JP4860705B2 - 周波数変調コヒーレントアンチストークスラマン散乱分析による高感度振動イメージングのためのシステムおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ａｗａｒｄ ５ ＤＰＩ ＯＤ０００２７７の下で国立衛生研究所により支援されている。アメリカ合衆国政府は、本発明に対する正当な権利を有する。

優先権
本願は、２００６年３月１５日に出願された米国特許出願番号１１／３７６，３９６、２００５年１０月２６日に出願された米国仮特許出願番号６０／７３０，５５８、ならびに２００６年１月１９日に出願された米国仮特許出願番号６０／７６０，１８９に対する優先権を主張する。

本発明は、顕微鏡検査法の分野に関し、詳細にはコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡検査法の分野に関する。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡検査法は、コントラストメカニズムとして分子振動を使用して化学的試料と生体試料を撮像する。詳細には、ＣＡＲＳ顕微鏡検査法は、一般に、ω_ｐに中心周波数を有するポンプ電磁場と、ω_ｓに中心周波数を有するストークス電磁場の２つのレーザ場を使用する。ポンプ場とストークス場は、試料と相互作用し、位相整合方向にω_ＡＳ＝２ω_ｐ−ω_ｓの周波数を有するコヒーレントアンチストークス場を生成する。ω_ｐ−ω_ｓのラマンシフトが、所定の振動モードで共鳴するように調整されたとき、強化されたＣＡＲＳ信号がアンチストークス周波数ω_ＡＳで観察される。

ＣＡＲＳ顕微鏡検査法は、蛍光顕微鏡検査法と違って、撮像が生体試料と化学的材料の振動コントラストに依存するので、（蛍光退色を受ける場合がある）蛍光体［fluorophores］を使用する必要がない。更に、ＣＡＲＳ顕微鏡検査法のコヒーレント特性は、自然ラマン[spontaneous Raman]顕微鏡検査法よりかなり高い感度を示す。これにより、（生体試料が耐えることができる）より低い平均励起電力の使用が可能になる。ω_ＡＳ＞ω_ｐの場合、ω_ｓは、一光子バックグラウンド蛍光がある状態での信号の検出を可能にする。ＣＡＲＳ顕微鏡検査法は、試料の固有振動共鳴に関する情報を高感度で提供し、無標識の化学的固有の撮像を可能にする。

例えば、米国特許第４，４０５，２３７号は、時間的空間的に重なった異なる波長の２つのレーザパルス列を使用して試料を同時に照明するコヒーレントアンチストークスのラマン分光撮像装置を開示している。２３７’特許は、非共線的（non-collinear）な幾何学形状の２本のレーザビームと、二次元検出器による位相整合方向での信号ビームの検出を開示している。

米国特許第６，１０８，０８１号は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を使用する顕微鏡振動イメージングのための様々な方法と装置を開示している。０８１’特許の装置では、共線的なポンプビームとストークスビームが、高開口数（ＮＡ）の対物レンズによって集束されている。励起強度に対する信号の非線形依存が、焦点の小さいプローブ容積を保証し、厚い試料の三次元切片法を可能にする。信号ビームは、前方（ｆｏｒｗａｒｄ）方向に検出される。

しかしながら、ＣＡＲＳ信号には、また、対象の共鳴信号を歪ませ一様に埋没させる可能性のある化学的固有の情報を伝えない非共鳴寄与（nonresonant contribution）がある。この非共鳴寄与は、所望の信号をフィルタリングしあるいはなんとか区別しなければならない振動コントラストをバックグラウンドに提供しない。例えば、水に浸された５３５ｎｍのポリスチレンビーズの従来の横方向ＣＡＲＳ強度プロファイルは、ビーズからの特有のＣＡＲＳ信号の他に、水からの相当量のＣＡＲＳバックグラウンドを含む。等方性バルク水からのこのバックグラウンドの存在は、特に生物学用途で、ＣＡＲＳ撮像の感度を高める努力を妨げてきた。ＣＡＲＳバックグラウンドは、三次非線形感度に対する電子的寄与によって引き起こされる。対象の試料および周囲の等方性バルク媒体（即ち、溶液）のＣＡＲＳ信号には、ラマンシフトω_ｐ−ω_ｓに依存しない非共鳴寄与がある。

