JP2010002254A

JP2010002254A - 非線形ラマン散乱光測定装置

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Publication number: JP2010002254A
Application number: JP2008160175A
Authority: JP
Inventors: Kazuhide Hasegawa; 一英長谷川
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2010-01-07

Abstract

【課題】非線形ラマン散乱光測定装置において、被検体を構成する分子を効率良く分析できるようにする。
【解決手段】広帯域ストークス光照射部４１により、ポンプ光Ｌｐと広帯域ストークス光Ｌｓｗとを被検体１へ同時に照射する。この照射を受けた被検体１から発せられる非線形ラマン散乱光Ｌｃｗのスペクトルをスペクトル取得部６０が取得して被検体１を構成する複数種類の分子が特定される。その後、狭帯域ストークス光照射部４２により、特定された複数種類の分子のうちの一部の分子を分析するための、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとを被検体１へ同時に照射する。この照射を受けた被検体１から発せられる非線形ラマン散乱光Ｌｃｎのスペクトルをスペクトル取得部６０が取得して前記一部の分子が分析される。
【選択図】図１

Description

本発明は非線形ラマン散乱光測定装置に関し、詳しくは、被検体から発せられる非線形ラマン散乱光のスペクトルを取得する非線形ラマン散乱光測定装置に関するものである。

従来より、レーザ光の照射を受けた被検体から発せられるラマン散乱光を分光して得られたスペクトルを分析するラマン分光法が知られている。被検体から発せられるラマン散乱光は物質固有のものであることから、被検体を構成する分子を分析することができるので、材料評価や新物質創製等に広く活用されている。このラマン分光法としては、以下のような方式が知られている。

すなわち、例えば、ポンプ光とこのポンプ光よりも波長が長いストークス光を被検体へ同時に照射して、この被検体から上記ポンプ光よりも波長が短い非線形ラマン散乱光を発生させる。そして、この非線形ラマン散乱光を分光してスペクトルを得、このスペクトルの示す光強度分布におけるピークの値（極大値）とそのピークの示すラマンシフト量とから被検体を構成する分子を分析する非線形ラマン散乱光測定方法が知られている（特許文献１参照）。

この非線形ラマン散乱光測定方法によれば、ポンプ光およびストークス光の照射を受けた被検体から発せられる蛍光と非線形ラマン散乱光との波長範囲が重ならないので、非線形ラマン散乱光に混入するノイズを抑制することができ、より正確に被検体を構成する分子を分析することができる。

この非線形ラマン散乱光測定方法には、特定の１つの波長に光強度を持つストークス光とポンプ光とを被検体に照射してこの被検体を構成する分子を分析する方式が知られている。

この、方式では、特定の１つの波長に光強度を持つストークス光とポンプ光とを被検体へ同時に照射したときに、それらの波長差に応じた振動数のうなりが生じ、そのうなりに共鳴した１種類の分子の共鳴振動を示すピークが非線形ラマン散乱光のスペクトル中に生じる。そのスペクトルを調べることにより、被検体を構成する１種類の分子を分析することができる。

この方式は分析対象とする分子に応じてストークス光の波長を決定するが、被検体中の分析対象とする分子の種類（例えば、生体試料中の患部を構成している分子の種類）が不明なときには、予め他の測定装置により、被検体を構成する分子の種類を特定する事前測定を行い、その後、特定された分子を詳しく分析するために、この方式を利用して本測定を行っている。
特開２００４−６１４１１号明細書

ところで、上記被検体を構成する分子を詳しく分析する方式を実施するための本測定用の装置と、被検体を構成する分子の種類を特定するための事前測定用の装置とが異なるため、事前測定と本測定とを行うためには、２種類の測定装置を用意したり、生体試料を２種類の測定装置の間を移動させたりする必要があり、測定を実施するための負担が大きくなることがある。そのため、その負担を軽減したいという要請がある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、被検体を構成する分子の分析を効率良く実施できる非線形ラマン散乱光測定装置を提供することを目的とするものである。

本発明の非線形ラマン散乱光測定装置は、ポンプ光とこのポンプ光よりも波長が長くエネルギの小さいストークス光とを被検体に同時に照射するための光照射手段と、ポンプ光とストークス光の照射を受けた被検体から発せられる非線形ラマン散乱光のスペクトルを取得するスペクトル取得手段とを備えた非線形ラマン散乱光測定装置であって、光照射手段が、被検体を構成する複数種類の分子を特定するための広い波長範囲に光強度を持つ広帯域のストークス光を照射する広帯域ストークス光照射手段と、特定された複数種類の分子のうちの一部の分子を分析するための、広帯域のストークス光の波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域のストークス光を照射する狭帯域ストークス光照射手段とを有することを特徴とするものである。

前記、狭帯域のストークス光は、互に異なる波長を持つ複数のピークを有するものとすることができる。

前記狭帯域のストークス光は、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであり、互に波長が隣り合う２つのピークの間の波長範囲内に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ²以下の光強度となる波長範囲を有するものであることが望ましい。

また、前記狭帯域のストークス光は、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであり、互に波長が隣り合う２つのピークの間の波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有するものであることが望ましい。

なお、線形ラマン散乱光を実質的に発生させないストークス光の光強度とは、分子を分析するためのスペクトルの取得を可能とする光強度を有する非線形ラマン散乱光を発生させることができない光強度を意味するものである。

前記広帯域のストークス光および前記狭帯域のストークス光は、１つの光源から発せられた光から生成されるものとすることが望ましい。

前記狭帯域ストークス光照射手段は、狭帯域のストークス光のピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するものとすることができる。

非線形ラマン散乱光測定装置は、被検体を、ポンプ光およびストークス光と交わる平面に沿って、ポンプ光およびストークス光に対して相対的に移動させる移動手段と、移動手段による移動と光照射手段によるポンプ光およびストークス光の照射とを実行しつつ、被検体から発せられた非線形ラマン散乱光のスペクトルをスペクトル取得手段が取得するように制御する制御手段とを備えることもできる。

本発明の非線形ラマン散乱光測定装置によれば、被検体を構成する複数種類の分子を特定するための広帯域のストークス光を照射する広帯域ストークス光照射手段と、特定された複数種類の分子のうちの一部の分子を分析するための、前記広帯域のストークス光の波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域のストークス光を照射する狭帯域ストークス光照射手段とを両方共に備えるようにしたので、被検体中の分析対象とする分子の種類を特定する準備段階の測定と、その特定された分子のうちの一部の分子を詳しく分析するための本測定とを１つの装置で実施できる。これにより被検体を構成する分子の分析を効率良く実施できる。

