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Die Raman-Mikroskopie bietet die Möglichkeit, die chemische Struktur von biomedizinischen und technischen Objekten mit einer Raumauflösung im Mikrometerbereich färbungsfrei zu analysieren. Dies kann u. a. zur Gewebedifferenzierung, zur Virendetektion, zur Untersuchung eines Wirkstoffwechsels in Zellen, zum Kontaminations-Monitoring und zur Materialanalyse von Mikrostrukturen eingesetzt werden.
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Eine wichtige Einschränkung der Raman-Mikroskopie stellt die erforderliche lange Messzeit dar, die für die Erfassung der Raman-Bilder nötig ist. Die Messzeit ist abhängig von den Konzentration und den Raman-Streukoeffizienten der detektierten chemischen Stoffe in der zu untersuchenden Probe und liegt typischerweise im Bereich von 1–60 min.
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Bei der Raman-Mikroskopie wird eine singuläre Laserlinie (nachfolgend auch als erste Anregungslaserlinie oder Pump bezeichnet beziehungsweise mit dem Index „Pump” versehen) zur Anregung einer Probe eingesetzt.
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Nach der Wechselwirkung mit der Probe wird eine große Anzahl von Raman-Linien (Stokes-Linien) generiert. Die Stokes-Linien weisen eine längere Wellenlänge als die erste Anregungslaserlinie (Pump-Linie) auf.
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Die Differenz der Photonenergie zwischen Pump-Linien und Stokes-Linien entspricht der Energie einer charakteristischen Vibrationsresonanz der zu detektierenden chemischen Substanz. Dabei wird die Anregungslaserintensität des Pump-Lasers zum Teil auf mehreren Raman-Linien verteilt, die mit Hilfe eines Spektrometers oder mit Hilfe von Farbfiltern spektral aufgelöst werden können. Die spektral aufgelösten Raman-Linien liefern die Information über die zu detektierenden chemischen Substanzen.
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Um die Geschwindigkeit und/oder die Sensitivität der Raman-Mikroskopie zu verbessern, sind zwei Verfahren bekannt, die überwiegend verwendet werden: das Coherent AntiStokes Raman Scattering (CARS, 1) und das Stimulated Raman Scattering (SRS).
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Bei beiden Verfahren wird zusätzlich zur ersten Anregungslaserlinie eine zweite Anregungslaserlinie zur Anregung eingesetzt. Die Wellenlänge dieser zweiten Anregungslaserlinie stimmt mit einer Stokes-Wellenlänge überein, so dass der Übergang zur oben erwähnten Vibrationsresonanz durch die zweite Anregungswellenlänge stimuliert wird. Damit wird die Anregungsenergie auf eine singuläre Resonanz übertragen, wodurch stärkere Signale für die Bildaufnahme generiert werden.
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Bei der Stimulierten Raman-Mikroskopie (Stimulated Raman-Microscopy) wird entweder die Absorption der ersten Anregungslaserlinie (Stimulated Raman Loss = SRL) oder die zusätzliche Emission von Stokes-Linien (Stimulated Raman Gain = SRG) detektiert. Da die detektierten Wellenlängen mit den Wellenlängen der Anregungslaserlinien übereinstimmen, weisen diese Signale von SRL und von SRG sehr hohe Hintergrundsignale auf.
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Aufgrund von Intensitätsschwankungen der eingesetzten Beleuchtungsquellen, insbesondere (Anregungs-)Laserquellen, stellen die hierdurch auftretenden Kurzzeitvariationen dieser Hintergrundsignale ein ganz erhebliches Problem bei der Detektion von schwachen SRL- beziehungsweise SRG-Signalen dar.
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Um dieses Problem zu beheben, wurde in der
US 2010/0046039 A1 ein Konzept vorgeschlagen, bei der die Stimulierte Raman-Mikroskopie mit der Methode der Lock-In-Detektion kombiniert wird. Trotzdem ist die Sensitivität dieser Methode durch Kurzzeitfluktuationen (Pulse-to-Pulse fluctuation) der Anregungslaserquelle/n weiterhin eingeschränkt.