ＣＡＲＳ分光学における非共鳴バックグラウンド場を少なくする１つの手法は、非共鳴バックグラウンドが共鳴信号と異なる偏光特性を有することを利用することである。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｊｕｎｅ １９７９，ｐｐ．７５８〜７６０（１９７９）に掲載されたＯｕｄａｒ、ＳｍｉｔｈおよびＳｈｅｎによる「Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」と、ＪＥＴＰ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．４１６−４２０（１９７７）に掲載されたＡｋｈｍａｎｏｖ、Ｂｕｎｋｉｎ、ＩｖａｎｏｖおよびＫｏｒｏｔｅｅｖによる「Ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ」を参照されたい。これらの論文は、異なる偏光方向を有する非共線励起ビームを使用している。

米国特許第６，７９８，５０７号は、ポンプビームとストークスビームが偏光され、偏光感度検出器が使用されるシステムを開示している。しかしながら、高分解能ＣＡＲＳ顕微鏡検査法では、強く集束された共線励起ビームを必要とするときがある。強く集束された偏光ビームは、偏光スクランブリングを引き起こすことが知られている。Ｐｅｒｇａｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，ｐｐ．４３５−４４９に記載されたＢｏｒｎとＷｏｌｆによる「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ」を参照されたい。

米国特許第６，８０９，８１４号は、ＣＡＲＳ信号を試料と逆方向（ｅｐｉ方向）で受け取るシステムを開示している。しかしながら、ｅｐｉ方向の信号は、前方信号よりかなり弱く、特定の用途にはもっと強い信号が必要とされる場合がある。

従って、特定の用途のための改善された感度のＣＡＲＳ顕微鏡検査法を提供し、具体的には非共鳴バックグラウンドを少なくしそれによりＳＢ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒａｔｉｏ）を高めるＣＡＲＳ検出方式を提供するシステムおよび方法が必要とされている。

一実施形態によれば、本発明は、試料内に生じる非線形コヒーレント場を検出するためのシステムを提供する。このシステムは、光学素子、変調システムおよび検出器システムを含む。光学素子は、第１の周波数ω_１の第１の電磁場と第２の周波数ω_２の第２の電磁場を、差分周波数ω_１−ω_２が焦点体積内の試料の振動周波数と共鳴するように焦点体積の方に導くためのものである。変調システムは、差分周波数ω_１−ω_２を、差分周波数ω_１−ω_２が変調周波数の試料の振動周波数と同調され離調されるように変調するものである。検出器システムは、ω_１とω_２の非線形相互作用と変調周波数に応答する試料とによって生成される光学場を検出するためのものである。

本発明の別の実施形態によれば、システムは、光源システム、変調システム、光学素子、および検出器システムを含む。ソースシステムは、第１の周波数の第１の電磁場、前記第１の周波数と異なる第２の周波数の第２の電磁場、および第１の周波数と異なりかつ第２の周波数と異なる第３の周波数の第３の電磁場を生成するためのものである。変調システムは、変調周波数で第２の周波数と第３の周波数に切り換えられる変調電磁場を提供するためのものである。光学素子は、第１の電磁場と変調電磁場を共通の焦点体積の方に導くためのものである。検出器システムは、焦点体積内の第１の電磁場と変調電磁場に応じて生成される非線形コヒーレント場を検出するためのものである。

更に他の実施形態によれば、本発明は、試料内に誘導された非線形コヒーレント場を検出する方法を提供する。この方法は、第１の周波数ω_１の第１の電磁場と第２の周波数ω_２の第２の電磁場を、差分周波数ω_１−ω_２が焦点体積内の試料の振動周波数と共鳴するように焦点体積の方に導くステップと、差分周波数ω_１−ω_２を、差分周波数ω_１−ω_２が変調周波数の試料の振動周波数に同調及び離調するように変調するステップと、ω_１とω_２の非線形相互作用と変調周波数に応答する試料によって生成される光学場を検出するステップとを含む。

以下の説明は、添付図面を参照して更によく理解されるであろう。
図面は、単に説明のためにのみ示されている。

本発明は、周波数差ω_１−ω_２が所望の分子振動周波数との間で素早く変化するようにＣＡＲＳ顕微鏡検査法を実行することを含む。一実施形態によれば、ストークスビームを一定の(fixed)光周波数に維持し、ポンプビームの光周波数を素早く切り換えて周波数差を変調する。別の実施形態において、ポンプビームを一定の光学周波数で維持しながらストークスビームの光周波数を素早く変調してもよい。更に他の実施形態において、ストークスビームとポンプビームの両方の光周波数を素早く切り換えて、変調された周波数差を作成してもよい。

