JP4753947B2 - 位相感応性ヘテロダイン・コヒーレント・アンチ・ストークス・ラマン散乱顕微分光法、ならびに顕微鏡観察システムおよび方法 - Google Patents

Description

本願は、２００４年６月９日出願の米国特許仮出願連続番号第６０／５７８，１４６号の優先権を主張する。

本発明は、一般には顕微鏡観察法（マイクロスコピー）システムに関し、より特定的には、コヒーレント・アンチ・ストークス・ラマン散乱（ＣＡＲＳ）振動画像形成（イメージング）に関する。

ＣＡＲＳ振動イメージングは、生物学試料を蛍光伝達物質でラベル付けする必要なく高感度で視覚化できるため、生物学上で有効な手段であることが示されている。感度は良いのだが、ＣＡＲＳマイクロスコピーは特定の振動信号とともに固有に発生する非共鳴背景信号の存在によって妨害される。ＣＡＲＳは、振動共鳴部分χ_ｒｅｓ ^（３）と非共鳴電子寄与χ_ｎｒ ^（３）との和である３次非線形光学感受率χ^（３）から発生する。背景信号は微弱共鳴信号を圧し、干渉混合により信号を汚染し、対象となる共鳴信号の正しい再構築を妨げる。非共鳴背景の存在は、ＣＡＲＳマイクロスコピーの感度のさらなる向上を制約する主要因である。ＣＡＲＳマイクロスコピーのある種の生物学および臨床上の応用では、背景を完全に抑圧し、共鳴信号の完全な抽出が望まれる。

非共鳴背景に加えて、現在の最新のＣＡＲＳ顕微鏡には他にもいくつかの制約がある。第１に、ＣＡＲＳ信号は対象の分子エンティティの濃度に対して二次的にスケーリングする。これは微弱信号の定量評価の妨げとなる。信号と濃度との線形依存は、取得した画像とスペクトルの定量分析に有益と考える。第２に、現在の最新のＣＡＲＳ顕微鏡では、微弱信号の増幅はできない。微弱ＣＡＲ信号の検出は難しいので、微弱信号の増幅手段は非常に有益と考える。最後に、共鳴比は分子のラマン行動から得られる。非常に多くの生化学化合物の自発ラマンの断面とスペクトルが文献に十分に記録されているが、ＣＡＲＳ信号は文献中のラマン値と直接比較することはできない。ＣＡＲＳ信号と自発ラマン値とを相関させるのが困難であるため、日常的な画像形成手段としてＣＡＲＳマイクロスコピーを応用することに、さらなる制約を課している。

特許文献１には、ＣＡＲＳ信号を逆方向または後方向に検波することによって、ＣＡＲＳマイクロスコピーの非共鳴背景を抑制する方法が記載されている。だがこの文献に記載されているシステムは、フォーカスした、水とは異なる光感受率をもつ副波長サイズの非共鳴特徴からの寄与は抑制しない。またこのシステムは、微弱信号の増幅方法は提供しないし、またＣＡＲＳ信号とラマン断面値とを定性的に関連付ける方法も提供しない。

特許文献２には、異なる偏光のポンプおよびストークス場を用いてＣＡＲＳマイクロスコピーの非共鳴背景を抑制する方法が記載されている。分析器（偏光子）を用いて背景を抑制すると、信号の非共鳴寄与を除去するだけでなく、共鳴寄与をも減衰するおそれがある。このため偏光感応性のマイクロスコピーの使用は、共鳴信号が非常に強力な場合の考察に限定されうる。また偏光ＣＡＲＳ顕微鏡では、Ｉｍχ_ｒｅｓ ^（３）の分離は不可能であり、ラマン断面との直接比較はできない。

米国特許第６，８０９，８１４号 米国特許第６，７９８，５０７号

上記のことから、ＣＡＲＳマイクロスコピーの感度を改善するシステムおよび方法、特に、微弱ＣＡＲＳ信号の画像形成を改善したＣＡＲＳ検波法を提供することが必要とされている。また、多様な生化学化合物のＣＡＲＳ信号と自発ラマン値とを比較する方法が求められている。