さらに、狭帯域のストークス光を、互に異なる波長を持つ複数のピークを有するものとすれば、同時に２種類以上の分子を詳しく分析することができ、これにより被検体を構成する分子の分析をより効率良く実施できる。すなわち、複数種類の分子を個別に分析するために定められた波長においてストークス光の光強度を高めるように複数のピークを設定できるので、ストークス光の光強度を広い波長範囲に亘って全体的に高めて被検体を変質させるような光強度にすることなく、複数種類の分子を同時に分析する際の測定を高速化できる。より詳しくは、複数種類の分子を個別に分析するために定められた各波長においてストークス光の光強度を高めるように複数のピークを設定し、一方で、上記分子の分析に不要な、互に波長が隣り合う２つのピーク間の波長においてストークス光の光強度を低下させることにより、複数種類の分子を同時に分析する際の測定時間を短縮しつつ、ストークス光の持つ光強度の総量を抑制して被検体を変質させないようにすることができる。これにより、被検体を構成する複数種類の分子を一度に分析する際の測定効率を高めることができる。

また、狭帯域のストークス光を、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものとし、互に波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ²以下の光強度となる波長範囲を有するものとすれば、本測定の測定精度を低下させることなく、狭帯域のストークス光のパワーを小さくすることができるので、狭帯域のストークス光が照射された被検体の受けるダメージを小さくすることができる。

また、広帯域のストークス光および前記狭帯域のストークス光を、１つの光源から発せられた光から生成されるものとすれば、装置構成をより簡素化することができ、装置コストを抑制できる。

なお、狭帯域ストークス光照射手段を、狭帯域のストークス光のピークの波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するものとすれば、分析対象とする一部の分子を分析するための狭帯域のストークス光をより容易に生成することができる。

さらに、非線形ラマン散乱光測定装置を、ポンプ光およびストークス光と交わる平面に沿って被検体をそのポンプ光およびストークス光に対して相対的に移動させる移動手段と、移動手段による移動と光照射手段によるポンプ光およびストークス光の照射とを実行しつつ、被検体から発せられた非線形ラマン散乱光のスペクトルをスペクトル取得手段が取得するように制御する制御手段とを備えたものとすれば、被検体を構成する分子をより正確に分析することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。図１は本発明の非線形ラマン散乱光測定装置の一例を示すブロック図、図２はＣＡＲＳ光の発生過程のエネルギー準位を示す図である。

初めに、非線形ラマン散乱光の１例であるＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）について説明する。定性的なＣＡＲＳ光の発生原理は以下のように説明される。

測定対象の分子が存在している領域に、振動数の異なる２つの光、振動数ω１の光と振動数ω２の光を入射させると（ω１＞ω２とする）、振動数ω１−ω２のうなりが生じる。このうなりの振動数が測定対象の分子の固有振動数Ωと一致しているとき、分子は共鳴振動を起こす。共鳴振動が起こっている状態で、さらに振動数ω３の光を入射させると、分子の共鳴振動と振動数ω３の光との相互作用により、ＣＡＲＳ光が発生する。

図２を参照しながら、エネルギー準位の観点から上記のＣＡＲＳ光の発生過程を辿る。光を入射させる前の分子は、図２で示すエネルギー準位がＥ１の初期状態にある。ここに振動数ω１の光と振動数ω２の光を入射させると、分子のエネルギー準位は、振動数ω１の光により励起されて仮想的なエネルギー準位Ｅ３まで上がり、振動数ω２の光に対応する仮想的な光子放出によりＥ３からＥ２に下がると考えられる。この振動数の差ω１−ω２が分子の固有振動数Ωと一致したとき、分子は共鳴振動を起こしてエネルギー準位がＥ２の励起状態となる。ここにさらに振動数ω３の光を入射させると、分子のエネルギー準位はＥ２から仮想的なエネルギー準位Ｅ４に上昇し、ＣＡＲＳ光が発生することにより分子のエネルギー準位はＥ４からＥ１に下がることになる。

上記のような３つの励起光、すなわち振動数ω１、ω２、ω３の光の入射により、いわゆる四光波混合過程が生じ、結果として振動数ωａｓ＝ω１−ω２＋ω３のＣＡＲＳ光が発生する。上記の過程は、振動数ω３の光の代わりに振動数ω１の光を用いて起こすことも可能である。この場合は振動数の異なる２種類の励起光でＣＡＲＳ光を発生でき、このときのＣＡＲＳ光の振動数ωａｓはωａｓ＝２ω１−ω２となる。励起光を２種類にした方が装置構成を簡易化できるため、本発明の非線形ラマン散乱光測定装置１００も、振動数の異なる２つの励起光でＣＡＲＳ光を発生させる構成を採っている。なお、一般に、振動数ω１の光はポンプ光、振動数ω２の光はストークス光と呼ばれている。

ＣＡＲＳ光は、ω１−ω２が測定対象の分子の固有振動数Ωと一致したときに強く現れる光である。分子の固有振動数Ωは、分子の種類やその構造によって異なるため、ＣＡＲＳ光の観測により、非破壊的に測定対象の分子の同定を行うことができる。例えば、ポンプ光の振動数ω１を固定したまま、ストークス光の振動数ω２を掃引して観測することにより、分子の固有振動スペクトルを観察することができ、これにより分子の同定が可能になる。あるいは、検出したい分子の固有振動数Ωが既知の場合は、ω１−ω２＝Ωを満たすようにポンプ光、ストークス光の振動数を設定して観測することにより、目的を達成することができる。

ＣＡＲＳ光の発生する過程は非線形光学過程であり、基本的には２つの励起光の位相が一致した光強度の高い状態で発生する。また、空間的にもＣＡＲＳ光は、ポンプ光とストークス光が強く集光された部分からのみ発生するため、ＣＡＲＳ光による測定は、基本的に高い三次元空間分解能を実現することができる。観測されるＣＡＲＳ光の光強度Ｉａｓは、下式（１）に示すように、ポンプ光の光強度Ｉｐの二乗とストークス光の光強度Ｉｓの積に比例する。

Ｉａｓ ∝ Ｉｐ²・Ｉｓ（１）
２種類の励起光でＣＡＲＳ光を発生させる場合は、ＣＡＲＳ光の振動数ωａｓ、ポンプ光の振動数ω１、分子の固有振動数Ωは、ωａｓ＝ω１＋Ωの関係にあるため、ＣＡＲＳ光の波長は励起光であるポンプ光の波長より短くなる。これに対して、自家蛍光の波長や、線形光学現象である自発ラマン散乱により生じるストークス散乱光の波長は、励起光の波長より長い。ストークス散乱光を検出する場合、ストークス散乱光と自家蛍光は重畳してしまい分離しにくいのに対して、ＣＡＲＳ光は、自家蛍光およびストークス散乱光との分離が容易であり、検出しやすいという利点がある。また、ＣＡＲＳ光による測定は、自発ラマン散乱を用いた場合よりも強い信号強度が得られるため、自発ラマン散乱を用いた場合よりも高いスループットを実現することができる。

