JP5577998B2

JP5577998B2 - 非線形顕微鏡及び非線形観察方法

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Publication number: JP5577998B2
Application number: JP2010218951A
Authority: JP
Inventors: 直樹福武
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Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2014-08-27
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Also published as: JP2012073152A

Description

本発明は、非線形顕微鏡及び非線形観察方法に関する。

近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料を観察対象とした３次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも空間分解能の高い共焦点顕微鏡は、古くから現在に至るまで広く使われている。従来の共焦点顕微鏡は、生体試料に含まれる蛍光分子が照射光の強度に対して線形な強度で発する蛍光（線形光学過程による信号）を観測するものであるが、近年になると、生体試料に含まれる特定種類の分子が照射光の強度に対して非線形な強度で発する光（非線形光学過程による信号）を観測する非線形顕微鏡が注目されつつある（特許文献１等を参照。）。

非線形顕微鏡は、照射光として比較的長い波長の光（例えば近赤外線）を用いるので、試料の深部まで観察することが可能である。また、上述した非線形過程は対物レンズの焦点近傍の微小領域でしか生起しないので、非線形顕微鏡が取得する画像は極めて薄い層の画像（セクショニング画像）となる。

特開２００６−２３３８７号公報

しかし、非線形顕微鏡で発生する物体光はコヒーレントなので、被観察物から射出した物体光束のうち或る条件を満たした光線同士が互いに打ち消し合う。この打ち消し合いが発生すると、結像光束に含まれるべき必要な光線が欠落し、セクショニング画像に対して試料の像が良好に反映されない虞がある。

具体的には、セクショニング画像に含まれる各周期構造の強度バランスが、試料に含まれる各周期構造の強度バランスから離れてしまい、例えば、試料上では殆ど目立たなかったはずの周期構造がセクショニング画像上では著しく目立つ、といった不都合が発生する虞がある。

そこで本発明は、被観察物の構造を良好に反映したセクショニング画像を取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法を提供することを目的とする。

本発明を例示する非線形顕微鏡の一態様は、光源から供給される照明光を前記被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手段と、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光のうち、前記照明光の上流側へ向かって射出した光である反射物体光を受光し、受光した光の強度を示す信号を生成する検出手段と、前記物体光の０次回折成分と同じ角度を有し、かつ、前記物体光と同じ波長を有したコヒーレントな光である参照光を、前記受光前の前記反射物体光と干渉させる干渉手段と、前記被観察物中の被観察面を前記集光点で走査しながら、前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込み、前記被観察面上の前記信号の分布を計測する制御手段とを備え、前記干渉手段は、前記光源から供給される照明光を非線形結晶上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させると共に、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光を、前記参照光として使用する。

また、本発明を例示する非線形観察方法の一態様は、光源から供給される照明光を前記被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手順と、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光のうち、前記照明光の上流側へ向かって射出した光である反射物体光を受光し、受光した光の強度を示す信号を生成する検出手順と、前記物体光の０次回折成分と同じ角度を有し、かつ、前記物体光と同じ波長を有したコヒーレントな光である参照光を、前記受光前の前記反射物体光と干渉させる干渉手順と、前記被観察物中の被観察面を前記集光点で走査しながら、前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込み、前記被観察面上の前記信号の分布を計測する制御手順とを含み、前記干渉手順では、前記光源から供給される照明光を非線形結晶上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させると共に、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光を、前記参照光として使用する。

本発明によれば、被観察物の構造を良好に反映したセクショニング画像を取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法が実現する。

第１実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。対物レンズ１６がコヒーレントな反射物体光により伝達可能な構造の空間周波数域を示す図である。生体試料１０の構造と伝達可能な構造とを波数空間上で比較する図である。非線形結晶１８の構造を波数空間上で表した図である。第２実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。対物レンズ１６ｒがコヒーレントな反射物体光により伝達可能な構造の空間周波数域と、対物レンズ１６ｔがコヒーレントな透過物体光により伝達可能な構造の空間周波数域とを示す図である。第３実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。第３実施形態の変形例が伝達可能な構造の空間周波数域を示す図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態としてＳＨＧ顕微鏡を説明する。

