JP6830427B2 - 光測定装置 - Google Patents

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Description

本発明は、光を用いて試料を測定する光測定装置に関するものである。
近年、医療や創薬分野における生体組織を観察することを目的とした顕微鏡の開発が盛んである。現在は観察対象である生体組織を染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察する方法が一般的である。しかしながら、染色試薬の影響により、同一の生体組織を継続的に観察することが困難であり、非染色な観察方法が求められてきた。
ラマン顕微鏡は、観察対象に対して励起レーザ光を照射することにより発生する散乱光のうち、励起光に対して周波数シフトを示すラマン散乱光を観測する。ラマン散乱光の示す周波数シフトはラマンシフトと呼ばれ、そのシフト量はレーザ照射箇所に分布する化学結合種に依存する。したがって、レーザ照射箇所を変化させ、観察対象の複数箇所においてラマンスペクトルを得ることにより、観察対象の分子種およびその分布に関する情報を非侵襲かつ非接触に得ることができる。以上のような特長を有するラマン顕微鏡だが、自発ラマン散乱と呼ばれる通常のラマン散乱においては、ラマン散乱光の強度が弱く計測に時間を要するので、時間変化が大きい生体組織に用いることは困難だった。
近年の高性能な短パルスレーザの出現により、非線形光学効果を用いた顕微鏡の技術が発展した。従来の蛍光顕微鏡は、各蛍光物質の励起周波数ωに相当する光源を用い単一光子により試料を励起する。一方、非線形光学効果を用いた多光子励起蛍光顕微鏡は、ω=Σ(ω)を満たすように複数の光子で試料を励起する。特に2光子で励起する場合を2光子顕微鏡と呼ぶ。2光子顕微鏡は、通常の蛍光顕微鏡と比較して空間分解能が優れている。ラマン顕微鏡においても、非線形光学効果を用い信号強度を増大させたCARS(Coherent Anti−Stokes Raman Scattering)顕微鏡などが開発されている。その結果、計測時間が短縮され、ラマンにより生体組織を観察することができるようになってきている。
CARSは、励起光としてポンプ光、ストークス光、プローブ光という3種類のレーザを用いる3次非線形光学現象である。一般的には光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。この場合CARS光の強度は、下記式で表される。χ(3)は3次の電気感受率、Eはポンプ光およびプローブ光の電場、Eはストークス光の電場である。Eの肩についたアスタリスクは複素共役を表す。
AS(ωAS)∝|χ(3) (ω)E (ω)|
以上より、CARS光の強度はポンプ光の強度の2乗およびストークス光の強度の1乗に比例する。自発ラマン散乱と異なり分子をコヒーレントに励起するので、CARS光は自発ラマン散乱光と比較して10倍程度の強い信号強度を示す。
近年、生体組織評価においてCARS顕微鏡と蛍光顕微鏡を一体化し、検出可能な物質の種類を広げる試みがなされている(非特許文献1、2)。このような顕微鏡は、蛍光計測により生体組織内の詳細な構造を可視化し、CARS計測により各内部構造における分子種の分布を導出することができる。また生体組織の有する自家蛍光の計測とCARS計測を合わせた非染色計測を実施することも考えられる。下記特許文献1は、CARS観察と蛍光観察をともに実施することができる装置の1例を開示している。
特許文献1記載の技術は、波長掃引光源を用いているので、装置が高価格化または大型化する傾向がある。本発明は、このような従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、波長掃引光源を使用することなくCARS観察と蛍光観察を実施することができる光計測装置を提供することを目的とする。
本発明に係る光計測装置は、光源が出射したレーザ光を用いて、前記レーザ光よりも広帯域な広帯域光を生成し、前記広帯域光を長波長成分と短波長成分に分岐し、前記長波長成分を用いてCARS計測を実施し、前記短波長成分を用いて蛍光観察を実施する。