図１に示す本発明の実施の形態の非線形ラマン散乱光測定装置の１例である非線形ラマン散乱光測定装置１００は、生体組織の細胞である被検体１を構成する分子を分析するための測定を行うものである。

この非線形ラマン散乱光測定装置１００は、ポンプ光Ｌｐと、このポンプ光Ｌｐよりも波長が長くエネルギの小さいストークス光Ｌｓとを被検体１に同時に照射するための光照射部１０と、上記ポンプ光Ｌｐとストークス光Ｌｓの照射を受けた被検体１から発せられる非線形ラマン散乱光のスペクトルを測定するためのスペクトル測定部６０とを備えている。

ここでは、スペクトル測定部６０により、非線形ラマン散乱光としてＣＡＲＳ光Ｌｃ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）のスペクトルを得、このＣＡＲＳ光Ｌｃのスペクトルを用いて被検体１を構成する分子を分析する場合について説明する。

光照射部１０は、ポンプ光Ｌｐおよびストークス光Ｌｓを生成するための超短パルス光からなるレーザ光を発する光源である光源部２０と、このレーザ光からポンプ光Ｌｐを生成し射出するポンプ光照射部３０と、そのレーザ光からストークス光Ｌｓを生成し射出するストークス光照射部４０と、ポンプ光Ｌｐとストークス光Ｌｓを合波させ、合波させた合波パルス光Ｌｇを被検体１上に走査させる合波走査部５０とを備えている。

光源部２０は、高ピークパワーのパルス光を射出するレーザ２１と、レーザ２１から出射されたパルスレーザ光を分岐させて、ポンプ光照射部３０とストークス光照射部４０の両方に入射させるためのビームスプリッタ２２とを有している。

レーザ２１は、超短パルス光を発生するレーザである。より詳しくは数十ｆｓ（フェムト秒）〜数十ｐｓ（ピコ秒）の時間範囲でパルス光を発生するレーザである。このレーザ２１としては、例えば、波長８００ｎｍ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー２５０ＫＷ、平均パワー２Ｗのチタンサファイアレーザを用いることができる。

ポンプ光照射部３０は、光路の伝播方向に沿って、光路折り曲げ用のミラー３１、光路折り曲げ用のミラー３２、光遅延部３５、光路折り曲げ用のミラー３３、バンドパスフィルタ３６、光減衰器３７をこの順に有している。

光路折り曲げ用のミラー３１は、ビームスプリッタ２２で分岐された超短パルス光を光遅延部３５に導くものである。

光遅延部３５は、ポンプ光Ｌｐとストークス光Ｌｓとを被検体１に照射するタイミングを調節するものである。ポンプ光Ｌｐおよびストークス光Ｌｓは、超短パルス光であるため、異なる光路を通ると被検体１を照射するタイミングがずれる。そのため、ポンプ光Ｌｐおよびストークス光Ｌｓのいずれか一方の光路に光遅延部３５を設けることにより、ポンプ光Ｌｐおよびストークス光Ｌｓを同時に被検体１へ照射することができる。

ディレイラインであるこの光遅延部３５は、互いに直交する２つの反射面を有するミラーからなり、このミラーを図１中の両矢印Ｈの示す方向へ移動させることにより、ミラー３１〜光遅延部３５〜ミラー３３の間の光路長を変化させて、ポンプ光Ｌｐの伝播時間が調節されるように構成されている。なお、光遅延部３５は、ポンプ光Ｌｐとストークス光Ｌｓとが被検体１へ同時に照射されるように調節できるものであれば上記構成に限定されず、別の構成を採用してもよく、また、ストークス光照射部４０におけるストークス光Ｌｓの光路に光遅延部３５を設けてもよい。

バンドパスフィルタ３６は、レーザ２１から出射されビームスプリッタ２２で分岐された上記超短パルス光を透過させて波長幅を狭めるものであり、バンドパスフィルタ３６を透過させることにより波長幅を例えば２ｎｍとすることができる。

光減衰器３７は、バンドパスフィルタ３６を通った超短パルス光の光強度を減衰させるものである。

レーザ２１から出射された超短パルス光を、上記光遅延部３５、バンドパスフィルタ３６、光減衰器３７等に通してポンプ光Ｌｐが生成される。

なお、ここでは、光減衰器３７により、ポンプ光Ｌｐの平均パワーが被検体１において３０ｍＷ以下になるように調節される。

ストークス光照射部４０は、広帯域ストークス光照射部４１と、狭帯域ストークス光照射部４２と、光路切換用ミラー４９Ａ、光路切換用ミラー４９Ｂと、光路を折り曲げるためのミラー４９Ｍとを備えている。

広帯域ストークス光照射部４１は、レーザ２１から出射されビームスプリッタ２２で分岐された上記超短パルス光の波長範囲を広帯域化して射出する帯域拡張部４３と、帯域拡張部４３から射出された広帯域化された超短パルス光の波長範囲の長波長側のみを透過させるロングパスフィルタ４５と、入射した光を減衰させて射出する光減衰器４７とを備えている。

帯域拡張部４３としては、上記レーザ２１であるチタンサファイアレーザから出射された波長８００ｎｍの光を、波長５００〜１５００ｎｍの広帯域光に変換するＰＣＦ（ＰｈｏｔｏｎｉｃＣｒｙｓｔａｌＦｉｂｅｒ：フォトニック結晶ファイバ）を採用することができる。なお、帯域拡張部４３として、上記ＰＣＦと同様の機能を有するもの、例えば非線形ファイバ等を用いてもよい。

ロングパスフィルタ４５は、帯域拡張部４３から射出された波長５００〜１５００ｎｍの広帯域化された光が入射され波長８１０ｎｍより長波長側の光を透過させる。

光減衰器４７は、ロングパスフィルタ４５を通った、波長８１０ｎｍより長波長側の超短パルス光の光強度を減衰させる。

上記レーザ２１から出射された超短パルス光を、帯域拡張部４３、ロングパスフィルタ４５、に通して光強度が減衰される前の広帯域のストークス光が生成され、さらに、この広帯域ストークス光を光減衰器４７に通して所定の光強度を有する広帯域ストークス光Ｌｓｗが生成される。

なお、ここでは、光減衰器４７により、広帯域ストークス光Ｌｓｗの平均パワーが被検体１において３０ｍＷ以下になるように調節される。

光路切換用ミラー４９Ａ、４９Ｂは、広帯域ストークス光照射部４１のロングパスフィルタ４５から射出された減衰される前の広帯域ストークス光を、狭帯域ストークス光照射部４２へ通してから試料体１へ向けて伝播させる光路と、この狭帯域ストークス光照射部４２を通すことなく光減衰器４７へ通して試料体１へ向けて伝播させる光路とを切り換えるものである。