先ず、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成を説明する。図１は、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり本実施形態のＳＨＧ顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、コリメートレンズ１２と、ビームスプリッタ１３と、ダイクロイックミラー１４と、光スキャナ１５と、対物レンズ１６と、試料ステージ３０と、ハーフミラー２４と、集光レンズ２５と、ピンホール絞り２６と、光検出器２７と、対物レンズ１７と、非線形結晶１８と、対物レンズ１９と、遅延回路２０と、全反射ミラー２１と、波長選択フィルタ２２と、減光率が可変の減光フィルタ（ＮＤフィルタ）２３と、制御部４０とが備えられる。

試料ステージ３０には、透明な生体試料１０が配置される。生体試料１０に含まれる特定種類の分子（タンパク質など）が、ＳＧＨ顕微鏡の観察対象となる。以下、観察対象となる特定種類の分子を「観察対象分子」と称す。

パルスレーザ光源１１は、パルスレーザ光Ｌ０を発振する。このパルスレーザ光Ｌ０の光周波数は、観察対象分子のＳＨＧ（第２高調波発生）に必要な光周波数ωに設定される。また、このパルスレーザ光Ｌ０のパルス幅及びパルス高さは、後述するレーザスポットＳ１、Ｓ１’の中央の微小領域のエネルギー密度が、ＳＨＧに必要なエネルギー密度となるように設定されている。

パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光Ｌ０は、コリメートレンズ１２へ入射する。コリメートレンズ１２へ入射したパルスレーザ光Ｌ０は、平行光束となってビームスプリッタ１３へ入射し、ビームスプリッタ１３を透過するパルスレーザ光Ｌ１と、ビームスプリッタ１３を反射するパルスレーザ光Ｌ１’とに振幅分割される。よって、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ１’の間では、光周波数は等しい。また、ここでは、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ１’の間では、パルスレーザ光Ｌ１’のほうが強度は強いとする。

ビームスプリッタ１３を透過したパルスレーザ光Ｌ１は、ダイクロイックミラー１４へ入射した後、ダイクロイックミラー１４を反射する。ダイクロイックミラー１４を反射したパルスレーザ光Ｌ１は、光スキャナ１５へ入射し、光スキャナ１５のＹスキャン用のガルバノメータ１５ＹとＸスキャン用のガルバノメータ１５Ｘとを経由した後、対物レンズ１６へ入射する。

なお、Ｙスキャンとは、生体試料１０において光軸方向（Ｚ方向）に垂直な所定方向（Ｙ方向）へのレーザ走査のことであり、Ｘスキャンとは、生体試料１０においてＺ方向及びＹ方向に垂直な所定方向（Ｘ方向）へのレーザ走査のことである。

対物レンズ１６へ入射したパルスレーザ光Ｌ１は、対物レンズ１６の焦点面上に集光する。この対物レンズ１６の開口数は、例えば０．９に設定される。また、対物レンズ１６の焦点面は、生体試料１０の深部の特定面に一致しており、この特定面が観察対象面１０Ａとなる。以下、この観察対象面１０Ａ上でパルスレーザ光Ｌ１の照射される部分を「レーザスポットＳ１」と称す。

このレーザスポットＳ１の中央の微小領域に観察対象分子が存在していれば、コヒーレントな第２高調波（ＳＨＧ光）が発生する。このＳＨＧ光の光周波数は、レーザスポットＳ１を形成したパルスレーザ光Ｌ１の光周波数ωの２倍（＝２ω）である。

生体試料１０において、ＳＨＧ光は、パルスレーザ光Ｌ１の上流側と下流側との双方に向けて射出するが、上流側に向けて射出したＳＨＧ光（反射物体光）は、対物レンズ１６によって捕らえられるが、下流側に向けて射出したＳＨＧ光（透過物体光）は、対物レンズ１６によって捕らえられることはない。

対物レンズ１６へ入射した反射物体光Ｌ２は、レーザスポットＳ１を形成したパルスレーザ光Ｌ１の光路を逆向きに辿り、光スキャナ１５を介してダイクロイックミラー１４へ入射する。

ダイクロイックミラー１４へ入射した反射物体光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１４を透過し、ハーフミラー２４へ向かう。なお、ダイクロイックミラー１４の特性は、光周波数が２ωである光を透過し、かつ光周波数がωである光を反射する特性に設定されている。よって、余分なパルスレーザ光Ｌ１がダイクロイックミラー１４からハーフミラー２４へ向かうことは無い。

ハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２は、ハーフミラー２４を透過した後、集光レンズ２５へ入射する。集光レンズ２５へ入射した反射物体光Ｌ２は、集光レンズ２５によって集光された後、ピンホール絞り２６を介して光検出器２７へ入射する。なお、ピンホール絞り２６の配置先は、集光レンズ２５の集光面であり、ピンホール絞り２６のピンホールの配置先は、レーザスポットＳ１と共役な位置であり、ピンホールのサイズは、レーザスポットＳ１に対応したサイズである。

