JP2004191251A - 蛍光分光分析装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能・低コストな蛍光分光分析装置を提供する。
【解決手段】試料に照射するための励起光を発生する励起光源(1)と、励起光を試料の複数個所に同時に照射するための光束をファイバ(2)を用いて形成するファイバ光学系と、ファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射するための励起光学系と、励起光を照射された試料より発する蛍光を同時に検出する複数の検出器(11)と、検出器に蛍光を導く検出光学系とを備えた蛍光分光分析装置である。
【選択図】 図1
【解決手段】試料に照射するための励起光を発生する励起光源(1)と、励起光を試料の複数個所に同時に照射するための光束をファイバ(2)を用いて形成するファイバ光学系と、ファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射するための励起光学系と、励起光を照射された試料より発する蛍光を同時に検出する複数の検出器(11)と、検出器に蛍光を導く検出光学系とを備えた蛍光分光分析装置である。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光分光分析装置に関し、特に複数点の蛍光統計分布解析を行う蛍光分光分析装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
DNA塩基配列の解析、SNPs(一塩基多型)解析、蛋白質相互作用の解析など、ゲノム関連解析に蛍光種の統計分布解析の技術を用いた方法が用いられている。統計分布解析には、蛍光相関分光分析法、蛍光強度分布解析法などが知られている。
【0003】
蛍光相関分光分析法は蛍光強度の揺らぎを解析し、分子毎の拡散時間や平均分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,69P,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keIler等に詳述されている。
【0004】
また、蛍光強度分布解析法は、蛍光揺らぎデータから観測領域内の分子毎の光子計数(明るさ)や平均分子数を求める手法であり、The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuation Spectroscopy, Yan Chan et.al., Biophysical Journal Vol.177 July 1999 553-567、Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Hong Qian and Elliot L.Elson.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.5479-5483,july 1990等に記載されている。
【0005】
その他、蛍光寿命解析法は、蛍光の減衰時間を解析することにより、分子毎の蛍光寿命や平均の分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,59p,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keller等に記載されている。
【0006】
従来、このような解析は、溶液中で行われていたが、バイオ技術の進展に伴って、細胞内において同様の解析を行うことが求められてきている。図8は、従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図である。この装置は、顕微鏡にレーザを導入しそのレーザ光によって励起された溶液中の蛍光分子から発生する蛍光を測定し統計分布解析を行うものである。
【0007】
光学顕微鏡の上部に蛍光色素励起用のレーザ光源70を設けてレーザ光を入射する。レーザ光は対物レンズ71によって集光され試料容器72中に観測領域を作り出す。試料容器72中には、観察する蛍光標識された被観察分子(あるいは小胞などの被観察物質)の溶液が入れられている。観測領域中に存在する試料の蛍光標識から発生した蛍光は再び対物レンズ71を通過してビームスプリッタ73により検出器74へと導かれる。検出器74の前には集光レンズ75とピンホール76が設けられており、コンフォーカル検出を行う。
【0008】
この構成により非常に小さな観測領域のみからの蛍光を検出することができる。検出器74で得られた蛍光信号は解析装置77で解析され、例えば蛋白質の相互作用の測定など、所望の測定が行われる。
【0009】
細胞に対して統計分布解析を行うためには、この蛍光分光分析の手法を溶液の替わりに細胞に適用することが考えられる。即ち、この装置で試料容器72に替えてシャーレ等を用い、細胞を光学顕微鏡で観察して測定部位を特定する。そして、図示していないステージ移動機構によりシャーレを移動することで、特定した測定部位をレーザによる観測領域に移動させて観測する。
【0010】
従来技術をこのようにして適用すれば、統計分布解析の技術を細胞内の測定に応用することができる。しかしながら、従来技術を適用した場合は、測定点が1個所であるため十分な観測ができない。そこで、この問題を解決するため、複数のレーザビームを形成して複数点の蛍光統計分布解析を行う方法が提案されている。
【0011】
この方法は、レーザビームをコリメータレンズによって一旦平行光束にし、その平行光束を集光レンズによって集光するときに集光レンズの直後に回折格子(DOE)を配置し4点の集光点を得て、この4点の二次光源を光源として4本の光束を形成するものである。(Applied Optics Vol.41,No.16,pp3336−3342(2002).)
