JP2003028795A - 試料検査方法及び走査型顕微鏡 - Google Patents

試料検査方法及び走査型顕微鏡

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JP2003028795A
JP2003028795A JP2002125511A JP2002125511A JP2003028795A JP 2003028795 A JP2003028795 A JP 2003028795A JP 2002125511 A JP2002125511 A JP 2002125511A JP 2002125511 A JP2002125511 A JP 2002125511A JP 2003028795 A JP2003028795 A JP 2003028795A
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illumination light
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エンゲルハルト ヨハン
Juergen Hofmann
ホフマン ユルゲン
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Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Leica Microsystems CMS GmbH
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Abstract

(57)【要約】 【課題】被検試料中の蛍光着色物質の褪色（脱色）特性
を改善し、更に、とりわけ紫外スペクトル領域で励起可
能な被検試料において、同時的多色的検出を可能とする
検査方法及び走査型顕微鏡を提供すること。 【解決手段】少なくとも２つの光学的励起線を有しかつ
少なくとも第一波長の光と第二波長の光とによって光学
的に励起可能な被検試料の検査方法は、以下のステッ
プ：第一波長の数倍の波長と第二波長の数倍の波長とを
少なくとも有する照明光（１５）により被検試料（２
７）を照射すると共に、該照明光（１５）を該被検試料
（２７）の部分領域で合焦させること；複数の前記部分
領域に亘って照明光（１５）を順次案内することにより
前記被検試料（２７）を走査すること；前記被検試料
（２７）から到来する検出光（２９）を検出すること；
前記検出光（２９）を、振幅が該検出光（２９）のパワ
ーないし強度に依存する検出信号へ変換すること；前記
検出信号を前記走査された複数の部分領域へ配属するこ
と；前記検出信号をディスプレイに表示することを特徴
とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも２つの
光学的励起線ないしスペクトル（optische Uebergangsl
inien）を有しかつ少なくとも第一波長の光と第二波長
の光とによって光学的に励起可能な被検試料の検査方法
に関する。
【０００２】本発明は、更に、被検試料を照射するため
の照明光を放射する少なくとも１つの光源装置を有する
と共に、該被検試料は少なくとも２つの光学的励起線な
いしスペクトルを有しかつ少なくとも第一波長の光と第
二波長の光とによって光学的に励起可能であり、該被検
試料から到来する検出光を検出するための少なくとも１
つの検出器と、前記照明光を前記被検試料の部分領域で
合焦させるための対物レンズとを有する走査型顕微鏡に
関する。
【０００３】
【従来の技術】生物学的試料を検査するために、従来は
一般的に、試料を光学的マーカー、とりわけ蛍光着色物
質で標識（調製）していた。例えば遺伝子検査の分野で
は、所定の試料構成部位に特異的に付加される相異なる
複数の蛍光着色物質を試料中に導入することがしばしば
ある。標識された試料の蛍光特性から、例えば試料の性
質、試料の組成（構成）又は試料内部の所定の物質の濃
度を帰納的に導き出すことができる。
【０００４】走査型顕微鏡では、試料から放出される−
反射光又は蛍光としての−検出光を観察するために、試
料は光線で照射される。照明光線の合焦スポットは、制
御可能な光線偏向装置を用い、通常２つのミラーの傾動
操作によって、試料面内で移動させられる。この場合、
２つの偏向軸は、大抵互いに垂直に配されているため、
一方のミラーはｘ方向に、他方のミラーはｙ方向に偏向
を行う。ミラーの傾動操作は、例えばガルバノメータ位
置（調節）要素によって行われる。試料から発する検出
光のパワー（エネルギないし強度：Leistung）は、走査
光線の位置に応じて測定される。通常、位置（調節）要