本発明に係る光計測装置によれば、波長掃引光源を用いずにCARS観察と蛍光観察を実施することができるので、装置を小型化および低価格化することができる。上記以外の課題、構成、および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
CARS過程を示すエネルギー準位図である。 広帯域光を用いるCARS過程を示すエネルギー準位図である。 実施形態1に係る光計測装置の構成例である。 1060nm付近を中心波長とする短パルスレーザ光源302を用いた場合における各光の波長である。 CARS計測を実施する際における各光の波長である。 蛍光計測を実施する際における各光の波長である。 800nm付近を中心波長とする短パルスレーザ光源302を用いた場合における各光の波長である。 コントローラ301が提供するユーザインターフェースの画面例である。 コントローラ301が計測を実施する手順を説明するフローチャートである。 実施形態2に係る光計測装置が用いる各光の波長である。 実施形態3に係る光計測装置の構成例である。 実施形態4に係る光計測装置の構成例である。 実施形態5に係る光計測装置の構成例である。
<実施の形態1>
図1は、CARS過程を示すエネルギー準位図である。分子は始状態として基底準位101をとる。周波数ωのポンプ光と周波数ωのストークス光を同時に照射することにより、分子は中間準位103を経て振動励起準位102に励起される。この励起状態にある分子に対して周波数ωのプローブ光を照射すると、試料は中間準位104を経て周波数ωASのCARS光を放出し、基底準位101に緩和する。したがってCARS光は周波数がω−ωである振動励起準位を有する分子から発生する。ωASは2ω−ωと等しい。
図2は、広帯域光を用いるCARS過程を示すエネルギー準位図である。CARS計測において広帯域なスペクトルを取得するためには、励起光の波長を掃引する手法と、図2に示すようにストークス光として広帯域な光を用い、発生するCARS光を分光検出する手法がある。ストークス光が広帯域であるので、中間準位104を経て複数の振動励起準位102に励起することができる。図2に示すCARSはマルチプレックスCARSと呼ばれ、1回の露光でスペクトル情報を取得することができる。
図3は、本発明の実施形態1に係る光計測装置の構成例である。本実施形態1に係る光計測装置は、コントローラ301、光学系(短パルスレーザ光源302〜検出器313)、解析部314を備える。コントローラ301は、光計測装置の全体動作を制御する。光学系については後述する。解析部314は、観察対象312のハイパースペクトル画像を取得し、これに対してスペクトル解析を実施する。コントローラ301と解析部314は単一の装置として構成してもよい。
短パルスレーザ光源302から出射した光は、ビームスプリッタ303により2分岐される。分岐光の一方は、フォトニック結晶ファイバ304などの光ファイバに導入され、その内部でスーパーコンティニウム(以下SC)光が発生する。波長フィルタ305は、発生したSC光のうち、短パルスレーザ光源302から出射した光よりも長波長かつ所望のCARS計測に適した波長成分のみを、抽出する。CARS計測においてはこの長波長成分がストークス光として用いられる。SC光を生成するために用いられなかったもう一方の分岐光は、CARS計測においてはポンプ光(兼プローブ光)として用いられる。
ポンプ光、ストークス光という名称はCARS計測を行う場合に限り用いられるものであるが、本発明の理解を容易にするため、以下の説明においては各光を次のように呼称する。(a)短パルスレーザ光源302が出射する光:ポンプ光、(b)SC光のうちCARS計測に用いる長波長成分:ストークス光またはSC長波長成分、(c)SC光のうちCARS計測に用いない短波長成分:SC光短波成分。
ダイクロイックミラー308は、ポンプ光とストークス光を合波する。この合波光が観察対象312に対して集光・照射され、これによりCARS光が発生する。ダイクロイックミラー310は、波長フィルタ305が除去したSC光短波成分を、ポンプ光、ストークス光と合波する。この合波光が観察対象312に対して集光・照射され、これにより蛍光が発生する。検出器313は、これらCARS光と蛍光を検出し、スペクトルを取得する。自動ステージ311は、観察対象312に対する集光箇所を微調整する。
