JP2013171154A - 光学装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 CARS顕微鏡光学装置で生体物質等の観察物体への照射光量を増加させずに、高分解能と信号雑音比の向上を図る。
【解決手段】 観察物体202からのCARS光と、スーパーコンティニューム光の一部であって波長がω_AS=2ω_P -ω_ST である参照光とを干渉させ、干渉光から信号を取り出すことにより、信号を増幅させる。
【選択図】図１

Description

本発明は光学的な分解能を要する光学装置に関し、特に光ビームを絞り込み、光ビームの観物体に対する照射位置を相対的に変化させて応答信号を取得する光学装置に関する。

ラマン分光顕微鏡は生物関連の試料を観察するのに非常に有効である。ラマン分光顕微鏡では、観察対象に絞り込んだレーザ光を照射し、発生するラマン散乱光を検出する。ラマン散乱光は励起光波長から周波数シフトしており、分光器等でスペクトルを取る。観察対象と照射ビームの位置を相対的に変え、走査することでそれぞれの位置での分光スペクトルを得ることができる。このスペクトルをもとに画像化が可能である。それぞれの観察位置でのラマンスペクトルは、そこに存在する分子の振動励起状態を反映したものとなっており、その分子に特徴的なものとなっている。そのスペクトルの特徴を利用することで、生物の細胞を観察しているのであれば、組織内での生体分子の分布が分かる。

図２にラマン散乱が起こる過程を示すエネルギー準位図を示す。ラマン散乱にはストークス散乱とアンチストークス散乱とがあるが、図２ではストークス散乱のみを示した。７０１は分子の振動基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ω_Pのポンプ光を分子に照射すると、中間状態７０３を経て、周波数ω_Ｓの光を散乱する。このとき、分子は７０２振動励起状態の一つに帰着する。散乱光の周波数ω_Sはポンプ光より周波数の低いストークス光となっている。分子の振動励起状態の準位は複数あり、分子の種類によって振動励起状態が異なり、また中間状態から振動励起状態の準位への遷移確率が異なるため、分子特有のスペクトルが形成される。ラマンシフト周波数ΩはΩ＝ω_P−ω_Sで表され、ストークス散乱の場合は正の値となる。アンチストークス光の場合は、始状態が分子の振動励起状態であり、中間準位を経て分子の状態が振動基底状態に帰着する。この場合、ω_ASをアンチストークス光の周波数とすると、ω_P＜ω_ASとなっており、すなわちアンチストークスラマン散乱光の方がポンプ光より周波数が高い。

上記のラマン散乱は得られる散乱光の強度が弱いため測定に時間がかかる。強い散乱光が得られる方式として、CARS（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering：コヒーレント反ストークスラマン散乱）という非線形ラマン散乱を使用する分光方法がある。この方法でもラマンスペクトルを得ることが可能であり、分子の振動状態が分かる。CARSの発生のためにはピークパワーの高いパルスレーザを用いる。これにより、ラマン散乱と比べて桁違いに強い信号が得られ、すなわち高い信号雑音比の信号が得られ、計測時間が格段に短くすることができる。

CARSは３次の分極による発光であり、CARSを発生させるためには、ポンプ光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は

で表される。ここに、χ_r ⁽³⁾(ω_AS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、χ_nr ⁽³⁾は非共鳴項である。また、ポンプ光およびプローブ光の電場をE_Pで表し、ストークス光の電場はE_Sで表されている。非共鳴項は周波数依存性がない。数１のE_Sの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。CARS光の強度は以下のように表される。

CARS光が発生する機構を分子のエネルギー準位図（図３）を用いて説明する。本図は共鳴項のプロセスを示している。図１と同様に、７０１は分子の振動基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ω_Pのポンプ光と周波数ω_Sのストークス光を同時に照射する。このとき分子は中間状態７０３を介して、７０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ω_Pのプローブ光を照射すると、中間状態７０４を介して周波数ω_ASのCARS光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのCARS光の周波数はω_AS＝2・ω_P−ω_Sと表される。

数１の非共鳴項に関係する一つのプロセスを図４に示す。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、中間状態７０５を介したプロセスとなる。周波数ω_Pのポンプ光と周波数ω'_Sのストークス光の同時照射により電子等の関与する７０５の中間状態が励起され、さらに周波数ω'_Pのプローブ光を照射することにより、中間状態７０４を介して周波数ω_ASの非共鳴のCARS光が発生する。パルス幅の狭いレーザ光をストークス光として使用した場合などは、幅広い周波数の光が照射されることになるので、図４における周波数ω'_Pやω'_Sなどの光が含まれることがある。これらの共鳴CARS光と非共鳴CARS光とは互いにコヒーレントであり、干渉することになる。