図１に示すように、光路切換用ミラー４９Ａおよび４９Ｂが光路に挿入されたときには、広帯域ストークス光照射部４１から射出された広帯域ストークス光Ｌｓｗが狭帯域ストークス光照射部４２を通ってから試料体１へ向けて伝播される。また、光路切換用ミラー４９Ａおよび４９Ｂが光路から外されたときには、広帯域ストークス光照射部４１から射出された広帯域ストークス光Ｌｓｗが狭帯域ストークス光照射部４２を通ることなくミラー４９Ｍで折り曲げられて試料体１へ向けて伝播される。

狭帯域ストークス光照射部４２は、光路切換用ミラー４９Ａ、４９Ｂが光路に挿入されて導かれた上記ロングパスフィルタ４５から射出された減衰前の広帯域ストークス光の光路を折り曲げるミラー４４と、このミラー４４で折り曲げられた減衰前の広帯域ストークス光を通して、さらに狭帯域化させる狭帯域化部４６と、狭帯域化部４６を通って入射した光を減衰させる光減衰器４８とを備えている。

上記減衰前の広帯域ストークス光が狭帯域化部４６と光減衰器４８を通ることにより狭帯域ストークス光Ｌｓｎが生成される。

なお、ここでは、光減衰器４８により、狭帯域ストークス光Ｌｓｎの平均パワーが３０ｍＷ以下になるように調節される。

狭帯域化部４６としては、透過波長帯域が可変可能なフィルタ等を採用することができる。

狭帯域ストークス光照射部４２から射出された狭帯域ストークス光Ｌｓｎは、光路に挿入されたミラー４９Ｂで折り曲げられて試料体１へ向けて伝播される。

なお、光路切換用ミラー４９Ａ、４９Ｂによって光路が切り換えられる広帯域ストークス光Ｌｓｗと狭帯域ストークス光Ｌｓｎと合波されることはない。

また、狭帯域ストークス光照射部４２は、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成するものである。狭帯域ストークス光Ｌｓｎは、上記広帯域ストークス光Ｌｓｗの照射を受けた被検体１から発せられるＣＡＲＳ光Ｌｃのスペクトルによって特定されたこの被検体１を構成する複数種類の分子のうちの注目する一部の分子(１つ以上の分子)をより詳しく分析するための本測定を実施するために被検体１へ照射されるものである。

一方、広帯域ストークス光Ｌｓｗは、被検体１を構成する複数種類の分子を特定するための準備段階の測定を実施するために被検体１へ照射されるものである。

なお、広帯域ストークス光Ｌｓｗと狭帯域ストークス光Ｌｓｎとをまとめて上記ストークス光Ｌｓと称している。

合波走査部５０は、ポンプ光Ｌｐとストークス光Ｌｓとを合波させるビームスプリッタ５１と、この合波された合波パルス光Ｌｇを被検体１上に２次元走査させるための第１のガルバノミラー５２および第２のガルバノミラー５３と、合波パルス光Ｌｇを被検体１上に集光させる対物レンズ５４とを備えている。

ビームスプリッタ５１は、広帯域ストークス光照射部４１から射出された広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光照射部３０から射出されたポンプ光Ｌｐとを合波させたり、あるいは、狭帯域ストークス光照射部４２から射出された狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光照射部３０から射出されたポンプ光Ｌｐとを合波させたりするものである。

ここで、広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐとを合波させるか、あるいは、狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとを合波させるかは、光路切換用ミラー４９Ａ、４９Ｂによる光路の切り換えによって決定することができる。

なお、広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐとを合波させてなる超短パルス光を広帯域合波パルス光Ｌｇｗと称し、狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとを合波させてなる超短パルス光を狭帯域合波パルス光Ｌｇｎと称し、広帯域合波パルス光Ｌｇｗと狭帯域合波パルス光Ｌｇｎとをまとめて合波パルス光Ｌｇと称している。

対物レンズ５４は、上記合波パルス光Ｌｇを高密度に集光して被検体１内の微小領域に照射する。ここでは対物レンズ５４として、高ＮＡ（ＮＡ：ＮｕｍｅｒｉｃａｌＡｐｅｒｔｕｒｅ：開口数）のものを用いている。この対物レンズ５４には、例えば、倍率６０倍、ＮＡ１．２のものを用いることができ、この場合には集光サイズをサブミクロンオーダーにまで絞ることができる。

したがって、合波走査部５０により、高密度に集光させた合波パルス光Ｌｇを被検体１上に２次元走査させることができる。

なお、合波パルス光Ｌｇを２次元走査させる走査系は、ガルバノミラーに限らず、例えばガルバノミラーとポリゴンミラーとを組み合わせて２次元走査させたり、被検体１を移動させつつ合波パルス光Ｌｇを１方向にのみ走査させたりするものを採用できる。さらに、合波パルス光Ｌｇをシリンドリカルレンズに通して線状の合波パルス光Ｌｇを生成し、この線状の合波パルス光Ｌｇに対して被検体１を、この合波パルス光Ｌｇが線状に延びる方向と交わる方向へ相対的に移動させるように走査系を構成してもよい。

なお、上記被検体を、ポンプ光およびストークス光と交わる平面に沿って、そのポンプ光およびストークス光に対して相対的に移動させる移動手段である合波走査部５０や、この合波走査部５０による移動と光照射部によるポンプ光およびストークス光の照射とを実行しつつ、スペクトル取得部が被検体から発せられた非線形ラマン散乱光のスペクトルを取得する２次元走査等に係る動作は、制御手段であるコントローラ９０によって制御される。

スペクトル取得部６０は、広帯域合波パルス光Ｌｇｗまたは狭帯域合波パルス光Ｌｇｎの照射を受けた被検体１から発せられたＣＡＲＳ光Ｌｃのスペクトルを取得するためのものである。

このスペクトル取得部６０は、対物レンズ６１と、ポンプ光Ｌｐを遮断するためのカットフィルタ６２と、ポンプ光Ｌｐの波長よりも短波長側に生じるＣＡＲＳ光Ｌｃを選択的に透過させるためのショートパスフィルタ６３と、ショートパスフィルタ６３を通ったＣＡＲＳ光Ｌｃの光路を折り曲げるためのミラー６４とを備えている。

対物レンズ６１は、被検体１上の１点から発せられた前方散乱光を平行光束にするものである。この対物レンズ６１は、例えば、合波走査部５０を構成する対物レンズ５４と同じ仕様のものを用いることができる。

また、ショートパスフィルタ６３が、ストークス光Ｌｓ、被検体１から発せられた自家蛍光等を遮断する。

さらに、スペクトル取得部６０は、ＣＡＲＳ光Ｌｃを分光する分光器６５と、分光器６５で分光されたＣＡＲＳ光Ｌｃのスペクトルを検出するための検出器６６とを備えている。

分光器６５としてはグレーティング等を用いることができる。また、検出器６６としては、低ノイズで高増幅型でＣＡＲＳ光Ｌｃの検出時間を短縮することができる超高感度分光用のＥＭ−ＣＣＤ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇＣＣＤ）を採用することができる。また、検出器６６として、フォトマルチプライヤーや、アバランシェフォトダイオード等を用いることもできる。