本発明の実施形態に従えば、本発明は、試料の体積中に誘起される非線形のコヒーレントな場を検出するシステムを提供する。システムは、第１周波数で第１電磁場を発生する第１のソースと、第２周波数で第２電磁場を発生する第２のソースと、第１および第２の電磁場を試料の体積方向に導く第１の光学系と、第１および第２の電磁場を局部発振器の体積方向に導く第２の光学系と、干渉計とを含む。干渉計は、試料体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第１の散乱場と、局部発振器の体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第２の散乱場とを干渉させる。

本発明の他の実施形態に従えば、本発明は、試料の体積中に誘起される非線形のコヒーレントな場の検出を助けるシステムを提供する。システムは、第１周波数で第１電磁場を受信する第１のソース入力と、第２周波数で第２電磁場を受信する第２のソース入力と、第１および第２の電磁場を試料の体積方向に導く出力光学系と、局部発振器の光学系とを含む。局部発振器の光学系は、第１および第２の電磁場を局部発振器の体積方向に誘導し、かつ局部発振器の体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第１の散乱場も試料の体積方向に導き、これにより第１の散乱場と、試料体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第２の散乱場との間で干渉を発生させる。

本発明のさらに他の実施形態に従えば、本発明は、試料の体積中に誘起される非線形のコヒーレントな場を検出する方法を提供する。この方法は、第１周波数で第１電磁場を発生するステップと、第２周波数で第２電磁場を発生するステップと、第１および第２の電磁場を第１の焦点レンズを通って試料の体積方向に導くステップと、第１および第２の電磁場を第２の焦点レンズを通って局部発振器の体積方向に導くステップと、試料体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第１の散乱場を、局部発振器の体積中で第１の電磁場と第２の電磁場との相互作用により発生する第２の散乱場で干渉させるステップとを含む。方法はまた、第１の散乱場と第２の散乱場との干渉に応答する干渉信号を付与するステップも含む。

以下の説明は添付図面を参照すればより良好に理解できると考える。

添付図面は例示としてのみ示す。

一実施形態によれば、本発明は関心のある振動共鳴信号の分離および増幅が可能なＣＡＲＳ顕微鏡システムを提供する。各種実施形態において、本発明のシステムは、微弱ＣＡＲＳ信号をより良好に画像形成するＣＡＲＳ検波方法を提供し、また非共鳴背景信号の抑制方法を提供する。ある実施形態では、本発明のシステムは、対象となる分子エンティティの濃度に線形な共鳴信号を発生する。さらに、発生した信号は文献から得られる自発ラマンデータと直接比較することができる。

非共鳴背景の問題に対する一つの解決法は、共鳴と非共鳴の非線形光感受率間の基本的な差を利用する方法であり、ここでχ_ｎｒ ^（３）は実数成分のみを含み、χ_ｒｅｓ ^（３）は実数成分と虚数成分の両方を含む。χ_ｒｅｓ ^（３）の虚部は、自発ラマン断面に比例する（Ｓ_{Ｒａｍａｎ}∝Ｉｍ{χ^（３）}）。虚部を求められれば、共鳴情報を得ることができる。場の虚部は実部より９０°遅延しているので、局部発振器の場とのヘテロダイン方式の混合と同じく、慎重な位相制御によって共鳴情報が直接抽出される。

ヘテロダイン検波は、いわゆる局部発振器によって明確な特徴をもつ別個のＣＡＲＳ場を発生することを含み、この場が試料からの信号と線形に混合される。信号の場と局部発振器の場との位相は制御可能できるので、信号の場と局部発振器の場との建設的かつ破壊的な干渉を制御できる。この位相制御は信号の場の正確な振幅および位相決定方法となり、ひいては信号に実数寄与および虚数寄与を与える。