ラマン散乱は１９２８年に発見されて以来、各種の分子についてスペクトルの研究がなされており、データの蓄積が進んでいる。したがって、このスペクトルデータを参照して分子の同定を行うのが望ましい。CARS光は数１、２で表されるが、ラマン散乱スペクトルに比例する部分はIm[χ_r ⁽³⁾(ω_AS)]である。これは共鳴項の複素部分であり、前述したように、非共鳴項χ_nr ⁽³⁾と干渉するので、CARSで得られるスペクトルではラマン散乱スペクトルIm[χ_r ⁽³⁾(ω_AS)]を直接得ることができない。

CARSスペクトルからラマン散乱スペクトルを抽出する方法の開発は重要な課題であり、いろいろな方式が開発されている（非特許文献１）。たとえば、強度スペクトルから位相スペクトルを回復する方法である最大エントロピー法では数学的な計算を行い、共鳴項の複素部分を求める。あるいは、干渉を利用する方法もある（非特許文献２）。この方法では、ポンプ光とストークス光を集光レンズで同時に観察試料に絞り込み、CARS信号を発生させる。他方、非共鳴のCARS信号を発生する別試料にポンプ光とストークス光を照射し、非共鳴CARS信号を得る。非共鳴CARS信号をローカル光とし、両者のCARS信号を干渉させる。非共鳴信号のローカル光にはλ／４板により円偏光とし、観察試料からのCARS光はλ／２板により偏光方向を４５度回転させる。これらのビームの干渉光を２本のビームに偏光分離し、それぞれを分光器で分光する。観察試料からのCARSの電場をE_AS (ω)としローカル光の電場をE_LOとすると、それぞれの干渉信号は

となる。ここに、Φ(ω)はローカル光とCARS信号光の位相差を表しており、Φ(ω)＝ωτ+θ_S(ω)+θ_inst(ω)のように表される。ωτは二つの光の光路差、θ_S(ω)は共鳴光による位相差、θ_inst(ω)は装置に由来する位相差である。数３、４における|E_LO|²および| E_AS (ω)|²は一方を遮断することで求めることが可能である。したがって、数３、４からtanΦ(ω) が求められ、Φ(ω)も決めることができる。まず、観察試料として非共鳴CARS光だけを発生する試料を測定することで、ωτ+θ_inst(ω)を決めておく。次に、共鳴CARSを発生する観察試料を測定する。これによりθ_S(ω)を決めることができるので、共鳴成分の複素数部分は| E_AS (ω)|sinθ_S(ω)として求めることができる。これにより、ラマン散乱スペクトルに相当するものを得ることができる。

上述の方法は非共鳴CARS光を発生する試料を用いて正確にωτ+θ_inst(ω)を決める方法である。しかし、θ_inst(ω)の周波数依存性が小さい場合で，あらかじめ得られるCARSスペクトのピーク周波数やスペクトルが平坦となる周波数が分かっているのであれば、そのスペクトルを実現するための初期値としてのθ_inst(ω)を設定すればよい。この場合は、非共鳴CARS光を発生する参照試料が不要となる。

分子構造に敏感なスペクトル領域として指紋領域と呼ばれるラマン散乱スペクトル領域（1800から800 cm^-1）がある。CARS光の検出においても同様な領域のスペクトルが得られることが望ましい。非特許文献１に紹介した方式では励起用のストークス光のスペクトル幅が140 cm^-1程度であり、この領域をカバーできない。この欠点を補うために、光源にフォトニックファイバを使用する方式が、非特許文献３に紹介されている。フォトニックファイバに超短パルスレーザを照射することでスーパーコンティニューム光（SC光）と呼ばれるブロードバンドの光を発生させ、ストークス光として使用するものである。

J. P. R. Day, K. F. Domke, G. Rago, H. Kano, H. Hamaguchi, E. M. Vartiainen, and M. Bonn "Quantitative Coherent Anti-Stokes Scattering (CARS) Microscopy," J. Phys. Chem. B, Vol. 115, 7713-7725 (2011) C. L. Evans, E. O. Potma, X. S. and Xie, "Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Spectral Interferometry: Determination of the Real and Imaginary Components of Nonlinear Susceptibility χ(3) for Vibrational Microscopy," Opt. Lett. Vol. 29, 2923-2925 (2004) M. Okuno, H. Kano, P. Leproux, V. Couderc, J. P. R. Day, M. Bonn, and H. Hamaguchi, "Quantitative CARS Molecular Fingerprintig of Single Living Cells with the Use of the Maximum Entropy Method," Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 49, 6773-6777 (2010)

CARSで生体細胞を観察するときに有用とされる点に「非侵襲」がある。CARSを発生させるためには、ポンプ光とストークス光の超短パルス光を同時に照射することになるが、一般的にCARSで使用される両励起光の波長は生体細胞で吸収されない波長を使用する。したがって、ピークパワーが低い状態では「非侵襲」であり、細胞を傷つけないと云える。しかし、ピークパワーを上げすぎるとマルチフォトンプロセスが起こり細胞に影響を与える可能性があり、「非侵襲」といえども生体細胞に照射するピークパワーは低い方が望ましい。本発明の課題は、励起光のピークパワーを抑えた条件で発生する弱いCARS信号の信号雑音比を向上させ、かつ高い空間分解能を実現することにある。