なお、ここでは、被検体１を間に挟んで合波走査部５０を構成する対物レンズ５４とスペクトル取得部６０を構成する対物レンズ６１とが対向配置されている。

分析部７１は、検出器６６から出力されたＣＡＲＳ光Ｌｃのスペクトルを示す信号を非線形ラマン分光法に基づいて信号処理し、被検体１を構成する分子を分析して被検体１の内部構造の情報を取得するものである。

分析部７１としては、例えばパーソナルコンピュータ等のコンピュータシステムを用いることができる。なお、被検体１の内部構造とは、細胞を構成する各成分（例えばタンパク質や脂質、無機質等）の分布や各成分の割合等を意味する。さらに、分子の種類に依存する官能基、あるいは分子の立体構造に応じて発現される機能等に関する情報も得ることができる。

表示部７２は、分析部７１で得られた分析結果を表示するものであり、例えば液晶モニタ装置等により構成できる。

なお、上記コントローラ９０は、非線形ラマン散乱光測定装置１００全体の動作やそのタイミング等を制御するものである。

以下、上記非線形ラマン散乱光測定装置の作用について説明する。

図３は縦軸にパワーＰ（光強度）、横軸に波長λを示す座標上に、広帯域ストークス光Ｌｓｗ、ポンプ光Ｌｐ、および上記広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐの同時照射を受けた被検体１から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｗの各スペクトルを示す図である。

図４は縦軸にパワーＰ（光強度）、横軸に波長λを示す座標上に、互いに波長の異なる複数のピークを持つ狭帯域ストークス光Ｌｓｎ、ポンプ光Ｌｐ、および上記狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐの同時照射を受けた被検体１から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｎの各スペクトルを示す図である。

始めに、広帯域ストークス光Ｌｓｗを用いて被検体１を構成する複数種類の分子を特定する場合について図１、３を参照して説明する。

光路切換用ミラー４９Ａおよび光路切換用ミラー４９Ｂを広帯域ストークス光Ｌｓｗを通す光路から外して、広帯域ストークス光Ｌｓｗを合波走査部５０のビームスプリッタ５１へ入射させる。

広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐとはビームスプリッタ５１を通って合波される。合波された広帯域合波パルス光Ｌｇｗは、合波走査部５０を通って被検体１に照射され、この被検体１上を２次元状に走査する。

広帯域合波パルス光Ｌｇｗの走査により被検体１から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｗを含む光は、カットフィルタ６２とショートパスフィルタ６３とを通ってＣＡＲＳ光Ｌｃｗのみが抽出される。抽出されたＣＡＲＳ光Ｌｃｗは、分光器６５で分光されて、検出器６６がこのＣＡＲＳ光Ｌｃｗのスペクトルを検出する。

このようにして検出されたＣＡＲＳ光Ｌｃｗのスペクトルを示す信号は、分析部７１によって分析され被検体１を構成する多数の分子が特定される。分子を特定した結果は表示部７２に表示される。

上記広帯域ストークス光Ｌｓｗを用いた測定はマルチプレックス分光法とも呼ばれるものであり、ポンプ光Ｌｐと広帯域ストークス光Ｌｓｗとを同時に入射させたときに様々な振動数のうなりが同時に生じ、複数の共鳴振動の情報を有するＣＡＲＳ光Ｌｓｗが発生する。このＣＡＲＳ光を分光Ｌｓｗすることにより、走査領域に含まれる多種類の分子の振動を一度に特定することができる。

次に、特定された多数の分子のうちの注目する一部の分子を分析するためのストークス光の波長を定める場合について図１、４を参照して説明する。

上記注目する一部の分子を分析するための、各分子の分析に対応する１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域ストークス光Ｌｓｎが生成されるように、狭帯域ストークス光照射部４２の狭帯域化部４６を設定する。上記狭帯域ストークス光Ｌｓｎは、その光強度分布が互に異なる波長を持つ複数のピークを持った光強度分布を有するものである。

そして、光路切換用ミラー４９Ａおよび光路切換用ミラー４９Ｂを広帯域ストークス光Ｌｓｗを通す光路に挿入して、狭帯域ストークス光照射部４２から射出させた狭帯域ストークス光Ｌｓｎを合波走査部５０のビームスプリッタ５１へ入射させる。

狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとはビームスプリッタ５１を通って合波される。合波された狭帯域合波パルス光Ｌｇｎは合波走査部５０を通って被検体１に照射され、この被検体１上を２次元状に走査する。

狭帯域合波パルス光Ｌｇｎの走査により被検体１から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｗを含む光は、スペクトル取得部６０を通って、ＣＡＲＳ光Ｌｃｎのみが抽出される。抽出されたＣＡＲＳ光Ｌｃｎは分光されて、このＣＡＲＳ光Ｌｃｎのスペクトルが検出される。

このようにして検出されたＣＡＲＳ光Ｌｃｎのスペクトルを示す信号は、分析部７１によって分析され被検体１を構成する多数の分子のうちの注目する一部の分子（１つ以上の分子）が詳しく分析される。

上記分析により被検体１の内部構造の情報が取得される。そして、被検体１である細胞が正常であるか異常であるか等の判別が行われ、その結果が表示部７２に表示される。

上記構成を有する非線形ラマン散乱光の測定は、非破壊的な分析であるため、細胞等の生体の分析に適している。さらに、この測定は、分子の固有振動に基づくものであり、高い空間分解能を有するので、細胞中の局所的な内部構造や機能を詳しく分析することができる。

図５に、非線形ラマン散乱光測定装置において取得される非線形ラマン散乱光のスペクトルの一例を示す。図５の横軸は波数（波数＝１ｃｍ／波長、すなわち、１センチメートルあたりの波の数、単位はカイザー）、縦軸は相対信号強度である。横軸の波数は、励起光の振動数とＣＡＲＳ光の振動数との差に対応し、一般にラマンシフトと呼ばれる量である。縦軸の相対信号強度はＣＡＲＳ光の光強度に対応する。

図５中の符号Ｎは正常部位から得られた非線形ラマン散乱光のペクトルを示しており、図５中の符号ＡＮは癌部位から得られたラマンスペクトルを示している。癌細胞に関連した細胞の構成要素としては、アミドＩ、アミドＩＩＩ、脂質由来物質が下記のラマンシフトを有するものであることが知られている。