図4Aは、1060nm付近を中心波長とする短パルスレーザ光源302を用いた場合における各光の波長である。CARS計測においては、SC光の長波長成分を用いて観察対象312を励起する。これにより生じるCARS光(CARS信号光)の波長は、SC光短波長成分と重なっている。
図4Bは、CARS計測を実施する際における各光の波長である。CARS計測を実施する際には、波長フィルタ309をSC光短波長成分の光路に挿入する。これにより、CARS信号光とSC光短波長成分が重ならないようにし、CARS計測を適切に実施することができる。
図4Cは、蛍光計測を実施する際における各光の波長である。蛍光計測を実施する際には、SC光短波成分、ポンプ光、ストークス光を用いて多光子励起を実施する。これにより観察対象312から蛍光(蛍光信号光)が発生する。観察対象312に対してダメージを与えないようにするため、各光の光路に波長フィルタ306、307、309を挿入することにより、計測に不要な波長帯域を除去してもよい。
図5は、800nm付近を中心波長とする短パルスレーザ光源302を用いた場合における各光の波長である。CARS計測においては、図4Bと同様に波長フィルタ309を用いてSC光短波長成分を除去する。蛍光計測においては、SC光短波成分と蛍光励起光の波長帯域が一部重なっているので、使用する蛍光試薬の励起波長がSC光短波成分の波長に含まれていれば、単一光子励起による蛍光を観察してもよい。
単一光子励起を用いる場合、蛍光信号光の波長は蛍光励起光の波長から大きくシフトしないので、蛍光信号光の波長と蛍光励起光の波長が一部重なる場合がある。この場合は、蛍光信号光と波長帯域が重なるSC短波長成分を除去するように、波長フィルタ309を構成すればよい。図4Cと同様に多光子励起蛍光を観察する場合は、蛍光信号光の波長は蛍光励起光から大きくシフトするので、そのようなフィルタ構成は必要ないことが多いであろう。
図6は、コントローラ301が提供するユーザインターフェースの画面例である。ユーザインターフェースは、露光時間などの一般的な計測条件に加え、CARS計測と蛍光計測の組み合わせ方法や波長フィルタを選択する部分を備える。取得したスペクトルや特定波長の空間強度分布を表示する部分を備えていてもよい。コントローラ301は、指定にしたがって、CARS計測と蛍光計測のいずれを実施するか、または双方実施するかを切り替える。コントローラ301はさらに、指定にしたがって、いずれのフィルタを用いるかを切り替え、あるいはフィルタを用いるか否かを切り替える。
図7は、コントローラ301が計測を実施する手順を説明するフローチャートである。S701においてコントローラ301は、インターフェースを介してユーザから計測領域の指定を受ける。S702においてコントローラ301は、CARS計測と蛍光計測それぞれについて、計測手法の指定(各計測を実施するか否か)と使用する波長フィルタの指定を受ける。波長フィルタは、計測する波長帯域にしたがってコントローラ301が自動選択してもよい。波長フィルタを手動で挿抜する場合は、波長フィルタを指定しなくてもよい。S703においてコントローラ301は、露光時間の指定を受ける。S702においてCARS計測と蛍光計測をともに実施することを指定した場合は、それぞれの露光時間を指定する。S704において、コントローラ301またはユーザは、指定された波長フィルタを挿入する。S705〜S708においてコントローラ301は、1ピクセルの計測を実施する。S709においてコントローラ301は、指定した全ての計測を完了したかどうかを判断する。S710においてコントローラ301は、自動ステージ311により次のピクセル位置に観察対象312を移動させる。S711においてコントローラ301は、計測領域全体を計測したか否かを判断する。
<実施の形態1:まとめ>