上述の課題を解決するための光学装置は、波長ω_Pの第１のレーザ光と、前記レーザとコヒーレントな関係を維持している波長ω_STの第２のレーザ光と、スーパーコンティニューム光の一部であって、波長がω_AS=２ω_P -ω_STである参照光としての第３のレーザ光と、第１、第２のレーザ光をほぼ同軸状に一致させる光学系と、第１、第２のレーザ光の位相を調整する機構と、前記第１、第２のレーザ光を集光する対物レンズと、観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、前記CARS光と前記第３のレーザ光とを干渉させる干渉光学系と、干渉光を検出する光検出器と、前記光検出器からの信号を処理する演算装置とで実現される。光学装置に表示装置が組み込まれている場合には、更に、前記演算装置の情報に基づいて画像を表示する表示装置を有する。

さらに、前記光学装置でCARSスペクトルを取るために、第１または第２のレーザを波長可変としてもよい。

さらに、前記光学装置でCARSスペクトルを取るために、第２のレーザを広帯域とし、干渉光の分光検出のために分光器を使用してもよい。

さらに、前記光学装置において、空間分解能を向上させるために、参照光の光路中に光学フィルタを設置してもよい。

本発明によると、照射レーザ光のパワーデンシティを小さくした状態でも、観察物体からのCARS光と参照光とを干渉させ、干渉光から信号を取り出すことにより、信号を増幅できる。これにより、非侵襲を維持し、信号雑音比を向上させ、かつ空間分解能を向上させることが出来る。

本発明による光学装置の一例を示す図。 通常のラマン散乱におけるストークス散乱のエネルギー準位図。 CARSにおけるエネルギー準位図。 CARSにおける非共鳴光の一例を説明するエネルギー準位図。 パルスレーザ光の周波数スペクトル。 スーパーコンティニューム光の周波数スペクトル。 ストークス光として使用されるスーパーコンティニューム光の低周波数領域の周波数スペクトル。 参照光として使用されるスーパーコンティニューム光の高周波数領域の周波数スペクトル。 光学フィルタの形状の一例を示す図。 本発明による光学装置の一例を示す図。 本発明による光学装置の一例を示す図。 本発明による光学装置の一例を示す図。

以下、本発明の光学装置を実施するための最良の形態を、図を用いて説明する。

図１に、本発明に基づく光学装置を示す。１４１はパルスレーザ光源であり、図５のスペクトルで示す中心波長ω_Pのレーザ光１６１（第1の光）を出射する。出射レーザ光の偏光方向はｓ偏光であり、２５１のビームスプリッタで２つのビームに分けられる。ビームスプリッタを透過したビームはフォトニック結晶ファイバー１４２に入射する。入射光はＳＣ光と呼ばれる図６の１６２のスペクトルで示すような光に変換される。ここではフォトニック結晶ファイバーによりＳＣ光を得ているが、分散フラット/減少ファイバ、双方向テーパファイバ等の他の手段でＳＣ光を得ることも可能である。ＳＣ光は励起光周波数ω_Pを含んだ広い範囲に及び、コヒーレントな性質は保持されている。このＳＣ光はダイクロイックミラー２５７で周波数ω_Pを境に二つのビームに分けられる。すなわち、このダイクロイックミラーを図７の１６３で示される領域の低い周波数の光は透過し、図８の１６４のスペクトルで示される領域の高い周波数の光は反射される。ダイクロイックミラー２５７の透過光（第２の光）はミラー２５９で反射され、ダイクロイックミラー２６０を透過し、ブロードバンドの周波数ω_STのストークス光として使用される。一方、ダイクロイックミラー２６０には中心波長ω_Pのポンプ光として使用されるレーザ光も入射する。このレーザ光は、２５１のビームスプリッタで反射され、さらにミラー２５２と光路差調整のためのミラー群２５３、２５４、２５５、２５６で反射された後にダイクロイックミラー２６０に達する。二つのレーザ光は同軸光となり、レンズ２６１と２０８でコリメートされた後、ダイクロイックミラー２１０で反射され、対物レンズ２０１で観察試料２０２に絞り込まれる。観察物体は走査機構１０２で走査できるようになっている。本実施例では、光学系の複雑さを避けるために、観察物体そのものを走査する方式を採用しているが、これに限定されるものではなく、集光スポット自体を走査する光学系を搭載する方式でもよい。観察物体で発生した周波数ω_AS =2ω_P -ω_STのCARS光は、対物レンズ２０１とダイクロイックミラー２１０を透過し、反射鏡２１１で反射された後、ハーフビームスプリッタ２１３に入射する。