従って、本発明の種々の実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡検査システムは、非共鳴バックグラウンド情報が、変調された周波数差のスイッチング周期にロックされて抑制されるので検出感度を大幅に高める。ＣＡＲＳ信号は、共線的に重ねられ強く集束されラスタスキャンされた、ポンプビームとストークスレーザビームによって生成され、ポンプビームとストークスレーザビームの周波数差は素早く変調される。得られたＣＡＲＳ信号は、変調周波数に応じた検出器システムによって検出される。この方式は、非共鳴バックグラウンドを効率的に抑制し、既存のＣＡＲＳ顕微鏡検査法でできるよりもはるかに小さい振動の発振器の検出を可能にする。

得られたアンチストークス信号が、周波数差を変調させたときに変化する場合、その信号は、振動共鳴によるものであることが分かっている。従って、周波数差を変調させたときに変化しない非共鳴バックグラウンドは、受け取ったアンチストークス信号から容易に除去される。図１を参照すると、ポンプビームがω_ｐ１とω_ｐ２の間で変調されたとき、非共鳴バックグラウンドは、１０で示したように同じままであるが、検査している共鳴試料は、図２に１２で示したような、変調周波数と極めて強く相関する応答を提供する。変調周波数は、例えば、約５００ｋＨｚ以上である。この周波数は、一般にレーザノイズが１０キロヘルツ未満で生じるときにレーザに見られるノイズより高速である。

出力信号をロックイン増幅器に通して、変調周期の時間スケールでの変化だけが最終出力に提供されるようにすることができる。他の実施形態によれば、ＲＦ変調器／復調器を使用することができる。例えば、図３に１４で示したように、所望の信号１６は、変調周波数で変化する信号成分にロックすることによって、非共鳴バックグラウンド信号１８から容易に分離される。本発明は、従来のＣＡＲＳシステムでバックグラウンドのノイズを大幅に抑制できるようにする。感度が改善されるため、細胞中の分子をミクロモル濃度で見ることが可能になる。

ＣＡＲＳ応答は、
共鳴寄与

と
非共鳴電子成分

の和である三次非線形感受率から生じる。検出される全ＣＡＲＳ信号は、次の式で示される。

３つの項

の周波数依存性を図４Ａにそれぞれ２０、２２および２４で示す。３つの項は、離調Δ＝ω_ｐ−ω_ｓ−Ω_Ｒに対してプロットされており、ここで、Ω_Ｒは、帯域幅Γを有する均一的に広がったラマン線の中心周波数である。実線２０は、純粋な共鳴ＣＡＲＳ信号成分である。
点線２２は、非共鳴三次非線形性

によるスペクトル的に独立したＣＡＲＳ信号成分である。点線２４は、式（１）のヘテロダイン成分を表わす。
曲線は、

という前提で計算されている。非共鳴の項は、対象の共鳴ＣＡＲＳ信号を不明瞭にすることがあり、それにより、画像に対する化学選択的な寄与を識別することが困難になる。これは、特に、生体物質を撮像するときに当てはまり、その理由は、水性環境では、共鳴信号をしばしば埋没させる実質的な非共鳴応答が生じるからである。

振動周波数Ω_Ｒに中心があり、狭帯域源（narrow-band source）で調べるＦＷＨＭ線幅Γ（図４Ａに示したような）の分離された共鳴を検討する。ソースが、周波数差δ＝ω_１−ω_２を有する２つの周波数ω_１とω_２の間で素早く切り換えられる場合、この周波数変調によって、ＣＡＲＳ信号の振幅変調Δｌ（δ）＝ｌ（ω_１）−ｌ（ω_２）が得られ、この変調は、位相敏感検出(phase-sensitive detection)を使用して抽出することができる。図４Ｂは、そのようなＦＭ−ＣＡＲＳプロセスの概略を示す。実線３４は、図４Ａからの寄与の和である。従って、ＦＭ−ＣＡＲＳで調べられるラマン共鳴は、ＦＭ−ＡＭコンバータとして働き、ロックイン増幅器によって振幅変調信号を検出することができる。この手法では、共鳴スペクトル機能は、図４Ｂに示した信号３４に関して３０と３２で示したような周波数変調（ＦＭ）から振幅変調（ＡＭ）に変換する。非共鳴寄与は、本質的にスペクトルが平らであり、検出される変調信号に寄与せず、従って効率的に抑制される。