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In der
WO 2007/112449 A2 wird eine Methode auf der Basis von Stimuliertem Raman-Scattering vorgeschlagen, wobei eine Vielfalt von Stokes-Wellenlängen in der Form eines Weißlichtspektrums (Supercontinuum) für die Stimulation des Raman-Prozesses eingesetzt wird. Hier wird die zeitliche Aufteilung der Stokes-Wellenlängen mit Hilfe eines dispersiven optischen Elements erreicht. Das Stimulated Raman Gain Signal wird für die verschiedenen Stokes-Wellenlängen innerhalb eines einzelnen Laserpulses in der Form eines Waveforms erfasst.
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Für die Erfassung eines eindeutigen SRG-Signales von schwach streuenden Substanzen beziehungsweise von Substanzen mit geringer Konzentration ist die Integration über mehrere Waveforms notwendig. Das Supercontinuum des Stokes-Pulses wird auf der Basis von nichtlinearen Prozessen in photonischen Fasern (PCFs) generiert, welche eine sehr hohe Fluktuation der Wellenlängenverteilung im Supercontinuum aufweisen. Diese Spektrumsfluktuationen schränken die Sensitivität dieses Detektionsverfahrens ein.
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In der Patentanmeldung
US 5,275,168 A1 werden die Pump- und Stokes-Laserpulse nach der Wechselwirkung mit der Probe durch einen Raman-Verstärker geführt. Mit diesem Verfahren werden sowohl das SRL- beziehungsweis das SRG-Signal als auch das Hintergrundsignal verstärkt. Daher ist diese Methode bei der Detektion von chemischen Stoffen mit geringen Konzentrationen für Intensitätsschwankungen der Laserquellen anfällig.
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Bei der CARS-Mikroskopie wird nach dem Übergang zur Vibrationsresonanz (hier eine Zwischenresonanz; 1) ein zusätzliches Pump-Photon absorbiert, welches durch nicht-lineare Wechselwirkungen mit der chemischen Substanz die im Molekül deponierte Vibrationsenergie übernimmt. Dabei wird seine Photonenergie erhöht, was zur Generierung des sogenannten anti-Stokes Signals führt.
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Der Photonenergieunterschied zwischen Pump und anti-Stokes entspricht ebenfalls der Energie der Vibrationsresonanz der detektierten chemischen Subtanzes (siehe
WO 2000/004352 A1 ).
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Ein wichtiger Nachteil für die CARS-Mikroskopie ist der nicht-resonante Hintergrund des anti-Stokes Signals. Dieser entsteht überwiegend durch die Absorption zweier Pump-Photonen und anschließend eines Stokes-Photons. Dieses Anregungsschema (1) beinhaltet nicht die für die detektierten Stoffe charakteristische Vibrationsresonanz. Das generierte Signal liefert daher keine Information über die chemische Substanz in der Probe. Dieser nicht-resonante Hintergrund verhindert die Detektion von sehr schwachen CARS-Signalen, z. B. von solchen, die von Substanzen mit Konzentrationen in Mikromolarbereich generiert werden.
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Zu den Konzepten zur Unterdrückung des nicht-resonanten Hintergrunds beziehungsweise zur Sensitivitätssteigerung von CARS zählen die
WO 2007/050596 A1 ,
US 2005/0280827 A1 und die
US 2003/0011765 A1 . Diese Konzepte zeigen keine Sensitivität im Mikromolarbereich.
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Einsatzmöglichkeiten der Raman-Mikroskopie sind beispielsweise aus der
JP 07146295 A und der
JP 09079982 A bekannt.