光検出器２７は、光電子増倍管などの検出器であり、制御部４０から与えられる駆動信号に応じて、入射光の光量を電気信号に変換する受光素子、例えばＰＭＴ（フォトマルチプライヤ）である。光検出器２７が生成した信号は、制御部４０によって取り込まれる。

一方、ビームスプリッタ１３を反射したパルスレーザ光Ｌ１’は、対物レンズ１７へ入射する。対物レンズ１７へ入射したパルスレーザ光Ｌ１’は、対物レンズ１７の焦点面上に集光する。なお、対物レンズ１７の焦点面は、非線形結晶１８の深部の特定面に一致している。以下、この特定面上でパルスレーザ光Ｌ１’の照射される部分を「レーザスポットＳ１’」と称す。

非線形結晶１８は、χ^（２）結晶である。よって、レーザスポットＳ１’の中央の微小領域では、コヒーレントな第２高調波（ＳＨＧ光）が発生する。このＳＨＧ光の光周波数は、レーザスポットＳ１’を形成したパルスレーザ光Ｌ１’の光周波数ωの２倍（＝２ω）である。

非線形結晶１８において、ＳＨＧ光は、パルスレーザ光Ｌ１’の上流側と下流側との双方に向けて射出するが、上流側に向けて射出したＳＨＧ光（反射物体光）は、対物レンズ１９によって捕らえられないが、下流側に向けて射出したＳＨＧ光（透過物体光）は、対物レンズ１９によって捕らえられる。

対物レンズ１９へ入射した透過物体光Ｌ２’は、平行光束となり、遅延回路２０の全反射ミラー２０ａ、２０ｂを反射した後、全反射ミラー２１にて反射し、波長選択フィルタ２２、ＮＤフィルタ２３を介してハーフミラー２４へ入射する。なお、波長選択フィルタ２２の特性は、光周波数が２ωである光を透過し、かつ光周波数がωである光をカットする特性に設定されている。よって、余分なパルスレーザ光Ｌ１’が波長選択フィルタ２２からハーフミラー２４へ向かうことは無い。

ハーフミラー２４へ入射した透過物体光Ｌ２’は、生体試料１０の側からハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２と同様に、集光レンズ２５及びピンホール絞り２６を介して光検出器２７へ入射する。

ここで、前述した遅延回路２０は、図１中に矢印で示す方向へとシフト可能であって、このシフトにより、生体試料１０で発生した反射物体光Ｌ２と、非線形結晶１８で発生した透過物体光Ｌ２’との間の光路長差が調整される。本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、その光路長差は、反射物体光Ｌ２が光検出器２７へ入射するタイミングと、透過物体光Ｌ２’が光検出器２７へ入射するタイミングとが一致するように予め調整される。

したがって、反射物体光Ｌ２と、透過物体光Ｌ２’とは、光検出器２７の手前で干渉する。

なお、干渉に供される一方の光である反射物体光Ｌ２の強度は、レーザスポットＳ１の微小領域における観察対象分子の密度に応じた強度となるのに対し、干渉に供される他方の光である透過物体光Ｌ２’の強度は、所定強度（ＮＤフィルタ２３の減光率に応じた強度）となる。このような透過物体光Ｌ２’は、反射物体光Ｌ２の強度を検出する際の参照光（ホモダイン検出の局部発振光のような光）として使用される。透過物体光Ｌ２’の働きについては、後に詳述する。

制御部４０は、光スキャナ１５を駆動しながら、各走査位置において、パルスレーザ光源１１のパルスレーザ発振を行うと共に光検出器２７からの信号取り込みを行う。そして、制御部４０は、各走査位置で取り込まれた信号の値を二次元状に並べることにより、観察対象面１０Ａのセクショニング画像を取得し、不図示のモニタへ表示する。なお、試料ステージ３０を光軸方向（Ｚ方向）にシフトさせると、生体試料１０における観察対象面１０Ａの高さを変更することができる。

次に、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の効果を説明する。図２は、対物レンズ１６がコヒーレントな反射物体光により伝達可能な構造の空間周波数域（＝対物レンズ１６のコヒーレントトランスファーファンクションの分布域）を示す図である。図２（Ａ）は、ＸＺ方向の波数空間を示し、図２（Ｂ）は、ＹＺ方向の波数空間を示している。これらの図２（Ａ）、（Ｂ）において＋Ｚ方向が、反射物体光の進行方向である。