ダイクロイックミラー２５７で反射された高周波領域のレーザ光もＳＣ光であり、周波数（ω_AS =2ω_P -ω_ST）を含む参照光（第３の光）として使用される。参照光はレンズ２５８と２０６でコリメータされ、光学フィルタ２２０を透過する。光学フィルタ２２０で部分的に遮光あるは減光されたレーザ光は、偏光ビームスプリッタ２１６とλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２１７を透過し、ミラー２１８でフレネルロム波長板２１７に戻される。ミラー２１８は光路長の調整に使用される。フレネルロム波長板２１７透過したレーザ光はｐ偏光になっており、偏光ビームスプリッタ２１６で反射され、ビームスプリッタ２１３に向かう。光学フィルタ２２０の形状の１例として遮光板を図９に示す。２５１で示す円は参照光のビーム形状を示しており、ビームの中心部を遮光するように遮光領域２５２が配置されている。遮光板は、使用する波長の光が透過するガラス基板上に円形状のクロムの金属薄膜を蒸着することにより作製可能である。この光学フィルタ２２０によりビームの周辺領域のみの光が干渉に関与することになり、空間分解能が向上する。十分な分解能の向上のためには、遮光領域の大きさはビームの有効径に対してその半径が中心より７０％以上が望ましい。また、本実施例では、光学フィルタを参照光の光路に配置した。これにより、観察物体からのCARS光を減らさず、高分解能と高信号雑音比を同時に実現できる。

ハーフビームスプリッタ２１３には偏光方向の異なる光が両方向から入射することになり、それぞれの光は２方向に分割され、２方向に干渉光が出射する。｜E_AS(ω)｜の検出のために位相ダイバーシティ検出という方法を用いる。紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の右方向に出射してくる干渉光には光学軸が２２．５度傾いたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板２２１が設置されており、集光レンズ２１５で焦点位置に置かれた分光器上に集光される。分光器前の光路中には偏光ビームスプリッタ２２３が設置されており、ｓ方向とｐ方向の成分に干渉光を分解し、それぞれを分光器１０６と分光器１０８で検出する。ここで、観察物体を焦点面の光軸上にある点物体とし、観察物体からのCARS光の複素振幅、参照光の複素振幅はそれぞれE_AS(ω)、E_LOであるものとする。分光器１０６と分光器１０８のそれぞれの波長での差動信号をI_C(ω)としたとき、I_C(ω)＝α｜E_AS(ω)｜・｜E_LO｜ cosΦ(ω)と表わされる。αは信号増幅や分光器効率等を含む係数であり、Φ(ω)は観察物体からのCARS光と参照光との位相差である。また、紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の上方向に出射する干渉光には光学軸が４５度傾いたλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２２２が挿入されている。集光レンズ２１４で集光された干渉光は分光器１０５および１０７で検出される。途中に設置されている偏光ビームスプリッタ２２４によりｓ偏光とp偏光に分離した後に、それぞれの分光器で検出される。ここで分光器１０５と１０７のそれぞれの波長での差動信号をI_S(ω)としたとき、I_S(ω)＝α｜E_AS (ω)｜｜E_LO｜ sinΦ(ω)のように表わされる。I_C(ω)およびI_S(ω)には干渉成分のみが検出されている。演算装置１０９では、

で示す計算を行う。I(ω)は観察物体のCARS光振幅と参照光の振幅に比例した形となる。したがって、波長依存性のない｜E_LO｜を大きくすることにより、｜E_AS(ω)｜を増幅した形のI(ω)を得ることが可能となる。一般的にはSC光のスペクトルは平坦ではないので、より正確なスペクトルI(ω)を得るためには、SC光の振幅スペクトルを使用した補正を行う必要がある。次に、最大エントロピー法によるCARS光の共鳴項の複素成分の抽出、あるいは前述した干渉を用いる方法により、共鳴光によって発生した位相差を計算し、共鳴項の複素成分[I(ω) sinθ_S(ω)]の抽出を行う。分光器における検出はCCD等の検出器を使用してもよい。１１０は表示装置であり、観察物体２０２の走査位置と表示位置の対応をつけた表示がなされる。分子振動に特徴的な周波数位置でのI(ω)を表示することで、その分子の分布を知ることができる。

光軸からx軸上で距離a離れたところにある焦点面上の観察物体として点物体は、ポンプ光、ストークス光で照射され、CARS光を発生しているものとする。ポンプ光およびストークス光の2次元振幅点像分布関数をそれぞれh_P 、h_Sとし、発生したCARS光の分光器上での2次元振幅点像分布関数をh_ASとする。光学系の倍率をMとし、それぞれの４つの分光器上では光軸からMa離れた位置を中心とした点像分布h_AS(x−Ma,y)が形成される。また、同時に参照光は光軸を中心とした点像分布h_AS(x,y)となる。干渉の結果、数５の出力から形成されるCARS光のある波長における2次元振幅点像分布関数をh_CARSとしたとき、x軸上での絶対値を取った２次元振幅点像分布関数|h_CARS(a, 0)|は