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Gemäß der
JP 07146295 A wird Anregungslicht in eine Zelle gerichtet und Immunokomplexe detektiert, die aufgrund einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung gebildet sind. An einer Probe gestreutes Licht (Raman scattering) wird mittels eines Spektraldetektors erfasst. Auftretende Fluktuationen der Intensitäten des Anregungslichts werden ebenfalls erfasst und zur Kompensation der Messwerte der erfassten Ramanstreuung verwendet.
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Die
JP 09079982 A betrifft die simultane qualitative und quantitative Analyse einer Tumorprobe. Fluktuationen der Lichtintensitäten werden wiederum anhand von Referenzmessungen kompensiert.
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Die
US 2013/0018237 A1 betrifft eine Vorrichtung zur nicht-invasiven Untersuchung von Substanzen der Interstitial-Flüssigkeit in der Haut mittels Raman-Spektroskopie. Eine Metabolitkonzentration wird in vivo gemessen, indem mittels eines Detektors durch die Metabolite gestreutes Detektionslicht erfasst wird.
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Aus der
DE 696 23 544 T2 ist ein Messverfahren bekannt, bei dem eine Wellenzahl mit einer exzellenten Korrelation zwischen der Konzentration einer Komponente und der Lichtstreu-Spektralintensität als eine Mess-Wellenzahl ausgewählt wird, die für die Komponente im Hinblick auf jede Komponente eines Körperfluids, die gemessen werden soll, spezifisch ist. Anschließend erfolgt ein Bestrahlen einer Körperfluidprobe mit Anregungslicht zum Messen einer Lichtstreu-Spektralintensität bei jeder Messwellenzahl für jede Komponente, die gemessen werden soll. Alternativ wird eine kumulative Lichtstreuspektralintensität in jedem Messwellenzahlbereich gemessen. Gleichzeitig erfolgt ein qualitatives/quantitatives Analysieren der jeweiligen Komponenten in dem Körperfluid anhand einer Kalibrierungskurve, die zuvor für die Lichtstreuspektralintensität bei jeder Messwellenzahl oder für die kumulative Lichtstreu-Spektralintensität in jedem Messwellenzahlbereich und der Konzentration der Komponente vorbereitet wurde.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Erhöhung der Sensitivität der Stimulierten Raman-Mikroskopie vorzuschlagen.
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Die Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren vorgeschlagen, das zu einer Verbesserung der Sensitivität der Stimulierten Raman-Mikroskopie führt und außerdem eine Erhöhung der Messgeschwindigkeit ermöglicht. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorteilhaft die Detektion von chemischen Stoffen mit Konzentrationen im Mikromolarbereich und mit einer Bildaufnahmerate von 1–10 Hz ermöglicht. Das Verfahren der Stimulierten Raman Mikroskopie, bei dem eine zu untersuchende Probe mit einer ersten Anregungslaserlinie und einer zweiten Anregungslaserlinie simultan beleuchtet wird, wobei eine Energiedifferenz der Photonen der ersten Anregungslaserlinie und der Photonen der zweiten Anregungslaserlinie einer Energie einer charakteristischen Vibrationsresonanz einer zu detektierenden mindestens einen chemischen Substanz der Probe entspricht, ist dadurch gekennzeichnet, dass entweder Messwerte der Pulsenergie der unbeeinflussten ersten Anregungslaserlinie als erste Referenzmesswerte und Messwerte der Pulsenergie der durch eine Interaktion mit der Probe und/oder mit der zweiten Anregungslaserlinie beeinflussten ersten Anregungslaserlinie erfasst werden und ein differentielles SRL-Signal ΔSRL ermittelt wird, wobei die Ermittlungen der unbeeinflussten und der beeinflussten Messwerte jeweils parallel erfolgen oder Messwerte der Pulsenergie der unbeeinflussten zweiten Anregungslaserlinie als zweite Referenzmesswerte und Messwerte der Pulsenergie der durch eine Interaktion mit der Probe und/oder mit der ersten Anregungslaserlinie beeinflussten zweiten Anregungslaserlinie erfasst werden und ein differentielles SRG-Signal ΔSRG ermittelt wird, wobei die Ermittlungen der unbeeinflussten und beeinflussten Messwerte jeweils parallel erfolgen und das SRL-Signal ΔSRL beziehungsweise das SRG-Signal ΔSRG zur Detektion der zu detektierenden mindestens einer chemischen Substanz der Probe verwendet wird.