アミドＩ：１６５５〜１６７０ｃｍ^−１
アミドＩＩＩ：１２６５〜１２８０ｃｍ^−１
脂質由来物質：１４４０〜１４５０ｃｍ^−１
：２８００〜２８８０ｃｍ^−１
：２８９０〜２９７０ｃｍ^−１
図５では、上記ラマンシフトに見られる各ピークに縦線および横線からなる補助線を付している。図５中に符号ＡＮで示すスペクトルは、上記のアミドＩ、アミドＩＩＩ、脂質由来物質に対応する波数において強度の大きい鋭いピークが見られるが、図５中に符号Ｎで示すスペクトルではこれらの波数におけるピークは強度が小さく鈍った形状となっている。上記の癌細胞に関連した構成要素は癌細胞にも正常細胞にも存在するが、細胞が癌化すると細胞内で構成バランスが崩れ、非線形ラマン散乱光のペクトルが相対的に変化する。この相対的な変化を検出することにより癌細胞と正常細胞を区別することができる。

上記実施の形態で示したような非線形ラマン散乱光測定装置は、例えば、組織に含まれる正常細胞と癌細胞を分離する際に使用可能であり、細胞へのダメージが軽微であるため、測定に用いられた細胞を培養して株化細胞の生成や、抗癌剤の効果検証等の実験に用いることができる。例えば、培養した細胞を分析して、細胞の大きさや構造に関する情報を得ることができる。

さらに、従来、被検体１から発せられたＣＡＲＳ光の検出は、１受光画素当たり１５０ｍｓ程度の電荷蓄積時間が必要であったが、上記のように狭帯域ストークス光Ｌｓｎを用いることにより、効率良くＣＡＲＳ光を発生させることができ、１受光画素当たりの電荷蓄積時間を１０ｍｓ程度に短縮することができる。

また、本発明の非線形ラマン散乱光測定装置は、癌腫瘍を摘出する際の判断材料を提供することも可能である。癌腫瘍の摘出手術では、癌細胞が患者の身体に残存すると再発の可能性が高まり好ましくないが、再発を恐れるあまり、過剰に組織を切除するのも患者の身体の負担が増大し好ましくない。そこで、摘出腫瘍が接していた領域の組織を微少量切り取り、本発明の非線形ラマン散乱光測定装置を用いて、癌細胞の有無を調べることができる。癌細胞が検出された場合はさらなる切除が必要と判断し、癌細胞が検出されなかった場合は摘出が十分であったと判断することができる。

図６は、光照射部を構成するための各構成要素の例と、各構成要素の組み合わせの適合性とを示すものである。すなわち、光源の数、光の分配方式、波長選択方式、合波方式、およびそれらの構成要素の組み合わせの適合性を示す図である。適合性の欄に記載されている「◎」、「○」、「△」、「×」の記号は、この順に適合性が低下することを示すものである。

例えば、光源の数を１以上、光の分配方式をビームスプリッタ、波長選択方式を波長チューナブルフィルタ、および合波方式をビームスプリッタ合波としたときの適合性の記号は「◎」であり、適合性は非常に良好である。

また、例えば、光源の数を複数、光の分配方式を「なし」、波長選択方式を波長チューナブルフィルタ、および合波方式をファイバ合波としたときの適合性の記号は「×」であり、適合性は非常に低い。

以下に、狭帯域化部４６の具体的な構成について説明する。すなわち、広帯域の光から、光強度分布に１つのピークもしくは２つ以上の互に異なる波長を持つピークを有する光強度分布からなる狭帯域ストークス光を生成するための種々の構成およびその作用について図７から図１１を用いて説明する。

図７は第１の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図８は第２の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図９は第３の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図１０は第４の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図１１は第５の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図である。なお、各図において、同様の機能を有する構成要素には同じ符号を用いている。例えば、異なる性能を有する空間光変調器であっても各狭帯域ストークス光の生成方式毎に繰り返し同じ符号を用いている。

図７に示す第１の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。

すなわち、超短パルス光である広帯域の光Ｌｗを、複数のビームスプリッタＢｓａ、Ｂｓｂ・・・に通して分岐させて複数の広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・を得、複数の広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・それぞれを互に波長特性の異なるチューナブルフィルタＴａ、Ｔｂ・・・へ通して複数の互に異なる波長を持つ狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を生成する。

そして、超短パルス光である狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の一部または全部を光遅延部Ｄｅａ、Ｄｅｂ・・・（ディレイライン）および減衰器Ａｔａ、Ａｔｂ・・・（ＡＴＴ：アッテネータ）に通して、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の被検体への照射タイミングを同期させるとともにそれらの光強度を調節する。

その後、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を複数のビームスプリッタＢｐａ、Ｂｐｂ・・・へ通して合波させ、第１の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。

なお、広帯域の光Ｌｗとしては、上記広帯域ストークス光Ｌｓｗ等を用いることができる。

すなわち、上記のように狭帯域化部４６を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互に波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ²以下の光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。

図８に示す第２の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。

すなわち、互に異なる波長の超短パルス光を射出する複数種類のレーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・と、各レーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から超短パルス光を射出させるタイミングを定める同期信号Ｓｇを発生する同期信号発生部Ｓｙとを用意する。

同期信号発生部Ｓｙの同期信号Ｓｇに同期させて各レーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から超短パルス光を射出させる。

複数のレーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から射出させた超短パルス光である、互いに異なる波長を持つ各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の一部または全部を光遅延部Ｄｅａ、Ｄｅｂ・・・（ディレイライン）および減衰器Ａｔａ、Ａｔｂ・・・（ＡＴＴ：アッテネータ）に通して、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の被検体への照射タイミングを同期させるとともにそれらの光強度を調節する。

その後、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を複数のビームスプリッタＢｐａ、Ｂｐｂ・・・へ通して合波させ、第２の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。

すなわち、上記のように狭帯域化部４６を構成し、複数のレーザ光源から射出させた超短パルス光を合成することにより、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。なお、上記複数のレーザ光源それぞれは、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた超短パルス光を射出するものである。これにより、互に波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。

図９に示す第３の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。

すなわち、超短パルス光である小径の広帯域の光ＬｗをミラーＭ１で反射させ、グレ−ティングＧ１へ通して、この広帯域の光Ｌｗが波長に応じて空間的に分離されるように発散させる。

グレ−ティングされて空間的に分離されるように発散せしめられた広帯域の光Ｌｗは、コリメートレンズＣｏ１を通って大径の平行光束となる。

大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗは空間光変調器Ｓｍを通って波長が選択され、１つの波長にのみピーク波長を有する光成分Ｌｎａが抽出される。

なお、空間光変調器Ｓｍとしては、例えば液晶パネル型変調器を用いることができ、その液晶パネルの変調パターン（光を空間変調させるためのパターン）を電気的な制御によって変更することにより、抽出する光成分のピーク波長を選択することができる。

