WO2017090075A1 - 光計測装置及び光計測方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an optical measurement device and an optical measurement method using coherent anti-Stokes Raman scattering.
  • the optical microscope has been developed as an indispensable device in the natural science, engineering, and industrial fields.
  • a method of staining cells with a reagent and observing with a microscope or the like is common.
  • this method affects the cells by staining, it is difficult to continuously analyze the same cells and use the examined cells directly for medical purposes.
  • the CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) microscope is suitable for cell observation because it can identify molecules faster than a Raman microscope by applying non-linear optical effects and has non-invasive characteristics.
  • CARS is light emission by third-order polarization, and pump light, Stokes light, and probe light are required to generate CARS.
  • the probe light is substituted with pump light.
  • ⁇ r (3) ( ⁇ AS ) is a resonance term of molecular vibration of the third-order electric susceptibility
  • ⁇ nr (3) having no frequency dependency is a non-resonance term.
  • the electric field of pump light and probe light is represented by E P
  • the electric field of Stokes light is represented by E S.
  • An asterisk attached to the shoulder of the E S in the above formula represents a complex conjugate.
  • the intensity of CARS light is expressed as follows.
  • FIG. 2 is an energy level diagram in CARS.
  • the mechanism by which CARS light is generated will be described using the molecular energy level diagram shown in FIG. This figure shows the resonance term process.
  • 201 represents the ground state of the molecule, and 202 represents the vibrationally excited state.
  • the pump light having the frequency ⁇ P and the Stokes light having the frequency ⁇ S are simultaneously irradiated.
  • the molecule is excited to a certain vibration excitation level 202 through the intermediate state 203.
  • this excited molecule is irradiated with probe light having the frequency ⁇ P , the molecule returns to the ground state while generating CARS light having the frequency ⁇ AS via the intermediate state 204.
  • FIG. 1 One process related to the non-resonant term ⁇ nr (3) in the third-order polarization is shown in FIG.
  • the state induced by the simultaneous irradiation of the pump light with the frequency ⁇ P and the Stokes light with the frequency ⁇ ′ S is not the vibration excitation state, but is a process in which the intermediate state 205 is excited.
  • the probe light with the frequency ⁇ P By irradiating the probe light with the frequency ⁇ P , non-resonant CARS light with the frequency ⁇ AS is generated through the intermediate state 204.
  • multicolor CARS microscopes those that use a broadband light source as Stokes light and spectrally detect the generated CARS light as shown in FIG. 4 are called multicolor CARS microscopes (or multiplex CARS microscopes).
  • No. 2 discloses the configuration. Since the multicolor CARS microscope can estimate the Raman spectrum from the spectral spectrum of the CARS light, it can be obtained as compared with a method of detecting only a specific spectral component as in Patent Document 1 (this is called a monochromatic CARS for convenience). It has a lot of information and is suitable for more detailed analysis of the measurement target.
  • FIG. 5 is a diagram showing a configuration of a conventional multicolor CARS microscope.
  • the output from the short pulse laser light source 501 is bifurcated by a beam splitter 502, one of which is introduced into an optical fiber such as a photonic crystal fiber 503, and broadband light (referred to as supercontinuum light) is generated inside.
  • supercontinuum light only a desired wavelength component (a component having a wavelength longer than that of the excitation light) is extracted by the long pass filter 504 after being emitted from the fiber, and this is used as Stokes light.
  • the other excitation light and Stokes light are combined by a dichroic mirror 505 or the like, and are collected and irradiated on a sample 506 to generate CARS light, which is detected by a spectroscope 507 to acquire a spectrum.
  • a fingerprint region (about 800 to 1800 cm ⁇ 1 ) in which a number of peaks corresponding to the composition of the living body are dense. Since the signal in the fingerprint region is about 1/10 of the CH expansion / contraction signal of about 2900 cm ⁇ 1 , which has been mainly reported in papers, it is necessary to improve the signal-to-noise ratio of the signal. However, when the laser power to be irradiated is increased in order to increase the signal intensity, there is a possibility of damaging the cells.
  • an optical measurement device includes a short pulse laser light source, a modulator that modulates power of a predetermined pulse among pulses of laser light generated from the short pulse laser light source, and a short pulse.
  • a branching unit for branching the emitted light from the laser light source through the modulator into a first light flux and a second light flux, an optical fiber for generating supercontinuum light from the first light flux, and supercontinuum light Generated from the sample, and a combining unit that combines the two components with Stokes light as the long wavelength component of the light and the second light beam as pump light, and the light combined at the combining unit on the sample.
  • the optical measuring device is characterized by having a spectroscope for detecting the light.
  • the damage to a cell can be suppressed, without reducing the signal intensity of CARS significantly.
  • Energy level diagram in CARS One process related to the nonresonant term ⁇ nr (3) .
  • the energy ranking diagram of a multicolor CARS microscope The figure which shows the structure of the conventional multicolor CARS microscope.
  • the figure which shows the light emission conditions of a laser The schematic diagram which showed the relationship between damage and signal strength.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a basic configuration example according to the present invention.
  • the feature of this apparatus is that a pulse modulator 120 and a temperature sensor 121 controlled by the controller 100 are provided.
  • the controller 100 includes an interface that controls the entire apparatus including the adjustment mechanism, accepts measurement instructions from the user, and displays measurement results.
  • the short pulse laser light source 101 emits short pulse laser light based on an instruction from the controller 100.
  • the short pulse laser light source 101 is a titanium sapphire laser, a fiber laser, a microchip laser, or the like, and has a pulse width of nanoseconds or less.
  • the peak power is preferably on the order of kilowatts or more capable of inducing a nonlinear optical effect.