素には、ミラーの実際位置を求めるためのセンサが設け
られる。
【０００５】とりわけ共焦点走査型顕微鏡の場合、被検
試料は、光線の合焦（スポット）によって三次元的に走
査される。
【０００６】共焦点走査型顕微鏡は、通常、光源と、光
源からの光をピンホール絞り−所謂励起用絞り−におい
て合焦させる合焦光学系と、ビームスプリッタと、光線
制御用の光線偏向装置と、顕微鏡光学系と、検出用絞り
と、検出光ないし蛍光を検出するための検出器とを含
む。照明光線は、ビームスプリッタを介して入射結合さ
れる。被検試料から発する蛍光ないし反射光は、光線偏
向装置を介してビームスプリッタへ戻り着いて通過し、
そして検出器に前置されている検出用絞りで合焦する。
この検出構成は、走査ミラー介在型検出構成（Descan構
成）と称する。合焦領域に直接由来しない検出光は、上
記光路とは異なる光路を辿るため、検出用絞りを通過せ
ず、そのため点情報が得られる。照明光線の合焦（スポ
ット）によって被検試料を逐次的（連続的）に走査する
ことにより、この点情報（の総体ないし集合）から三次
元画像が得られる。三次元画像は、大抵、層状の（断層
的な）画像データを利用することにより得られる。商取
引されている走査型顕微鏡は、大抵、伝統的な光学顕微
鏡の架台にフランジ結合される走査モジュールから構成
されるが、走査モジュールは、試料を走査するために必
要な上述の要素を全て含む。
【０００７】共焦点走査型顕微鏡では、２光子励起ない
し双子光子励起（又は多光子励起）の場合、検出用絞り
は省略できる。というのは、励起確率は、光子密度の２
乗、従って照明光線強度の２乗に依存するからである
が、光子密度ないし照明光線強度は、当然のことなが
ら、合焦（スポット）においては、その近傍に比べて遥
かに大きいからである。従って、検出されるべき蛍光
は、その大部分が大きい確率で合焦領域（スポット）に
由来するので、合焦領域（スポット）からの蛍光光子を
絞り装置によってその周辺領域（近傍）からの蛍光光子
から殊更に区別（差別化）する必要はない。
【０００８】複数の波長の光で同時に照明するために
は、大抵、複数のレーザが用いられる。EP 0 495 930：
多色フルオレッセンスのための共焦点顕微鏡“Konfokal
es Mikroskopsystem fuer Mehrfarbenfluoreszenz”か
ら、複数のスペクトル線をそれぞれ発振する（多モード
発振する）レーザを有する装置が既知である。このよう
なレーザとしては、実用上、一般的に、とりわけアルゴ
ン−クリプトンレーザのような、混合気体レーザが使用
される。検出については、一般的に、異なる波長の検出
光のために複数の検出器が設けられる。複数の波長の検
出光を同時に多色的に検出するためのとりわけ柔軟な構
成は、ドイツ特許公報DE 199 02 625：レーザ光線の複
数のスペクトル領域の同時検出のための装置“Vorricht
ung zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Spektral
bereiche eines Laserstrahls”に開示されている。こ
れらの文献の記載は、引用をもって本書に繰込み記載さ
れたものとみなす。
【０００９】蛍光着色物質の多くは、紫外領域の照明光
によってのみ励起される。紫外領域の照明光の使用に
は、とりわけ生試料に対して、極めて甚だしく試料が損
傷するという不利がある。その上、光学部材は全て、紫
外線及びストークスシフトに基づき（当該紫外線より）
より長い波長を有する蛍光に対し透過性でなければなら
ないが、紫外線を含む照明によって損傷されてはならな
い。ところが、とりわけ、例えば顕微鏡対物レンズのレ
ンズ系のような、パテ等の接合剤で密封される光学部材
の場合、接合剤及びレンズは、紫外線を含む照明によっ
て不可逆的に損傷される。紫外線を含む照明の更なる不
利は、生物学的試料における侵入深度が比較的小さいと
いうことである。この不利は、２光子又は多光子励起に
よって回避することができる。多光子（励起型）−走査
型顕微鏡では、２光子又は多光子励起過程に帰すること
ができる蛍光光子が検出される。２光子遷移の確率は、
励起光強度の２乗に依存する（比例する）。それゆえ、
大きい光強度を得るために、照明光をパルス化して大き
いパルスピーク強度を得られるようにすることが目的に
適う。
【００１０】このような技術は既知であり、例えば米国
特許US5,034,613：２光子レーザ顕微鏡“Two-photon la
ser microscopy”及びドイツ特許公開DE 44 14 940に開
示されている。とりわけ共焦点走査型顕微鏡検査におけ
る多光子励起の更なる有利は、褪色（脱色）特性が改善