１つの波長にのみピークを持つ大径の光成分Ｌｎａを、集光レンズＣｏ２を通して集光させグレーティングＧ２に通して小径の光成分とすることにより第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。この第３の狭帯域ストークス光ＬｓｎはミラーＭ２で反射され伝播される。

すなわち、上記のように狭帯域化部４６を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、１つのピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。

図１０に示す第４の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。

すなわち、超短パルス光である小径の広帯域の光ＬｗをミラーＭ１で反射させグレ−ティングＧ１へ通して、この広帯域の光Ｌｗが波長に応じて空間的に分離されるように発散させる。

グレ−ティングされ空間的に分離されるように発散せしめられた広帯域の光Ｌｗは、コリメートレンズＣｏ１を通って大径の平行光束となる。

大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗは空間光変調器Ｓｍ１を通って波長が選択され、互に異なる波長にピークを持つ２種類の光成分Ｌｎａ１、Ｌｎｂ１が抽出される。

なお、上記のように空間光変調器の変調パターンを制御することにより上記ピークの波長を変更することができる。すなわち、この空間光変調器の変調パターンの制御により、上記所望のピークの波長が得られる変調パターンが形成された空間光変調器Ｓｍ１を得ることができる。

空間光変調器Ｓｍ１から射出され波長が選択された大径の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂは、集光レンズＣｏ２を通して集光され、さらにグレーティングＧ２を通して小径の平行光束からなる同一光路を通る光成分Ｌｎａ１、Ｌｎｂ１である第４の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１が生成される。この第４の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１はミラーＭ２で反射され伝播せしめられる。すなわち、広帯域の光の波長領域中の一部分を切り出した光成分を合成して、互いに異なる波長を持つ２つのピークを有する狭帯域のストークス光を生成することができる。

なお、大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗ中へ空間光変調器Ｓｍ２が配された場合には、互に異なる波長にピークを持つ２種類の光成分Ｌｎａｂ２、Ｌｎｃ２が抽出され、これらの成分を合成してなる第４の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ２が生成される。

光成分Ｌｎａｂ２の波長範囲は、光成分Ｌｎｃ２の波長範囲よりも広い。すなわち、波長範囲が広い光成分Ｌｎａｂ２を用いると、波長範囲が狭い光成分Ｌｎｃ２よりも多くの分子を一度に分析することができる。

さらに、大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗの光路中へ空間光変調器Ｓｍ３が配された場合には、互に異なる波長にピークを持つ３種類の光成分Ｌｎａ３、Ｌｎｂ３、Ｌｎ３が抽出され、これらの光成分を合成してなる第４の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ３を生成することができる。すなわち、広帯域の光の波長領域中の一部分を切り出した光成分を合成して、互いに異なる波長を持つ３つのピークを有する狭帯域のストークス光を生成することができる。

すなわち、上記のように狭帯域化部４６を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互に波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。

なお、空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３は、１つの空間光変調器を光路中に配置したままの状態で、この空間光変調器を制御することにより形成することができる。すなわち、１つの空間光変調器について変調パターンを制御することにより、所望のピークの波長が得られるように変調パターンが形成された空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３を得ることができる。なお、上記空間光変調器の変調パターンを制御するための制御部４６Ｈを狭帯域化部４６に備えるようにすることもできる。

図１１に示す第５の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。

すなわち、第５の狭帯域ストークス光の生成方式は、広帯域のストークス光を用いて被検体を構成する複数種類の分子を特定する測定の結果を用いて空間光変調器の変調パターンを定めるようにしたものである。他の構成および作用は第４の狭帯域ストークス光の生成方式と同様なのでその説明は省略する。

準備段階の測定で得られたスペクトルＳｐ１中に分子Ｍｏａ１の振動を示す波長λａ１と分子Ｍｏｂ１の振動を示す波長λｂ１とが存在する場合には、分子Ｍｏａ１を詳しく分析するための波長λａ１１と分子Ｍｏｂ１を詳しく分析するための波長λｂ１１とを選択的に通す空間変調器Ｓｍ１が選択される。

空間変調器Ｓｍ１を通して生成された第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１は、分子Ｍｏａ１を分析するための光成分Ｌｎａ１と分子Ｍｏｂ１を分析するための光成分Ｌｎｂ１とを有するものとなる。

すなわち、第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１は、互いに異なる波長λａ１１、λｂ１１を持つ２つのピークを有し、分子Ｍｏａ１および分子Ｍｏｂ１の分析に適したものとすることができる。

また、準備段階の測定で得られたスペクトルＳｐ２中に分子Ｍｏａ２の振動を示す波長λａ２と分子Ｍｏｂ２の振動を示す波長λｂ２と分子Ｍｏｃ２の振動を示す波長λｃ２が存在する場合には、分子Ｍｏａ２と分子Ｍｏｂ２の両方を同時に詳しく分析するための波長λａｂ２２と分子Ｍｏｃ２を詳しく分析するための波長λｃ２２とを選択的に通す空間変調器Ｓｍ２が選択される。

ここでは、波長λａ２と波長λｂ２との波長の差は少ないものとする。

空間変調器Ｓｍ２を通して生成された第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ２は、分子Ｍｏａ２と分子Ｍｏｂ２とを同時に分析するための光成分Ｌｎａｂ２と、分子Ｍｏｃ２を分析するための光成分Ｌｎｃ２とを有するものとなる。

すなわち、第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ２は、互いに異なる２種類の波長λａ２２、λｂ２２に対応する２種類のピークを有し、３種類の分子Ｍｏａ２、Ｍｏｂ２、Ｍｏｃ２の分析に適したものとすることができる。

また、準備段階の測定で得られたスペクトルＳｐ３中に分子Ｍｏａ３の振動を示す波長λａ３と分子Ｍｏｂ３の振動を示す波長λｂ３と分子Ｍｏｃ３の振動を示す波長λｃ３が存在し、波長λａ３、波長λｂ３、波長λｃ３の順にピーク光強度が小さくなる場合には、分子Ｍｏａ３を詳しく分析するための波長λａ３３と分子Ｍｏｂ３を詳しく分析するための波長λｂ３３と分子Ｍｏｃ３を詳しく分析するための波長λｃ３３とを選択的に通す空間変調器Ｓｍ３が選択される。

さらに、この空間変調器Ｓｍ３は、波長λａ３３、波長λｂ３３、波長λｃ３３の順にピーク光強度が大きくなるように光強度を変換するものでもある。このように光強度を調節することにより、より望ましい強度で非線形ラマン散乱光を発生させることができる。

すなわち、準備段階の測定で得られたスペクトルＳｐ３中の光強度の小さい波長λｃ３に対応する分子Ｍｏｃ３を詳しく分析するために被検体へ照射する波長λｃ３３の光強度は大きくし、スペクトルＳｐ３中の光強度の大きい波長λａ３に対応する分子Ｍｏａ３を詳しく分析するために被検体へ照射する波長λａ３３の光強度は小さくして、本測定で得られるスペクトル中の光強度をバランスさせることができる。

