１つは、（ｉ）ストークス光およびポンプ光のパルスと、ストークス光およびポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅を有するプローブ光のパルスとを、ストークス光およびポンプ光のパルスとプローブ光のパルスとの間の時間関係のみを変化させながら、プローブ光のパルスのパルス幅内で重なるようにターゲットの一部に照射することにより、ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するステップと、（ｉｉ）取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することにより、共鳴成分を抽出するステップとを含む方法である。ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するステップは、ストークス光およびポンプ光のパルスに対して負の遅延（ｉｎｖｅｒｓｅ ｄｅｌａｙ、逆遅延）を備えたプローブ光のパルスをターゲットの一部に照射することを含んでもよい。

本発明のさらに異なる態様の１つは、（ｉ）ストークス光およびポンプ光のパルスと、ストークス光およびポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅を有するプローブ光のパルスとをターゲットの一部に照射するように構成された光路と、（ｉｉ）プローブ光のパルス幅の範囲内で、プローブ光のパルスとストークス光およびポンプ光のパルスとの相対的な時間関係を制御するように構成されたモジュレーターと、（ｉｉｉ）ストークス光、ポンプ光およびプローブ光のパルスによって生成されたＣＡＲＳスペクトルを検出し、相対的な時間関係に関連したＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成されたディテクターとを含むシステムである。

本発明のさらに異なる態様の１つは、上述したシステムをコンピューターにより動作させるために非一時的な記録媒体に格納されたコンピュータープログラムまたはコンピュータープログラム製品である。このコンピュータープログラム（プログラム製品）は、ストークス光およびポンプ光のパルスに対して負の遅延でプローブ光のパルスをターゲットに照射するように相対的な時間関係を制御するための命令を含んでもよい。このプログラムは、ストークス光およびポンプ光のパルスに対して負の遅延を備えたプローブ光のパルスをターゲットに照射する相対的な時間関係を設定するようにモジュレーターを制御する命令を含んでもよい。このプログラムは、ストークス光およびポンプ光のパルスよりも早いタイミングでプローブ光のパルスを照射する相対的な時間関係を設定するようにモジュレーターを制御するための命令を含んでもよい。

本明細書の実施形態は、図面を参照して以下の詳細な説明から、よりよく理解されるであろう。
図１は、本発明のシステムの一実施形態を示す。 図２は、典型的なＣＡＲＳスペクトルを示す。 図３は、プローブ光の遅延を変化させた場合のＣＡＲＳスペクトルの例を示す。 図４は、ＭＥＭアルゴリズムを用いた解析方法の一例を示す。 図５は、ＣＡＲＳ測定とインターナルリファレンス測定の例を示す。 図６は、インターナルリファレンス法の概要を示す。 図７は、正規化する方法の概要を示す。 図８は、インターナルリファレンス法による結果の例を示す。 図９は、インターナルリファレンス法を用いた結果の異なる例を示す。 図１０は、モジュレーターの異なる例を示す。 図１１は、インターナルリファレンス法のフロー図を示す。

本明細書の実施形態ならびにその様々な特徴および有利な詳細は、添付した図面および以下の説明に詳述される非限定的な実施形態を参照して、より詳しく説明される。周知の構成要素および処理技術の説明は、本明細書の実施形態を不必要に不明瞭にしないように省略される。本明細書で使用される例は、単に、本明細書の実施形態が実施され得ることの理解を容易にし、当業者が本明細書の実施形態を実施することを可能にすることを意図したものである。したがって、実施例は、本明細書における実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

図１は、本発明の一実施形態によるシステム１を示す。システム１は、ターゲット５のある部分（一部）５ａに照射するようにストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３の各パルスを供給（出射）し、ターゲット（オブジェクト、サンプル）５の一部（ある部分）５ａにおいてＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）信号（ＣＡＲＳスペクトル、ＣＡＲＳライト）１５を発生させるように構成された光学モジュール（光学系、光学システム）１０を含む。システム１は、測定装置、分析装置、モニタリング装置、モニターおよび用途に応じて他の装置として使用することができる。光学系１０は、ＣＡＲＳを用いて、キュベット内のサンプルや人体などの測定対象物５の表面や内部の状態や成分を示すデータを取得する。

このシステムは、さらに、ストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３でターゲット５をスキャン（走査）し、レンズ２５および他の光学要素を通してターゲット５からＣＡＲＳ光１５を取得するように構成されたスキャナー（走査インターフェース）６０と、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスに対するプローブ光１３のパルスの相対的な時間関係を制御するように構成されたモジュレーター（変調器、調整装置）７０と、分析のためにＣＡＲＳ光１５を検出するように構成されたディテクター（検出器、検出装置）５０と、システム１およびモジュール、例えば、スキャナー６０、モジュレーター７０、レーザー光源３０などを制御するように構成されたコントローラー（制御装置）５５とを含む。スキャニングモジュール６０は、キュベット、非侵襲的サンプラー、侵襲的サンプラー、流路、またはフィンガーチップ（指先用）スキャニングインターフェースモジュールのようなウェアラブルスキャニングインターフェースであってもよい。コントローラー５５は、レーザー光源３０を制御するレーザーコントローラー５８と、ＣＡＲＳ（ＣＡＲＳスペクトル）によって内部組成（成分）を分析する分析器５６とを含む。分析器５６は、ＣＡＲＳ光１５が生成されるターゲット５の部分（部位）５ａを点検するための複数のモジュール５６ａ～５６ｄを含んでいてもよい。コントローラー５５のメモリーに格納されたプログラム（プログラム製品、ソフトウェア、アプリケーション）５９は、メモリー、ＣＰＵ等のコンピューター資源を用いてコントローラー５５上の処理を実行するために提供される。なお、プログラム（ソフトウェア）５９は、プロセッサーやコンピューターによって読み取り可能な他の記憶媒体（非一時的記録媒体）として提供されてもよい。