この抑制条件下で試料内の共鳴種の濃度が高いとき、
式１の二次項

が、検出信号に対する寄与が最も大きい。しかしながら、もっと低い濃度では、
式１の一次項

が支配的になる。
このヘテロダイン項は、

の係数を含み、このことは、溶媒の非共鳴応答によって成分を実質的に強化できることを示す。前述の手法は、ポンプビームの光周波数ω_ｐを、変調信号をさらに低い周波数のレーザノイズから分離できるほど高い周波数（＞５００ｋＨｚ）で変調することによって実現される。変調周波数は、使用する特定のレーザ光源に依存する場合がある。レーザのノイズスペクトルピーク（緩和共鳴周波数）ならびにビームステアリングとレーザ共鳴光学素子の特有の力学的共鳴周波数から遠くに値を設定することができる。

図５に示したように、本発明の一実施形態によるシステムは、高波長スイッチング素子４２に２つのポンプビームω_ｐ１とω_ｐ２を提供するデュアル周波数レーザ光源またはシステム４０を含む。次に、２つのスイッチングしたビームω_ｐ１とω_ｐ２は、単一周波数レーザ光源４４から、ストークスビームω_ｓと共にマルチプレクサ４６に導かれる。次に、３つのビームω_ｐ１、ω_ｐ２およびω_ｓが、顕微鏡検査または分光のために試料体積(sample volume)４８内に導かれる。また、高速波長スイッチング素子４２は、周期波形発生器５０から無線周波数の変調周波数信号（ｆｍ）を受け取る。波形発生器５０は、また、ロックイン増幅器５６に基準入力信号５２を提供する。ロックイン増幅器５６は、また、試料体積４８からＣＡＲＳ信号５４を受け取り、信号５４の基準入力信号５２と同じ周波数で同じ位相の部分だけを識別する。次に、信号５４のバックグラウンドではなく試料からの部分が、出力ノード５８に提供される。従って、このシステムは、振幅変調アンチストークス信号を分離することによって、バックグラウンド情報を除去することができる。

図６に示したように、ＣＡＲＳ顕微鏡検査システム６６は、顕微鏡対物レンズ７０に向けられ試料７２上に導かれる変調ポンプビーム６８と共に、ストークスビームを受け取ることができる。ＣＡＲＳ信号は、前方に検出され、集光素子７４によって受け取られ、１つまたは複数のフィルタ７６によってフィルタリングされ、検出器７８によって検出され、ロックイン増幅器８０に通され、コンピュータ８２に導かれる。変調ポンプビームは、変調ポンプビームをストークスビームと組み合わせるスイッチング装置８４に提供される。装置８４は、方形波光源８６から方形波を受け取り、また図示したように半波長板９０および９２に通された後に、偏光ビームスプリッタ８８で合成された(combined)ω_ｐ１信号とω_ｐ２信号を受け取る。

図７Ａに示したように、本発明の特定の実施形態によるパルスＣＡＲＳシステムのスイッチングシステムは、半波長板１０４を介して第１のポンプビームω_ｐ１１０２を受け取り、ビームスプリッタ／コンバイナ１０８を介して第２のポンプビームω_ｐ２１０６を受け取るポッケルスセル１００を有する。ポッケルスセル１００の出力は、グランテイラー（Glan-Taylor）プリズム１１０に提供され、次にダイクロイックミラー１１２に提供され、そこでストークスビーム１１４と合成される。次に、ストークスビームとポンプビーム（共線になるように合成されてもよい）は、顕微鏡（例えば、図６に示した要素７０〜８２を含む）または分光計１１６に導かれる。図７Ａのシステムは、また、同期システムを含み、この同期システムによって、信号１０４、１０６および１１４をそれぞれ生成するソース１０３、１０５および１１３が互いに同期され、同期信号が周波数分割器１１７に提供される。次に、周波数分割器（分周器）１１７は、変調信号を提供する波形発生器１１９に結合され、変調信号は、ポンプおよびストークス信号１０４、１０６および１１４と同期される。ストークスビームとポンプビームの少なくともどちらかは、差分周波数が、変調周波数で試料の振動周波数と同調し離調するように変調される。