されていることである。というのは、試料は、（光の）
エネルギ密度が十分に大きい領域、即ち照明光線の合焦
（スポット）においてのみ褪色するからである。この領
域の外部では、１光子励起とは対照的に、褪色は殆ど起
こらない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】多光子励起に基づき試
料を検査するための既知の方法・装置は全て、唯一の蛍
光着色物質の励起に限定されている。多くの応用例で
は、複数の蛍光着色物質を全て同時に励起し多色的に検
出することにより試料の空間的構造又は組成に関する情
報を得るために、試料を種々異なる蛍光着色物質又は他
のマーカーにより特異的に標識することが不可避であ
る。複数のＵＶ−蛍光着色物質の同時励起は、目下、１
光子励起によってのみ可能であるため、紫外線の入射に
よるネガティブな効果がそのまま現れる。
【００１２】それゆえ、本発明の課題は、改善された褪
色特性で、とりわけ紫外スペクトル領域で励起可能な試
料において、同時多色的検出を可能にする方法（第一の
視点）及び走査型顕微鏡（第二の視点）を提供すること
である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この課題を解決するた
め、本発明の第一の視点により、少なくとも２つの光学
的励起線（optische Uebergangslinien）を有しかつ少
なくとも第一波長の光と第二波長の光（ここでいう第一
ないし第二波長とは、蛍光着色物質を通常励起発光させ
るのに要するエネルギーを有する光子の波長）とによっ
て光学的に励起可能な被検試料（例えば、最も好ましく
は、被検試料は、それぞれ異なる励起波長を有する少な
くとも２つ（２種）の蛍光着色物質で標識されるが、場
合によっては、少なくとも２つの異なる励起準位を介し
て励起可能な１つ（１種）の蛍光着色物質で標識され
る）の検査方法が提供される。この方法は、以下のステ
ップ：第一波長の数倍の波長と第二波長の数倍の波長と
を少なくとも有する照明光により被検試料を照射すると
共に、該照明光を該被検試料の部分領域で合焦させるこ
と；複数の前記部分領域に亘って照明光を順次的に案内
することにより前記被検試料を走査すること；前記被検
試料から到来する検出光を検出すること；前記検出光
を、振幅が該検出光のパワーないし強度に依存する検出
信号へ変換すること；前記検出信号を前記走査された複
数の部分領域へ配属すること；前記検出信号をディスプ
レイに表示することを特徴とする。
【００１４】上記課題を解決するため、更に、本発明の
第二の視点により、被検試料を照射するための照明光を
放射する少なくとも１つの光源装置を有すると共に、該
被検試料は少なくとも２つの光学的励起線（optische U
ebergangslinien）を有しかつ少なくとも第一波長の光
と第二波長の光とによって光学的に励起可能であり、該
被検試料から到来する検出光を検出するための少なくと
も１つの検出器と、前記照明光を前記被検試料の部分領
域で合焦させるための対物レンズとを有する走査型顕微
鏡が提供される。この走査型顕微鏡は、前記照明光が、
第一波長の数倍の波長と第二波長の数倍の波長とを少な
くとも有すること、及び前記光源装置が、光学パラメト
リック発振器を含むことを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下に本発明の好ましい実施の形
態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。検査
方法は、更に、前記検出が、前記検出光の波長に応じて
少なくとも２つの検出チャンネルにおいて行われるこ
と、及び前記照明光が、パルス化されていることが好ま
しい。検査方法は、更に、前記照明光が、第一波長の２
倍の波長と第二波長の２倍の波長とを有することが好ま
しい。検査方法は、更に、前記照明光が、第一波長の３
倍の波長と第二波長の３倍の波長とを有することが好ま
しい。検査方法は、更に、前記照明光が、（複数の）相
関化光子（verschraenkte Photonen、entangled or cor
related photon）を含むことが好ましい。走査型顕微鏡
は、更に、前記光源装置が、時間的に１ps（1×10
ー１２秒）より小さい光パルスを繰り返し放射する少な
くとも１つのレーザを含むこと、及び該光源装置が、微
細構造化光学要素を含むことが好ましい。走査型顕微鏡
は、更に、前記微細構造化光学要素が、少なくとも２つ
の異なる光学密度を有する多数の微細光学構造要素から
構成されることが好ましい。走査型顕微鏡は、更に、前
記微細構造化光学要素が、隣接配置する、ガラス又はプ