光学系１０は、ストークス光（ストークスビームパルス、第１の光パルス）１１およびポンプ光（ポンプビームパルス、第２の光パルス）１２用に第１の波長１０４０ｎｍの第１のレーザーパルス３０ａを発生させるためのレーザー光源３０を含む。好ましいレーザー光源３０の１つは、ファイバーレーザーである。第１のレーザーパルス３０ａは、数１０～数１００ｍＷの１～数１００ｆｓ（フェムト秒）オーダーのパルス幅を有し、フェムト秒オーダーのパルス幅を有するストークス光１１およびポンプ光１２のパルス（複数のパルス）を生成する。ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスのパルス幅ＰＷ１は、１～数１００ｆｓであってもよく、例えば、１～９００ｆｓであってもよく、１０～６００ｆｓであってもよく、５０～４００ｆｓであってもよい。光学系１０は、レーザー光のパルスを分離、組み合わせる（合波する）ための１つまたは複数の光路を形成するためのレンズ、フィルター、ミラー、ダイクロイックミラー、プリズムなどの複数の光学素子２９を含む。

光学系１０は、ポンプ光パルス１２と共通する第１のレーザーパルス３０ａから波長１０８０～１３００ｎｍの第１の波長範囲Ｒ１を有する広帯域（ブロードバンド）の複数のストークス光パルス（第１の光パルス）１１をＰＣＦ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｆｉｂｅｒ、ファイバー）２１ａを介して供給するように構成されたストークス光路（第１の光路、ストークスユニット）２１を含む。光学系１０は、ストークス光１１に共通する第１のレーザーパルス３０ａからの第１の波長範囲（第１の範囲）Ｒ１よりも短い波長１０７０ｎｍの第２の波長範囲Ｒ２を有する複数のポンプ光パルス（第２の光パルス）１２を供給するように構成されたポンプ光路（第２の光路、ポンプユニット）２２を含む。光学系１０は、経路２１により供給される複数のストークス光パルス１１と、経路２２により供給される複数のポンプ光パルス１２とを光入出力部（レンズ系）２５に供給する共通光路を含む。これらの光路には、各光路を構成するために必要なフィルター、ファイバー、ダイクロイックミラー、プリズム等の複数の光学素子が含まれる。後述する光路についても同様である。

レーザー光源３０は、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２のための第１の波長１０４０ｎｍの第１のレーザーパルス３０ａに加えて、プローブ光パルス（プローブ光、第３の光パルス）１３のための第２の波長７８０ｎｍの第２のレーザーパルス３０ｂを生成する。第２のレーザーパルス３０ｂは、ピコ秒オーダーのパルス幅を有するプローブ光１３の複数のパルスを生成するために、数１０～数１００ｍＷの１～数１０ｐｓ（ピコ秒）オーダーの複数のパルスを含んでもよい。プローブ光１３のパルスのパルス幅ＰＷ２は、１～数１０ｐｓであってもよく、例えば、１～９０ｐｓであってもよく、１～５０ｐｓであってもよく、２～１０ｐｓであってもよい。波長７８０ｎｍの第２のレーザーパルス３０ｂは、波長１５６０ｎｍのソースオシレーター（光源発振器）から発生させてもよい。光学系１０は、ストークス光路２１およびポンプ光路２２に加えて、第２の波長範囲Ｒ２よりも短い波長７８０ｎｍの第３の波長範囲Ｒ３を有する複数のプローブ光パルス（プローブ光パルス、プローブパルス、第３の光パルス）１３を供給するように構成されたプローブ光路（第３の光路、プローブユニット）２３を含む。

光学系１０は、さらに、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２およびプローブ光パルス１３をターゲット５に同軸的に出力し、共通の光路を介してターゲット５からＣＡＲＳ光１５を取得するように構成された光入出力ユニット（光学ユニット）２５を含む。典型的な光入出力ユニット２５は、ターゲット５と対向し、後方ＣＡＲＳ光パルス（後方に出射されたＣＡＲＳ光パルス、Ｅｐｉ－ＣＡＲＳ）１５を取得する対物レンズまたはレンズ系（レンズシステム）である。光学系１０は、前方ＣＡＲＳ光（前方に出射されたＣＡＲＳ光）を得るように構成された光路を含んでもよい。この光学系（光学システム）１０では、複数のプローブ光パルス１３によってそれぞれ生成された波長範囲Ｒ３よりも短い波長範囲である６８０～７６０ｎｍの複数のＣＡＲＳ光パルス１５が取得され、ディテクター５０によって検出される。

光学系１０は、プローブ光１３のパルス幅ＰＷ２の範囲内で、プローブ光１３のパルスと、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスとの間の相対的な時間関係を制御するように構成されたモジュレーター（変調ユニット、時間遅延ユニット）７０を含む。典型的には、モジュレーターは、プローブ光パルス１３の照射のタイミングと、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２の照射のタイミングとの間の時間差Δｔを制御（変化、設定、変調）する。モジュレーターは、時間遅延ステージ（時間遅延ユニット）７１と、コリメーター７２と、モーターやピエゾなどのアクチュエーター７３とを含み、プローブ光パルス１３の光路（光路の長さ）を変調することができるものであってもよい。モジュレーター７０は、ＬＣ－ＳＬＭ（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｐａｔｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、液晶空間光モジュレーター）、ＡＷＧ（Ａｒｒａｙｅｄ ｗａｖｅ－ｇｕｉｄｅ ｇｒａｔｉｎｇ、アレイ導波路回折格子）等を含み、コリメーター間の距離を制御することができるものであってもよい。モジュレーター７０は、プローブ光１３の光路に加えて、またはプローブ光１３の光路の代わりに、ストークス光１１およびポンプ光１２の光路を制御してもよい。

モジュレーター７０のプローブ光１３のパルスとストークス光１１およびポンプ光１２のパルスとの相対的な時間関係（時間差、時間遅れ）Δｔｓは、コントローラー５５内のタイミングコントローラー（タイミング制御器、タイミングモジュール）５６ｔの制御下で変更したり、設定したりすることができる。プローブ光路２３は、モジュレーター７０を用いて、光入出力部２５を介してターゲット５の部位５ａに照射するストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２を出射するタイミングに対する時間差Δｔｓが異なる、典型的には３種類（型）のプローブ光パルス１３ａ、１３ｂ、および１３ｃを供給することができ、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルス光による励起から／に対し、時間的関係Δｔｓがマイナスで（負の）数１０００ｆｓ（数ピコ秒）から０、時間的関係Δｔｓが０、さらに、時間的関係Δｔｓが０からプラスで（正の）数１０００ｆｓ（数ピコ秒）またはそれ以上に遅延した、異なる時間的関係Δｔｓにより生成される、典型的には３種類（タイプ）のＣＡＲＳパルス１５ａ、１５ｂ、および１５ｃを得ることができる。