図７Ｂに示したように、パルスまたはＣＷ ＣＡＲＳ顕微鏡検査あるいは分光システム１１６用のスイッチングシステムは、（例えば、パルスまたはＣＷ）入力信号１１１と、（例えば、２波長光源１１５を変調するか、または光学パラメトリック発振器１１５の非線形結晶の温度または配向を変化させる）変調入力１０９を受け取る２波長光源１１５を含むことができる。いずれの場合も、（同一線形上になるように組み合わせることができる）２つの出力の差分周波数は、差分周波数ω_１−ω_２が、変調周波数で試料の振動周波数と同調しかつ離調するように変調される。更に他の実施形態によれば、システムは、また、試料を所望の検査周波数で調べるために使用することができる第３の周波数ω_３の第３の電磁場を提供する第３のソースを含んでもよい。

本発明の実施形態によれば、３つのパルスレーザが、改良されたレーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＦＶ３００）に結合される。ストークスビームは、パッシブモードロック固定周波数[passively mode-locked, fixed-frequency]Ｎｄ：ＹＶＯ_４レーザ（高Ｑ、ｐｉｃｏＴＲＡＩＮ、７ｐｓ、１０６４ｎｍ、７６ＭＨｚ反復率）からの出力の約１０％である。キャビティ内二重光学パラメトリック発振器（ＯＰＯ）を同期的にポンピングしてポンプビーム（ポンプ−１）として使用する同調可能な５ｐｓ近赤外線を生成するために、Ｎｄ：ＹＶＯ_４ソースの９０％出力が使用される。第２のポンプビーム（ポンプ−２）は、Ｎｄ：ＹＶＯ_４ソースに電子的に同期された同期可能な３ｐｓパルスを送出するモードロックＴｉ：Ａｌ_２Ｏ_３発振器によって提供される。ポンプ−１のビーム経路に挿入された半波長板は、ポンプ−１とポンプ−２が垂直偏光されるように偏光光を回転させるために使用される。次に、２つのポンプビームは、２ポートのグランタイラープリズム内で結合され、ポッケルスセルに共線的に送られる。レーザパルス列に同期されたパルス遅延発生器から導出されたデューティサイクル５０％の方形波形は、５００ｋＨｚ以下の周波数の変調信号をポッケルスセルに供給する。波形が低レベル状態のとき、ポンプ−１は出力分析器を通ることができる。波形が高レベル状態のときは、両方のビームの偏光がπ／２回転され、その結果、ポンプ−２は減衰せずに分析器を通り、ポンプ−１は遮断される。この構成により、実験に必要とされる迅速な波長変調が提供される。変調したポンプビームは、ダイクロイックミラー上でストークスビームと空間的に組み合わされ、組み合わされたビームが走査顕微鏡に導かれる。試料からのＣＡＲＳ信号は、ＰＭＴによって検出され、ロックイン増幅器に送られる。ロックイン基準は、ポッケルスセルを駆動するパルス発生器から供給される外部信号によって提供される。ポンプ−１のビーム経路に導入された半波長板は、グランタイラープリズムと共に使用され、最大非共鳴信号を抑制するために２つのビームの強度を釣り合わせることができる。

図８Ａは、約３０５０ｃｍ^−１のΔで得られたガラス表面上の直径３６０ｎｍのポリスチレンビーズのＣＡＲＳ顕微鏡検査画像を１２０に示し、図８Ｂは、図８Ａの区分１２４に沿った強度プロファイルのグラフ表示を１２２に示す。図８Ｃは、本発明の実施形態による周波数変調（ＦＭ）ＣＡＲＳシステムでの直径３６０ｎｍのポリスチレンビーズのＣＡＲＳ顕微鏡検査画像を１２６に示し、図８Ｄは、図８Ｃの区分１３０に沿った強度プロファイルのグラフ表示を１２８に示す。ポンプ−１は、３０５０ｃｍ^−１にあるビニルＣＨ伸縮バンドのピークに合わせられ、ポンプ−２は、３０００ｃｍ^−１にあるスペクトル的に平らな領域をターゲットとする。

図８Ｂに示したように、共鳴信号は非共鳴バックグラウンドより少しだけ強い。本発明の実施形態によりＦＭ−ＣＡＲＳ技術を使用して得た同じ画像は、図８Ｄに示したように非共鳴バックグラウンドのかなりの抑制を実証する。ＳＢ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒａｔｉｏ）の改善は、ビーズ内の強度プロファイルに示されている（図８Ｂと図８Ｄ）。ＦＭ−ＣＡＲＳの非共鳴信号抑制は、生体内撮像（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ）に直ちに適用可能であり、非共鳴ＣＡＲＳ信号は、対象の共鳴信号と同程度の強さでもよい。