のように表わされる。面積分は検出器上で行われる。コヒーレント光学系になっているので、光学的には点像分布関数は数６を平方したものになる。しかし、物質の濃度に比例するIm[χ_r ⁽³⁾(ω_AS)]も平方した形になるので、数６では平方をつけていない。CARS光を使用せず、かつ干渉光学系を使わない通常の光学系での点像分布関数は、たとえばポンプ光の波長では|h_P (a,0)|²となる。この通常の点像分布関数と比較して、数６では励起光の部分で| h_S(a,0) |が乗じられている点と積分の項が乗算されることから、CARS光の点像分布関数が狭くなり、分解能が向上する。さらに、参照光に光学フィルタを配置した場合は、数６の積分内の参照光の2次元振幅点像分布関数h_AS(x,y)を狭くすることが出来るので、さらにCARS光の点像分布関数が狭くなり、空間分解能の向上が図られる。

透過タイプの実施例を図１０に示す。CARS光の出射方向の強度分布は観察物体の形状と大きさで異なる。一般にはCARS光の後方散乱はCARS光を発する分子が含まれている観察物体が大きくなるほど弱くなる。他方、前方散乱は逆の依存性を示す。図１０に示した実施例はこの前方散乱のCARS光を検出するための構成となっている。図１の構成と異なる点はポンプ光とストークス光の照射方向が観察試料の反対方向から入る点である。すなわち、ダイクロイックミラー２５７を透過したストークス光（第２の光）とミラー２５６で反射されたポンプ光（第1の光）をそれぞれミラー２５９とダイクロイックミラー２６０により同軸光とし、レンズ２６１と２０８でコリメート光とする。コリメートされた同軸レーザ光はミラー２１０で反射された後、対物レンズ２０７で観察試料２０２に絞り込まれる。観察試料から前方方向に発生したCARS光は対物レンズ２０１を透過し、図１の実施例と同様な干渉計測が行われる。

図１の実施例と図１０の実施例は別の光学系としたが、光路の切り替えによって、一つの光学系で実施可能である。

前述の実施例では互いに直交する直線偏光を干渉させる方式を採用し、位相ダイバーシティ検出を行った。他の方式としては、観察物体からのCARS光と参照光とを円偏光の状態で直交させて、干渉させる方法もある。たとえば、CARS光を右円偏光、参照光を左円偏光とする。干渉させた光を検出するための検光子の光学軸を０、４５、９０、１３５度に設定すると、ビームの位相差が相対的に０、９０、１８０、２７０度のものが得られる。これらの信号を組み合わせることで、数５で表される信号を得ることができ、前述の実施例と同様な効果を得ることができる。

図１１の実施例では、図１の実施例での検出ビーム数を２本にして、簡略化を図っている。２６０のダイクロイックミラーで同軸にされたポンプ光（第1の光）およびストークス光（第２の光）はコリメートされ、光学シャッター２１９を透過し、観察試料２０２に集光される。観察試料から発生した周波数ω_AS =2ω_P -ω_STのCARS光はフレネルロム波長板２２５により円偏光に変換され、ミラー２１１によりハーフビームスプリッタ２１３に入射する。また、ダイクロイックミラー２５７で反射された高周波領域のレーザ光（第３の光）は２５８および２０６のレンズでコリメートされ、周波数（2ω_P -ω_ST）を含む参照光として使用される。参照光は光学シャッター２０９および高分解能を実現するための光学フィルタ２２０を透過する。その後、偏光ビームスプリッタ２１６を透過し、フレネルロム波長板２１７で円偏光に変換され、光路長調整用のミラー２１８で反射される。反射された参照光は逆回りの円偏光となり、２１７のフレネルロム波長板でｐ偏光になり、２１６の偏光ビームスプリッタで反射される。２２６は２２．５度傾けたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板であり、参照光の偏光方向を４５度傾ける。参照光はビームスプリッタ２１３に入射し、左側から入射した観察試料からのCARS光と干渉する。重ねあわされた光は集光レンズ２１４に向かい、集光された干渉光は偏光ビームスプリッタ２２４で2分割され、それぞれの分光器１０５および１０７上に集光される。光学シャッター２１９と２０９が開いているときは、分光器１０５からは数３で表される信号が出力され、分光器１０７からは数４で表される信号が出力される。光学シャッター２１９を閉め、光学シャッター２２５を空けておくことで、それぞれの分光器１０５、１０７には|E_LO|²が出力される。逆に光学シャッター２１９を開け、２２５の光学シャッターを閉めることにより、それぞれの分光器には|E_S(ω)|²が出力される。これらの出力から演算装置１０９で|E_LOE_S(ω)|を計算する。この結果を用いて、最大エントロピー法によるCARS光の共鳴項の複素成分の抽出、あるいは前述した干渉を用いる方法により共鳴光による発生する位相差を計算し、共鳴項の複素成分[I(ω) sinθ_S(ω)]の抽出を行い、ラマン分光と等価な結果を得る。