図２（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり、対物レンズ１６が伝達可能な構造の空間周波数域（伝達域）５０Ａは、波数空間上の＋Ｚ側に位置し、波数空間上の原点近傍の低周波域５０Ａ’をカバーしていない。

したがって、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡において、対物レンズ１６の結像光束である反射物体光Ｌ２は、生体試料１０の構造（観察対象分子の分布）のうち、高周波成分により発生した光を含んでいる可能性はあるものの、低周波成分により発生した光を含んでいる可能性は無い。

ここで、一例として、生体試料１０の構造が図３（Ａ）に示すような構造であった場合を考える。この構造は主に、伝達域５０Ａの内部にピークを有する高周波成分Ｈ１と、伝達域５０Ａの内部の別の位置にピークを有する高周波成分Ｈ２と、低周波域５０Ａ’の中心にピークを有するＤＣ成分Ｌとからなる。

この場合、生体試料１０の本来の像は、主に、高周波成分Ｈ１及び高周波成分Ｈ２が成す干渉縞と、高周波成分Ｈ１及びＤＣ成分Ｌとが成す第２の干渉縞と、高周波成分Ｈ２及びＤＣ成分Ｌが成す第３の干渉縞とによって構成されるべきである。以下、このように、複数の必要な干渉縞によって構成された像を、「理想的な像」と称す。

しかし、実際の反射物体光Ｌ２は、図３（Ａ）→図３（Ｂ）に示すとおり、伝達域５０Ａから外れているＤＣ成分Ｌを伝達することができないので、反射物体光Ｌ２が単独で形成する生体試料１０の像は、高周波成分Ｈ１及び高周波成分Ｈ２が成す第１の干渉縞のみによって構成された、不自然な像となってしまう。これが、前述した不具合（例えば、試料上では殆ど目立たなかった周期構造がセクショニング画像上では著しく目立つ、といった不具合）の主な原因である。

そこで、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、対物レンズ１６の結像光束である反射物体光Ｌ２に対し、対物レンズ１９の結像光束である透過物体光Ｌ２’を、光検出器２７の手前で干渉させている。

また、非線形結晶１８は一様な物体であるため、非線形結晶１８の構造は、図４に示すとおりＤＣ成分Ｌ’のみからなる。

よって、透過物体光Ｌ２’に実際に含まれる光線は、ＤＣ成分Ｌ’（図４）を伝達する光線（＝非線形結晶１８の０次回折成分）のみとなる。

しかも、前述したとおり、透過物体光Ｌ２’は、生体試料１０で発生した物体光では無いものの、生体試料１０で発生した物体光と同じ波長を有している。

したがって、透過物体光Ｌ２’は、ＤＣ成分Ｌ（図３（Ａ））を伝達すべき光（＝生体試料１０の０次回折成分）と同じ角度及び同じ波長を有した光（コヒーレントな光）である。

したがって、透過物体光Ｌ２’を、反射物体光Ｌ２に対して光検出器２７の手前で干渉させれば、高周波成分Ｈ１、Ｈ２（図３（Ｂ））と共にＤＣ成分Ｌ’（図４）を光検出器２７の側へ伝達することができるので、前述した理想的な像に近い像を、生体試料１０の像として得ることができる。

しかも、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、ＮＤフィルタ２３により透過物体光Ｌ２’の強度を調節することができる。よって、生体試料１０の種類（具体的には、生体試料１０に固有のＤＣ成分の量）に応じてその強度を予め調整しておけば、生体試料１０の像に対するＤＣ成分Ｌ’の寄与度を最適化することができる（つまり、光検出器２７から見たＤＣ成分Ｌ’の強度をＤＣ成分Ｌの強度と同じにすることができる。）。これによって、生体試料１０の像を、理想的な像に確実に近づけることができる。

以上の結果、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡が取得するセクショニング画像は、生体試料１０の構造を良好に反映する。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態のＳＨＧ顕微鏡の変形例である。