ラスチック材料と中空空間とから構成されることが好ま
しい。走査型顕微鏡は、更に、前記微細構造化光学要素
が、フォトニックバンドギャップ材料（Photonic-Band-
Gap-Material）から構成されることが好ましい。走査型
顕微鏡は、更に、前記微細構造化光学要素が、先鋭化先
端部を有する光ファイバとして構成されることが好まし
い。
【００１６】本発明には、種々異なる蛍光着色物質で標
識された試料を、同時的励起及び実質的に改善された褪
色特性で検出することができるという有利がある。
【００１７】更なる方法ステップでは、試料の部分領域
で照明光線の合焦が行われることにより、より大きい
（光）エネルギ（ないしパワー）密度、従って多光子励
起のためのより大きい確率が生じる。次のステップで
は、複数の部分領域に亘って照明光線を逐次的（連続
的）に案内することにより試料を走査する。照明光線の
案内には、ガルバノメータによって駆動される回動可能
に支承された複数のミラーを有する光線偏向装置を使用
するのが好ましい。
【００１８】試料から発する光の検出を共焦点的に行う
変形形態は、とりわけ好ましい。そのために、検出器に
は、照射された部分領域に由来する光のみが通過できる
検出用絞りを前置する。他の一実施形態では、所謂Non-
Descan（走査ミラー非介在型）検出により、検出用絞り
なしで検出が行われる。例えば２光子励起の励起確率
は、光子密度の２乗に、従って照明光線強度（これは、
勿論、合焦（スポット）においては、その周辺領域（近
傍）の強度より遥かに大きい）の２乗に依存（比例）す
るので、検出器に入射する光は、その大部分が大きい確
率で合焦領域（スポット）に由来する。そのため、合焦
領域からの蛍光光子をその周辺領域からの蛍光光子から
検出用絞りによって殊更に区別する必要はない。
【００１９】検出のために、一実施形態では、ダイクロ
イックフィルタ（複数）が設けられる。ダイクロイック
フィルタは、試料から到来する検出光（これは複数の波
長を含む）をその波長ないし個々の波長領域（成分）に
応じて複数の検出器へ配属する。検出器は、例えば、光
電子増倍管、半導体検出器（例えばフォトダイオード又
はアバランシュフォトダイオード）である。これらの検
出器は、検出光を検出信号（その振幅は、検出光の強度
ないしエネルギに依存、好ましくは比例する）に変換す
る。とりわけ好ましい実施形態では、検出器は、マルチ
バンド検出器である。
【００２０】試料を走査する際、検出信号をディスプレ
イ上で二次元又は三次元画像に割り当てて表示するため
に、検出信号は走査された部分領域の位置に配属され
る。
【００２１】更に好ましい実施形態では、照明光は、パ
ルス化される。このため、光源装置は、少なくとも２つ
のパルスレーザを含むが、パルスレーザは、第一波長の
数倍の波長と第二波長の数倍の波長とを有する光パルス
列を放出する。光パルス列は、ダイクロイックビームス
プリッタによって結合されて照明光線を生成する。パル
スレーザは、好ましくは、光パルスが1ps未満であるよ
うに構成される。
【００２２】他の好ましい一変形形態では、光源装置
は、必要な波長（複数）の光を同時に放出するパルスレ
ーザを１つだけ含む。
【００２３】とりわけ好ましい一実施形態では、光源装
置は、１つのパルスレーザとそのパルスレーザに後置さ
れるビームスプリッタとを含む。このビームスプリッタ
は、放出された光を分割して第一及び第二分割光線に分
ける。分割光線の光路の一方には、波長変換手段（例え
ば、光学パラメトリック発振器又は周波数逓倍結晶（Kr
istall zur Frequenzvervielfachung）等）が配され
る。
【００２４】更に、光源装置が微小構造化光学要素を含
む一変形形態がとりわけ有利である。レーザの光はこの
微小構造化光学要素で合焦するが、この微小構造化光学
要素では、異なる波長の光への変換、好ましくは長い
（ないし幅の広い）波長スペクトルへの変換が行われ
る。
【００２５】微小構造化光学要素は、走査型顕微鏡の好
ましい一実施形態では、少なくとも２つの異なる光学密
度を有する、多数の微小光学構造要素から構成される。
微小構造化光学要素が第一領域及び第二領域を含み、第
一領域が均一な構造を有し、かつ第二領域では、微視的
（微小）構造が微小光学構造要素から形成される実施形
態はとりわけ好ましい。第一領域が第二領域を取り囲ん
でいれば更に有利である。微小光学構造要素は、好まし
くは、カニューレ（Kanuelen）、スタッド（Stege）、
ハニカム状体（Waben）、パイプ（Roehren）又は中空空
間から構成される。
【００２６】微小構造化光学要素は、他の一実施例で
は、互いに隣接配置された、ガラスないしプラスチック