  • the wavelength may be selected from the absorption band to be measured and the corresponding wavelength of the optical component used, but may be 800 nm, 1064 nm, or the like.
  • the pulse modulator 120 receives the pulse timing signal of the laser beam from the controller 100, and controls the pulse repetition frequency by thinning out the number of pulses of the laser beam incident from the short pulse laser light source to half or 1/3.
  • This pulse modulator may be composed of a Pockels cell and a half-wave plate, or may use a high-speed shutter or an ND (Neutral-Density) filter. Further, it may be incorporated in the short pulse laser light source 101 as a pulse modulation function. Such a built-in type is also referred to as a pulse modulator in this specification.
  • the laser light modulated by the pulse modulator enters the half-wave plate 102 and the polarization beam splitter 103, and is branched into a transmission component and a reflection component at a power ratio based on the polarization direction by the polarization beam splitter 103.
  • the laser light that has passed through the polarization beam splitter 103 is condensed on the end face of the photonic crystal fiber 105 by the condenser lens 104.
  • a photonic crystal fiber is an optical fiber in which a honeycomb-like hollow clad is formed around a core, and incident light is strongly confined in the core. When a short pulse laser beam is incident, nonlinear optical phenomena such as self-phase modulation are induced, and supercontinuum light having a wide spectrum is generated.
  • the generated supercontinuum light becomes parallel light by the collimating lens 106, and after the short wavelength component is cut by the long pass filter 107, it passes through the dichroic mirror 108 that reflects the pump light wavelength and transmits the light of other wavelengths. Then, it enters the objective lens 113 as Stokes light.
  • the laser light reflected by the polarization beam splitter 103 is reflected by the mirror 109, the mirror 112, and the dichroic mirror 108, and enters the objective lens 113 as pump light.
  • the objective lens 113 condenses the broadband Stokes light and the pump light combined on the same axis by the dichroic mirror 108 on the sample 114.
  • the numerical aperture of the objective lens 113 be as high as 0.8 or more, for example.
  • the CARS process described above is induced, and CARS light having a wavelength corresponding to the molecular species of the sample 114 is generated. Further, the temperature near the condensing point of the Stokes light and the pump light is measured by the temperature sensor 121.
  • a radiation thermometer may be used for this temperature sensor.
  • a camera for observing bubbles generated near the condensing point due to a temperature rise and a monitor of evaporated water are used. The temperature may be converted using a hygrometer. Further, instead of the temperature sensor, a camera that directly monitors the shape change due to cell damage may be used.
  • the sample 114 has an area for learning pulse frequency conditions described later. For example, as shown in FIG. 7, when a glass bottom dish is used as a sample, a lower right 10 ⁇ 10 ⁇ m region 701 of the glass portion may be used for learning only in a medium without cells. Note that this area may be omitted when the learning operation is not performed.
  • the generated CARS light is converted into parallel light by the collimating lens 115, and the transmitted components of the pump light and Stokes light are cut by the notch filter 117 and the short pass filter 118, and enter the spectroscope 119.
  • the spectroscope 119 detects the CARS spectrum and passes the spectrum information to the controller 100.
  • the pulse modulator may be installed at any location as long as it is not focused on the sample. For example, it may be installed between the dichroic mirror 108 and the objective lens 113. It is necessary to use a modulator corresponding to the above.
  • FIG. 1 shows a transmissive CARS system that detects CARS light propagating in the same direction as the incident direction of pump light and Stokes light
  • reflected CARS light may be detected as shown in FIG.
  • reflected CARS light may be introduced into the spectroscope 119 using a dichroic mirror 122 that reflects light having a wavelength shorter than the pump light wavelength and transmits light having a longer wavelength. Such a configuration is useful when measuring an opaque sample or a thick sample with respect to the incident laser.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of a pulse modulation method.
  • (a) is a laser emission waveform when no modulation is performed, and a laser pulse having a predetermined peak power and pulse width is emitted at a specific repetition frequency.
  • the average power is a value obtained by averaging these pulses over time.
  • (B) is the example which adjusted the power with the conventional apparatus. If the peak power is halved without changing the pulse repetition frequency, the average power is also halved.
  • (c) and (d) are diagrams showing a pulse modulation method according to the present invention.
  • (C) is an example in which the pulse is thinned by the pulse modulator 120 while the peak power is kept constant, and the frequency is halved. Even in this case, the average power is 1 ⁇ 2.
  • (d) is an example in which one pulse is thinned out from three pulses.
  • FIG. 8 is an example of a flowchart showing an operation in which the device according to the present invention learns and determines the pulse frequency.
  • the controller 100 instructs the start of the learning operation.
  • the relationship between the pulse frequency shown in FIG. 9 and the temperature rise after irradiation for a predetermined time is acquired.
  • it is possible to shorten the irradiation time by performing measurement from a region having a high pulse frequency without performing pulse thinning, and to shorten the time required for the entire learning.
  • the temperature rise of the culture medium may be measured in the learning region of FIG.
  • the pulse repetition frequency is determined from the specification of the temperature rise corresponding to the cell damage, and the measurement is started in S804.
  • the result of the first implementation may be stored in a memory or the like built in the controller 100, and thereafter, the learning may be performed at the pulse frequency determined for the first time without performing the learning. May be performed.
  • frequency optimization for each measurement is effective.
  • FIG. 10 is a diagram showing an irradiation time and a temperature rise in the vicinity of the laser focusing point when laser irradiation is continued on the cell sample. 11 when the peak power is halved as shown in FIG. 11B and the number of pulses is halved as shown in FIG. 11C. A comparison of conditions was presented. As described above, the average power when the number of pulses is halved and when the peak power is halved is 1 ⁇ 2 of the reference condition.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the relationship between the aforementioned damage and signal intensity.