ストークス光として広帯域なスーパーコンティニウム(SC)光を用いた従来のマルチプレックスCARS顕微鏡においては、SC光のうち、ポンプ光の波長λよりも長波長な帯域をストークス光として使用し、CARS光発生に寄与しない短波長成分は波長フィルタなどにより除去していた。本実施形態1に係る光計測装置は、SC光短波長成分をポンプ光とストークス光に対応する光と合波して、蛍光観察の励起光として用いる。これにより、一般的な蛍光観察に必要な励起波長帯域を網羅し、単一装置によりCARS計測と蛍光観察を実施することができる。また、波長掃引光源を用いることなくCARS計測と蛍光計測を実施できるので、装置を小型化かつ低価格化できる。
図4Cにおいて、SC光短波長成分の全波長領域を用いて蛍光計測を実施している。これは蛍光試薬の励起波長域に制限を設けず、全波長域のSC光短波成分を使用できるようにするためのものである。したがって、CARS光とSC光短波長成分が重ならないように、波長フィルタ309を用いることとした。これに代えて、CARS光と波長帯域が重ならないSC光短波成分によって励起することができる蛍光試薬を用いる場合は、両計測を同時に実施できる。またCARS計測において、ラマンの生体組織情報が多いとされる指紋領域に限定して計測を実施する場合は、指紋領域と重ならないSC光短波成分を用いて蛍光計測を同時に実施できる。
<実施の形態2>
図8は、本発明の実施形態2に係る光計測装置が用いる各光の波長である。図4Aで説明した各波長のうち、SC短波長成分がCARS信号光と重なっているので、CARS計測と蛍光計測を同時に実施することは困難である。そこで本実施形態2においては、波長フィルタ309がSC短波長成分のうちCARS信号光と波長が重なる部分を除去することとした。これにより、CARS計測と蛍光計測を同時に実施することができる。SC短波長成分を除去することにより、対応する蛍光成分が図4Aと比較して減少するが、これを許容できる限りにおいては、本実施形態2の構成も有用である。
<実施の形態3>
実施形態1においては、波長フィルタ309を挿抜することにより、SC光短波長成分を照射するか否かを切り替えることとした。本発明の実施形態3では、高速シャッタを用いた時間分解により、SC光短波長成分を照射するか否かを切り替える例を説明する。
図9は、本実施形態3に係る光計測装置の構成例である。ダイクロイックミラー308は、ポンプ光とストークス光を合波した後に2分岐する。一方の分岐光は、ダイクロイックミラー901によってSC光短波成分と合波される。この合波光を蛍光励起光として用い、もう一方の分岐光をCARS励起光として用いる。光路長調整機構902は、蛍光励起光が観察対象312に対して照射されるタイミングが、CARS励起光が観察対象312に対して照射されるタイミングとは異なるように、蛍光励起光のタイミングを調整する。ビームスプリッタ903は、CARS励起光と蛍光励起光を同一光軸上に揃える。
蛍光計測を実施する際には、ロングパスフィルタ904を用いて蛍光を光軸から分岐させる。ロングパスフィルタ904は、CARS光波長域と蛍光波長域の中間波長をカットオン波長として有する。ロングパスフィルタ906は、ロングパスフィルタ904が分岐させた蛍光を、再度同じ光軸上に揃える。高速シャッタ905は、光路長調整機構902によって調整されたタイミングと同期して、蛍光励起光を遮断する。これにより、蛍光計測において蛍光励起光は検出器313に入射しない。したがって検出器313は、蛍光を検出することができる。
CARS励起光とCARS信号光が検出器313に対して入射するタイミングは、蛍光励起光と蛍光が検出器313に対して入射するタイミングとは異なるので、これらは時間軸上では重ならない。さらにCARS励起光(SC光の長波長成分)の波長とCARS信号光の波長は異なるので(すなわち検出すべき波長成分が互いに異なるので個別に検出することができる:図4A〜図5参照)、検出器313は入射するCARS信号光を検出することができる。励起光を除去するフィルタを別途設けてもよい。
高速シャッタ905としては、光源の繰り返し周波数に応じて最適なものを選択すればよい。繰り返し周波数が比較的遅い光源を用いる場合はメカニカルチョッパなどを用い、速い光源を用いる場合はポッケルス効果やカー効果を利用する光スイッチなどを用いればよい。
<実施の形態3:まとめ>