図１２の実施例では分光器を使用しない。これにより装置の小型化が可能になる。１４３は周波数ω_Pのポンプ光（第1の光）用の光源であり、１４４は周波数ω_STのストークス光（第２の光）の光源である。両者は同期の取られたモードロックレーザであり、狭帯域のパルスレーザである。ポンプ光は光学パラメトリック発振器等により波長可変となっている。２５２、２５４，２５５のミラーはストークス光の光路長の調整を行うためのものである。ダイクロイックミラー２６２でポンプ光とストークス光が同軸光になり、その同軸光はビームスプリッタ２６３で二つに分けられる。透過同軸光はミラー２６４で反射され、レンズ２６１、２０８でコリメートされる。コリメートされた同軸光は、ダイクロイックミラー２１０で反射され、対物レンズ２０１で観察試料に集光される。発生した観察試料からのCARS光は対物レンズ２０１とダイクロイックミラー２１０を透過し、ビームスプリッタ２１３に向かう。ビームスプリッタ２６３で反射された同軸光はレンズ２５８、２０６でコリメートされ、ダイクロイックミラー２６５を透過した後、参照光発生試料２０３上に対物レンズ２６６により集光される。参照光発生試料からは非共鳴光のCARS光だけが発生し、第３の光として使用される。参照光であるCARS光は対物レンズ２６６を透過しダイクロイックミラー２６５で反射される。２２０は光学フィルタであり、空間分解能を向上させる機能を持つ。この光学フィルタは参照光の光路に設けているが、これは、高分解能と高信号雑音比を同時に実現するためである。２２７は位相変調器であり、観察試料からのCARS光との位相差をつける。本実施例では第３の光を位相変調器により位相変調しているが、第１あるいは第２の光、観察試料２０２から発生したCARS光を位相変調しても同様の効果が得られる。観察試料および参照光発生試料からのCARS光はビームスプリッタ２１３で重ねあわされて、長波長カットフィルタ２６７を透過する。長波長カットフィルタ２６７はポンプ光とストークス光を取り除く。干渉光はレンズ２１４で検出器１１２に絞り込まれ、検出される。１１２はアバランシェホトダイオードの検出器であり、ここでは分光器を使用しない。検出信号はロックインアンプ１１３で処理され、表示装置１１０で表示される。ここで、観察試料および参照光発生試料からのCARS光の位相差をδとすると、検出信号は以下のように表される。

E_LOは参照光発生試料からの非共鳴CARS光の振幅を表し、E_AS(ω_AS)は観察試料から発生したCARS光の振幅を表す。位相差δを位相変調器２２７で変調すると、数７で示すように強度変調に変換される。ロックインアンプ１１３で位相敏感検波によりサイン成分を取り出し、検出信号とすることでIm χ_r ⁽³⁾(ω_AS)に比例した値を得ることができる。ポンプ光の波長を変えれば、ω_ASも変わりスペクトルを得ることができる。また、ポンプ光の波長を特定分子の共鳴波長に合わせ、観察試料２０２を走査機構１０２で走査することでその分子の分布を計測することも可能である。

なお、本実施例では、第１の光を波長可変としたが、第２の光であるストークス光を波長可変としても良い。第１または第２の光を波長可変とすることで、分光器を使用せずにスペクトルを得ることができる。

また、上記実施例では、何れも観察物体を走査する例を示したが、観察物体に限らず、光学系を走査しても良い。

本発明によれば、CARS光を用いた高分解能な画像を取得することができ、非侵襲で生体分子の分布あるいは分布の変化を計測するための光学装置に適用することができる。

１０２：走査機構、１０５、１０６，１０７，１０８：分光器、１０９：演算装置、１１０：表示装置、１１３：ロックインアンプ、１４１：パルスレーザ光源、１４２：フォトニック結晶ファイバー、２０１：対物レンズ、２０２：観察物体、２０３：参照光発生試料、２０７：対物レンズ、２０９：光学シャッター、２１０：ダイクロイックミラー、２１３：ビームスプリッタ、２１４：集光レンズ、２１６：偏光ビームスプリッタ、２１７：フレネルロム波長板、２１８：ミラー、２２０：光学フィルタ、２２１：フレネルロム波長板、２２２：フレネルロム波長板、２２３：偏光ビームスプリッタ、２２４：偏光ビームスプリッタ、２２５：光学シャッター、２２６：フレネルロム波長板、２２７：位相変調器、２６７：長波長カットフィルタ。