空間変調器Ｓｍ３を通して生成された第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ３は、分子Ｍｏａ３を分析するための光成分Ｌｎａ３と分子Ｍｏｂ３を分析するための光成分Ｌｎｂ３と分子Ｍｏｃ３を分析するための光成分Ｌｎｃ３とを有するものとなる。

この第５の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ３は、互いに異なる３種類の波長λａ３３、λｂ３３、λｃ３３に対応する互に光強度の異なる３種類のピークを有し、３種類の分子Ｍｏａ３、Ｍｏｂ３、Ｍｏｃ３の分析に適したものとすることができる。

すなわち、上記のように狭帯域化部４６を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互に波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲それぞれに、２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ²以下の光強度となる波長を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。

なお、上記と同様に、空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３は、１つの空間光変調器を光路中に配置したままの状態で、この空間光変調器を制御することにより形成することができる。すなわち、１つの空間光変調器について変調パターンを制御することにより、所望のピークの波長が得られるように変調パターンが形成された空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３を得ることができる。なお、上記空間光変調器の変調パターンを制御するための制御部４６Ｈを狭帯域化部４６に備えるようにすることもできる。

ここで、上記のような空間光変調器を用いる場合には、光路切換用ミラー４９Ａ、４９Ｂを光路中に配置したままの状態で、広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐとを合波させるか、あるいは、狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとを合波させるかを切り換えることができる。すなわち、空間光変調器を制御して変調パターンを変化させたり、この空間光変調を単なる透明体としたりすることにより広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐとを合波させたり、狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐとを合波させたりする切り換えを行うことができる。

図１２は、本発明の非線形ラマン散乱光測定装置を適用した内視鏡装置を示す図である。なお、この内視鏡装置にかかる説明および図面に関し、前述の実施形態の構成要素と実質的に同じ機能を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。より具体的には、非線形ラマン散乱光測定装置を適用した内視鏡装置１０１を構成する光照射部１０のガルバノミラー５３から合波パルス光Ｌｇを射出させるまでに適用される構成要素とその作用、および、ＣＡＲＳ光Ｌｃを含む光がスペクトル測定部６０のカットフィルタ６２に入射した後に適用される構成要素とその作用については上述の非線形ラマン散乱光測定装置と同様なのでその説明は省略する。

上記非線形ラマン散乱光測定装置を適用した内視鏡１０１において、ガルバノミラー５３から射出された合波パルス光Ｌｇは、ミラー７８で折り曲げられダイクロイックミラー７９を通して光ファイバユニット８０の一端のレンズ部８１へ入射せしめられる。

光ファイバユニット８０のレンズ８１部へ入射した合波パルス光Ｌｇは、このレンズ部８１および光ファイバ８２通って、光ファイバユニット８０の他端に配された高ＮＡレンズ部８３から射出され被検体１に入射する。

この合波パルス光Ｌｇの照射を受けた被検体１から発せられるＣＡＲＳ光Ｌｃを含む後方散乱光は、他端のレンズ部８３に再び入射し、光ファイバ８２を通って一端のレンズ部８１から射出される。

レンズ部８１から射出されたＣＡＲＳ光Ｌｃを含む光成分の一部は、ダイクロイックミラー７９で反射せしめられてカットフィルタ６２に入射する。

その後のＣＡＲＳ光Ｌｃを含む光成分の一部の処理は上述の非線形ラマン散乱光測定装置と同様である。

以上、本発明による非線形ラマン散乱光測定装置および方法の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない限りにおいて、種々変更することが可能である。

なお、上記実施形態では、非線形ラマン散乱光として、ＣＡＲＳ光を例にとり説明したが、別の散乱光、例えば、誘導ラマン散乱光やハイパーラマン散乱光等を用いることも可能である。

本発明の非線形ラマン散乱光測定装置の一例を示すブロック図ＣＡＲＳ光の発生過程のエネルギー準位を示す図広帯域ストークス光、ポンプ光、およびＣＡＲＳ光の各スペクトルを示す図狭帯域ストークス光、ポンプ光、およびＣＡＲＳ光の各スペクトルを示す図非線形ラマン散乱光測定装置において取得される非線形ラマン散乱光のスペクトルの一例を示す図光照射部の構成要素の例と各構成要素の組み合わせの適合性とを示す図第１の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図第２の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図第３の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図第４の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図第５の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図本発明の非線形ラマン散乱光測定装置を適用した内視鏡装置を示す図

符号の説明

１被検体
１０光照射部
２０光源部
３０ポンプ光照射部
４０ストークス光照射部
４１広帯域ストークス光照射部
４２狭帯域ストークス光照射部
５０合波走査部
６０スペクトル取得部
１００非線形ラマン散乱光測定装置
Ｌｐポンプ光
Ｌｓｗ広帯域ストークス光
Ｌｓｎ狭帯域ストークス光
Ｌｃ非線形ラマン散乱光

Claims

ポンプ光と該ポンプ光よりも波長が長くエネルギの小さいストークス光とを被検体に同時に照射するための光照射手段と、
前記照射を受けた前記被検体から発せられる非線形ラマン散乱光のスペクトルを取得するスペクトル取得手段とを備えた非線形ラマン散乱光測定装置であって、
前記光照射手段が、前記被検体を構成する複数種類の分子を特定するための広帯域のストークス光を照射する広帯域ストークス光照射手段と、前記特定された複数種類の分子のうちの一部の分子を分析するための、前記広帯域のストークス光の波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた１つ以上のピーク波長を持つ狭帯域のストークス光を照射する狭帯域ストークス光照射手段とを有するものであることを特徴とする非線形ラマン散乱光測定装置。
前記狭帯域のストークス光が、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであり、互に波長が隣り合う２つの前記ピーク間の波長範囲内に、該２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ²以下の光強度となる波長範囲を有するものであることを特徴とする請求項１記載の非線形ラマン散乱光測定装置。
前記広帯域のストークス光および前記狭帯域のストークス光が、１つの光源から発せられた光から生成されるものであることを特徴とする請求項１または２記載の非線形ラマン散乱光測定装置。
前記狭帯域ストークス光照射手段が、前記狭帯域のストークス光の前記ピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の非線形ラマン散乱光測定装置。
前記被検体を、前記ポンプ光およびストークス光と交わる平面に沿って、該ポンプ光およびストークス光に対して相対的に移動させる移動手段と、
前記移動手段による移動と前記光照射手段によるポンプ光およびストークス光の照射とを実行しつつ、前記被検体から発せられた非線形ラマン散乱光のスペクトルをスペクトル取得手段が取得するように制御する制御手段とを備えたことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の非線形ラマン散乱光測定装置。