本実施形態3に係る光計測装置は、光路長調整機構902により、CARS光と蛍光が時間軸上で互いに重ならないように調整するとともに、高速シャッタ905により、CARS光と波長が重なるSC短波長成分を除去する。これにより、CARS計測と蛍光計測を一括して実施することができる。その結果、実施形態1と比較して読み出しノイズの低減や読み出し時間の短縮などの効果が得られる。
<実施の形態4>
実施形態3では、CARS光とSC短波長成分を時間的に分離することにより、一度の計測でCARS計測と蛍光計測を実施する。他方で、光路長調整機構902や高速シャッタ905を配置する必要があるので、装置構成が複雑である。本発明の実施形態4では、励起光の偏光を調整することにより、実施形態3よりも簡易な構成で実施形態3と同様の効果を発揮することを図る。
図10は、本実施形態4に係る光計測装置の構成例である。アクロマティック波長板1001は、SC短波長成分(蛍光励起光)の偏光を、SC長波長成分(CARS励起光)の偏光とは異なるように調整する。偏光ビームスプリッタ1002は各励起光を合波する。偏光ビームスプリッタ1003は、蛍光励起光に対応する偏光成分を除去する。その他構成は実施形態3と同様である。本実施形態4は、励起光の偏光を調整することによりCARS計測と蛍光計測を同時に実施するので、より簡易な構成で実施形態3と同様の効果を発揮することができる。
<実施の形態5>
図11は、本発明の実施形態5に係る光計測装置の構成例である。以上の実施形態においては単一の短パルスレーザ光源302から出射するレーザ光をビームスプリッタ303によってポンプ光と励起光に分岐するが、これに代えて2つの光源を設け、短パルスレーザ光源302はポンプ光を供給し、短パルスレーザ光源601は励起光を供給するようにしてもよい。この場合、ダイクロイックミラー308は短パルスレーザ光源302からレーザ光を受け取り、フォトニック結晶ファイバ304は短パルスレーザ光源601からレーザ光を受け取る。
<本発明の変形例について>
本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
301:コントローラ
302:短パルスレーザ光源
303:ビームスプリッタ
304:フォトニック結晶ファイバ
305:波長フィルタ
306:波長フィルタ
307:波長フィルタ
308:ダイクロイックミラー
309:波長フィルタ
310:ダイクロイックミラー
311:自動ステージ
312:観察対象
313:検出器
314:解析部
601:短パルスレーザ光源
901:ダイクロイックミラー
903:ビームスプリッタ
904:ロングパスフィルタ
905:高速シャッタ
906:ロングパスフィルタ
1001:アクロマティック波長板
1002:偏光ビームスプリッタ
1003:偏光ビームスプリッタ

Claims (13)

  1. 光を用いて試料を計測する光計測装置であって、
    レーザ光を通過させることにより前記レーザ光よりも広帯域な広帯域光を生成する広帯域光生成部、
    前記広帯域光を、前記レーザ光よりも波長が長い長波長成分と、前記長波長成分よりも波長が短い短波長成分とに分岐する、波長分岐部、
    前記レーザ光と前記長波長成分を合波することにより合波光を生成する合波部、
    前記合波光を前記試料に対して集光し、前記短波長成分を前記試料に対して集光する、集光光学系、
    前記合波光を前記試料に対して照射することにより生じるラマン散乱光を検出する分光器、
    前記短波長成分を前記試料に対して照射することにより生じる蛍光を検出する蛍光検出器、
    を備えることを特徴とする光計測装置。
  2. 前記光計測装置はさらに、前記短波長成分のうち少なくとも一部を遮断するフィルタを備え、
    前記分光器は、前記フィルタが前記短波長成分を遮断しているとき前記ラマン散乱光を検出し、
    前記蛍光検出器は、前記フィルタが前記短波長成分を遮断していないとき前記蛍光を検出する
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  3. 前記フィルタは、前記短波長成分のうち前記蛍光の波長と重なる部分を遮断する
    ことを特徴とする請求項2記載の光計測装置。