  • the signal intensity decreases to the third power as the average power decreases.
  • the number of pulses it remains a linear decrease with respect to a decrease in average power.
  • the average power of the laser corresponds to damage due to a temperature rise
  • the damage specification is 0.8 or less and the signal intensity specification is 0.6 or more
  • the condition is satisfied only when the number of pulses is changed.
  • FIG. 13 is a diagram showing pump light, Stokes light, CARS light wavelength, and water absorption spectrum corresponding to the Raman shift when the wavelength of the short pulse laser light source serving as pump light is 1064 nm.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing a basic configuration example according to the present embodiment. Note that description of elements similar to those in the first embodiment is omitted.
  • Examples of means for controlling the Stokes light band include (1) control of incident power to a photonic crystal fiber (hereinafter abbreviated as PCF), (2) adjustment of the PCF length, and (3) a wavelength filter.
  • PCF photonic crystal fiber
  • the half-wave plate 102 is rotated according to an instruction from the controller 100 by a movable holder, and changes the polarization of the incident laser light in an arbitrary direction. Since the polarization beam splitter 103 changes the power branching ratio of the reflected light and the transmitted light based on the polarization direction of the laser light, the incident power of the PCF changes.
  • the length of the PCF 105 is adjusted so that the generated Stokes light has a desired spectral band.
  • the incident power to the PCF is the same, the spectrum tends to spread as the PCF length increases.
  • the length may be 30 cm or more and 1 m or less.
  • the generated Stokes light is incident on the short-pass filter 1401 having a variable cutoff wavelength, and only a desired wavelength component is transmitted and combined with the pump light.
  • PCF which has a predetermined length, and a wavelength filter was shown here, any one or two may be sufficient.
  • FIG. 15 is an example of a flowchart showing an operation in which the apparatus according to the present invention learns and determines the pulse frequency after adjusting the Stokes light band. Note that description of operations similar to those of the first embodiment is omitted.
  • the Stokes light band is controlled according to the desired molecular species. For example, when a CH expansion / contraction signal of about 2900 cm ⁇ 1 is required, the pump light wavelength is controlled from 1064 nm to about 1600 nm, and when only the fingerprint region is required, control is performed to about 1300 nm.
  • the above-described incident power adjustment to the PCF or a wavelength filter may be used.
  • the relationship between power and band may be acquired in advance using a spectroscope.
  • the spectrum of CARS light or non-resonant light may be acquired by changing the incident power to the PCF, and a search may be made directly for a condition in which those spectra spread to a desired wave number.
  • an incident power condition to the PCF may be searched for in the learning area of FIG. Since the subsequent operation is the same as that of the first embodiment, the description thereof is omitted.
  • FIG. 16 is an example of a flowchart showing the operation of adjusting the Stokes light band after the apparatus according to the present invention determines the pulse frequency.
  • the pulse frequency when the pulse frequency is lowered, the signal intensity is lowered although it is a linear change.
  • the operation of FIG. 16 is effective when it is impossible to secure a signal strength necessary for suppressing damage. It is confirmed whether the required signal intensity is secured at the pulse frequency determined in S1601.
  • the signal intensity may be determined from the non-resonant light of the culture medium in the learning region of FIG. 7, or may be determined from the CARS signal intensity by measuring an actual sample. If the signal is greater than or equal to the desired intensity, measurement is started in S804.
  • FIG. 17 is a diagram showing two types of broadband Stokes light spectra and water absorption spectra.
  • FIG. 18 is a diagram showing the irradiation time and the temperature increase in the vicinity of the laser condensing point when the above-mentioned two types of Stokes light irradiation are continued on the cell sample. In contrast to Stokes (i), (ii) has a low temperature rise rate, and damage to the sample is suppressed.
  • the damage to the sample can be further suppressed by limiting the bandwidth of the Stokes light.
  • a combination of the first and second wavelengths realizing the measurement wave number set by the wave number setting means is a combination in which the first and second wavelengths are both 700 nm or more and 1400 nm or less.
  • a wavelength selection method in a so-called monochromatic CARS that uses light of a single wavelength for pump light and Stokes light. The control of multi-color CARS broadband light, which is a problem in the present application, is not described.
  • FIG. 19 is a schematic diagram showing a basic configuration example according to the present embodiment. Since the pulse modulator 120 is not provided in FIG. 14 of the second embodiment, the configuration is simpler. Such a configuration is effective when downsizing is required, for example, when incorporating into a cell culture apparatus. Since other elements are the same as those in the second embodiment, description thereof is omitted.
  • FIG. 20 is an example of a flowchart showing an operation of adjusting the Stokes light band by the apparatus according to the present invention.
  • S1501 for example, after limiting the spectrum of the Stokes light to a band that contributes to the fingerprint region, in S2001, damage to the sample is confirmed.
  • the confirmation of damage may be performed by monitoring the temperature rise of the culture medium in the learning area shown in FIG. 7, and since only one condition determined in S1501 is used, the acceleration test may not be performed. If the damage is less than or equal to the predetermined amount, cell measurement is started. On the other hand, if it exceeds a predetermined amount, the measurement is stopped.