材料と中空空間とから構成される。微小構造化光学要素
がフォトニックバンドギャップ材料から形成され、かつ
光ファイバとして構成される変形形態がとりわけ好まし
い。レーザ（光源）と光ファイバとの間には、光ファイ
バの各端部に由来する光線の戻り反射を抑制する光ダイ
オードが配されるのが好ましい。
【００２７】とりわけ好ましくかつ容易に実現可能な変
形形態は、微小構造化光学要素として、ファイバコア径
が凡そ9μmの従来の光ファイバ（これは、少なくとも一
部位に沿って先鋭化先端部を有する）を含む。この種の
光ファイバは、所謂「テーパファイバ（tapered fiber
s）」として既知である。光ファイバは、全長が1mで、
かつ30mm〜90mmの長さの先鋭化先端部を有するのが好ま
しい。ファイバ全体の直径は、好ましい一実施形態で
は、先鋭化先端部の部分においては、凡そ2μmである。
【００２８】更なる一実施形態では、照明光の光子の少
なくとも幾つかが相関化（verschraenkt, entangled）
される。米国特許US5,796,477には、相関化光子顕微鏡
（entangled-photon microscope）が開示されている
（相関化光子に関しては当該米国特許を参照された
い）。相関化光子顕微鏡は、多光子励起の有利を有する
が、極めて大きい励起光強度とそれと結びついた不利を
回避している。互いに独立に生成した光子の代わりに、
試料を励起するための相関化された光子が使用される。
光子は、所謂量子力学的相関化状態で存在する。試料中
の１つの蛍光体が励起する確率は、相関化光子により照
射する場合、励起光強度に対し直線的であり、既知の２
光子励起の場合のように、励起光強度の２乗に依存（比
例）しない。なぜなら、合焦（スポット）において、境
界条件が適切であれば、相関化光子は、時間と空間に関
し、原理的に常に相関しているからである。
【００２９】
【実施例】本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明
する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は、
発明の理解の容易化のためであり、本発明を図示の態様
に限定することを意図しない。また、以下の実施例も発
明の理解の容易化のためであり、本発明の技術的思想を
逸脱しない範囲において当業者により実施可能な置換・
変更等を排除することも意図するものではない。なお、
この点は、出願から補正に至るまで同様である。
【００３０】図１は、モード同期（modenverkoppelt）
チタンサファイアレーザとして構成される第一及び第二
レーザ５及び７を含む光源装置３を有する本発明の走査
型顕微鏡１の模式図である。第一レーザ５から発する光
９（この実施例では、その波長は780nmである）と、第
二レーザ７から発する光１１（この実施例では、その波
長は960nmである）とは、ダイクロイックビームスプリ
ッタ１３によって結合され照明光１５を形成する。１つ
の光線に形成された照明光１５は、カルダン式に懸架す
るミラー１９を含む光線偏向装置１７へ入射する。一光
線化された照明光１５は、走査光学系２１、鏡筒光学系
２３及び対物レンズ２５を介して、390nm又は480nmで光
学的に励起可能な２種類の蛍光着色物質を含む被検試料
２７に導かれないし該試料２７を通過する。被検試料２
７から発する検出光２９は、コンデンサ３１によってコ
リメートされ、ミラー３３によって反射されダイクロイ
ックビームスプリッタ３５へ向う。ダイクロイックビー
ムスプリッタ３５は、検出光を空間的、スペクトル的に
分割（分解）して２つの分解検出光線３７、３９とす
る。分解検出光線３７、３９は、何れも光電子増倍管と
して構成される２つの検出器４１、４３によって検出さ
れ、その振幅が、当該分解検出光線３７、３９のパワー
（強度）に比例する電気的信号に変換される。
【００３１】図２は、図１の走査型顕微鏡と同様にNon-
Descan検出構成（走査ミラー非介在形検出構成）で作動
する本発明の走査型顕微鏡１の模式図である。この実施
例の光源装置３は、モード同期チタンサファイアレーザ
として構成されたレーザ４５を含む。レーザ４５の光４
７は、ビームスプリッタ４９によって第一及び第二分解
光線５１及び５３に分割される。分解光線５３は、光学
パラメトリック発振器５５に入射する。光学パラメトリ
ック発振器５５から射出された分解光線５７は、ダイク
ロイック光線結合器（ビームスプリッタ）５９に至り、
そこで、ミラー６１及び６３を介して導かれる第一分解
光線５１と結合し、照明光１５となる。
【００３２】図３は、図１の走査型顕微鏡と同様にNon-