コントローラー５５は、さらに、上記の３種類のモードに対応して、ターゲットＣＡＲＳスペクトル取得モジュール（ターゲットＣＡＲＳ取得モジュール、ターゲットＣＡＲＳ取得装置）５６ａ、リファレンスＣＡＲＳ取得モジュール（内部リファレンス（インターナルリファレンス）取得モジュール、内部リファレンス取得装置）５６ｂおよびＴＤ－ＣＡＲＳ取得モジュール（ＴＤ－ＣＡＲＳ取得装置）５６ｃを含む。ターゲットＣＡＲＳ取得モジュール５６ａは、タイミングモジュール５６ｔを介してモジュレーター７０を制御し、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスと、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスのパルス幅ＰＷ１よりも大きいパルス幅ＰＷ２のプローブ光１３ａの各パルスとを、ターゲット５の一部５ａに照射することにより、第１のＣＡＲＳスペクトル（ターゲットＣＡＲＳスペクトル）１５ａを取得する。ターゲットＣＡＲＳ取得モジュール５６ａは、ストークス光１１およびポンプ光を、プローブ光１３のパルス幅ＰＷ２内でターゲット５に照射することにより、一般的にはストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３ａの各パルスをターゲット５に時間差なく（遅延なく）実質的に、ほぼ同時に照射することにより、ＣＡＲＳスペクトル１５ａを取得する。

インターナルリファレンス取得モジュール５６ｂは、タイミングモジュール５６ｔを介してモジュレーター７０を制御し、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスを、プローブ光１３のパルス幅ＰＷ２内において、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａを取得するときと同一の条件下で、ただし、プローブ光１３のパルスとの時間関係Δｔｓのみを変化させて、プローブ光１３ｂのパルスとともにターゲット５の部位５ａに照射し、第２のＣＡＲＳスペクトル（インターナルリファレンスＣＡＲＳスペクトル、内部基準スペクトル、内部参照スペクトル）１５ｂを取得することにより、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａから共鳴成分（共鳴特性）Ｒｆを抽出可能とする。すなわち、ターゲットＣＡＲＳ取得モジュール５６ａは、モジュレーター７０を用いてストークス光１１およびポンプ光１２のパルスの照射（照射のタイミング）に対して、プローブ光１３のパルス幅ＰＷ２内の第１の相対的時間関係（第１の遅延、第１の時間遅延）Δｔ１で、それらの照射と重なるようにプローブ光１３のパルス１３ａを照射し、ターゲットＣＡＲＳスペクトル（第１のＣＡＲＳスペクトル）を生成し、また、インターナルリファレンス取得モジュール５６ｂは、モジュレーター７０を用いて、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスの照射に対し、第１の遅延Δｔ１に対して負の遅延（逆遅延）を有する第２の相対的時間関係（第２の遅延、第２の時間遅延）Δｔ２であるが、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスの照射とプローブ光１３ａのパルスのパルス幅ＰＷ２内で重なる範囲の第２の相対的時間関係Δｔ２で、プローブ光１３ｂのパルスを照射し、インターナルリファレンススペクトル（第２のＣＡＲＳスペクトル）１５ｂを生成する。したがって、インターナルリファレンス取得モジュール５６ｂは、モジュレーター７０を制御して、プローブ光１３ｂのパルスをストークス光１１およびポンプ光１２のパルスよりも早いタイミングで照射する。

典型的には、ターゲットＣＡＲＳ取得モジュール５６ａは、モジュレーター７０を制御して、ストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３ａの各パルスを実質的に同時に照射し、第１の遅延Δｔ１を０、または実質的に０とする。また、インターナルリファレンス取得モジュール５６ｂは、モジュレーター７０を制御して、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスを、プローブ光１３ｂのパルスのパルス幅ＰＷ２の実質的な終端（ほぼ最終のタイミング）で照射し、第２の遅延Δｔ２をＰＷ２と同等、または実質的に同等とする。

ＴＤ－ＣＡＲＳ取得モジュール５６ｃは、タイミングモジュール５６ｔを介してモジュレーター７０を制御し、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスの照射に対し、第１の遅延時間Δｔ１に対して正の遅延時間を有する第３の相対的時間関係（第３の遅延時間）Δｔ３でストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３ｃの各パルスをターゲット５の部位５ａに照射してＴＤ－ＣＡＲＳスペクトル１５ｃを取得する。したがって、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスとプローブ光１３ｃのパルスとが実質的に重なることはない。

ディテクター５０は、ストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３ａ、１３ｂ、１３ｃのパルスによって生成されたＣＡＲＳスペクトル１５ａ、１５ｂ、および１５ｃを検出して、相対的な時間関係Δｔ１、Δｔ２、およびΔｔ３に関連付けられたスペクトル１５ａ、１５ｂ、および１５ｃを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成されている。ＣＡＲＳスペクトル１５のセットは、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス１５ｂを含み、インターナルリファレンス１５ｂをリファレンス（参照、基準）または比較（正規化、減算）することによって、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａから共鳴成分（共鳴の構成要素）Ｒｆを抽出することができる。

コントローラー５５は、さらに、ターゲット５の部位５ａの特徴または組成を分析するために、インターナルリファレンス１５ｂを参照することによって、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａから共鳴成分（共鳴特性）Ｒｆを抽出するように構成された抽出モジュール（抽出器）５６ｄを含んでもよい。抽出モジュール５６ｄは、スキャナー６０を用いてターゲット５をスキャンする機能を含んでいてもよい。スキャナー６０は、ストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３ａおよび１３ｂを用いてターゲット５を走査し、各画素におけるターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス１５ｂを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成される。分析器５６は、共鳴特性Ｒｆを有するピクセル（画素）単位でターゲット５の画像（２次元画像）を生成する画像生成モジュール（画像生成器）５６ｅを含んでもよい。したがって、システム１は、ＣＡＲＳ分光法とＣＡＲＳ顕微鏡法の機能を有することができる。