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In jeder der beiden vorgenannten Alternativen werden Referenzmesswerte parallel zu Messwerten von Pulsen erfasst, die infolge einer Wechselwirkung mit der Probe und/oder mit einem Puls der jeweils anderen Anregungslaserlinie beeinflusst sind. Eine parallele Erfassung bedeutet insbesondere, dass gleichzeitig bereitgestellte Pulse erfasst werden, wobei eine Erfassung vor oder nach einer Wechselwirkung mit der Probe und/oder dem Puls der jeweils anderen Anregungslaserlinie erfolgt.
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Diese Messungen sind daher aufgrund der pulsweisen (Pulse-to-Pulse) Referenzierung und der linearen Abhängigkeit des SRL- und SRG-Signals von der ersten Anregungslaserlinie und der zweiten Anregungslaserlinie unempfindlich für Schwankungen der eingesetzten Beleuchtungsquellen.
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Zweidimensionale Bilder von der Probe werden durch die Umlenkung von erster Anregungslaserlinie und zweiter Anregungslaserlinie in X- und/oder Y-Richtung, beispielsweise in einer X-Y-Ebene, mit Hilfe eines Scanners und bei gleichzeitiger Aufnahme des jeweiligen differenziellen Signals ermittelt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Sensitivitätssteigerung der Stimulierten Raman-Mikroskopie auf Basis der Stimulierten Raman-Streuung. Um die Sensitivität der Stimulierten Raman-Mikroskopie zu erhöhen, ist eine effektive Subtraktion des Hintergrund Stokes-Signals der zweiten Anregungslaserlinie nötig. Da die Schwankung des Hintergrundsignals aufgrund der Intensitätsschwankungen der Beleuchtungsquellen eine Modulationsamplitude aufweist, die vergleichbar mit der Amplitude des SRL- beziehungsweise des SRG-Signals ist, wird hierfür eine differenzielle Detektion des SRL- beziehungsweise des SRG-Signals angewendet.
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In diesem Zusammenhang wird zwischen der Beleuchtungsquelle, beziehungsweise zwischen den Beleuchtungsquellen, und einem Mikroskopobjektiv ein Teil der Laserleistung der ersten Anregungslaserlinie beziehungsweise der zweiten Anregungslaserlinie beispielsweise mittels eines teildurchlässigen Spiegels, aufgespalten und aus dem Strahlengang der ersten beziehungsweise der zweiten Anregungslaserlinie ausgekoppelt und zu einem Referenzdetektor, beispielsweise einem schnellen Photodetektor, umgeleitet, der jeweils die Pulsenergie von Pulsen der ersten Anregungslaserlinie beziehungsweise der zweiten Anregungslaserlinie erfasst.
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Zur differentiellen Detektion des SRL-Signals werden vorzugsweise vier Messungen der Pulsenergie der ersten Anregungslaserlinie (Pump-Energie) durchgeführt.