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Abstract

多色ＣＡＲＳにおいて指紋領域は信号が密集している領域であり、これら信号の強度や空間分布の情報は細胞解析にとって重要であるが、信号強度が低いためレーザのパワーを増加させると細胞へダメージを与えるという課題があった。そこで、パルス変調器１２０によって短パルスレーザ光源から出射されたレーザ光のパルス数を変化させる構成とした。これにより信号強度を大幅に低下させず細胞へのダメージを抑制することを可能とした。

Description

光計測装置及び光計測方法
　本発明は、コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱を利用する光計測装置及び光計測方法に関する。
　光学顕微鏡は自然科学、工学、産業分野において必須の装置として発展してきた。特に近年は再生医療や創薬の分野で細胞観察用途として高機能化のニーズが高まっている。現在の細胞解析では試薬を用いて細胞を染色し、顕微鏡等で観察する方法が一般的である。しかし、この方法は染色による細胞への影響のため、同一の細胞の継続的な解析や検査した細胞を直接医療向けに用いることが困難である。
　ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）顕微鏡は、非線形光学効果の応用によってラマン顕微鏡と比較して高速に分子同定が可能であり、非侵襲特性を有することから細胞観察用途に好適である。
　ＣＡＲＳは３次の分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、ポンプ光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は
　　　ＰAS (3)(ωAS)=|χr (3)(ωAS)+χnr (3)|ＥP 2(ωP)Ｅ* S(ωS)
で表される。ここに、χr (3)(ωAS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、周波数依存性のないχnr (3)は非共鳴項である。また、ポンプ光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表している。上式中でＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度は以下のように表される。
　　　ＩCARS(ωAS)∝|ＰAS (3)(ωAS)|2
　図２は、ＣＡＲＳにおけるエネルギー準位図である。ＣＡＲＳ光が発生する機構を、図２に示した分子のエネルギー準位図を用いて説明する。本図は共鳴項のプロセスを示している。２０１は分子の基底状態を表し、２０２は振動励起状態を表す。周波数ωPのポンプ光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は中間状態２０３を介して、２０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、中間状態２０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はωAS＝２・ωP－ωSと表される。
　上記３次の分極のうち非共鳴項χnr (3)に関係する一つのプロセスを図３に示す。周波数ωPのポンプ光と周波数ω'Sのストークス光の同時照射によって誘起される状態が振動励起状態ではなく、２０５の中間状態が励起されるプロセスである。周波数ωPのプローブ光を照射することにより、中間状態２０４を介して周波数ωASの非共鳴のＣＡＲＳ光が発生する。
　ＣＡＲＳ顕微鏡のうち、図４に示すようにストークス光として広帯域な光源を用い、発生するＣＡＲＳ光を分光検出するものは多色ＣＡＲＳ顕微鏡（もしくはマルチプレックスＣＡＲＳ顕微鏡）と呼ばれており、例えば特許文献２に構成等が開示されている。多色ＣＡＲＳ顕微鏡は、ＣＡＲＳ光の分光スペクトルからラマンスペクトルを推定できるため、特許文献１のように特定のスペクトル成分のみを検出する方式（これを便宜的に単色ＣＡＲＳと呼ぶ）に比べて取得できる情報が多く、測定対象のより詳細な解析に適している。
　図５は、従来の多色ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を示す図である。短パルスレーザ光源５０１からの出力はビームスプリッタ５０２で２分岐され、一方がフォトニック結晶ファイバ５０３などの光ファイバに導入され、内部で広帯域な光（スーパーコンティニューム光と呼ばれる）が発生する。スーパーコンティニューム光はファイバからの出射後に所望の波長成分（励起光よりも波長が長い成分）のみがロングパスフィルタ５０４により抽出され、これがストークス光として用いられる。もう一方の励起光とストークス光はダイクロイックミラー５０５等により合波され、サンプル５０６に集光、照射されてＣＡＲＳ光が発生し、これを分光器５０７で検出してスペクトルを取得する。
米国特許６１０８０８１号明細書 特開２００９－２２２５３１号公報 特開２０１５－７６１２号
ＣＡＲＳ顕微鏡によって細胞の分化状態や活性状態を評価するには、生体の組成に対応するピークが多数密集している指紋領域(約８００～１８００ｃｍ－１)の活用が適している。指紋領域の信号は論文等で主に報告されている約２９００ｃｍ－１のＣＨ伸縮信号に対して１／１０程度であるため、信号のＳＮ比の向上が必要である。しかし、信号強度を上げるため照射するレーザパワーを増加させる場合、細胞へダメージを与える可能性があった。