ＣＡＲＳスペクトロスコピー（分光法）では、ストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３の焦点またはスポットを移動させることにより、システム１は、ターゲット５の深さプロファイルを生成することができる。したがって、スキャナー６０は、ストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３ａおよび１３ｂでターゲット５を３次元的に走査して、各ボクセル（体積要素）におけるターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス１５ｂを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成されてもよい。分析器５６は、共鳴特性Ｒｆを有するボクセルによってターゲット５の３Ｄ画像を生成する３Ｄ画像生成モジュール（３Ｄ画像生成器）５６ｆを含んでもよい。したがって、システム１は、ＣＡＲＳ３Ｄ顕微鏡の機能を有することができる。

広帯域のストークスパルス（ストークスビーム）１１を用いることで、一度に多くの共鳴を励起し、１ショットでフルスペクトルを記録することができる。したがって、ターゲット（サンプル）５を走査することにより、各ショットで各ピクセルまたはボクセルに広いＣＡＲＳスペクトル１５ａおよび１５ｂを提供することができ、短時間で２Ｄまたは３ＤのＣＡＲＳ撮像を行うことができる。また、本システム１を用いることで、組織などを含むターゲット５内の、実際の測定位置からの（測定位置を変えずに）、通常のＣＡＲＳ信号１５ａに加えて、インターナルの非共鳴リファレンス１５ｂを各ピクセルまたはボクセルで記録することができる。したがって、発生、光路、散乱、サンプルの不均一性、その他のアーチファクトの違いが相殺され、システム１によって感度が向上したＣＡＲＳスペクトルが生成される。

図２は、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスと、時間遅延Δｔ１（０ｆｓ）が設定されたプローブ光１３のパルス（図２（ａ））とにより生成された、広帯域の非共鳴バックグラウンド（ＮＲＢ）と共鳴特性（Ｒｆ）とを含む典型的なＣＡＲＳスペクトル（光、信号、スペクトル、分光）（図２（ｂ））を示している。すなわち、ストークスパルス１１、ポンプパルス１２、およびプローブパルス１３が同時に照射（出射）され、プローブ光パルス１３のパルス幅ＰＷ２内の範囲で、ＣＡＲＳ信号１５の時間遅延による特徴（組成、成分）が取得される。ストークスパルス１１とポンプパルス１２は時間的に重なっており、プローブ光パルス１３の位置を制御することができる。ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスと、プローブパルス１３との時間差（時間関係、時間遅延）Δｔは任意に選択される。図２（ａ）では、時間遅延ΔｔはΔｔ１（ｔ＝０）であり、このため、ストークスパルス１１とポンプパルス１２はプローブパルス１３の開始（最初に到達）の部分１３ｘと重なり、その後、プローブパルス１３の残りは最終（最後に到達）の部分１３ｙを含めて遅れて到達する。

図３は、プローブ光１３の遅延（時間関係）Δｔｓを変化させた場合のシミュレーション結果としてのＣＡＲＳ光（信号、スペクトル、分光）１５の複数のセットを示している。図３（ｃ）は、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａの例を示し、ストークスパルス１１、ポンプパルス１２、およびプローブパルス１３ａを同時に照射した場合（時間遅延ΔｔをΔｔ１（Δｔ＝０）とした場合）に生成される。図３（ａ）および（ｂ）は、インターナルリファレンス１３ｂの例を示し、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と、負の遅延時間Δｔ２が設定されたプローブパルス１３ｂとにより生成される。すなわち、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２は、プローブパルス１３ｂの照射よりも遅れて照射されるが、プローブパルス１３ｂと重なるように照射される。典型的なインターナルリファレンス１５ｂは、図３（ａ）に示すように、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２が、プローブパルス１３ｂの終端（最終の部分、最終の端）と重なるように照射されたときに取得される。

図３（ｄ）および図３（ｅ）は、ＴＤ－ＣＡＲＳスペクトル１５ｃの例を示し、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と、正の遅延Δｔ３を持つプローブパルス１３ｃとにより生成される。すなわち、プローブパルス１３ｃは、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２の照射よりも遅れて照射され、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２とは重ならない。典型的なＴＤ－ＣＡＲＳ１５ｃは、図３（ｅ）に示すように、ほぼ共鳴成分（共鳴成分、共鳴特性）Ｒｆのみで形成されているが、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス１５ｂと比較して強度が非常に小さいものが取得される。

図３（ａ）～（ｅ）に示すように、共鳴特性（Ｒｆ）に相当する減衰時間の長い分子振動変化などの現象は、ビルドアップ（構築、増大、信号の高まり）に長い時間を必要とし、ＮＲＢに相当する減衰時間の短い分子振動変化などの現象は、ビルドアップに短い時間を必要とする。つまり、ＮＲＢは瞬時の電子応答である。共鳴特性（Ｒｆ）はビルドアップが遅く、ＴＤ－ＣＡＲＳのシミュレーション結果でも同様の傾向を示している。また、減衰時間が長いと、ビルドアップが長くなり（信号の線幅が狭くなる）、減衰時間が短いと応答のビルドアップにかかる時間が短くなる（信号の線幅が広くなる）。そこで、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と同時にプローブパルス１３ａを照射した場合には、ＮＲＢとの共鳴特性が大きいＣＡＲＳスペクトル１５ａを取得でき、プローブパルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２の最後の時点でストークスパルス１１およびポンプパルス１２を照射した場合には、ほぼＮＲＢ（本明細書において、ほぼＮＲＢまたは専らＮＲＢを含むスペクトルとは、ＮＲＢの基準となるのに十分な程度に共鳴成分を含まないスペクトルを示す）のＣＡＲＳスペクトルであるインターナルリファレンス１５ｂを取得できる。

ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と重ならないようにプローブ光１３ｃを照射すると、比較的大きな共鳴特性を有するが、信号強度が非常に小さいＴＤ－ＣＡＲＳ光（スペクトル）１５ｃが取得される。すなわち、ＴＤ－ＣＡＲＳスペクトル１５ｃは共鳴特性を持つだけでなく、非共鳴の寄与に対する共鳴の寄与の比率が大きくなっている。遅延が大きくなると、ほとんど共鳴寄与のみのＴＤ－ＣＡＲＳスペクトル１５ｃが取得される。これは減衰時間が異なるためである。非共鳴信号は励起（ポンプ１２およびストークス１１）後、非常に速く減衰し、共鳴特性（共鳴成分）は通常、よりゆっくりと減衰する（共鳴の線幅に依存する）ので、プローブ１３が到着したときには、相対的にではあるが、非共鳴に対してより多くの共鳴信号が残っている。