Descan検出構成で作動する本発明の走査型顕微鏡１の模
式図である。この実施例では、検出を行うために、マル
チバンド検出器６５が使用される。検出光２９は、プリ
ズム６７によって空間的、スペクトル的に分割（分解）
される。スペクトル分割のための他の手段としては、例
えば、反射型ないし透過型（回折）格子を用いることが
できる。スペクトル的に分割（分解）された拡開光線６
９は、合焦光学系７１によって合焦され、そしてミラー
絞り装置７３、７５に入射する。ミラー絞り装置７３、
７５、スペクトル的空間的分割手段（プリズム６７）、
合焦光学系７１及び検出器７７、７９は、まとめて、マ
ルチバンド検出器６５称する。検出光２９の分割（分
解）された拡開光線６９の一部（これは予め選択された
スペクトル領域（成分）の光のみを含む）は、ミラー絞
り装置を通過し、光電子増倍管として構成された検出器
７７によって検出される。分割された拡開光線６９の他
の一部は、この実施例では、ミラー絞り装置７５で反射
され、同様に光電子増倍管として構成された検出器７９
に入射する。ミラー絞り装置は双方向矢印によって示さ
れた方向に変位可能なので、検出器７７、７９に導かれ
る光のスペクトル検出領域（成分）を連続的に変化させ
ることができる。明瞭化の観点から図示はしないが、更
に、検出器、ミラー絞り装置を設けることも可能であ
る。検出器７７、７９では、被検試料２７から到来する
検出光２９の各スペクトル領域（成分）の強度（ないし
エネルギ：Leistung）に比例する電気的検出信号が生成
し、当該検出信号は、制御・処理ユニット（不図示）に
おいて、光線偏向装置内で位置センサによって求められ
た位置信号に割り当てられる。次に、当該信号は、ＰＣ
（コンピュータ）によって１つの画像にまとめあげられ
る。この過程は、当業者には既知であり、従って明瞭化
の観点から詳細に説明しない。より明瞭にするために、
光線を導き、形成する幾つかの光学要素も省略してい
る。これらの光学要素は、当業者に十分既知である。
【００３３】図４は、Descan検出構成（走査ミラー介在
検出構成）の本発明の走査型顕微鏡１の模式図である。
光源装置３の照明光１５は、ダイクロイックビームスプ
リッタ８１によって反射され光線偏向装置１７へ向い、
光線偏向装置１７から、走査光学系２１、鏡筒光学系２
３及び対物レンズ２５を介し、被検試料２７に導かれな
いし被検試料２７を通過する。被検試料２７から発する
検出光２９は、上記と同一の光路を光線偏向装置１７を
介して逆向きに辿り、ダイクロイックビームスプリッタ
８１に入射し、これを通過し、更に検出用絞り（明瞭化
のため図示していない）を通過し、そしてマルチバンド
検出器６５に入射する。
【００３４】図５は、本発明の走査型顕微鏡１のための
光源装置３の模式図である。光源装置３は、レーザダイ
オード励起型モード同期チタンサファイアレーザとして
構成され、かつ破線で描かれたパルス化された光線８３
を発振するレーザ４５を含む。光パルスの持続時間（パ
ルス幅）は、凡そ80MHzの繰返周波数では凡そ100fs（10
0×10−１５秒）である。光線８３は、合焦光学系８５
（これはズーム光学系として構成され、光線８３の伝播
方向に沿って双方向矢印の向きに変位可能に配される）
によって微細構造化光学要素８７（これは、この実施例
では、フォトニックバンドギャップ材料からなる光ファ
イバ８９から構成される）で合焦される。微細構造化光
学要素８７内では、レーザの光は、スペクトル的に拡開
される。バンドフィルタ９３は、凡そ300nm〜凡そ1600n
mの波長を有するスペクトル的に拡開された光線９１の
スペクトルの内、本発明の照明に好適な２つの波長の光
を通過させ、照明光１５を生成する。
【００３５】
【発明の効果】本発明の第一の検査方法の視点（請求項
１）及び第二の走査型顕微鏡の視点（請求項６）によ
り、被検試料中の蛍光着色物質の褪色（脱色）特性が改
善され、更に、とりわけ紫外スペクトル領域で励起可能
な被検試料において、同時的多色的検出が可能となる。
各従属請求項により、更に付加的な効果がそれぞれ達成
される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の走査型顕微鏡。
【図２】本発明の他の走査型顕微鏡。
【図３】マルチバンド検出器を有する本発明の更なる顕
微鏡。
【図４】マルチバンド検出器を有する本発明の更に他の
走査型顕微鏡。