先ず、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成を説明する。図５は、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。図５において、図１に示した要素と同じ要素には同じ符号を付した。図５に示すとおり本実施形態のＳＨＧ顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、コリメートレンズ１２と、ダイクロイックミラー５１と、対物レンズ１６ｒと、生体試料１０を支持する透過型の試料ステージ３０と、対物レンズ１６ｔと、全反射ミラー５２１、５２２、５２３と、遅延回路２０と、全反射ミラー５２４と、波長選択フィルタ２２と、ハーフミラー２４と、集光レンズ２５と、ピンホール絞り２６と、光検出器２７とが備えられる。

このような構成のＳＨＧ顕微鏡では、非線形結晶１８が省略されており、非線形結晶１８で発生した透過物体光の代わりに、生体試料１０で発生した透過物体光が、参照光として使用される。また、このＳＨＧ顕微鏡では、光スキャナ１５が省略されており、光スキャナ１５を駆動する代わりに、試料ステージ３０をＸＹ面内（光軸と垂直な面内）で走査することにより、レーザ走査を行う。

パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光Ｌ１の光周波数は、第１実施形態のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ１’と同じ光周波数ωに設定され、パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅及びパルス高さは、後述するレーザスポットＳ１の中央の微小領域のエネルギー密度が、ＳＨＧに必要なエネルギー密度となるように設定されている。

パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光Ｌ１は、コリメートレンズ１２へ入射する。コリメートレンズ１２へ入射したパルスレーザ光Ｌ１は、平行光束となってダイクロイックミラー５１へ入射し、ダイクロイックミラー５１を透過する。

ダイクロイックミラー５１を透過したパルスレーザ光Ｌ１は、対物レンズ１６ｒへ入射する。この対物レンズ１６ｒの開口数は、例えば０．９に設定される。また、対物レンズ１６ｒの焦点面は、生体試料１０の深部の特定面に一致しており、この特定面が観察対象面１０Ａとなる。以下、以下、この観察対象面１０Ａ上でパルスレーザ光Ｌ１の照射される部分を「レーザスポットＳ１」と称す。

このレーザスポットＳ１の中央の微小領域に観察対象分子が存在していれば、第２高調波（ＳＨＧ光）が発生する。このＳＨＧ光の光周波数は、レーザスポットＳ１を形成したパルスレーザ光Ｌ１の光周波数ωの２倍（＝２ω）である。

生体試料１０において、ＳＨＧ光は、パルスレーザ光Ｌ１の上流側と下流側との双方に向けて射出し、上流側に向けて射出したＳＨＧ光（反射物体光）は、対物レンズ１６ｒによって捕らえられ、下流側に向けて射出したＳＨＧ光（透過物体光）は、対物レンズ１６ｔによって捕らえられる。なお、対物レンズ１６ｔの開口数及び倍率は、対物レンズ１６ｒのそれらと等しいものとする。

対物レンズ１６ｒへ入射した反射物体光Ｌ２は、レーザスポットＳ１を形成したパルスレーザ光Ｌ１の光路を逆向きに辿り、ダイクロイックミラー５１を反射し、ハーフミラー２４へ向かう。なお、ダイクロイックミラー５１の特性は、光周波数が２ωである光を反射し、かつ光周波数がωである光を透過する特性に設定されている。よって、余分なパルスレーザ光Ｌ１がダイクロイックミラー５１からハーフミラー２４の側へ向かうことは無い。

ハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２は、ハーフミラー２４を透過した後、集光レンズ２５へ入射する。集光レンズ２５へ入射した反射物体光Ｌ２は、集光レンズ２５によって集光された後、ピンホール絞り２６を介して光検出器２７へ入射する。なお、ピンホール絞り２６の配置先は、集光レンズ２５の集光面であり、ピンホールのサイズは、レーザスポットＳ１に対応したサイズである。

光検出器２７は、不図示の制御部から与えられる駆動信号に応じて、入射光の光量を電気信号に変換する。光検出器２７が生成した信号は、不図示の制御部によって取り込まれる。

一方、対物レンズ１６ｔへ入射した透過物体光Ｌ２’は、平行光束となり、全反射ミラー５２１へ向かう。全反射ミラー５２１へ入射した透過物体光Ｌ２’は、全反射ミラー５２１、５２２、５２３を順に反射した後、遅延回路２０の全反射ミラー２０ａ、２０ｂを反射し、更に全反射ミラー５２４にて反射し、波長選択フィルタ２２を介してハーフミラー２４へ入射する。なお、波長選択フィルタ２２の特性は、光周波数が２ωである光を透過し、かつ光周波数がωである光をカットする特性に設定されている。よって、余分なパルスレーザ光Ｌ１が波長選択フィルタ２２からハーフミラー２４へ向かうことは無い。