図４にＣＡＲＳスペクトルを用いた定量分析方法（アルゴリズム）の一例を示す。従来の定量分析では、サンプル／水のノルム（サンプルを、水を基準（リファレンス）として正規化した情報）１７を推定するために水のスペクトルなどのリファレンススペクトル１６が必要であり、キュベットを交換する際に検出条件が変化して定量分析の感度が低下する可能性があった。定量結果を得るために、ＭＥＭ（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｅｎｔｒｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄ、最大エントロピー法）アルゴリズムが適用され、その最初のステップは正規化のプロセスであり、（ａ）サンプル（例：グルコース溶液）の測定と、（ｂ）全く同じ条件下での水を測定という２つの測定を含む。これらの測定のためには、サンプルを変える必要がある。感度は絶対的に安定した条件に依存するので、スペクトルなどに変化があれば感度は制限される。同じキュベットを水とサンプルの両方に使うことは可能だが不便であり、さらにキュベットを変えること自体が感度に限界をもたらす要因になる。

図５および図６に本出願のインターナルリファレンス（内部参照、内部基準）技術（方法）の基本を示す。図５に示すように、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２に対するプローブパルス１３の時間関係Δｔｓを変化させることにより、全く同じ実験条件（焦点、散乱、吸収、光路など）で、サンプルとキュベットを変えることなく、ＮＲＢとの共鳴特性を持つＣＡＲＳスペクトル１５ａ（図５（ｂ））と、ＮＲＢのみのＣＡＲＳスペクトル１５ｂ（図５（ａ））とを取得することができる。

図６に示すように、遅延のないプローブパルス１３ａにより、ＮＲＢと共鳴特性とを持つＣＡＲＳスペクトル１５ａが取得され、負の遅延を持つプローブパルス１３ｂにより、ＮＲＢのみを含むＣＡＲＳスペクトル１５ｂが、サンプルおよびキュベットを変えることなく取得される。ＮＲＢのみのＣＡＲＳスペクトル１５ｂをリファレンス信号（インターナルリファレンス）として用いることにより、共鳴特性のみを含むＣＡＲＳスペクトル１５ｄを得ることができる。インターナルリファレンススペクトル１５ｂは、サンプルの測定に関する細かな部分を含めて、吸収、信号経路などの実験条件が同じ状態で取得でき、水を参照することは冗長であり、特に高濃度および中濃度では冗長である。さらに、このインターナルリファレンス法は、前方散乱ＣＡＲＳおよび後方散乱ＣＡＲＳに適用可能である。この方法では、水のリファレンスは高／中濃度サンプルでは冗長かもしれないが、補正により精度をさらに向上するという点では、水の測定を行うことで測定結果が改善される可能性がある。この方法は、様々な実装（例えば、ｋＨｚスイッチングに追従し、信号の急激な変化にも追従する）が可能である。

図７は、低濃度における非共鳴ＩＮＲ（ＩＮｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、内部リファレンス）を用いた計算と補正の例を示す。上部の図は補正のための水の測定例、下部の図はサンプルの測定例である。従来、水のスペクトルでサンプルのスペクトルを正規化するためには、フォーマット１０２の補正を適用する必要があった。しかしながら、本手法では、フォーマット１０１を用いて補正を行うことができる。サンプルの測定と水の測定では、プローブの移動によるスペクトルの変化が同じであるため、フォーマット１０１を使用することで、変化を正規化することができ、水（非共鳴サンプル）とサンプルの測定を全く異なる条件で行うことができる。なお、水の測定はスペクトル変化を得ることだけが目的である。

図８および図９は、本出願で開示するインターナルリファレンス法を適用した実験結果を示す。図８は、水のリファレンス用キュベットを用いずに、インターナルリファレンススペクトルを用いてグルコース成分を検出したＣＡＲＳスペクトルである。図８（ａ）は、５０００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液のＣＡＲＳスペクトル１０５の例を示しており、遅延のないＣＡＲＳスペクトル１５ａと、負の遅延（－２８００ｆｓ）によるインターナルリファレンス１５ｂとを用いて導出（抽出）されたものである。図８（ａ）は、リファレンス用の水のＣＡＲＳスペクトル１０６の例も併せて示す。図８（ｂ）は、２００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液のＣＡＲＳスペクトル１０５の例を示し、遅延なしのＣＡＲＳスペクトル１５ａと、負の遅延（－２８００ｆｓ）によるインターナルリファレンス１５ｂとを用いて導出されたものである。図８（ｂ）には、参考のために、水のＣＡＲＳスペクトル１０６も示されている。図８（ｃ）は、図８（ｂ）のＣＡＲＳスペクトル１０５を、図７で示した水のＣＡＲＳスペクトルを用いて正規化（補正）した２００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液のＣＡＲＳスペクトル１０７の一例を示す。図８（ｃ）には、従来法に用いて正規化されたＣＡＲＳスペクトル１０８が参考として示されている。高濃度および中濃度のグルコースを含む溶液については、水のリファレンスは必要なく、グルコースの濃度に対応する共鳴特性を有するＣＡＲＳスペクトルを供給（検出）してもよい。グルコースの濃度が低い溶液では、励起スペクトルにわずかな違いが見られ、１回の外部リファレンスを用いてもよい。

図９は、後方（Ｅｐｉ、エピ）ＣＡＲＳの測定結果の例を示す。従来の方法で水をリファレンスとして使用した場合、前方ＣＡＲＳ信号と比較して信号強度が非常に低いので、ＣＡＲＳスペクトルに含まれるノイズが増加し、Ｅｐｉ－ＣＡＲＳスペクトルはより高いノイズと、より多くのアーチファクトとを含むため、定量分析が困難であった。しかしながら、上述したインターナルリファレンス法を用いることで、信号強度の低下によるノイズを低減し、共鳴特性のシャープなピークを含むＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトルを得ることができる。図９（ａ）は、遅延のないＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトル１５ａの一例、負の遅延を持つＥｐｉ－インターナルリファレンス１５ｂの一例、外部のリファレンス（水）のＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトル１６の一例を示す。図９（ｂ）は、外部リファレンス（従来法）を用いたグルコース濃度１０％（１０６ａ）およびグルコース濃度５％（１０６ｂ）の正規化されたＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトルの例を示す。図９（ｃ）は、本出願の明細書に記載のインターナルリファレンス法を用いた、グルコース濃度１０％（１０５ａ）およびグルコース濃度５％（１０５ｂ）の正規化されたＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトルの例を示す。インターナルリファレンス法を用いることで、濃度に対応したグルコースピークを有するＥｐｉ－ＣＡＲＳスペクトルが得られる。