そこで本発明者らはＣＡＲＳの非線形光学特性に着目して、信号強度の大幅な低下なくダメージを抑制する計測装置を発明した。ＣＡＲＳは信号強度がポンプ光の2乗、ストークス光の1乗に比例するため、レーザのパワーを低下させた場合その3乗に比例して信号強度が低下する。そこで本発明の一態様の光計測装置は、短パルスレーザ光源と、短パルスレーザ光源から発生されるレーザ光のパルスのうち所定のパルスのパワーを低減させるように変調する変調器と、短パルスレーザ光源から変調器を介した出射光を第一の光束と第二の光束とに分岐する分岐部と、第一の光束からスーパーコンティニューム光を生成させる光ファイバと、スーパーコンティニューム光のうちの長波長成分をストークス光とし第二の光束をポンプ光として両者を合波する合波部と、合波部で合波された光をサンプルに集光する集光光学系と、サンプルより生じた光を検出する分光器を有することを特徴とする光計測装置とした。
本発明によれば、ＣＡＲＳの信号強度を大幅に低下させず細胞へのダメージを抑制することができる。
本発明に従う基本的な構成例を示す模式図。 ＣＡＲＳにおけるエネルギー準位図。 非共鳴項χnr (3)に関係する一つのプロセス。 多色ＣＡＲＳ顕微鏡のエネルギー順位図。 従来の多色ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を示す図。 反射型ＣＡＲＳの構成例を示す図。 ガラスボトムディッシュのサンプルの例。 本発明に従う装置がパルス周波数を学習し、決定する動作を示したフローチャートの例。 パルス周波数と所定時間照射後の温度上昇の関係。 細胞サンプルへレーザ照射を継続した場合の、照射時間とレーザ集光点近傍の温度上昇を示した図。 レーザの発光条件を示す図。 ダメージと信号強度の関係を示した模式図。 短パルスレーザ光源の波長が１０６４ｎｍの場合の、ラマンシフトに対応するポンプ光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の波長、および水の吸収スペクトルを示した図。 本実施例に従う基本的な構成例を示す模式図。 本発明に従う装置がストークス光の帯域を調整後、パルス周波数を学習し決定する動作を示したフローチャートの例。 本発明に従う装置がパルス周波数を決定後、ストークス光の帯域を調整する動作を示したフローチャートの例。 ２種類の広帯域ストークス光のスペクトルと水の吸収スペクトルを示した図。 細胞サンプルへ2種類のストークス光照射を継続した場合の、照射時間とレーザ集光点近傍の温度上昇を示した図。 本実施例に従う基本的な構成例を示す模式図。 本発明に従う装置がストークス光の帯域を調整する動作を示したフローチャートの例。
　本実施例では、レーザのパルスを変調することによりダメージを低減する装置や動作の例を説明する。
（装置構成）
　図１は、本発明に従う基本的な構成例を示す模式図である。本装置の特徴はコントローラ１００によって制御されるパルス変調器１２０及び温度センサ１２１を備えていることである。以下、各構成要素について詳細に説明する。
コントローラ１００は、調整機構を含む装置全体の制御を行うとともに、ユーザからの測定指示の受け付けや測定結果の表示を行うインターフェースを備える。短パルスレーザ光源１０１は、コントローラ１００の指示に基づいて短パルスレーザ光を出射する。短パルスレーザ光源１０１はチタンサファイアレーザやファイバレーザ、マイクロチップレーザなどであり、パルス幅はナノ秒以下である。また、ピークパワーは非線形光学効果を誘起可能なキロワットオーダ以上が望ましい。波長については測定対象の吸収帯域や用いる光学部品の対応波長から選定すればよいが、８００ｎｍや１０６４ｎｍなどとすることができる。
　パルス変調器１２０はコントローラ１００からレーザ光のパルスタイミング信号を受け取り、短パルスレーザ光源から入射されたレーザ光のパルス数を半分や１／３などに間引くことによってパルス繰り返し周波数を制御する。本パルス変調器はポッケルスセルと１／２波長板によって構成してもよいし、高速シャッタやＮＤ（Neutral Density）フィルタを用いてもよい。また、パルス変調機能として短パルスレーザ光源１０１に内蔵されていてもよい。なお、このような内蔵型の場合も、本願明細書では、パルス変調器と称するものとする。
　パルス変調器にて変調されたレーザ光は１／２波長板１０２及び偏光ビームスプリッタ１０３に入射し、偏光ビームスプリッタ１０３にて偏光方向に基づいたパワー比で透過成分と反射成分とに分岐する。偏光ビームスプリッタ１０３を透過したレーザ光は、集光レンズ１０４によってフォトニック結晶ファイバ１０５の端面に集光される。フォトニック結晶ファイバはコアの周囲に蜂の巣状の中空のクラッドが形成された光ファイバであり、入射光をコアに強く閉じ込める。短パルスレーザ光を入射することによって自己位相変調等の非線形光学現象が誘起され、幅広いスペクトルを有するスーパーコンティニューム光が生成される。生成されたスーパーコンティニューム光は、コリメートレンズ１０６によって平行光となり、ロングパスフィルタ１０７によって短波長成分がカットされたのち、ポンプ光波長を反射しそれ以外の波長の光を透過するダイクロイックミラー１０８を透過してストークス光として対物レンズ１１３に入射する。
　一方、偏光ビームスプリッタ１０３を反射したレーザ光は、ミラー１０９、ミラー１１２、及びダイクロイックミラー１０８によって反射され、ポンプ光として対物レンズ１１３に入射する。対物レンズ１１３は、ダイクロイックミラー１０８によって同軸上に合波された広帯域ストークス光とポンプ光とをサンプル１１４に集光する。ＣＡＲＳ光生成効率及び空間分解能の向上のため、対物レンズ１１３の開口数は例えば０．８以上など高いほうが望ましい。
　サンプル１１４では前述のＣＡＲＳ過程が誘起され、サンプル１１４の分子種に対応する波長のＣＡＲＳ光が生成される。また、温度センサ１２１によってストークス光とポンプ光の集光点近傍の温度が測定される。この温度センサには放射温度計を用いてもよいし、細胞サンプルの場合には水が主成分であるため、温度上昇により集光点近傍で発生する気泡を観察するカメラや蒸発した水分をモニタする湿度計を用いて温度に換算してもよい。また、温度センサの代わりに細胞のダメージによる形状変化を直接モニタするカメラを用いてもよい。
　サンプル１１４には後述するパルス周波数条件の学習用の領域が設けられている。例えば図７に示すようにガラスボトムディッシュをサンプルとする場合には、ガラス部の右下１０ｘ１０ｕｍの領域７０１を細胞の存在しない培地のみの学習用とすればよい。なお、学習動作を行わない場合には本領域は無くてもよい。