ハーフミラー２４へ入射した透過物体光Ｌ２’は、別の光路を経てハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２と共に、集光レンズ２５及びピンホール絞りを介して光検出器２７へ入射する。

ここで、前述した遅延回路２０は、図５中に矢印で示す方向へとシフト可能であって、このシフトにより、反射物体光Ｌ２と透過物体光Ｌ２’との間の光路長差が調整される。本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、その光路長差は、反射物体光Ｌ２が光検出器２７へ入射するタイミングと、透過物体光Ｌ２’が光検出器２７へ入射するタイミングとが一致するように予め調整される。

不図示の制御部は、試料ステージ３０の位置をＸＹ方向へ走査しながら、各走査位置において、パルスレーザ光源１１のパルスレーザ発振を行うと共に光検出器２７からの信号取り込みを行う。そして、不図示の制御部は、各走査位置で取り込まれた信号の値を二次元状に並べることにより、観察対象面１０Ａのセクショニング画像を取得し、不図示のモニタへ表示する。なお、試料ステージ３０を光軸方向（Ｚ方向）にシフトさせると、生体試料１０における観察対象面１０Ａの高さを変更することができる。

次に、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の効果を説明する。図６は、対物レンズ１６ｒがコヒーレントな反射物体光により伝達可能な構造の空間周波数域（＝対物レンズ１６ｒのコヒーレントトランスファーファンクションの分布域）と、対物レンズ１６ｔがコヒーレントな透過物体光により伝達可能な構造の空間周波数域（＝対物レンズ１６ｔのコヒーレントトランスファーファンクションの分布域）とを示す図である。図６（Ａ）は、ＸＺ方向の波数空間を示し、図６（Ｂ）は、ＹＺ方向の波数空間を示している。これらの図６（Ａ）、（Ｂ）において＋Ｚ方向が反射物体光の進行方向であり、−Ｚ方向が透過物体光の進行方向である。

図６（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり、対物レンズ１６ｔが伝達可能な空間周波数域（伝達域）５０Ａは、波数空間上の＋Ｚ側に位置し、対物レンズ１６ｒが伝達可能な空間周波数域（伝達域）５０Ｂは、波数空間上のＺ＝０の近傍に位置している。

したがって、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡において、対物レンズ１６ｒの結像光束である反射物体光Ｌ２は、生体試料１０の構造のうち、高周波成分を表す大角度の光線を含んでいる可能性があり、対物レンズ１６ｔの結像光束である透過物体光Ｌ２’は、生体試料１０の構造のうち、低周波成分を表す小角度の光線を含んでいる可能性がある。

よって、反射物体光Ｌ２と透過物体光Ｌ２’とを光検出器２７の手前で干渉させ、それによって、ＤＣ成分Ｌ及び高周波数成分Ｈ１、Ｈ２（図３（Ａ））を光検出器２７の側へ伝達すれば、前述した理想的な像を、生体試料１０の像として得ることができる。

なお、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、透過物体光Ｌ２’の強度を調節できないが、本実施形態における透過物体光Ｌ２’の強度は、生体試料１０の構造のＤＣ成分Ｌ（図３（Ａ））の量を反映しているので、本実施形態では、その必要は無い。

したがって、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡が取得するセクショニング画像は、生体試料１０の構造を、より良好に反映する。

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態を説明する。本実施形態は、第２実施形態のＳＨＧ顕微鏡の変形例である。

先ず、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成を説明する。図７は、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡の構成図である。図７において、図５又は図１に示した要素と同じ要素には同じ符号を付した。図７に示すとおり本実施形態のＳＨＧ顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、コリメートレンズ１２と、ダイクロイックミラー５１と、光スキャナ１５と、リレー光学系６１と、ハーフミラー２４と、全反射ミラー６３と、対物レンズ１６ｒと、生体試料１０を支持する透過型の試料ステージ３０と、対物レンズ１６ｔと、全反射ミラー６４と、波長選択フィルタ２２と、集光レンズ２５と、ピンホール絞り２６と、光検出器２７とが備えられる。

このような構成のＳＨＧ顕微鏡では、試料ステージ３０を走査する代わりに、光スキャナ１５を駆動することにより、レーザ走査を行う。

パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光Ｌ１の光周波数は、第２実施形態と同じ光周波数ωに設定され、パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅及びパルス高さは、後述するレーザスポットＳ１の中央の微小領域のエネルギー密度が、ＳＨＧに必要なエネルギー密度となるように設定されている。

パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光Ｌ１は、コリメートレンズ１２へ入射する。コリメートレンズ１２へ入射したパルスレーザ光Ｌ１は、平行光束となってダイクロイックミラー５１へ入射し、ダイクロイックミラー５１を透過する。なお、ダイクロイックミラー５１の特性は、光周波数がωである光を透過し、かつ光周波数が２ωである光を反射する特性に設定されている。

ダイクロイックミラー５１を透過したパルスレーザ光Ｌ１は、光スキャナ１５、リレー光学系６１を介してハーフミラー２４へ入射する。ハーフミラー２４へ入射したパルスレーザ光Ｌ１は、ハーフミラー２４を透過し、全反射ミラー６３を反射して対物レンズ１６ｒへ入射する。この対物レンズ１６ｒの開口数は、例えば０．９に設定される。また、対物レンズ１６ｒの焦点面は、生体試料１０の深部の特定面に一致しており、この特定面が観察対象面１０Ａとなる。以下、この観察対象面１０Ａ上でパルスレーザ光Ｌ１の照射される部分を「レーザスポットＳ１」と称す。

対物レンズ１６ｒへ入射した反射物体光Ｌ２は、レーザスポットＳ１を形成したパルスレーザ光Ｌ１の光路を逆向きに辿り、全反射ミラー６３を介してハーフミラー２４へ向かう。

ハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２は、ハーフミラー２４を透過した後、リレー光学系６１、光スキャナ１５を介してダイクロイックミラー５１へ入射する。なお、リレー光学系６１は、対物レンズ１６ｒの瞳を光スキャナ１５の近傍へ投影する働きがある。

ダイクロイックミラー５１へ入射した反射物体光Ｌ２は、ダイクロイックミラー５１を反射し、集光レンズ２５、ピンホール絞り２６を介して光検出器２６へ入射する。なお、ピンホール絞り２６の配置先は、集光レンズ２５の集光面であり、ピンホールのサイズは、レーザスポットＳ１に対応したサイズである。

一方、対物レンズ１６ｔへ入射した透過物体光Ｌ２’は、平行光束となり、全反射ミラー６４へ向かう。全反射ミラー５２１へ入射した透過物体光Ｌ２’は、全反射ミラー６４を反射した後、不図示の遅延回路及び波長選択フィルタ２２を介してハーフミラー２４へ入射する。なお、波長選択２２の特性は、光周波数が２ωである光を透過し、かつ光周波数がωである光をカットする特性に設定されている。よって、余分なパルスレーザ光Ｌ１が波長選択フィルタ２２からハーフミラー２４へ向かうことは無い。

ハーフミラー２４へ入射した透過物体光Ｌ２’は、ハーフミラー２４を反射し、別の光路を経てハーフミラー２４へ入射した反射物体光Ｌ２と共に、リレー光学系６１、光スキャナ１５、ダイクロイックミラー５１、集光レンズ２５、ピンホール絞り２６を介して光検出器２７へ入射する。

なお、不図示の遅延回路は、反射物体光Ｌ２と透過物体光Ｌ２’との間の光路長差を調整する。本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、その光路長差は、反射物体光Ｌ２が光検出器２７へ入射するタイミングと、透過物体光Ｌ２’が光検出器へ入射するタイミングとが一致するように予め調整される。

不図示の制御部は、光スキャナ１５を駆動しながら、各走査位置において、パルスレーザ光源１１のパルスレーザ発振を行うと共に光検出器２７からの信号取り込みを行う。そして、不図示の制御部は、各走査位置で取り込まれた信号の値を二次元状に並べることにより、観察対象面１０Ａのセクショニング画像を取得し、不図示のモニタへ表示する。なお、試料ステージ３０を光軸方向（Ｚ方向）にシフトさせると、生体試料１０における観察対象面１０Ａの高さを変更することができる。

したがって、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡においても、第２実施形態のＳＨＧ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。

なお、本実施形態のＳＨＧ顕微鏡では、パルスレーザ光Ｌ１の照射を、生体試料１０の一方の側からのみ行ったが（片側照射）、生体試料１０の両側から行うように変形してもよい（両側照射）。なお、その場合は、波長選択フィルタ２２は省略される。

この変形例が生体試料１０から光検出器２７の側へ伝達可能な構造の空間周波数域は、図８に示すとおりに拡大されるので、生体試料１０の像を、理想的な像と略同じにすることができる。