図１０は、モジュレーター７０の異なる実施形態を示す。モジュレーター７０は、入力プローブパルス１３の偏光を変換するための波長板７５と、入力プローブパルス１３から第１のプローブパルス（例えばｐ偏光の光）１３ａおよび第２のプローブパルス（例えばｓ偏光の光）１３ｂを分離するためのＰＢＳ（偏光ビームセパレータ）７６と、第１のプローブパルス１３ａを調整するための第１のプローブ経路７７であって、波長板、第１のプローブパルス１３ａをＰＢＳ７６に反射するためのミラー７７ｍを含む第１のプローブ経路７７と、第１のプローブパルス１３ａに対する（ストークスパルス１１およびポンプパルス１２に対する）時間差Δｔを含む第２のプローブパルス１３ｂを調整するための第２のプローブ経路７８であって、波長板、第２のプローブパルス１３ｂをＰＢＳ７６に反射するためのミラー７８ｍを含む第２のプローブ経路７８とを含む。第２のプローブ経路７８は、遅延Δｔを制御するためにミラー７８ｍを移動させるアクチュエーターを含んでもよい。波長板７５は、供給されるプローブパルス１３ａ、１３ｂを偏光により電気的に制御または選択できるＥＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏ－Ｏｐｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、電気光学モジュレーター）であってもよい。移動ステージを使用するモジュレーター７０は、所望のプローブ遅延変化に対応する距離をステージ上で移動するため、変調速度が比較的遅く、位置の再現性が正確でない場合がある。移動ステージを偏光光学系に置き換えることで、高速で再現性の高い変調が可能なモジュレーター７０を提供することができる。このモジュレーター７０は、偏光によって選択される調整可能な相対遅延を有する２つの経路７７および７８を含む。波長板７５は、高速（ｋＨｚより高い周波数）で変調のための回転ステージまたは電気光学モジュレーター（ＥＯＭ）であってもよい。高速変調により、ノイズが低減され、パワーやアライメントのドリフト、エタロニングの可能性等を抑制でき、ＣＡＲＳ画像を生成するための走査速度を向上できる。

レーザー光をサンプル、例えばキュベット内の溶液に集光することで、ＣＡＲＳスペクトルが生成され、それを分析することで異なる分子を同定したり、溶液の濃度を定量的に決定したりすることができる。蛍光や通常のラマン分光のような他の方法とは対照的に、ＣＡＲＳあるいは他の非線形方法では、信号は焦点位置でのみ生成される。集光性能を上げることで、本質的な空間分解能が達成され、信号を１μｍ^３オーダーの微小体積からのみ発生させることができる。しかしながら、キュベット内の液体溶液を測定する代わりに、組織のような構造化された物質にＣＡＲＳを直接適用することができる。システム１は、ビーム１１、１２、および１３によってサンプル上をスキャン（走査）し、異なる位置ごとにスペクトルを提供することができるため、画像を生成することが可能である。システム１は、ＣＡＲＳ分光法としてだけでなく、スキャンにより各ピクセルでスペクトルを取得して画像を形成することができ、ＣＡＲＳ顕微鏡としても適用できる。薄いサンプル（ターゲット）５に対しては、サンプルを通る前方散乱方向で信号を記録することができ、厚いサンプルに対しては後方散乱方向で信号を記録することができる。例えば脂肪細胞中の脂質のような高い局所濃度の画像化が必要である。高い局所濃度を含む小さな体積に焦点を合わせることで、ピークがバックグラウンドから際立つ。非共鳴リファレンスの測定は、外部または組織サンプルのガラスカバースリップの水から行うことができる。これは、局所濃度が高く、散乱やその他のアーチファクトが最小限のサンプルにのみ有効で、リファレンスとサンプルとのスペクトル形状がある程度一定である場合に限られる（例えば、前方方向で測定した非常に薄いサンプル）。より複雑なサンプル（後方散乱、より厚いもの、散乱性が高いもの）では、組織の不均一性により全体的なスペクトル形状が変化し、感度が非常に制限される。

ここで提案しているインターナルリファレンス法を使用する場合、組織内の実際の測定位置からの通常のＣＡＲＳ信号に加えて、各ピクセルまたはボクセルで内部非共鳴のインターナルリファレンスを記録できる。本出願のインターナルリファレンス法により、発生、光路、散乱、サンプルの不均一性、その他のアーチファクトの違いが相殺され、ＣＡＲＳ顕微鏡の感度を大幅に向上できる。

図１１は、インターナルリファレンス法の処理の概要を示すフローチャートである。この方法は、ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得し（ステップ８０）、取得したＣＡＲＳスペクトルのセットを比較して共鳴成分（共鳴成分、共鳴特性）を抽出する（ステップ８３）ことを含む。ステップ８０では、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスと、パルス幅ＰＷ２がストークス光１１およびポンプ光１２のパルスのパルス幅ＰＷ１よりも大きい（広い、長い）プローブ光１３のパルスとを、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスとプローブ光１３のパルスとの間の時間関係Δｔのみを変化させながら、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスがプローブ光１３のパルスと、プローブ光１３のパルスのパルス幅ＰＷ２内で重なるようにターゲット５の一部５ａに照射することにより、ＣＡＲＳスペクトル１５のセットを次々と取得する。

ステップ８０は、第１のＣＡＲＳスペクトル１５ａを取得するステップ８１と、インターナルリファレンスとして第２のＣＡＲＳスペクトル１５ｂを取得するステップ８２とを含んでもよい。ステップ８１では、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスと、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスのパルス幅ＰＷ１よりも大きなパルス幅ＰＷ２を有するプローブ光１３のパルスとをターゲット（サンプル）５の部位５ａに照射することにより、ＣＡＲＳスペクトル１５ａを生成して取得する。ストークス光１１およびポンプ光１２は、プローブ光１３のパルス幅ＰＷ２内で照射される。典型的には、ストークス光１１、ポンプ光１２、プローブ光１３の各パルスは遅延なく照射される（Δｔ＝０）。ステップ８２では、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスとプローブ光１３のパルスとの間の時間関係（時間差、遅延）Δｔのみを変化させた状態で、ターゲット５の部位５ａにストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３の各パルスを照射してインターナルリファレンス１５ｂを取得し、第１のＣＡＲＳスペクトル１５ａから共鳴成分を抽出する。典型的には、インターナルリファレンス１５ｂは負の遅延（Δｔ＜０）で取得される。