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこの方法では、回折を利用しているため、必要とする4点の集光点以外に光の不均一な広がりであるサイドローブが生じノイズの原因になるという問題が生ずる。また、回折格子を用いるため色収差が生じ、複数の励起波長を利用して分布解析を行う際には不利となる。更に本方式では、蛍光検出系と一体に構成することができず、調整が複雑になるという問題点もある。
【0013】
本発明は、係る事情に鑑みてなされたものであって、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能・低コストな蛍光分光分析装置を提供することを目的とする。
【0014】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解消するための本発明は、試料に照射するための励起光を発生する励起光源と、励起光を試料の複数個所に同時に照射するための光束をファイバを用いて形成するファイバ光学系と、ファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射するための励起光学系と、励起光を照射された試料より発する蛍光を同時に検出する複数の検出器と、検出器に蛍光を導く検出光学系とを備えた蛍光分光分析装置である。
【0015】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、検出光学系は、ファイバ光学系を経由して検出器に蛍光を導く蛍光分光分析装置である。
【0016】
ファイバ光学系と蛍光検出系とを一体に構成することによって、調整に要する労力を低減させることができる。
【0017】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、ファイバ光学系は、ファイバを複数本束ねたファイババンドルによってなる蛍光分光分析装置である。
【0018】
ファイバ光学系をファイババンドルで構成することにより構成を簡単にすることができる。
【0019】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、ファイバ光学系の射出開口数を小さくする光学系をファイバの射出端の直後に設けた蛍光分光分析装置である。
【0020】
光ファイバ射出端の直後に開口数を小さくする光学系を設けることで、通常光通信等で使われる開口数0.1程度の光ファイバを使用することが可能となる。
【0021】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光学系の倍率が10倍以下である蛍光分光分析装置である。
【0022】
通常のシングルモードファイバの射出開口数は通常0.1程度であり、統計分布解析に適した観測領域を作り出すのに最適な開口数1以上の対物レンズを用いる場合、レーザ光の利用効率を最適にするにはファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射する励起光学系の倍率が10倍以下に設定するのが望ましい。本発明によればレーザ光の有効利用により装置の小型化・低コスト化に貢献することができる。
【0023】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光源は、半導体レーザである蛍光分光分析装置である。
【0024】
ファイバの入射に適した半導体レーザを使用するのが好ましく、また、装置の小型化・低コストが達成できる。
【0025】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光源は、異なる励起波長の複数のレーザ光源であり、複数のレーザ光源より発せられるレーザビームをビームコンバイナにより一つの光軸に混合してファイバ光学系のそれぞれのファイバにこの混合されたレーザ光を導入する分岐光学系を備えた蛍光分光分析装置である。
【0026】
本発明によって、容易に複数励起波長による統計分布解析を行うことができ、このことにより高性能な統計分布解析のできる蛍光分光分析装置を提供することができる。
【0027】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、複数の励起光が照射された試料を観察する観察手段と、その観察結果に応じて試料を移動可能な移動機構とを備えた蛍光分光分析装置である。
【0028】
本発明によって、試料を実際に観察しながら、励起光を試料の所望の個所に照射することができる。
【0029】
【発明の実施の形態】
図1は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第1の実施の形態を示す構成図である。
複数箇所の一分子蛍光分光測定による統計分布解析を行うため、本蛍光分光分析装置は複数のレーザ光源1を用いて構成されている。複数のレーザ光源1は光ファイバ2に接続され、その複数の光ファイバ2はその端面配列が結像レンズの結像面になるように設置される。すなわち、レンズの結像面にファイバ端が一次元或いは二次元に配置されそれが顕微鏡光学系によって試料内に縮小投影され複数の観測領域を作り出す。尚、この顕微鏡光学系が励起光学系に相当する。
【0030】
ファイバ端を発した複数本のレーザビームは、検出光学系への分岐を行うビームスプリッタ3、結像レンズ4、眼視観察用の分岐ビームスプリッタ5を透過し、対物レンズ6により試料容器7中の試料内に縮小投影される。この様子は、眼視光学系によって試料の透過画像と重ねて観察できる。観察者はこの透過画像を観察しながら試料中の任意の位置に、観測領域を移動することができる。この観察は、カメラ8を通して表示装置9で行っても良い。また、移動は電動ステージ10によって行うこともできる。
【0031】