ヘテロダイン検波には多くの魅力的な性質がある。第一に、信号の虚部を非共鳴背景の寄与への干渉なく独自に分離できる。第２に、虚数成分を自発ラマン散乱断面およびラマンスペクトルのプロファイルと直接相等させることができる。第３に、ヘテロダイン信号は濃度に線形に比例するので、画像を定量的にそのまま変換できる。第４に、ヘテロダイン混合は、強力な局部発振器の場と混合することにより微弱ＣＡＲＳ信号の増幅が可能である。従って、ヘテロダイン検波方式を用いたマイクロスコピーは、共鳴信号を選択的に検波し増幅する。

局部発振器の場と信号の場とをヘテロダイン干渉させるには、並列と直列の２つの干渉計使用法（インターフェロメトリ）の構成が用いられる。並列インターフェロメトリでは、局部発振器の場と信号の場とは異なる場所で発生し、これらを混合して干渉させる。直列インターフェロメトリでは、まず局部発振器の場を発生し、これをポンプビームおよびストークスビームとともに試料中に入れる。局部発振器の場が焦点の体積中に新たに形成される信号場と干渉して信号が発生する時点で、干渉が発生する。直列の方法は、既存の商業用顕微鏡にほとんど修正を加えずに組み合わせることができるので、並列の方法に比較して有利である。

図１Ａに、本発明の一実施形態に従う並列インターフェロメトリ顕微鏡構成におけるヘテロダイン検波の実施例を示す。このシステムでは、局部発振器の場の位相を、ＣＡＲＳ信号の場に対するＩｍχ_ｒｅｓ ^（３）寄与を選択的かつ直接的に抽出できるような特定の設定にできる。この方法は、ＣＡＲＳ顕微分光法（マイクロスペクトロスコピー）、ならびにＣＡＲＳイメージングに応用できる。ヘテロダインＣＡＲＳ顕微鏡の特徴、例えば信号の濃度に対する線形依存性、および信号と自発ラマンデータとの率直な関係等は、完全に本発明の技術独自のものである。

図１Ａに示すように、一実施形態のシステム１０は、マッハツェンダー（Ｍａｃｈ−Ｚｅｈｎｄｅｒ）干渉計の原理に一部基づくことができる。システム１０は、ポンプ信号１２とストークス信号１４とをそれぞれ与えるポンプ源およびストークス源と、ダイクロイックミラー１６と、分光フィルタ１８と、立法形ビームスプリッタ２０と、短波通過型ダイクロイックミラー２２，２４と、局部発振器パス２６（局部発振器の体積と対物レンズを含む）と、試料パス２８（試料の体積と対物レンズを含む）と、別の立法形ビームスプリッタ３０と、４０ｎｍ帯域幅の帯域通過フィルタ３２と、検波器３４とを含む。顕微鏡の対物レンズは、同一の２枚の高開口数のレンズを含みうる。

同一線形に伝播するパルスで励起された２つの（ポンプおよびストークス）ビームは、立法形ビームスプリッタ２０で２部分に分割される。これらビームの直線偏光された部分が干渉計の２つのパス２６，２８にそれぞれ送られる。励起ビームの強度は減衰フィルタを通すことで制御できる。一般的には、局部発振器パス２６中の励起強度は試料パス２８中の励起強度を上回る。局部発振器パス２８のパス長は、正確な位相制御のためにステッパモータおよび圧電スキャナで、図中に「Ａ」で示すように調節可能である。各パスで生成されるＣＡＲＳ信号は、後（エピ）方向にコリメートされ（本願に引用して援用する米国特許第６，８０９，８１４号等に記載）、ダイクロイックミラー２２および２４によって入射光から分離される。両アームからのＣＡＲＳ信号は第２の立法形ビームスプリッタ３０で組み合わせられる。次いで、混合されたビームは分光計を備えた検波器３４、または分光器一体型の検波器で検波されうる。