  4. 前記光計測装置はさらに、前記短波長成分のうち前記試料から生じる前記ラマン散乱光と重なる部分を遮断するショートパスフィルタを備え、
    前記分光器は、前記蛍光検出器が前記蛍光を検出するのと並行して前記ラマン散乱光を検出し、
    前記蛍光検出器は、前記分光器が前記ラマン散乱光を検出するのと並行して前記蛍光を検出する
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  5. 前記光計測装置はさらに、
    前記短波長成分が前記試料に対して照射されるタイミングを、前記合波光が前記試料に対して照射されるタイミングとは異なるように調整する、タイミング調整部、
    前記短波長成分が前記試料を透過した後の光路において、前記短波長成分が前記試料に対して照射されるタイミングに同期して前記短波長成分を遮断する、遮断部、
    を備え、
    前記蛍光検出器は、前記遮断部が前記短波長成分を遮断しているとき前記蛍光を検出する
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  6. 前記光計測装置はさらに、前記短波長成分が前記試料を透過した後の光路において前記蛍光を分離するロングパスフィルタを備え、
    前記蛍光検出器は、前記ロングパスフィルタが分離した前記蛍光を検出する
    ことを特徴とする請求項5記載の光計測装置。
  7. 前記光計測装置はさらに、
    前記短波長成分の偏光を、前記合波光の偏光とは異なるように調整する、偏光調整部、
    前記短波長成分が前記試料を透過した後に前記短波長成分が有する偏光成分を分岐する分岐部、
    を備え、
    前記分岐部は、前記短波長成分が有する偏光成分が前記分光器に対して入射しないように分岐させる
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  8. 前記光計測装置はさらに、前記短波長成分が前記試料を透過した後に前記蛍光を分離するロングパスフィルタを備え、
    前記蛍光検出器は、前記ロングパスフィルタが分離した前記蛍光を検出する
    ことを特徴とする請求項7記載の光計測装置。
  9. 前記光計測装置はさらに、
    前記レーザ光を出射する光源、
    前記レーザ光を、前記合波部に対して入射する成分と前記広帯域光生成部に対して入射する成分に分岐させる分岐部、
    を備えることを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  10. 前記光計測装置はさらに、前記レーザ光を出射する第1および第2光源を備え、
    前記第1光源は、前記合波部に対して前記レーザ光を出射し、
    前記第2光源は、前記広帯域光生成部に対して前記レーザ光を出射する
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  11. 前記光計測装置はさらに、前記分光器が前記ラマン散乱光を検出するか、前記蛍光検出器が前記蛍光を検出するかを切り替えるよう指示する指示入力を受け取るインターフェースを備え、
    前記光計測装置は、前記インターフェースが受け取った前記指示入力にしたがって、前記分光器が前記ラマン散乱光を検出するか、前記蛍光検出器が前記蛍光を検出するかを切り替える
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
  12. 前記光計測装置はさらに、前記フィルタが前記短波長成分を遮断するか否かを切り替えるよう指示する指示入力を受け取るインターフェースを備え、
    前記光計測装置は、前記インターフェースが受け取った前記指示入力にしたがって、前記フィルタが前記短波長成分を遮断するか否かを切り替える
    ことを特徴とする請求項2記載の光計測装置。
  13. 前記広帯域光生成部は、前記広帯域光として、スーパーコンティニウム光を生成する
    ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
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