図８Ｅは、Δ＝２１００ｃｍ^−１で得られた、重水素標識したオレイン酸で培養された固定Ａ５４９ヒト肺癌細胞のＣＡＲＳ画像を１３２に示し、図８Ｆは、本発明の実施形態により２０６０ｃｍ^−１と２１００ｃｍ^−１の間で変調するときに取得されたΔ＝２１００ｃｍ^−１で得た図８Ｅと同じ試料を示す。細胞の非共鳴的特徴は完全に抑制され、重水素を多く含む細胞構造だけが見えるようにされている。ＦＭ−ＣＡＲＳ法により非共鳴バックグラウンドが著しく減少したことに注意されたい。細胞は、固定前に重水素化オレイン酸で培養され、ＣＤ_２伸縮振動数（ポンプ−１：２１００ｃｍ^−１）と共鳴外周波数（ポンプ−２：２０６０ｃｍ^−１）で撮像された。２１００ｃｍ^−１のラマンシフトで得られた通常の前方ＣＡＲＳ画像（ｆｏｒｗａｒｄ−ＣＡＲＳ ｉｍａｇｅ）（図８Ｅ）は、細胞要素が重水素化合物を含むことを不明瞭にする多くの非共鳴細胞特徴を示す。ＦＭ−ＣＡＲＳを用いて細胞を撮像するとき（図８Ｆ）、非共鳴信号が消滅し、重水素化した脂肪滴の共鳴信号だけが現れる。

ＦＭ−ＣＡＲＳは、正確な共鳴撮像の他に、従来のＣＡＲＳ顕微鏡検査法よりも優れた検出感度を可能にする。高い感度を定量化するために、水に溶かしたメタノール溶液を使用した。メタノールは、ラマン散乱分光法によって十分に特性が調べられおり、ＣＨ伸縮領域内に２つの比較的細く（Γ_ＦＷＨＭは約２５ｃｍ^−１）十分に離れたローレンツ型ピークを引き起こす単一のＣＨ_３部分だけを含む。この実験では、ポンプ−１は、メタノールの対称ＣＨ_３伸縮に対応する２９２８ｃｍ^−１をターゲットとするように同調され、ポンプ−２は、振動共鳴のない３０４８ｃｍ^−１をターゲットとするように同調された。前に検討したように、ＦＭ−ＣＡＲＳ強度は、離調（Δ_１，２＝ω_{ｐ１，ｐ２}−ω_ｓ−Ω）の項は、Δｌ（δ）＝ｌ（Δ_１）−ｌ（Δ_２）に等しい。比較的低い濃度において、ｌ（Δ_１，２）は、最大溶質濃度（ｎ）の一部分に関して以下の式で表すことができる。

ここで、

は、純水からの非共鳴ＣＡＲＳ強度であり、
Ｒは、

に対する純粋メタノールからのピークＣＡＲＳ信号の比である。
ＦＭ−ＣＡＲＳ信号は

で最大になる。
Ｒパラメータは、共鳴最大値で実験的に容易に測定することができ、この実験ではＲ＝２４である。

図９は、２つの明らかに異なるロックイン検出帯域幅の場合のＦＭ−ＣＡＲＳ顕微鏡検査信号の実験測定値と濃度の関係を表す。図９に１４０で示したように、上記の式（２）は、濃度（ｎ）に対する（強度／強度_ｍａｘ）の対数の関係としてプロットすることができる。信号強度は、水に溶かしたメタノールからのものであり、一方Ｉ_ｍａｘは、純粋なメタノール試料からのＣＡＲＳ信号強度である。塗り潰した丸（１４２で示したような）は、検出器帯域幅で得られた実験データポイントが２５ｋＨｚであることを表わす。白ぬき丸（１４４で示したような）は、検出器帯域幅が１．６Ｈｚに設定されたときに得られたデータに対応する。