このように本実施の形態の蛍光分光分析装置は、所謂倒立型顕微鏡を構成しており、観察用光源12とコンデンサ13で照明された試料容器7中の細胞等の試料を対物レンズ6で拡大して観察できる。そして、通常の生物観察用顕微鏡に備わっている位相差検鏡、微分干渉検鏡(DIC)なども観察可能であり、眼視観察だけでなくカメラ8によって撮像し表示装置9上に表示も可能となっている。すなわち通常の顕微鏡の機能を備えている。
【0032】
このようにして、試料中に形成された複数の観測領域で蛍光が発生する。発生した蛍光は、再び対物レンズ6、結像レンズ4、ビームスプリッタ3を経て検出光学系11で検出される。
【0033】
図2は、検出光学系を示す図である。検出光学系11は、ピンホール板14と対応した複数の検出器15で構成されており、共焦点(コンフォーカル)検出を行う。尚、本実施の形態では、複数の検出器15を用いて構成したが、この形態に限定されず複数の検出素子を有する一つの検出器によって構成しても良い。
【0034】
ピンホール板14の各ピンホールの位置は、観測領域に一致するように調整されている。即ち、ピンホールの位置は複数のファイバ端面で構成される複数光源と共役な位置にある。このようにして得られた複数の蛍光強度信号は解析装置16において、蛍光相関分光、蛍光強度分布解析などの統計分布解析処理が行われる。
【0035】
このようにして、観測領域内の蛋白質反応の様子、特定の蛋白質濃度の測定、特定分子の検出などに関する情報を得ることができる。
【0036】
図3は、試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図である。
試料容器7中の細胞22の中に4つの観測領域23a、23b、23c,23dがある。上述のように、顕微鏡光学系による観察を行いながら任意の位置に観察領域23a〜23dを移動することができる。複数の観測領域23a〜23dにより同時に各点の統計分布解析情報を得ることができるため、例えば、観察領域A23aと観測領域B23bを比較することによって生化学反応の進行方向や速度などを分析することが可能となる。
【0037】
一分子検出による統計分布解析を行うためには、観測領域当たり観測時間中に1個程度の分子が存在することが望ましい。また、統計分布データ解析には非常に多くの測定数が必要となるので、分子のブラウン運動によって移動する時間を短時間で観測できる条件が好ましい。
【0038】
例えば、蛍光強度分布解析では、一観測時間40μ秒程度が使用される。また、蛍光相関分光法でもほぼ同等の観測時間が用いられる。この時間内に1分子が存在する観測領域の大きさは約1μm立方程度である。従って、励起用のレーザビーム24の径は0.5〜1μmに集光する必要がある。通常励起に用いられる可視光の波長は0.5μm程度であり、集光用の対物レンズ6の開口数は1.0程度が必要となる。通常のシングルモードファイバは、開口数は約0.1であり、ガウシアンビーム形状を保って対物レンズ6に入射するには、系の倍率を5倍程度にする必要がある。また、開口数を一致させる場合は、系の光学系を10倍にする必要がある。
【0039】
図4は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第2の実施の形態を示す構成図である。第1の実施の形態と同一機能を有する部分には同一の符号を付してその詳細の説明を省略する。
【0040】
本第2の実施の形態は、複数光源と検出系が一体になって構成されている点が異なっている。即ち、複数光源を形成するファイバ(ファイババンドルを含む)光学系を通して蛍光を検出する。このように構成することにより、第1の実施の形態で必要であった、複数光源を形成する複数の光ファイバ2の端面と検出光学系のピンホール板14の各ピンホールとを共役の位置に一致させる調整が不用になる。
【0041】
図4に示すように蛍光は光ファイバ2を透過した後、ビームスプリッタ3により検出器15に入射され蛍光強度が検出される。図4には、一本の光ファイバ2に対する構成のみが詳細に記入されているが、他の光ファイバ2についてもビームスプリッタ3とレーザ光源1、検出器15が組み合わされている。なお、レーザ光を光ファイバ2にカップリングするレンズは図4では省略してある。
【0042】
図5は、本発明に係る第3の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図である。本図の光源部は、光ファイバ2として一般的なシングルモードファイバをバンドル状に束ね、その端面にマイクロレンズアレイ28を設けた構成である。
【0043】
シングルモードファイバのコア25の径は通常数μm程度であり、クラッド26の径は125μmが用いられる。これは、通常の光ファイバは長距離の光伝送に用いられるので、できるだけ漏洩光を減らし光の減衰を少なくする為である。従って、この一般的なシングルモードファイバを用いて複数光源を構成すると、ファイバを直接束ねたファイババンドル27として構成しても光源の相互の間隔は、0.125mmが最小となる。
【0044】
第1の実施の形態で説明したようにファイバと対物レンズの開口数を考慮すると顕微鏡光学系の倍率は5〜10倍が望ましい。従って、試料中に投影される複数観測領域の間隔は、12.5〜25μmとなる。これは、試料の細胞の大きさから考えると大き過ぎ、2〜3μm程度に間隔を縮める必要がある。図5に示す光源部の構成はこの点を解決するためのものであり、光ファイバ2の射出開口数をレンズによって小さくすることにより顕微鏡の光学系の倍率を大きくすることができる。
【0045】
図5に示すマイクロレンズアレイ28によって、光ファイバ2の開口数0.1を0.01にすると、対物レンズ6の開口数1に合わせる顕微鏡光学系の倍率を50〜100倍にすることができる。すなわち試料中の観測領域の間隔を1.25〜2.5μmとすることができる。なお、ファイババンドル27は1次元に配列されている必要はなく、2次元に配列されていても良い。