この方法は、ターゲット５を走査（スキャン）するステップ（ステップ８４）をさらに含んでもよい。ステップ８４では、ストークス光１１、ポンプ光１２、およびプローブ光１３でターゲット５を走査して、各画素で第１のＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス（第２のＣＡＲＳスペクトル）１５ｂを取得し、ターゲット５の画像を生成する。ステップ８４は、各ボクセルにおいて第１のＣＡＲＳスペクトル１５ａおよびインターナルリファレンス（第２のＣＡＲＳスペクトル）１５ｂを取得してターゲット５の３Ｄ画像を生成する３Ｄスキャニング（３Ｄ走査）であってもよい。ステップ８５では、全ての画素情報が得られるまで上記ステップを繰り返してもよい。

本明細書に記載されているように、プローブ遅延は、生成されたＣＡＲＳ信号における共鳴寄与の量を制御するために使用される。正の時間遅延（プローブがポンプおよびストークスの後に到着）を使用することは既知であり、ＴＤ－ＣＡＲＳ１５ｃの生成に適用される。しかしながら、負のプローブ遅延（プローブがポンプおよびストークスの前に到着し、プローブパルスの最後でのみポンプおよびストークスと時間的に重なる）を利用することによる効果は、ＣＡＲＳスペクトロスコピー（分光法）とマイクロスコピー（顕微鏡検査）に全く新しい可能性を開く。正のプローブ遅延は、全シグナル強度を犠牲にして共鳴／非共鳴の比を向上させる。負の遅延は、生成される信号がほぼ純粋に非共鳴となる点まで、（共鳴／非共鳴）比を減少させる。負の遅延スペクトル（非共鳴信号）は、リファレンスとして、非共鳴サンプルを用いて外部で測定するものの代わりに使用することができる。さらなる分析に必要な正規化スペクトルは、プローブの遅延Δｔを変えるだけで取得できる。非共鳴のＩＮＲリファレンス（インターナルリファレンス）は、実際の（第１のＣＡＲＳスペクトルの）測定と全く同じ位置、同じ条件（ビーム経路、レーザーなど）で共鳴サンプルから取得できるため、アーチファクトが相殺される。

本明細書に記載される方法およびシステムは、生体対象の関心対象の生化学的および構造的特性評価、特に生体対象の関心対象の生化学的組成の侵襲的および非侵襲的評価、ならびにその応用に適用可能である。本明細書に記載された方法およびシステムは、あらゆる種類のサンプルに適用可能であり、生化学とは無関係な溶液のような単純なサンプルにも適用可能である。

本明細書では、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光により第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することと、ストークス光およびポンプ光とプローブ光との間の時間関係のみを変化させて、ストークス光、ポンプ光およびプローブ光により第１のＣＡＲＳスペクトルのリファレンスとなる第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することとを含む方法が開示されている。第１のＣＡＲＳスペクトルは共鳴成分および非共鳴成分を含んでもよく、第２のＣＡＲＳスペクトルはほぼ全てが非共鳴成分であってもよく、本方法は、第１のＣＡＲＳスペクトルおよび第２のＣＡＲＳスペクトルによって得られる共鳴成分を含む第３のＣＡＲＳスペクトルを取得することをさらに含んでもよい。第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、ストークス光およびポンプ光と、ストークス光およびポンプ光よりもパルス幅が大きいプローブ光とを、プローブ光のパルス幅内で重なるように第１の相対的時間関係で照射させることを含んでもよい。第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、プローブ光のパルス幅内で重なるように、第１の相対的時間関係に対して遅延した第２の相対的時間関係で、ストークス光およびポンプ光と、プローブ光とを出射することを含んでもよい。第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、ストークス光と、ポンプ光と、ストークス光およびポンプ光のパルス幅よりも大きいパルス幅を有するプローブ光とを、実質的に同時に照射することを含んでもよい。第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、ストークス光およびポンプ光を、実質的にプローブ光のパルス幅の最終の端に照射することを含んでもよい。

本明細書では、他の方法も開示している。この方法は、ストークス光、ポンプ光、およびパルス幅がストークス光およびポンプ光よりも大きいプローブ光によるＣＡＲＳスペクトルのセットを、ストークス光およびポンプ光と、プローブ光との時間関係のみをプローブ光のパルス幅内で重なるように変化させて取得することと、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較してターゲットＣＡＲＳスペクトルを取得することとを含む。

本明細書には、システムも開示されている。このシステムは、第１の波長範囲を有する第１の光パルスを供給するように構成された第１の光路と、第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲を有する第２の光パルスを供給するように構成された第２の光路と、第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲を有し、第１の光パルスおよび第２の光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を有する第３の光パルスを供給するように構成された第３の光路と、第１の光パルス、第２の光パルスおよび第３の光パルスをターゲットに照射し、ターゲットからの光を取得し、ターゲットからのＣＡＲＳスペクトルのセットを検出器（ディテクター）によって検出するように構成された光入出力ユニットと、第３の光パルスのパルス幅内で、第３の光パルスと第１の光パルスおよび第２の光パルスとの相対的な時間関係を変化させるように構成された第１の変調ユニット（モデュレーティングユニット）と、第１の光パルスおよび第２の光パルスに対する第３の光パルスの相対的な時間関係を変えて取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを参照してターゲットのＣＡＲＳスペクトルを取得するように構成された分析器とを備える。ＣＡＲＳスペクトルのセットは、第１の光パルスと第２の光パルスと第３の光パルスを実質的に同時に照射することによって取得された第１のＣＡＲＳスペクトルと、第１の光パルスと第２の光パルスを実質的にプローブ光のパルス幅の最終の端で照射することによって取得された第２のＣＡＲＳスペクトルとを含んでもよい。