　生成されたＣＡＲＳ光はコリメートレンズ１１５にて平行光となり、ノッチフィルタ１１７及びショートパスフィルタ１１８によってポンプ光及びストークス光の透過成分がカットされ、分光器１１９に入射する。分光器１１９はＣＡＲＳスペクトルを検出し、コントローラ１００にスペクトル情報を受け渡す。
　なお、パルス変調器はサンプルへの集光前であればいずれの場所に設置しても良く、例えばダイクロイックミラー１０８と対物レンズ１１３の間に設置しても良いが、この場合には広帯域の光に対応した変調器を用いる必要がある。また、図１ではポンプ光及びストークス光の入射方向と同方向に伝播するＣＡＲＳ光を検出する透過型ＣＡＲＳシステムを示したが、図６に示すように反射ＣＡＲＳ光を検出してもよい。この場合には、ポンプ光波長より短波長の光を反射し、長波長の光を透過するダイクロイックミラー１２２を用いて反射ＣＡＲＳ光を分光器１１９に導入すればよい。このような構成は入射レーザに対して不透明なサンプルや厚みのあるサンプルを測定する際に有用である。また、ミラー１０９とミラー１１２の間のポンプ光の光路は集光レンズ１０４からコリメートレンズ１０６までと同様に一般的なシングルモードファイバ等を用いたファイバ光学系としてもよい。装置の小型化が可能となるからである。
（装置動作）
　図１１はパルスの変調方法の模式図である。(ａ)は変調を行わない場合のレーザの出射波形であり、所定のピークパワーとパルス幅を有するレーザパルスが特定の繰り返し周波数で出射されている。平均パワーはこれらパルスを時間平均した値となる。（ｂ）は従来の装置によってパワーを調整した例である。パルスの繰り返し周波数を変化させることなくピークパワーを１／２とすることで平均パワーも１／２となる。このような制御はＮＤフィルタなどを用いることで容易に実現可能である。一方、（ｃ）（ｄ）は本発明に従うパルス変調方法を示した図である。（ｃ）はピークパワーを一定に保ったままパルス変調器１２０によってパルスを間引き、周波数を１／２とした例である。この場合にも平均パワーは１／２となる。また、（ｄ）は同様に３パルスに１パルスを間引いた例である。
　図８は本発明に従う装置がパルス周波数を学習し、決定する動作を示したフローチャートの例である。Ｓ８０１にてコントローラ１００が学習動作の開始を指示する。Ｓ８０２にて例えば図９に示すパルス周波数と所定時間照射後の温度上昇の関係を取得する。なお、パルスの間引きを行わないパルス周波数の高い領域から測定を行うことによって照射時間を短縮し、学習全体に要する時間を短縮することが可能である。また本動作では測定サンプルにダメージを与えることを避けるため、図７の学習用領域にて培地の温度上昇を測定してもよい。Ｓ８０３にて細胞ダメージに対応する温度上昇量の仕様からパルス繰り返し周波数を決定し、Ｓ８０４にて測定を開始する。このような動作は最初に実施した結果をコントローラ１００内蔵のメモリなどに格納しておき、以降は学習を行わず初回に決定したパルス周波数にて測定を行ってもよいが、測定毎に学習動作を行ってもよい。特に信号強度の低い細胞を測定する場合には、測定毎の周波数の最適化が有効である。
（発明の効果）
　図１０は細胞サンプルへレーザ照射を継続した場合の、照射時間とレーザ集光点近傍の温度上昇を示した図である。図１１の（ａ）に示した基準条件と、図１１（ｂ）のようにピークパワーを１／２とした場合、図１１（ｃ）のようにパルス数を１／２とした場合の３条件の比較を示した。なお、前述のようにパルス数を１／２とした場合とピークパワーを１／２とした場合の平均パワーは、ともに基準条件に対して１／２となる。
　基準条件に対してパルス数を１／２とした場合には温度上昇率が抑制されており、ピークパワーを１／２とした場合と同様に５分程度まではレーザ照射による影響が小さいことを示している。一般的にＣＡＲＳでは空間点１点当たりの測定時間が数ｍｓから数十ｍｓであるため、この場合にはサンプルに与えるダメージをほぼ無視できると考えられる。一方、信号強度はピークパワーの３乗に比例するため、ピークパワーを１／２とした場合は１／８となるのに対し、パルス数を１／２とした場合には１／２に留まる。このように、所定のパルスを照射しないように変調することで、より具体的には、パルス数を１／２以下にすることによって、所定時間照射してもサンプルに与えるダメージを劇的に低減することが可能となる。なお、パルスのパワーを１／２以下としても、信号強度は低くなるがサンプルダメージを劇的に低減させる効果がある。
　図１２は前述のダメージと信号強度の関係を示した模式図である。ピークパワーを変化させた場合には、平均パワーの低下に伴って信号強度が３乗で低下する。一方、パルス数を変化させた場合には平均パワーの低下に対して線形な低下に留まる。ここで、レーザの平均パワーが温度上昇によるダメージに対応するとして、ダメージ仕様を０．８以下、信号強度仕様を０．６以上と仮定するとパルス数を変化させる場合のみ条件を満足する。
　本実施例のようにパルスを変調することによって、ピークパワーを低下させる場合と比較して信号強度の大幅な低下なくサンプルへのダメージを抑制することが可能である。
　本実施例では、実施例１で述べたパルス変調に加えて広帯域ストークス光のスペクトル帯域の制御によるダメージ抑制について述べる。
　生体に光を照射した際、７００ｎｍ以下の光はヘモグロビンに吸収され、１４００ｎｍ以上の光は細胞の主成分である水に吸収される。その間の波長帯域はダメージを抑制しながら内部を観察することが可能な生体の窓として近年注目されている。多色ＣＡＲＳにおいては、短パルスレーザ光源の波長によっては広帯域ストークス光のスペクトル帯域が水の吸収帯域に含まれる場合がある。図１３はポンプ光となる短パルスレーザ光源の波長が１０６４ｎｍの場合の、ラマンシフトに対応するポンプ光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の波長、および水の吸収スペクトルを示した図である。水の吸収は１４００ｎｍ以上で急速に増加しており、３０００ｃｍ－１までＣＡＲＳ光を取得する場合にはストークス光の長波長領域が吸収帯域に含まれる。一方、指紋領域のみ取得する場合にはいずれの波長も水への吸収は少ない。すなわち水を主成分とする細胞サンプルへのダメージを抑制可能である。発明者らは、多色ＣＡＲＳにおける広帯域ストーク光の波長と水の吸収スペクトルの関係に着目し、細胞へのダメージを抑制し信号強度を確保する装置や動作を新規に考案した。