図１Ｂは、本発明の一実施形態に従う直列インターフェロメトリ顕微鏡構成におけるヘテロダイン検波の実施例を示す。このシステムもまた、位相を特定の設定にすることが可能で、ＣＡＲＳマイクロスペクトロスコピーおよびＣＡＲＳ画像形成に応用できる。この実施形態は、図１Ａに示すヘテロダインＣＡＲＳ顕微鏡のすべての特徴を保持する。

図１Ｂに示すように、他の実施形態のシステム４０もまた、マッハツェンダー干渉計の原理に一部基づくことができる。システム４０は、ポンプ信号４２とストークス信号４４とをそれぞれ与えるポンプ源およびストークス源と、ダイクロイックミラー４６と、分光フィルタ４８と、立法形ビームスプリッタ５０と、長さ調整可能なポンプおよびストークスパス５２（図中「Ｂ」で示すように調整可能）と、局部発振器パス５４とを含む。ポンプおよびストークスパス５２の出力は、別のダイクロイックミラー５６で局部発振器パス５４の出力と組み合わされる。局部発振器パス５４は、局部発振器の体積５８と、関連の対物レンズとを含む。ダイクロイックミラー５６からの混合出力は、スキャナ６２と対物レンズおよび試料体積ユニット６４と検波器６６とを備えた、商業用スキャン顕微鏡６０に与えられる。

同一線形に伝播するパルスで励起された２つの（ポンプおよびストークス）ビームは、立法形ビームスプリッタ５０で２部分に分割される。これらビームの直線偏光された部分が干渉計の２つのパス５２，５４にそれぞれ送られる。励起ビームの強度は減衰フィルタを通すことで制御できる。遅延パス５２のパス長は、正確な位相制御のためにマイクロメータおよび圧電スキャナで、図中に「Ｂ」で示すように調節可能である。局部発振器パスで生成される局部発振器ＣＡＲＳ信号は、短波通過ダイクロイックミラー５６で遅延されたポンプおよびストークスビームと組み合わされ、商業用顕微鏡６０に送られる。商業用顕微鏡の操作によりＣＡＲＳ信号の場を発生し、焦点の体積中で局部発振器の場と干渉させられる。次いで、干渉したビームは顕微鏡の検波器、例えば強度検波器または分光計一体型の検波器で検波される。

各種実施形態において、本発明は様々なバージョンのヘテロダインＣＡＲＳ顕微鏡を提供することができ、各バージョンの違いは励起と検波のモードである。例えば、スペクトルを分解し空間的には静止状態のマイクロスコピー用ＣＡＲＳ干渉計の開発が可能であり、これは顕微鏡用の体積から記録したＣＡＲＳスペクトル（χ_ｒｅｓ ^（３））の実部と虚部を分解する装置を含む。かかるシステムでは、試料の特定の位置にビームをフォーカスして、この位置でスペクトルの実成分および虚成分χ_ｒｅｓ ^（３）を求める。この方法は、ピコ秒単位のパルスのポンプビームと、フェムト秒単位のパルスの広帯域ストークスビームを用いる広帯域励起方法に基づく。干渉計の２つのパスで生成した試料および局部発振器からの広帯域ＣＡＲＳ信号を互いに干渉させ、得られたスペクトルのインターフェログラムはスペクトロメータで記録される。

他の実施形態では、空間を分解しスペクトルは静止状態のマイクロスコピー用ＣＡＲＳ干渉計を開発でき、これはスペクトル中のある特定の点についてχ_ｒｅｓ ^（３）の虚部を空間上の位置の関数として測定する装置を含む。対応する空間マップは、背景がなく、濃度が線形で、フォーカスしているエンティティのラマン断面に比例するＣＡＲＳ画像を導出できる。この方法は、狭帯域のピコ秒単位のパルスのポンプビームと、狭帯域のピコ秒単のストークスビームを用いる。干渉計の２つのパスで生成した試料および局部発振器からの狭帯域のＣＡＲＳ信号を互いに干渉させ、光検波器で検波する。虚部のみを記録するためには、試料パスと局部発振器パスとの位相差を９０°に設定する。局部発振器の背景を抑制するには、位相変調器をロックインアンプとともに使用する。