【0046】
図6は、本発明に係る第4の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図である。第1の実施の形態と同一機能を有する部分には同一の符号を付してその詳細の説明を省略する。
【0047】
本実施の形態では、蛍光励起光源として複数波長のレーザ光源1を用い、蛍光も複数波長領域で検出を行うように構成した点が異なっている。複数の波長を使うことによって、一度に複数の蛍光色素についての計測が可能となり、複数の物質(蛋白質など)の量やその変化、生化学反応などを同時に観測することが可能になる。
【0048】
各波長の違うレーザ光源1から発生したレーザはダイクロイックミラー17などのビームコンバイナを用いて効率的に一本のビームに合成される。合成された励起光ビームは、ビームスプリッタ18によって分割されカップリングレンズ19により複数の光ファイバ2に導入される。
【0049】
光ファイバ2のもう一方の端面は、結像レンズ4の結像面に設けられており、この光ファイバ2の端面で形成される多波長の複数光源が対物レンズ6によって試料に照射されて、試料中に複数の観測領域を形成する。試料から発生した蛍光は再び対物レンズ6、結像レンズ4を通過して光ファイバ2の端面に入射する。このとき光ファイバ2のコアによってピンホールと同等の共焦点効果が生じる。即ち、共焦点検出が行われる。
【0050】
試料からの蛍光は、光ファイバ2から射出した後、ビームスプリッタ18を介して検出器20に入射する。図7は、検出器の詳細を示す図である。複数の蛍光波長領域を含んだ蛍光は、ダイクロイックミラー20aによって励起波長に対応する各蛍光波長領域の蛍光に分けられ、それぞれの励起波長毎に検出器20bによって検出される。ここで、検出器20bには、アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管などが用いられる。
【0051】
検出された蛍光強度信号は、解析装置16に送られ統計分布等の必要なデータが計算される。また、得られた複数のデータは、その空間分布に従って、通常顕微鏡画像に重ねて表示することもできる。これによって、例えば細胞のどの位置にどのような変化が生じているかなどをリアルタイムに表示することが可能となる。
【0052】
また、この実施形態によれば、照射される試料のそれぞれの個所がどの波長に対応する蛍光を発生するかを予め決める必要がなくなり、未知の試料に対しても本発明を適用することが可能となる。
【0053】
尚、本実施の形態の変形例として、「ファイバ光学系」が複数の異なる波長を混合して光束を上述のファイバ束によって伝播させて別々の測定対象を照射し、その測光データを同様に伝播させた後、上述の複数のダイクロイックミラーを用いずに1個のグレーティング手段によって波長別に分離して各受光素子にて受光するように構成しても良い。
【0054】
更に、本実施の形態の変形例として、「ファイバ光学系」が複数の異なる波長を混合して光束を上述のファイバ束によって伝播させて別々の測定対象を照射し、その測光データを単一のファイバを用いて伝播させた後、上述の複数のダイクロイックミラーを用いずに1個のグレーティング手段によって波長別に分離して各受光素子にて受光するように構成しても良い。
【0055】
尚、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれているため、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明を抽出することができる。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【0056】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の蛍光分光分析装置によれば、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明に係る蛍光分光分析装置の第1の実施の形態を示す構成図。
【図2】検出光学系を示す図。
【図3】試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図。
【図4】本発明に係る蛍光分光分析装置の他の実施の形態を示す構成図。
【図5】本発明に係る蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図。
【図6】本発明に係る蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図。
【図7】検出器の詳細を示す図。
【図8】従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図。
【符号の説明】
1…レーザ光源
2…ファイバ
3…ビームスプリッタ
4…結像レンズ
6…対物レンズ
11…検出光学系
15…検出器
17…ビームコンバイナ
20…検出器
22…細胞
23…観測領域
27…ファイババンドル
28…マイクロレンズアレイ
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光分光分析装置に関し、特に複数点の蛍光統計分布解析を行う蛍光分光分析装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
DNA塩基配列の解析、SNPs(一塩基多型)解析、蛋白質相互作用の解析など、ゲノム関連解析に蛍光種の統計分布解析の技術を用いた方法が用いられている。統計分布解析には、蛍光相関分光分析法、蛍光強度分布解析法などが知られている。
【0003】