CARS光が発生する機構を分子のエネルギー準位図（図３）を用いて説明する。本図は共鳴項のプロセスを示している。図２と同様に、７０１は分子の振動基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ω_Pのポンプ光と周波数ω_Sのストークス光を同時に照射する。このとき分子は中間状態７０３を介して、７０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ω_Pのプローブ光を照射すると、中間状態７０４を介して周波数ω_ASのCARS光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのCARS光の周波数はω_AS＝2・ω_P−ω_Sと表される。

上述の課題を解決するための光学装置は、周波数ω_Pの第１のレーザ光と、前記レーザとコヒーレントな関係を維持している周波数ω_STの第２のレーザ光と、周波数がω_AS=２ω_P -ω_STである参照光としての第３のレーザ光と、第１、第２のレーザ光をほぼ同軸状に一致させる光学系と、第１、第２のレーザ光の位相を調整する機構と、前記第１、第２のレーザ光を集光する対物レンズと、観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、前記CARS光と前記第３のレーザ光とを干渉させる干渉光学系と、干渉光を検出する光検出器と、前記光検出器からの信号を処理する演算装置とで実現される。光学装置に表示装置が組み込まれている場合には、更に、前記演算装置の情報に基づいて画像を表示する表示装置を有する。

図１に、本発明に基づく光学装置を示す。１４１はパルスレーザ光源であり、図５のスペクトルで示す中心周波数ω_Pのレーザ光１６１（第1の光）を出射する。出射レーザ光の偏光方向はｓ偏光であり、２５１のビームスプリッタで２つのビームに分けられる。ビームスプリッタを透過したビームはフォトニック結晶ファイバー１４２に入射する。入射光はＳＣ光と呼ばれる図６の１６２のスペクトルで示すような光に変換される。ここではフォトニック結晶ファイバーによりＳＣ光を得ているが、分散フラット/減少ファイバ、双方向テーパファイバ等の他の手段でＳＣ光を得ることも可能である。ＳＣ光は励起光周波数ω_Pを含んだ広い範囲に及び、コヒーレントな性質は保持されている。このＳＣ光はダイクロイックミラー２５７で周波数ω_Pを境に二つのビームに分けられる。すなわち、このダイクロイックミラーを図７の１６３で示される領域の低い周波数の光は透過し、図８の１６４のスペクトルで示される領域の高い周波数の光は反射される。ダイクロイックミラー２５７の透過光（第２の光）はミラー２５９で反射され、ダイクロイックミラー２６０を透過し、ブロードバンドの周波数ω_STのストークス光として使用される。一方、ダイクロイックミラー２６０には中心周波数ω_Pのポンプ光として使用されるレーザ光も入射する。このレーザ光は、２５１のビームスプリッタで反射され、さらにミラー２５２と光路差調整のためのミラー群２５３、２５４、２５５、２５６で反射された後にダイクロイックミラー２６０に達する。二つのレーザ光は同軸光となり、レンズ２６１と２０８でコリメートされた後、ダイクロイックミラー２１０で反射され、対物レンズ２０１で観察試料２０２に絞り込まれる。観察物体は走査機構１０２で走査できるようになっている。本実施例では、光学系の複雑さを避けるために、観察物体そのものを走査する方式を採用しているが、これに限定されるものではなく、集光スポット自体を走査する光学系を搭載する方式でもよい。観察物体で発生した周波数ω_AS =2ω_P -ω_STのCARS光は、対物レンズ２０１とダイクロイックミラー２１０を透過し、反射鏡２１１で反射された後、ハーフビームスプリッタ２１３に入射する。

ダイクロイックミラー２５７で反射された高周波領域のレーザ光もＳＣ光であり、周波数（ω_AS =2ω_P -ω_ST）を含む参照光（第３の光）として使用される。参照光はレンズ２５８と２０６でコリメータされ、光学フィルタ２２０を透過する。光学フィルタ２２０で部分的に遮光あるは減光されたレーザ光は、偏光ビームスプリッタ２１６とλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２１７を透過し、ミラー２１８でフレネルロム波長板２１７に戻される。ミラー２１８は光路長の調整に使用される。フレネルロム波長板２１７を透過したレーザ光はｐ偏光になっており、偏光ビームスプリッタ２１６で反射され、ビームスプリッタ２１３に向かう。光学フィルタ２２０の形状の１例として遮光板を図９に示す。２５１で示す円は参照光のビーム形状を示しており、ビームの中心部を遮光するように遮光領域２５２が配置されている。遮光板は、使用する波長の光が透過するガラス基板上に円形状のクロムの金属薄膜を蒸着することにより作製可能である。この光学フィルタ２２０によりビームの周辺領域のみの光が干渉に関与することになり、空間分解能が向上する。十分な分解能の向上のためには、遮光領域の大きさはビームの有効径に対してその半径が中心より７０％以上が望ましい。また、本実施例では、光学フィルタを参照光の光路に配置した。これにより、観察物体からのCARS光を減らさず、高分解能と高信号雑音比を同時に実現できる。