マイクロスペクトロスコピーにＣＡＲＳ干渉計を用いる方法は、分光干渉計使用法に基づく。試料パスからの広帯域ＣＡＲＳの場Ｅ_ｓ（ω）と、局部発振器パス中の非共鳴試料から発生した広帯域ＣＡＲＳ局部発振器の場Ｅ_ｌｏ（ω）とが干渉する。干渉は、検出したスペクトル強度に対して正弦変調として現れる。
ここで、Φ（ω）＝ωτ＋φ_ｓ（ω）＋φ_ｉｎｓｔ（ω）は２つの場の間の全位相差とする。ここで、τは干渉計の２つのアーム間の時間遅延を示し、φ_ｓ（ω）は試料によって導入される位相差を示し、φ_ｉｎｓｔ（ω）は干渉計の光成分による相対的位相遅延を示す。位相情報はスペクトルの干渉縞（フリンジ）のスペーシング中にエンコードされ、スペクトルのインターフェログラムから抽出できる。φ_ｓ（ω）の値が与えられると、χ^（３）（ω）の実数成分および虚数成分も簡単に求められる(Ｒｅχ^（３）∝｜Ｅ_ｓ（ω）｜ｃｏｓφ_ｓ（ω）、およびＩｍχ^（３）∝｜Ｅ_ｓ（ω）｜ｓｉｎφ_ｓ（ω）)。

図２は、このようなシステムを並列のエピ構成にした場合の実験的設定を示す。システム７０は、ポンプ信号７２とストークス信号７４とをそれぞれ与えるポンプ源およびストークス源と、ダイクロイックミラー７６と、分光フィルタ７８と、立法形ビームスプリッタ８０と、短波通過型ダイクロイックミラー８２，８４と、局部発振器パス８６と、試料パス８８と、別の立法形ビームスプリッタ９０と、１／４波長板９２と、２つの４０ｎｍ帯域幅の帯域通過フィルタ９４および９６と、偏光ビームスプリッタ９８と、格子分光計ＣＣＤ１００と、シングルフォトン・アバランシェ光ダイオード１０２とを含む。顕微鏡の対物レンズは、同一の２枚の高開口数のレンズを含みうる。

このマイクロスペクトロスコピーシステムは、狭帯域のピコ秒単位のポンプビームと、広帯域のフェムト秒単位のストークスビームとを用いる。マッハツェンダー干渉計パスの相対長を制御するには、局部発振器パス上にステッパモータと閉ループ圧電スキャナとを直列にインストールして、図中「Ｃ」で示すようにパス長の粗調整および微調整ができるようにする。試料パス中で、ポンプビームおよびストークスビームは、高開口数のレンズを用いて試料にフォーカスされる。局部発振器（ＬＯ）パス中でも同じレンズを用いて、カバーガラス／空気臨界面等の非共鳴試料から局部発振器の場を発生させる。ＣＡＲＳ信号と局部発振器の場とを逆方向すなわち後ろ方向（エピ方向）に集めて、ダイクロイックミラー８２，８４によってポンプビームおよびストークスビームから分離する。次いで、２つのＣＡＲＳビームは立法形ビームスプリッタ９０で組み合わされ、混合した信号をスペクトルおよび時間検出器へ同時に送る。スペクトル・インターフェログラムは、窒素冷却したＣＣＤ等の検波器１００を備えた分光計でモニタされる。時間的インターフェログラムの記録のため、シングルフォトン・アバランシェホトダイオード１０２と圧電スキャナとを用いる。

スペクトル分解された位相情報は、Ｌｅｐｅｔｉｔｅらによって開発された方法を用いて、インターフェログラムから抽出できる。試料からのＣＡＲＳビームは１／４波長板９２を通過して円形偏光ビームとなる。ビームスプリッタ９０で局部発振器のＣＡＲＳビームと組み合わせた後、偏光ビームスプリッタ９８（局部発振器の偏光に対して４５°の角度に設定される）は、混合したＣＡＲＳビームを２つの直交して偏光する成分に分割する。これら２つの直線偏光ビームは、スペクトルが消散し、２つの別個のインターフェログラムがＣＣＤ１００によって同時に検出される。得られる２つのスペクトグラムはπ／２だけ位相シフトしており、一方の値を他方の値で除算すると全スペクトル位相Φ（ω）の正接が得られる。