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Dabei werden die folgenden vier Messwerttypen erfasst:
- EPump:
- die Pulsenergie eines Pulses der ersten Anregungslaserlinie nach ihrer Wechselwirkung mit dem Puls der zweiten Anregungslaserlinie und mit der Probe,
- EPump*:
- die Pulsenergie der ersten Anregungslaserlinie nach ihrer Wechselwirkung mit der Probe während der Puls der zweiten Anregungslaserlinie geblockt ist, so dass keine Wechselwirkung des Pulses der zweiten Anregungslaserlinie mit der Probe und/oder der ersten Anregungslaserlinie erfolgt,
- ERef1:
- ein erster Referenzmesswert in Form der Pulsenergie eines ausgekoppelten Anteils des Pulses der ersten Anregungslaserlinie vor ihrer Wechselwirkung mit dem Puls der zweiten Anregungslaserlinie und mit der Probe, und
- ERef1*:
- ein erster Referenzmesswert in Form der Pulsenergie eines ausgekoppelten Anteils des Pulses der ersten Anregungslaserlinie vor ihrer Wechselwirkung mit der Probe, während der Puls der zweiten Anregungslaserlinie geblockt ist, so dass keine Wechselwirkung des Pulses der zweiten Anregungslaserlinie mit der Probe und/oder mit der ersten Anregungslaserlinie erfolgt, sind.
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Nach der parallelen Ermittlung von EPump und ERef1 wird der Puls der zweiten Anregungslaserlinie z. B. mit Hilfe eines strahlblockenden Elements, beispielsweise eines Choppers oder eines akustooptischen Modulators geblockt und die Pulsenergie der ersten Anregungslaserlinie vor und nach der Wechselwirkung mit der Probe erneut parallel gemessen, wobei EPump* und ERef1* ermittelt werden. Das SRL-Signal wird vorteilhaft nach der Gleichung: ΔSRL = –Log(EPump*/ERef1*) + Log(EPump/ERef1) = –Log(EPump* × ERef1/ERef1* × EPump) ermittelt.
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Zur differentiellen Detektion des SRG-Signals werden vorzugsweise vier Messungen der Pulsenergie der zweiten Anregungslaserlinie (Stokes-Energie) durchgeführt.
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Dabei werden die folgenden vier Messwerttypen erfasst:
- EStokes:
- die Pulsenergie der zweiten Anregungslaserlinie nach ihrer Wechselwirkung mit dem Puls der ersten Anregungslaserlinie und mit der Probe,
- EStokes*:
- die Pulsenergie der zweiten Anregungslaserlinie nach ihrer Wechselwirkung mit der Probe,
- ERef2:
- ein zweiter Referenzmesswert in Form der Pulsenergie eines ausgekoppelten Anteils des Pulses der zweiten Anregungslaserlinie vor ihrer Wechselwirkung mit dem Puls der ersten Anregungslaserlinie und mit der Probe, und
- ERef2*:
- ein zweiter Referenzmesswert in Form der Pulsenergie eines ausgekoppelten Anteils des Pulses der zweiten Anregungslaserlinie vor ihrer Wechselwirkung mit der Probe, während der Puls der ersten Anregungslaserlinie geblockt ist, so dass keine Wechselwirkung des Pulses der ersten Anregungslaserlinie mit der Probe und/oder der zweiten Anregungslinie erfolgt, sind.
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Nach der parallelen Ermittlung von EStokes und ERef2 wird der Puls der ersten Anregungslaserlinie z. B. mit Hilfe des strahlblockenden Elements geblockt und die Pulsenergie der zweiten Anregungslaserlinie vor und nach der Wechselwirkung mit der Probe erneut parallel gemessen, wobei EStokes* und ERef2* ermittelt werden.
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Das SRG-Signal wird vorteilhaft nach der Gleichung: ΔSRG = –Log(EStokes*/ERef2*) + Log(EStokes/ERef2) = –Log(EStokes* × ERef2/ERef2* × EStokes) ermittelt.
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Um eine weiter verbesserte Sensitivität zu erreichen, können die ΔSRL- bzw. ΔSRG-Werte über mehrere Pulse gemittelt werden.
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Gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen wird erfindungsgemäß eine Referenzmessung der Anregungslaserintensität von erster beziehungsweise zweiter Anregungslaserlinie durchgeführt, wobei das bildgebende Signal nach den oben angegebenen Gleichungen zur Ermittlung von ΔSRL beziehungsweise ΔSRG erfolgt.