ハーフビームスプリッタ２１３には偏光方向の異なる光が両方向から入射することになり、それぞれの光は２方向に分割され、２方向に干渉光が出射する。｜E_AS(ω)｜の検出のために位相ダイバーシティ検出という方法を用いる。紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の右方向に出射してくる干渉光には光学軸が２２．５度傾いたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板２２１が設置されており、集光レンズ２１５で焦点位置に置かれた分光器上に集光される。分光器前の光路中には偏光ビームスプリッタ２２３が設置されており、ｓ方向とｐ方向の成分に干渉光を分解し、それぞれを分光器１０６と分光器１０８で検出する。ここで、観察物体を焦点面の光軸上にある点物体とし、観察物体からのCARS光の複素振幅、参照光の複素振幅はそれぞれE_AS(ω)、E_LOであるものとする。分光器１０６と分光器１０８のそれぞれの周波数での差動信号をI_C(ω)としたとき、I_C(ω)＝α｜E_AS(ω)｜・｜E_LO｜ cosΦ(ω)と表わされる。αは信号増幅や分光器効率等を含む係数であり、Φ(ω)は観察物体からのCARS光と参照光との位相差である。また、紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の上方向に出射する干渉光には光学軸が４５度傾いたλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２２２が挿入されている。集光レンズ２１４で集光された干渉光は分光器１０５および１０７で検出される。途中に設置されている偏光ビームスプリッタ２２４によりｓ偏光とp偏光に分離した後に、それぞれの分光器で検出される。ここで分光器１０５と１０７のそれぞれの周波数での差動信号をI_S(ω)としたとき、I_S(ω)＝α｜E_AS (ω)｜｜E_LO｜sinΦ(ω)のように表わされる。I_C(ω)およびI_S(ω)には干渉成分のみが検出されている。演算装置１０９では、

Claims (10)

1. 波長ω_Pの第１の光と、
   前記光とコヒーレントな関係を維持している波長ω_STの第２の光と、
   スーパーコンティニューム光の一部であって、波長がω_AS=2ω_P -ω_ST である参照光としての第３の光と、
   第１、第２の光をほぼ同軸状に一致させる光学系と、
   第１、第２の光の位相を調整する機構と、
   前記第１、第２の光を集光する対物レンズと、
   観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、
   前記CARS光と前記第３の光とを干渉させる干渉光学系と、
   干渉光を検出する光検出器と、
   前記光検出器からの信号を処理する演算装置と、
   を有することを特徴とする光学装置。
2. 請求項１に記載の光学装置において、
   前記第２の光はブロードバンドのレーザ光であり、分光器を用いた位相ダイバーシティ法を使用することを特徴とする光学装置。
3. 請求項２に記載の光学装置において、
   前記第２のレーザ光はスーパーコンティニューム光の一部であることを特徴とする光学装置。
4. 請求項１に記載の光学装置において、
   更に、前記演算装置に基づいて画像を表示する画像表示装置を有することを特徴とする光学装置。
5. 請求項１に記載の光学装置において、
   前記参照光の光路に光学フィルタを設置することを特徴とする光学装置。
6. 請求項５に記載の光学装置において、
   前記光学フィルタは光軸近傍の光を主に遮光し、光軸から離れた周辺の光を透過することを特徴とする光学装置。
7. 請求項１に記載の光学装置において、
   前記干渉光は、前記観察物体を透過した光を利用して形成されることを特徴とする光学装置。
8. 波長ω_Pの第１の光と、
   前記光とコヒーレントな関係を維持している波長ω_STの第２の光と、
   非共鳴CARS光を発生する参照試料と、
   前記第１および第２の光を前記参照試料に同時照射することで発生する非共鳴CARS光である第３の光と、
   第１、第２の光をほぼ同軸状に一致させる光学系と、
   第１、第２の光の位相を調整する機構と、
   前記第１、第２の光を集光する対物レンズと、
   観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、
   前記CARS光と前記第３の光とを干渉させる干渉光学系と、
   干渉光を検出する光検出器と、
   前記第３の光の光路に設置された光学フィルタと、
   前記光検出器からの信号を処理する演算装置と、
   を有することを特徴とする光学装置。
9. 請求項８に記載の光学装置において、
   前記第１から第３の光の一つ、あるいは前記観察試料から発生したCARS光を位相変調する位相変調器と、ロックインアンプとを備えたことを特徴とする光学装置。
10. 請求項８に記載の光学装置において、
    前記第１または第２の光は、波長可変であることを特徴とする光学装置。

Images