図３Ａおよび３Ｂは、ＣＡＲＳインターフェログラムの時間ドメインとスペクトルドメインの比較をそれぞれ示す。特定的には、図３Ａは、ラマンシフトが２８４５ｃｍ^−１付近でＣＨ伸縮振動帯域に同調した状態で記録した、ドデカンの時間インターフェログラム１１０を示す（正の時間遅延の長い後縁部分は狭い振動線幅から生じる）。図３Ｂは、パスのオフセット１ｐｓで非共鳴試料（カバーガラス）から同時に回収した直交する偏光信号１１２，１１４の分光インターフェログラムを示す（実線）。抽出したΦ_ｒｅｆ（ω）位相は破線１１６で示す。

原理上、時間インターフェログラムは分光インターフェログラムと同じ位相情報をもつ。だが実際は、時間インターフェログラムから振幅および位相を求めるには、時間的スキャンによって入手しなければならない高品質データのフーリエ変換が必要である。図３Ｂの分光インターフェログラムの記録にはスキャンは不要であり、ショットノイズが制限され、時間的なレーザの揺らぎに対してまったく感応しなかった。

非共鳴試料を共鳴試料に交換すると、共鳴スペクトルの位相プロファイルをそのまま確認できる。図４Ａおよび図４Ｂは、ドデカンのＣＨ伸縮振動帯域のスペクトルの振幅と位相を示す。図４Ａは、分光インターフェログラムから抽出したＣＡＲＳ振幅（実線）１２０と、位相（破線）１２２とを示す。図４Ｂは、再構築したＣＡＲＳスペクトルの実部（破線）１２４と、ＣＡＲＳスペクトルの虚部（実線）１２６とを示す。挿入したグラフは、比較用としてＣＨ伸縮振動範囲におけるドデカンのラマンスペクトル１２８を示し、自発ラマンスペクトルと虚ＣＡＲＳスペクトルとの類似性を指摘している。再構築した虚スペクトルは純粋に共鳴性で非共鳴背景の寄与がなく、ラマンスペクトルのすべての特徴を再現している。

さらに他の実施形態では、本発明は、ＣＡＲＳ干渉計システムを以下のようにマイクロスコピーに利用できる。ＣＡＲＳ干渉計イメージングでは、試料パスで発生した狭帯域幅のＣＡＲＳ場Ｅ_ｓと、局部発振器パスで発生した局部発振器の場Ｅ_ｌｏとを干渉させる。組み合わされた場は強度光検波器で検波される。従って、信号全体は次のように記述できる。
ここでΦは両パス間の全位相差を示す。最後の２項はヘテロダイン項であり、位相差の設定に左右される。位相が９０°に設定されていれば、余弦項が消え、同時に正弦項が最大となる。後者はＥ_ｌｏに対して線形スケーリングし、そして重要な点として、ＣＡＲＳ場に対する虚数寄与に対して線形スケーリングする。この虚数寄与はまた、対象量であるＩｍχ^（３）にも比例する。Ｉｍχ^（３）を信号全体から分離するには、前の３項を抑制しなければならない。寄与｜Ｅ_ｌｏ｜^２と｜Ｅ_ｓ｜^２とは、位相変調とロックイン検波によって好都合に消去でき、第３項は位相を９０°に設定すれば消去できる。