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Die Referenzmessung der Pulsenergie von erster beziehungsweise von zweiter Anregungslaserlinie kann an verschiedenen Stellen der Strahlengänge zwischen dem Mikroskopobjektiv und der jeweiligen Beleuchtungsquelle durchgeführt werden, z. B. vor, nach oder in einem X-Y-Scanner.
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Die Aufgabe wird ferner durch ein Mikroskop zur Durchführung der Stimulierten Raman-Mikroskopie gelöst. Das Mikroskop umfasst eine erste Beleuchtungsquelle zur Bereitstellung einer ersten Anregungslaserlinie, eine zweite Beleuchtungsquelle zur Bereitstellung einer zweiten Anregungslaserlinie, wobei Pulse der ersten Anregungslaserlinie und Pulse der zweiten Anregungslaserlinie in eine zur Platzierung einer Probe ausgebildeten Probenebene geleitet oder leitbar sind und wobei eine Energiedifferenz der Photonen der ersten Anregungslaserlinie und der Photonen der zweiten Anregungslaserlinie einer Energie einer charakteristischen Vibrationsresonanz einer zu detektierenden mindestens einer chemischen Substanz der Probe entspricht. Das Mikroskop umfasst ferner entweder ein strahlteilendes Mittel zur Auskopplung eines Anteils eines Pulses der ersten Anregungslaserlinie und/oder ein strahlteilendes Mittel zur Auskopplung eines Anteils eines Pulses der zweiten Anregungslaserlinie, mindestens einen Referenzdetektor zur Erfassung des ausgekoppelten Anteils des Pulses der ersten Anregungslaserlinie oder zur Erfassung des ausgekoppelten Anteils des Pulses der zweiten Anregungslaserlinie, einen Detektor zur Erfassung von Pulsen der ersten und/oder der zweiten Anregungslaserlinie nach deren Durchgang durch die Probenebene und mindestens ein strahlblockendes Element, das zum Abblocken von Pulsen der ersten Anregungslaserlinie oder von Pulsen der zweiten Anregungslaserlinie ausgebildet ist.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung der Anregungskonzepte Raman, CARS und nicht-resonantem CARS;
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2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, das zur Ermittlung eines ΔSRL-Signals ausgebildet ist und
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3 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, das zur Ermittlung eines ΔSRG-Signals ausgebildet ist
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Die Ausführungsbeispiele sind schematisch dargestellt. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche technische Elemente.
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In der 1 sind Anregungskonzepte von Raman, CARS und nicht-resonantem CARS dargestellt.
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Ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 3 ist in der 2 dargestellt. Als wesentliche Elemente sind eine erste Beleuchtungsquelle 1 zur Bereitstellung einer ersten Anregungslaserlinie 1.1, eine zweite Beleuchtungsquelle 2 zur Bereitstellung einer zweiten Anregungslaserlinie 2.1, ein strahlblockendes Mittel 4, Spiegel 5, strahlteilende Mittel 6, ein Referenzdetektor 7, ein Detektor 8, Mikroskopobjektive 12 und ein optischer Verzögerer 14 vorhanden.
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Pulse der zweiten Anregungslaserlinie 2.1 sind mittels des in dem Strahlengang der zweiten Anregungslaserlinie 2.1 angeordneten strahlblockenden Mittels 4 in Form eines akustooptischen Modulators blockierbar, indem das strahlblockende Mittel 4 gesteuert derart in den Strahlengang eingreift, dass die Pulse der zweiten Anregungslaserlinie 2.1 zu bestimmten Zeitpunkten blockiert werden.
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Aus dem Strahlengang der ersten Anregungslaserlinie 1.1 ist mittels eines strahlteilenden Mittels 6 ein Anteil eines Pulses der ersten Anregungslaserlinie 1.1 ausgekoppelt oder auskoppelbar und auf den Referenzdetektor 7 gerichtet oder richtbar.