（装置構成）
　図１４は本実施例に従う基本的な構成例を示す模式図である。なお、実施例１と同様な要素については説明を省略する。ストークス光の帯域を制御する手段としては、（１）フォトニック結晶ファイバ(以下ＰＣＦと略記する)への入射パワー制御、（２）ＰＣＦの長さ調整、（３）波長フィルタが挙げられる。１／２波長板１０２は可動式のホルダによってコントローラ１００の指示に従って回転され、入射したレーザ光の偏光を任意の方向に変化させる。偏光ビームスプリッタ１０３はレーザ光の偏光方向に基づいて反射光と透過光のパワー分岐比を変化させるため、ＰＣＦの入射パワーが変化する。ＰＣＦ１０５は生成するストークス光が所望のスペクトル帯域となるようにその長さが調整されている。一般に、ＰＣＦへの入射パワーが同一であれば、ＰＣＦの長さの増加に伴いスペクトルが広がる傾向にある。ストークス光の帯域を１４００ｎｍ以下に制御する場合には、例えば長さを３０ｃｍ以上１ｍ以下とすればよい。生成されたストークス光はカットオフ波長可変のショートパスフィルタ１４０１へ入射し、所望の波長成分のみが透過してポンプ光と合波する。なお、ここではＰＣＦへの入射パワー調整機構、所定の長さを有するＰＣＦ、波長フィルタの全てを備える例を示したが、いずれか１つまたは２つのみでもよい。
　その他の構成は実施例１と同様であるので説明を省略する。
（装置動作）
　図１５は本発明に従う装置がストークス光の帯域を調整後、パルス周波数を学習し決定する動作を示したフローチャートの例である。なお、実施例１と同様な動作については説明を省略する。Ｓ１５０１にて所望の分子種に応じてストークス光の帯域を制御する。例えば約２９００ｃｍ－１のＣＨ伸縮信号が必要な場合にはポンプ光波長である１０６４ｎｍから約１６００ｎｍまで、指紋領域のみが必要な場合には約１３００ｎｍまでに制御する。帯域の制御には前述したＰＣＦへの入射パワー調整または波長フィルタを用いればよい。前者の場合には予めパワーと帯域の関係を分光器を用いて取得しておけばよい。また、ＰＣＦへの入射パワーを変化させてＣＡＲＳ光や非共鳴光のスペクトルを取得し、それらのスペクトルが所望の波数まで広がる条件を直接探索してもよい。この場合には図７の学習用領域にてＰＣＦへの入射パワー条件を探索すればよい。以降の動作は実施例１と同様であるので説明を省略する。
　図１６は本発明に従う装置がパルス周波数を決定後、ストークス光の帯域を調整する動作を示したフローチャートの例である。図１２に示したように、パルス周波数を低下させた場合線形な変化ではあるが信号強度が低下する。図１６の動作はダメージ抑制のため必要な信号強度が確保不能な場合に有効である。Ｓ１６０１にて決定したパルス周波数にて必要な信号強度が確保されているかを確認する。信号強度は図７の学習用領域にて培地の非共鳴光から判定してもよいし、実際のサンプルを測定してＣＡＲＳ信号強度から判断してもよい。信号が所望の強度以上であればＳ８０４にて測定を開始する。所定の強度を下回っている場合にはＳ１６０２にて必要な信号強度までパルス周波数を増加させる。Ｓ１６０３にてストークス光の帯域を制限することによってサンプルへのダメージを抑制し、Ｓ８０４にて測定を開始する。なお、その他の動作については実施例１と同様であるため説明を省略する。また学習のタイミングについても実施例１と同様に、初回のみ実施しても良いし、測定毎に実施しても良い。
（発明の効果）
　ストークス光のスペクトルとサンプルへのダメージの関係について説明する。図１７は２種類の広帯域ストークス光のスペクトルと水の吸収スペクトルを示した図である。ストークス光の長波長領域が水の吸収帯域内に含まれており、特にスペクトル帯域が広い(i)の場合には温度上昇による細胞ダメージの可能性がある。図１８は細胞サンプルへ前述の2種類のストークス光照射をそれぞれ継続した場合の、照射時間とレーザ集光点近傍の温度上昇を示した図である。ストークス(i)に対して(ii)は温度上昇率が低く、サンプルへのダメージが抑制されている。
　本実施例のようにパルス周波数の制御に加えて、ストークス光の帯域制限を行うことでよりサンプルへのダメージを抑制することができる。特に図１４の構成によってＰＣＦへの入射パワーを制限し、剰余パワーをポンプ光へ配分することによって信号強度の増加を見込むことができる。
　なお、特開２０１５－７６１２号に、「波数設定手段により設定された計測波数を実現する第１と第２の波長の組み合わせに、第１と第２の波長が共に７００ｎｍ以上１４００ｎｍ以下になる組み合わせがある場合、その組み合わせが光源調整手段によって選択される」技術について記載されているが、ポンプ光とストークス光に単一波長の光を用いるいわゆる単色ＣＡＲＳにおいて波長の選択方法を示したものであり、本願で課題としている多色ＣＡＲＳの広帯域光の制御については述べられていない。
　本実施例では、広帯域ストークス光のスペクトル帯域の制御によるダメージ抑制について述べる。
　図１９は本実施例に従う基本的な構成例を示す模式図である。実施例２の図１４に対してパルス変調器１２０を備えないことにより、より簡素な構成としている。このような構成は、例えば細胞培養装置へ組み込む場合など小型化が要求される場合に有効である。その他の要素は実施例２と同様であるので説明を省略する。
　図２０は本発明に従う装置がストークス光の帯域を調整する動作を示したフローチャートの例である。Ｓ１５０１にて例えば指紋領域に寄与する帯域にストークス光のスペクトルを制限した後、Ｓ２００１にてサンプルへのダメージを確認する。ダメージの確認は図７の学習用領域にて培地の温度上昇をモニタすればよく、Ｓ１５０１にて決定した１条件のみであるので加速試験を行わなくてもよい。ダメージが所定量以下であれば細胞の測定を開始する。一方、所定量以上であれば測定を中止する。