図５は、前向き検波を用いる直列構成に基づいたＣＡＲＳイメージング用干渉計顕微鏡設定のシステム１３０を示す。システム１３０は、ポンプ信号１３２とストークス信号１３４とをそれぞれ与えるポンプ源およびストークス源と、ダイクロイックミラー１３６と、分光フィルタ１３８と、立法形ビームスプリッタ１４０と、ポンプおよびストークスパス１４２（パス長は図中「Ｄ」で示すように調節可能）と、局部発振器パス１４４と、短波通過型ダイクロイックミラー１４６とを含む。局部発振器パス１４４は、局部発振器の体積１４８と位相変調器１５０とを含む。ポンプおよびストークス出力信号と局部発振器の出力信号とが組み合わされて、スキャナ１５４と高開口数レンズ１５６と光電子増倍管等の光検波器１５８とを含む商業用ビームスキャン顕微鏡１５２に送られる。

局部発振器パス１４４では、局部発振器の場が発生する。位相変調器１５０は、ＬＯ場に高周波（例えば１０ＭＨｚ）の位相シフトを加える。ＬＯビームは信号パスでポンプおよびストークスビームと重畳され、商業用顕微鏡に送られ、ここでビームをビームスキャナで高速スキャンするラスタスキャンが行われる。試料の体積中で発生したＣＡＲＳ場と事前に発生させた局部発振器の場とが混合される。この結果、ヘテロダインＣＡＲＳ信号は変調周波数で変調される。ヘテロダイン信号は、光電子増倍管信号をロックインアンプ１６０（位相ロックしたループ等）に与えることによって、分離できる。ロックインアンプ１６０は、位相変調器１５０からドライバ１６２を介して位相変調信号も受信する。ロックインアンプ１６０でフィルタした信号は、その後コンピュータ１６４へ送られ、コンピュータは信号をスキャナの位置の関数としてプロットする。

局部発振器の場とＣＡＲＳ場との位相を圧電制御した遅延段で制御することにより、信号の実部および虚部を別個に検波できる。図６Ａは哺乳類の生体細胞からのＣＡＲＳ信号の虚成分１７０を示し、図６Ｂは同じＣＡＲＳ信号の実成分１７２を示す。Φを９０°に設定すると虚信号のみを現し、位相設定Φ＝０の場合はＣＡＲＳ信号の実部だけを測定する。虚画像には非共鳴背景がなく、濃度が線形で、局部発振器場の調整可能な振幅で線形に増幅されている。得られる画像は対応の自発ラマン画像に直接関係づけられるが、ただしＣＡＲＳを用いた画像取得は自発ラマン散乱を用いた場合よりも４桁以上高速である。

他の実施形態では、コリメートしたビームパスに立法形ビームスプリッタを追加し、かつエピ検波の前にコリメートしたビームをデスキャン（ｄｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）して、エピ検波型の干渉計ＣＡＲＳ顕微鏡を実現できる。また、ビームスキャナを２Ｄ圧電制御段等の試料スキャナで代用してもよい。

当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上述した各実施形態に対して多数の変形および変更が可能であると理解できると考える。

本発明のある実施形態に従う並列干渉計システムの概略図である。 本発明のある実施形態に従う直列干渉計システムの概略図である。 本発明の他の実施形態に従う分光干渉計システムの概略図である。 本発明の一実施形態に従うシステムにおいて試料の時間ドメインを示すＣＡＲＳインターフェログラムの概略グラフである。 本発明の一実施形態に従うシステムにおいて試料のスペクトルドメインを示すＣＡＲＳインターフェログラムを概略グラフである。 本発明の一実施形態に従うシステムにおいて試料のＣＡＲＳスペクトルの振幅と位相との関係を示す概略グラフである。 本発明の一実施形態に従うシステムにおいて試料のＣＡＲＳスペクトルの振幅と実スペクトルおよび虚スペクトルとの関係を示す概略グラフである。 本発明の一実施形態に従う直列の画像形成干渉計システムの概略図である。 本発明の一実施形態に従い、生化学試料のＣＡＲＳ画像の記録を虚応答から得たコントラストで表現した図である。 本発明の一実施形態に従い、生化学試料のＣＡＲＳ画像の記録を実応答から得たコントラストで表現した図である。

Claims (15)