ＦＭ−ＣＡＲＳがロックイン増幅器を利用するので、検出器帯域幅を狭くしてより高い共鳴信号検出感度を達成することによって、検出される共鳴信号のノイズフロアーを少なくすることができ、限界感度が極めて狭い帯域幅になる。ｆ_１＝２５ｋＨｚの検出帯域幅（塗り潰した丸）では、通常のＣＡＲＳで見られる感度よりもかなり高い感度が達成され、本実施形態の構成の限界感度は、ｆ_２＝１．６Ｈｚ（白ぬき丸）の帯域幅になる。１４０で示した式（２）の関係（実線）は、データに直接当てはまる。狭い検出帯域幅（ｆ_２）で水から生じる非共鳴バックグラウンドを効率的に除去することにより、同じ実験で通常の前方ＣＡＲＳで達成される約４×１０^８発振器と対照的に、１００アトリッター（ａｔｔｏｌｉｔｅｒ）の調査体積内のわずか５×１０^５発振器によってメタノールから共鳴信号を検出することができた。両方の帯域幅が、帯域幅（ｆ）で直線的にスケーリングしなければならないので、両方の帯域幅の最小検出信号は期待値と異なる。これは、ＣＡＲＳ信号ノイズスペクトルが、サブＨｚ領域に重要な成分を有し、この成分は、ビームポインティング安定性ならびにレーザ強度と空間モードの変動から生じる可能性が高い。

２波長レーザ光源、高速電気光学同調機能を備えたＯＰＯ、および迅速な波長変調用の音響光学的可変フィルタを含むこの技術の改良は、ノイズの原因を除去することによって検出限界を改善する可能性が高い。また、本発明のシステムを使用して、変調波長を適切に選択することによって振動帯域内の小さな変化を検出することもできる。

従って、種々の実施形態において、本発明は、ポンプビームとストークスビームビーム間の差分周波数の迅速な変調に基づいて非共鳴信号を効率的に抑制するＣＡＲＳ顕微鏡検査法を提供する。この手法は、共鳴特徴を非共鳴バックグラウンドと区別する能力を高め、低濃度の化学種の感度を約３桁高め、共鳴画像を提供する。

以上開示した実施形態に対して、本発明の精神と範囲から逸脱することなく多数の修正と変形を行うことができることを当業者は理解するであろう。

ＣＡＲＳシステムにおける非共鳴周波数バックグラウンド信号の周波数依存性を示すグラフである。 ＣＡＲＳシステムにおける共鳴信号の周波数依存性を示すグラフである。 本発明の一実施形態によるＣＡＲＳシステムのスイッチング出力信号を表すグラフである。 狭帯域光源で検査するシステムにおけるＣＡＲＳ信号の成分の分離された共鳴を表すグラフである。 図４Ａに示した寄与の和を示すグラフである。 本発明の一実施形態によるシステムの概略の機能図である。 本発明の実施形態によるＣＡＲＳ顕微鏡検査システムの概略図である。 本発明の様々な実施形態によるＣＡＲＳ顕微鏡検査法または分光学システムのためのスイッチングシステムの概略図である。 本発明の様々な実施形態によるＣＡＲＳ顕微鏡検査法または分光学システムのためのスイッチングシステムの概略図である。 前方ＣＡＲＳ顕微鏡検査システムを使用して得られた直径３６０ｎｍのポリスチレンビーズのＣＡＲＳ顕微鏡検査画像を表す概略図である。 図８Ａに示した画像の区分に沿って得られた強度のグラフである。 本発明の一実施形態による前方ＣＡＲＳ顕微鏡検査システムを使用して得られた直径３６０ｎｍのポリスチレンビーズのＣＡＲＳ顕微鏡検査画像を表す概略図である。 図８Ｂに示した画像の区分に沿って得られた強度を表すグラフである。 図８Ａと図８Ｂで使用されているＣＡＲＳシステムを使用する細胞の概略図である。 本発明の一実施形態による図８Ｃと図８Ｄで使用されているＣＡＲＳシステムを使用する細胞の説明図である。 本発明の一実施形態による顕微鏡検査システムにおけるＣＡＲＳ信号の測定値を表す説明的なグラフである。

Claims (20)