　本実施例によれば、広帯域ストークス光のスペクトルのうち不要な成分を除去するのみであるので、必要な信号帯域の強度を低下させることなくサンプルへのダメージを抑制することが可能である。
１００　コントローラ
１０１　短パルスレーザ光源
１０２　１／２波長板
１０３　偏光ビームスプリッタ
１０４　集光レンズ
１０５　フォトニック結晶ファイバ
１０６　コリメートレンズ
１０７　ロングパスフィルタ
１０８　ダイクロイックミラー
１０９　ミラー
１１２　ミラー
１１３　対物レンズ
１１４　サンプル
１１５　対物レンズ
１１７　ノッチフィルタ
１１８　ショートパスフィルタ
１１９　分光器
１２０　パルス変調器
１２１　温度センサ
１２２　ダイクロイックミラー
２０１　分子の基底状態
２０２　振動励起状態
２０３　中間状態
２０４　中間状態
２０５　中間状態
５０１　短パルスレーザ光源
５０２　ビームスプリッタ
５０３　フォトニック結晶ファイバ
５０４　ロングパスフィルタ
５０５　ダイクロイックミラー
５０６　サンプル
５０７　分光器
７０１　学習用領域
１４０１　ショートパスフィルタ

Claims (15)

  1. 　短パルスレーザ光源と、
    　前記短パルスレーザ光源とサンプルとの間の光路中に設けられた、前記短パルスレーザ光源から発生されるレーザ光のパルスのうち所定のパルスのパワーを低減させるように変調する変調器と、
    　前記短パルスレーザ光源からの出射光を第一の光束と第二の光束とに分岐する分岐部と、
    　前記第一の光束からスーパーコンティニューム光を生成させる光ファイバと、
    　前記スーパーコンティニューム光のうちの長波長成分をストークス光とし前記第二の光束をポンプ光として両者を合波する合波部と、
    　前記合波部で合波された光をサンプルに集光する集光光学系と、
    　前記サンプルより生じた光を検出する分光器と、
    を有することを特徴とする光計測装置。
  2. 　前記変調器は前記所定のパルスを照射しないように変調することを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  3. 　前記変調器は前記レーザ光のパルス数を１／２以下にすることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  4. 　前記変調器は前記レーザ光の所定のパルスのパワーを１／２以下に低減することを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  5. 　前記変調器は、前記短パルスレーザ光源に内蔵されていることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  6. 　前記変調器は、前記短パルスレーザ光源と前記分岐部との間に設けられていることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  7. 　さらに、水の吸収帯域における強度を低減するように前記スーパーコンティニューム光のスペクトルを調整するスペクトル調整手段が設けられていることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
  8. 　前記水の吸収帯域は１４００ｎｍから１００００ｎｍであることを特徴とする請求項７記載の光計測装置。
  9. 　前記スペクトル調整手段は、前記分岐部における前記第一の光束と前記第二の光束の光量比を調整する光量比調整手段であることを特徴とする請求項７記載の光計測装置。
  10. 　前記スペクトル調整手段は、前記第一の光束の光路中に設けられた波長フィルタであることを特徴とする請求項７記載の光計測装置。
  11. 　前記スペクトル調整手段は、前記光ファイバの長さが３０ｃｍ以上１ｍ以下であることを特徴とする請求項７記載の光計測装置。
  12. 　前記スペクトル調整手段は、前記光ファイバに入射するパワーを制御するパワー制御手段であることを特徴とする請求項７記載の光計測装置。
  13. 　短パルスレーザ光源と、
    　前記短パルスレーザ光源からの出射光を第一の光束と第二の光束とに分岐する分岐部と、
    　前記第一の光束からスーパーコンティニューム光を生成させる光ファイバと、
    　水の吸収帯域における強度を低減するように、前記スーパーコンティニューム光のスペクトルを調整するスペクトル調整手段と、
    　前記スーパーコンティニューム光のうちの長波長成分をストークス光とし前記第二の光束をポンプ光として両者を合波する合波部と、
    　前記合波部で合波された光をサンプルに集光する集光光学系と、
    　前記サンプルより生じた光を検出する分光器と、
    を有することを特徴とする光計測装置。
  14. 　サンプルの所定領域に、短パルスレーザ光源からの出射光を、第１の周波数で照射し、第１の温度上昇量を取得するステップと、
    　前記短パルスレーザ光源からの出射光を、前記第１の周波数とは異なる第２の周波数で照射し、第２の温度上昇量を取得するステップと、
    　少なくとも前記第１の温度上昇量と前記第２の温度上昇量から、前記サンプルに照射する前記出射光の周波数を決定するステップと、
    　前記決定された周波数の出射光を、前記サンプルに照射し、前記サンプルの光計測を行うステップと
    を有することを特徴とする光計測方法。
  15. 　前記出射光の周波数を決定するステップは、さらに、
    　所定の信号強度が確保されている否かを判断するステップと、
    　前記信号強度が確保されていない場合に、前記所定の信号強度が確保されるように、前記周波数を増加させるステップと
    を有することを特徴とする請求項１４記載の光計測方法。
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