［その他］
なお、上述した第１実施形態の非線形顕微鏡は、非線形過程としてＳＨＧを利用したが、生体試料１０及び非線形結晶１８へ照射するパルスレーザ光の波長（又は照射するパルスレーザ光の波長スペクトル）を最適化することにより、他の非線形過程を利用してもよい。他の非線形過程とは、例えば、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、和周波発生などである。

また、上述した第１実施形態の非線形過程としてＴＨＧ又はＣＡＲＳ又はＣＳＲＳを利用する場合は、非線形結晶１８として、χ^（２）結晶の代わりにχ^（３）結晶を使用すればよい。また、第１実施形態の非線形過程としてＳＨＧ又は和周波発生の何れかを利用する場合は、非線形結晶１８としてχ^（２）結晶を使用すればよい。

特に、ＣＡＲＳを利用する場合は、非線形結晶１８で発生した透過ＣＡＲＳ光を参照光として使用することもできるが、非線形結晶１８で発生したバックグラウンドノイズを参照光として使用することもできる。バックグラウンドノイズは、透過ＣＡＲＳ光と共に、透過ＣＡＲＳ光と同じ波長、かつ透過ＣＡＲＳ光より高強度で発生するノイズ光である。このバックグラウンドノイズを参照光として使用すれば、参照光の強度を高めることができるので、参照光の強度調節の自由度が高まる。

但し、バックグラウンドノイズの位相は透過ＣＡＲＳ光の位相よりπ／２だけ遅れるので、バックグラウンドノイズを参照光として使用する場合は、遅延回路２０のシフト位置を、その位相遅延分だけ予めずらしておく必要がある。

また、上述した第２実施形態又は第３実施形態の非線形顕微鏡は、非線形過程としてＳＨＧを利用したが、生体試料１０へ照射するパルスレーザ光の波長（又は照射するパルスレーザ光の波長スペクトル）を最適化することにより、他の非線形過程を利用してもよい。他の非線形過程とは、例えば、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、和周波発生などである。

１１…パルスレーザ光源、１２…コリメートレンズ、１３…ビームスプリッタ、１４…ダイクロイックミラー、１５…光スキャナ、１６…対物レンズ、３０…試料ステージ、２４…ハーフミラー、２５…集光レンズ、２６…ピンホール絞り、２７…光検出器、１７…対物レンズ、１８…非線形結晶、１９…対物レンズ、２０…遅延回路、２１…全反射ミラー、２２…波長選択フィルタ、２３…ＮＤフィルタ、４０…制御部

Claims

光源から供給される照明光を前記被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手段と、
前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光のうち、前記照明光の上流側へ向かって射出した光である反射物体光を受光し、受光した光の強度を示す信号を生成する検出手段と、
前記物体光の０次回折成分と同じ角度を有し、かつ、前記物体光と同じ波長を有したコヒーレントな光である参照光を、前記受光前の前記反射物体光と干渉させる干渉手段と、
前記被観察物中の被観察面を前記集光点で走査しながら、前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込み、前記被観察面上の前記信号の分布を計測する制御手段とを備え、
前記干渉手段は、
前記光源から供給される照明光を非線形結晶上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させると共に、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光を、前記参照光として使用する
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
前記干渉手段は、
前記参照光の強度を調節することが可能である
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
請求項１又は請求項２に記載の非線形顕微鏡において、
前記干渉手段は、
前記参照光と前記反射物体光との間の光路長差を調節することが可能である
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の非線形顕微鏡において、
前記被観察物上の前記集光点における前記非線形光学過程は、
第２高調波発生、第３高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱、和周波発生の何れかである
ことを特徴とする非線形顕微鏡。
光源から供給される照明光を前記被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手順と、
前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光のうち、前記照明光の上流側へ向かって射出した光である反射物体光を受光し、受光した光の強度を示す信号を生成する検出手順と、
前記物体光の０次回折成分と同じ角度を有し、かつ、前記物体光と同じ波長を有したコヒーレントな光である参照光を、前記受光前の前記反射物体光と干渉させる干渉手順と、
前記被観察物中の被観察面を前記集光点で走査しながら、前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込み、前記被観察面上の前記信号の分布を計測する制御手順とを含み、
前記干渉手順では、
前記光源から供給される照明光を非線形結晶上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させると共に、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな物体光を、前記参照光として使用する
ことを特徴とする非線形観察方法。