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Die gepulst bereitgestellten erste Anregungslaserlinie 1.1 und zweite Anregungslaserlinie 2.1 sind entlang ihrer jeweiligen Strahlengänge geleitet und mittels eines weiteren strahlteilenden Mittels 6 in Form eines halbdurchlässigen Spiegels in einem gemeinsamen Strahlengang zusammengeführt beziehungsweise zusammenführbar.
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Die zusammengeführten erste und zweite Anregungslaserlinien 1.1, 2.1 gelangen entlang ihres gemeinsamen Strahlengangs zu einem X-Y-Scanner 11, mittels dem die erste und zweite Anregungslaserlinien 1.1, 2.1 durch ein Mikroskopobjektiv 12 in eine zur Aufnahme einer Probe 10 ausgebildeten Probenebene 9, beispielsweise einer Probenhalterung, gerichtet oder richtbar ist. Durch eine entsprechende Ansteuerung des X-Y-Scanners 11 ist die Probenebene 9 mit den Anregungslaserlinien 1.1, 2.1 beleuchtbar, insbesondere abtastbar.
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Die durch die Probenebene 9 durchgetretene und gegebenenfalls durch die Probe 10 beeinflusste Strahlung der ersten und/oder zweiten Anregungslaserlinien 1.1, 2.1 wird mittels eines Detektors 8 erfasst, vor dem ein weiteres Mikroskopobjektiv 12 und ein Farbfilter 13 angeordnet sind.
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Die Messwerte EPump* und EPump sind mittels des Detektors 8 erfassbar. Die ersten Referenzmesswerte ERef1*, ERef1 sind mittels des Referenzdetektors 7 erfassbar. Während der Erfassung der Messwerte EPump* und ERef* ist die zweite Anregungslaserlinie 2.1 durch das strahlblockende Mittel 4 unterbrochen. Das ΔSRL-Signal wird anhand der oben genannten Gleichung ermittelt.
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Die erste und zweite Beleuchtungsquelle 1, 2, das strahlblockende Mittel 4, die strahlteilenden Mittel 6, der Referenzdetektor 7, der Detektor 8 und/oder der X-Y-Scanner 11 sind mittels einer nicht dargestellten Steuerungseinheit ansteuerbar.
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Das in der 3 dargestellte zweite Ausführungsbeispiel des Mikroskops 3 weicht von dem ersten Ausführungsbeispiel (2) dahingehend ab, als dass das strahlblockende Mittel 4 als ein Chopper ausgebildet und in dem Strahlengang der ersten Anregungslaserlinie 1.1 angeordnet ist.
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Außerdem ist der Referenzdetektor 7 in dem Strahlengang der zweiten Anregungslaserlinie 2.1 angeordnet. Durch eines der strahlteilenden Mittel 6 ist ein Anteil eines Pulses der zweiten Anregungslaserlinie 2.1 aus dem Strahlengang auskoppelbar und auf den Referenzdetektor 7 gerichtet oder richtbar.
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Die Messwerte EStokes* und EStokes sind mittels des Detektors 8 erfassbar. Die zweiten Referenzmesswerte ERe2* und ERef2 sind mittels des Referenzdetektors 7 erfassbar. Während der Erfassung der Messwerte EStokes* und ERef2* ist der Strahlengang der ersten Anregungslaserlinie 1.1 durch das strahlblockende Mittel 4 unterbrochen. Das ΔSRG-Signal wird anhand der oben genannten Gleichung ermittelt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- erste Beleuchtungsquelle
- 2
- zweite Beleuchtungsquelle
- 1.1
- erste Anregungslaserlinie
- 2.1
- zweite Anregungslaserlinie
- 3
- Mikroskop
- 4
- strahlblockendes Mittel
- 5
- Spiegel
- 6
- strahlteilendes Mittel
- 7
- Referenzdetektor
- 8
- Detektor
- 9
- Probenebene
- 10
- Probe
- 11
- X-Y-Scanner
- 12
- Mikroskopobjektiv(-e)
- 13
- Farbfilter
- 14
- optischer Verzögerer