1. 試料体積中で誘起される非線形コヒーレント場を検出するシステムであって、
   第１周波数で第１電磁場を発生する第１のソースと、
   第２周波数で第２電磁場を発生する第２のソースと、
   前記第１の電磁場の第１の部分および第２の電磁場の第１の部分を前記試料体積方向に導く第１の光学系と、
   前記第１の電磁場の第２の部分および第２の電磁場の第２の部分を局部発振器の体積方向に導く第２の光学系と、
   前記試料体積中で前記第１の電磁場の第１の部分と前記第２の電磁場の第１の部分との相互作用により発生する第１の散乱場と、前記局部発振器中で前記第１の電磁場の第２の部分と前記第２の電磁場の第２の部分との相互作用により発生する第２の散乱場とを混合する第３の光学系と、
   前記第１の散乱場と前記第２の散乱場に応答して、少なくとも前記第１の散乱場の実成分と虚成分を検出する検出システムであって、干渉計から供給される出力信号に応答して前記第１の散乱場の振幅情報と位相情報とを求め、前記振幅情報と前記位相情報から前記実成分と虚成分を検出する検出システムと、
   を含むシステム。
2. 前記第１の散乱場は第１の位相を有し、前記第２の散乱場は前記第１の位相と異なる第２の位相を有する、請求項１に記載のシステム。
3. 前記第１の位相と前記第２の位相の少なくとも一方は、前記第１の位相と前記第２の位相の他方の位相とは無関係に変更可能である、請求項２に記載のシステム。
4. 前記第１の散乱場のパス長と前記第２の散乱場のパス長との差は変更可能である、請求項１に記載のシステム。
5. 前記システムは顕微分光法（マイクロスペクトロスコピー）に使用される、請求項１に記載のシステム。
6. 前記システムは顕微鏡観察法（マイクロスコピー）に使用される、請求項１に記載のシステム。
7. 前記試料体積と前記局部発振器体積とは光路上互いに並列位置に配置される、請求項１に記載のシステム。
8. 前記試料体積と前記局部発振器体積とは光路上互いに直列位置に配置される、請求項１に記載のシステム。
9. 前記第２の散乱場は、前記第１の電磁場と前記第２の電磁場とともに前記第１の光学系の少なくとも一部を通る、請求項８に記載のシステム。
10. 前記システムは、前記検出システムに接続し得る位相ロック増幅器をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
11. 試料体積中で誘起される非線形コヒーレント場を検出する方法であって、
    第１周波数で第１電磁場を発生するステップと、
    第２周波数で第２電磁場を発生するステップと、
    前記第１の電磁場の第１の部分および第２の電磁場の第１の部分を、第１の焦点レンズを通って前記試料体積方向に導くステップと、
    前記第１の電磁場の第２の部分および第２の電磁場の第２の部分を、第２の焦点レンズを通って局部発振器の体積方向に導くステップと、
    前記試料体積中で前記第１の電磁場の第１の部分と前記第２の電磁場の第１の部分との相互作用により発生する第１の散乱場と、前記局部発振器体積中で前記第１の電磁場の第２の部分と前記第２の電磁場の第２の部分との相互作用により発生する第２の散乱場とを干渉させるステップと、
    前記第１の散乱場と前記第２の散乱場との干渉に応答して、少なくとも前記第１の散乱場の実成分と虚成分を決定するステップであって、干渉計から供給される出力信号に応答して前記第１の散乱場の振幅情報と位相情報とを求め、前記振幅情報と前記位相情報から前記実成分と虚成分を決定するステップと、
    を含む方法。
12. 前記方法は、前記第１の散乱場の第１の位相と前記第２の散乱場の第２の位相との位相差を調整するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法は、前記第１の散乱場と前記第２の散乱場とを前記試料体積中で混合するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. 前記方法は、前記第２の散乱場を前記試料体積より前に前記第１および第２の電磁場と混合するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. 前記方法は、前記出力信号を検波器で受信するステップと、検波信号を位相ロック増幅器に与えるステップとをさらに含む、請求項１１に記載の方法。