1. 試料内で誘起された非線形コヒーレント場を検出するシステムであって、
   第１の周波数ω_１の第１の電磁場と第２の周波数ω_２の第２の電磁場を、差分周波数ω_１−ω_２が焦点体積内の試料の振動周波数と共鳴するように焦点体積内に導く光学素子と、
   前記差分周波数ω_１−ω_２を、前記差分周波数ω_１−ω_２が変調周波数で試料の振動周波数と同調及び離調するように変調する変調手段と、
   ω_１とω_２の非線形相互作用と変調周波数に応答する試料とによって生成される光学場を検出する検出器手段と、
   を含むシステム。
2. 前記第１の周波数は、ポンプ周波数であり、前記第２の周波数は、ＣＡＲＳシステムのストークス周波数である、請求項１に記載のシステム。
3. 前記変調周波数は、約５００ｋＨｚから約５０００ｋＨｚである、請求項１に記載のシステム。
4. 前記システムは、前記変調周波数の変調信号を生成する周期波形発生器を更に含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記変調信号は、前記第１と第２の電磁場の少なくともいずれかと同期する、請求項１に記載のシステム。
6. 前記第１と第２の電磁場の少なくともいずれかが、前記変調周波数で変調される、請求項１に記載のシステム。
7. 前記第１の電磁場と第２の電磁場は両方とも、前記差分周波数ω_１−ω_２が前記変調周波数の試料の振動周波数と同調及び離調するように前記変調周波数で変調される、請求項１に記載のシステム。
8. 前記システムは、更に、前記試料を調べるための第３の電磁場を含む、請求項１に記載のシステム。
9. 前記第１の電磁場と第２の電磁場の少なくともいずれかが、２波長光源によって生成される、請求項１に記載のシステム。
10. ω_１とω_２の非線形相互作用と変調周波数に応答する試料とによって生成される前記光学場は、２ω_１−ω_２で生成される、請求項１に記載のシステム。
11. 試料内で引き起こされる非線形コヒーレント場を検出するシステムであって、
    第１の周波数の第１の電磁場、前記第１の周波数と異なる第２の周波数の第２の電磁場、および第１の周波数と異なりかつ第２の周波数と異なる第３の周波数の第３の電磁場を生成するソースシステムであって、前記第２の周波数と前記第３の周波数は、それぞれ、前記第２の電磁場と前記第３の電磁場が前記第１の周波数で前記第１の電磁場と結合されたときに共鳴及び非共鳴する周波数であり、
    変調周波数で前記第２の周波数と第３の周波数を切り換える変調電磁場を提供する変調手段と、
    前記第１の電磁場と前記変調電磁場とを共通の焦点体積の方に導く光学素子であって、前記第１の周波数と前記第２の周波数の相違周波数は前記試料に共鳴し、前記第１の周波数と前記第３の周波数の相違周波数は前記試料に非共鳴であり、
    前記焦点体積内の前記第１の電磁場と変調電磁場とに応じて生成された非線形コヒーレント場を検出する検出器手段とを含むシステム。
12. 前記第１の周波数は、ポンプ周波数であり、前記第２と第３の周波数は、ＣＡＲＳシステムのストークス周波数である、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記第１の周波数は、ＣＡＲＳシステムのストークス周波数であり、前記第２と第３の周波数はポンプ周波数である、請求項１１に記載のシステム。
14. 前記変調周波数は、少なくとも約５００ｋＨｚである、請求項１１に記載のシステム。
15. 前記システムは、更に、前記変調周波数の変調信号を生成する周期波形発生器を含む、請求項１１に記載のシステム。
16. 前記周期波形発生器は、前記ソースシステムと同期された、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記第１と第２の電磁場の少なくとも一方が、２波長光源によって生成された、請求項１１に記載のシステム。
18. 試料内で誘起された非線形コヒーレント場を検出する方法であって、
    第１の周波数ω_１の第１の電磁場と第２の周波数ω_２の第２の電磁場を、差分周波数ω_１−ω_２が焦点体積内の試料の振動周波数と共鳴するように焦点体積の方に導き、
    差分周波数ω_１−ω_２を、差分周波数ω_１−ω_２が変調周波数で試料の振動周波数と同調及び離調するように調整し、
    ω_１とω_２の非線形相互作用と変調周波数に応答する試料とによって生成された光学場を検出することを含む方法。
19. 前記差分周波数を変調するステップは、前記第１の電磁場と第２の電磁場の少なくともいずれかを前記変調周波数で変調することを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記差分周波数を変調するステップは、前記第１の電磁場と第２の電磁場の両方を前記変調周波数で変調して前記差分周波数ω_１−ω_２が前記変調周波数で試料の周波数と同調及び離調することを含む、請求項１８に記載の方法。

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