本明細書では、コンピューターが装置を動作させるためのコンピュータープログラム（プログラム製品）を開示する。この装置は、第１の波長範囲を有する第１の光パルスを供給するように構成された第１の光路と、第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲を有する第２の光パルスを供給するように構成された第２の光路と、第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲を有し、第１の光パルスおよび第２の光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を有する第３の光パルスを供給するように構成された第３の光路と、第１の光パルス、第２の光パルスおよび第３の光パルスをターゲットに照射し、ターゲットからの光を取得し、ターゲットからのＣＡＲＳスペクトルのセットを検出器によって検出するように構成された光入出力ユニットとを備える。このコンピュータープログラムは、第１の光パルスおよび第２の光パルスに対する第３の光パルスの相対的な時間関係を変えて取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを参照することによりターゲットのＣＡＲＳスペクトルを取得するステップを実行するための実行可能なコード（命令）を含む。

具体的な実施形態に関する前述の説明は、本明細書における実施形態の一般的な性質を十分に明らかにするものであり、そのため、他者は、現在の知識を適用することによって、一般的な概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を様々な用途のために容易に修正および／または適合させることができ、したがって、そのような適合および修正は、開示された実施形態の意味および等価物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書で採用される言い回しまたは用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことを理解されたい。したがって、本明細書における実施形態は、好ましい実施形態の観点から説明されてきたが、当業者であれば、本明細書における実施形態は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内で変更を加えて実施することができることを認識するであろう。

Claims (20)

1. ストークス光およびポンプ光のパルスと、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅のプローブ光のパルスとをターゲットの一部に照射することにより第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することであって、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスを前記プローブ光のパルスのパルス幅内で照射することにより第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することと、
   同じ条件で、前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光のパルスを、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスと前記プローブ光のパルスとの間の時間関係のみを変化させて前記ターゲットの前記一部に照射することにより、前記第１のＣＡＲＳスペクトルのリファレンスとなる第２のＣＡＲＳスペクトルであって、前記第１のＣＡＲＳスペクトルから共鳴成分を抽出するための第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することとを有する、方法。
2. 請求項１において、
   前記第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、前記プローブ光のパルスのパルス幅内で前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスと重なるように、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスに対して第１の相対的時間関係で前記プローブ光のパルスを照射することを含み、
   前記第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、前記プローブ光のパルスのパルス幅内で前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスと重なるように、前記第１の相対的時間関係に対して負の遅延を有する第２の相対的時間関係で前記プローブ光のパルスを照射することを含む、方法。
3. 請求項１において、
   前記第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、前記プローブ光のパルスを、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早いタイミングで照射することを含む、方法。
4. 請求項３において、
   前記第１のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光のパルスをほぼ同時に照射することを含み、
   前記第２のＣＡＲＳスペクトルを取得することは、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスを、前記プローブ光のパルスのパルス幅のほぼ最後に照射することを含む、方法。
5. 請求項１ないし４のいずれかにおいて、
   前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを走査し、前記第１のＣＡＲＳスペクトルおよび前記第２のＣＡＲＳスペクトルを各画素において取得することをさらに有する、方法。
6. 請求項１ないし４のいずれかにおいて、
   前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを３次元的に走査し、前記第１のＣＡＲＳスペクトルおよび前記第２のＣＡＲＳスペクトルを各ボクセルにおいて取得することをさらに有する、方法。
7. ストークス光およびポンプ光のパルスと、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅を有するプローブ光のパルスとを、前記プローブ光のパルスの前記パルス幅内で重なるように、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスと前記プローブ光のパルスとの時間関係のみを変化させながら、ターゲットの一部に照射
   することにより、ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することと、
   取得した前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することで、共鳴成分を抽出することとを有する、方法。
8. 請求項７において、
   前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスに対して負の遅延で前記プローブ光のパルスを、前記ターゲットの前記一部に照射することを含む、方法。
9. 請求項７または８において、
   前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを走査し、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを各画素において取得することをさらに有する、方法。
10. 請求項７または８において、
    前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを３次元的に走査し、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを各ボクセルにおいて取得することをさらに有する、方法。
11. 請求項１または７において、
    前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスはフェムト秒オーダーのパルス幅を有し、前記プローブ光のパルスはピコ秒オーダーのパルス幅を有する、方法。
12. 請求項１または７において、
    前記ストークス光は第１の波長範囲を有し、前記ポンプ光は前記第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲を有し、前記プローブ光は前記第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲を有する、方法。
13. 請求項１または７において、
    前記ストークス光が広帯域のストークスビームを有する、方法。
14. ストークス光およびポンプ光のパルスと、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスのパルス幅よりも大きなパルス幅のプローブ光のパルスとをターゲットの一部に照射するように構成された光路と、
    前記プローブ光のパルス幅内で、前記プローブ光のパルスと、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスとの間の相対的な時間関係を制御するように構成されたモジュレーターと、
    前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光のパルスによって生成されたＣＡＲＳスペクトルを検出し、前記相対的な時間関係に関連したＣＡＲＳスペクトルの複数のセットを取得するように構成されたディテクターとを有する、システム。
15. 請求項１４において、
    前記モジュレーターは、前記相対的な時間関係を制御し、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスに対して負の遅延で前記プローブ光のパルスを前記ターゲットに照射するようにさらに構成されている、システム。
16. 請求項１４において、
    前記モジュレーターは、前記相対的な時間関係を制御し、前記プローブ光のパルスを前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早いタイミングで照射するするようにさらに構成されている、システム。
17. 請求項１６において、
    前記モジュレーターは、前記相対的な時間関係を制御し、前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光のパルスをほぼ同時に照射することによって取得される第１のＣＡＲＳスペクトルと、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスを前記プローブ光のパルス幅のほぼ最後に照射することによって取得される第２のＣＡＲＳスペクトルとを含むＣＡＲＳスペクトルのセットを生成するようにさらに構成されている、システム。
18. 請求項１４ないし１７のいずれかにおいて、
    前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを走査し、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを各画素において取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
19. 請求項１４ないし１７のいずれかにおいて、
    前記ストークス光、前記ポンプ光および前記プローブ光で前記ターゲットを３次元的に走査し、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを各ボクセルにおいて取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
20. 請求項１４に記載のシステムを、コンピューターが動作させるためのコンピュータープログラムであって、
    当該コンピュータープログラムは、前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスに対して負の遅延で前記プローブ光のパルスを前記ターゲットに照射するように前記相対的な時間関係を制御する命令を含む、コンピュータープログラム。

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