【図５】本発明の走査型顕微鏡のための光源装置。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン ホフマン ドイツ連邦共和国 Ｄ−65191 ヴィース バーデン ビーアシュタッター ヘーエ 63 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 AA03 BA16 DA02 EA01 FA02 GA01 GA02 GB01 GB19 HA01 HA02 HA05 HA06 HA09 HA15 JA04 JA05 KA01 KA02 KA03 KA05 KA08 KA09 LA01 LA02 MA16 NA02 NA05 2H052 AA08 AA09 AC12 AC14 AC15 AC26 AC27 AC34 AF06 AF21

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも２つの光学的励起線を有しかつ
    少なくとも第一波長の光と第二波長の光とによって光学
    的に励起可能な被検試料の検査方法において、以下のス
    テップ：第一波長の数倍の波長と第二波長の数倍の波長
    とを少なくとも有する照明光（１５）により被検試料
    （２７）を照射すると共に、該照明光（１５）を該被検
    試料（２７）の部分領域で合焦させること；複数の前記
    部分領域に亘って照明光（１５）を順次案内することに
    より前記被検試料（２７）を走査すること；前記被検試
    料（２７）から到来する検出光（２９）を検出するこ
    と；前記検出光（２９）を、振幅が該検出光（２９）の
    パワーないし強度に依存する検出信号へ変換すること；
    前記検出信号を前記走査された複数の部分領域へ配属す
    ること；前記検出信号をディスプレイに表示することを
    特徴とする検査方法。
  2. 【請求項２】前記検出は、前記検出光の波長に応じて少
    なくとも２つの検出チャンネルにおいて行われること、
    及び前記照明光（１５）は、パルス化されていることを
    特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記照明光（１５）は、第一波長の２倍の
    波長と第二波長の２倍の波長とを有することを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記照明光（１５）は、第一波長の３倍の
    波長と第二波長の３倍の波長とを有することを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記照明光（１５）は、（複数の）相関化
    光子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】被検試料を照射するための照明光を放射す
    る少なくとも１つの光源装置を有すると共に、該被検試
    料は少なくとも２つの光学的励起線を有しかつ少なくと
    も第一波長の光と第二波長の光とによって光学的に励起
    可能であり、 該被検試料から発する検出光を検出するための少なくと
    も１つの検出器と、前記照明光を前記被検試料の部分領
    域で合焦させるための対物レンズとを有する走査型顕微
    鏡において、 前記照明光（１５）は、第一波長の数倍の波長と第二波
    長の数倍の波長とを少なくとも有すること、及び前記光
    源装置（３）は、光学パラメトリック発振器（５５）を
    含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
  7. 【請求項７】前記光源装置（３）は、時間的に１psより
    小さい光パルスを繰り返し放射する少なくとも１つのレ
    ーザ（５、７、４５）を含むこと、及び該光源装置
    （３）は、微細構造化光学要素（８７）を含むことを特
    徴とする請求項６に記載の走査型顕微鏡。
  8. 【請求項８】前記微細構造化光学要素（８７）は、少な
    くとも２つの異なる光学密度を有する多数の微細光学構
    造要素から構成されることを特徴とする請求項７に記載
    の走査型顕微鏡。
  9. 【請求項９】前記微細構造化光学要素（８７）は、隣接
    配置するガラス又はプラスチック材料と中空空間とから
    構成されることを特徴とする請求項７に記載の走査型顕
    微鏡。
  10. 【請求項１０】前記微細構造化光学要素（８７）は、フ
    ォトニックバンドギャップ材料から構成されることを特
    徴とする請求項７に記載の走査型顕微鏡。
  11. 【請求項１１】前記微細構造化光学要素（８７）は、先
    鋭化先端部を有する光ファイバとして構成されることを
    特徴とする請求項７に記載の走査型顕微鏡。
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