蛍光相関分光分析法は蛍光強度の揺らぎを解析し、分子毎の拡散時間や平均分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,69P,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keIler等に詳述されている。
【0004】
また、蛍光強度分布解析法は、蛍光揺らぎデータから観測領域内の分子毎の光子計数(明るさ)や平均分子数を求める手法であり、The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuation Spectroscopy, Yan Chan et.al., Biophysical Journal Vol.177 July 1999 553-567、Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Hong Qian and Elliot L.Elson.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.5479-5483,july 1990等に記載されている。
【0005】
その他、蛍光寿命解析法は、蛍光の減衰時間を解析することにより、分子毎の蛍光寿命や平均の分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,59p,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keller等に記載されている。
【0006】
従来、このような解析は、溶液中で行われていたが、バイオ技術の進展に伴って、細胞内において同様の解析を行うことが求められてきている。図8は、従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図である。この装置は、顕微鏡にレーザを導入しそのレーザ光によって励起された溶液中の蛍光分子から発生する蛍光を測定し統計分布解析を行うものである。
【0007】
光学顕微鏡の上部に蛍光色素励起用のレーザ光源70を設けてレーザ光を入射する。レーザ光は対物レンズ71によって集光され試料容器72中に観測領域を作り出す。試料容器72中には、観察する蛍光標識された被観察分子(あるいは小胞などの被観察物質)の溶液が入れられている。観測領域中に存在する試料の蛍光標識から発生した蛍光は再び対物レンズ71を通過してビームスプリッタ73により検出器74へと導かれる。検出器74の前には集光レンズ75とピンホール76が設けられており、コンフォーカル検出を行う。
【0008】
この構成により非常に小さな観測領域のみからの蛍光を検出することができる。検出器74で得られた蛍光信号は解析装置77で解析され、例えば蛋白質の相互作用の測定など、所望の測定が行われる。
【0009】
細胞に対して統計分布解析を行うためには、この蛍光分光分析の手法を溶液の替わりに細胞に適用することが考えられる。即ち、この装置で試料容器72に替えてシャーレ等を用い、細胞を光学顕微鏡で観察して測定部位を特定する。そして、図示していないステージ移動機構によりシャーレを移動することで、特定した測定部位をレーザによる観測領域に移動させて観測する。
【0010】
従来技術をこのようにして適用すれば、統計分布解析の技術を細胞内の測定に応用することができる。しかしながら、従来技術を適用した場合は、測定点が1個所であるため十分な観測ができない。そこで、この問題を解決するため、複数のレーザビームを形成して複数点の蛍光統計分布解析を行う方法が提案されている。
【0011】
この方法は、レーザビームをコリメータレンズによって一旦平行光束にし、その平行光束を集光レンズによって集光するときに集光レンズの直後に回折格子(DOE)を配置し4点の集光点を得て、この4点の二次光源を光源として4本の光束を形成するものである。(Applied Optics Vol.41,No.16,pp3336−3342(2002).)
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこの方法では、回折を利用しているため、必要とする4点の集光点以外に光の不均一な広がりであるサイドローブが生じノイズの原因になるという問題が生ずる。また、回折格子を用いるため色収差が生じ、複数の励起波長を利用して分布解析を行う際には不利となる。更に本方式では、蛍光検出系と一体に構成することができず、調整が複雑になるという問題点もある。
【0013】
本発明は、係る事情に鑑みてなされたものであって、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能・低コストな蛍光分光分析装置を提供することを目的とする。
【0014】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解消するための本発明は、試料に照射するための励起光を発生する励起光源と、励起光を試料の複数個所に同時に照射するための光束をファイバを用いて形成するファイバ光学系と、ファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射するための励起光学系と、励起光を照射された試料より発する蛍光を同時に検出する複数の検出器と、検出器に蛍光を導く検出光学系とを備えた蛍光分光分析装置である。
【0015】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、検出光学系は、ファイバ光学系を経由して検出器に蛍光を導く蛍光分光分析装置である。
【0016】
ファイバ光学系と蛍光検出系とを一体に構成することによって、調整に要する労力を低減させることができる。
【0017】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、ファイバ光学系は、ファイバを複数本束ねたファイババンドルによってなる蛍光分光分析装置である。
【0018】
ファイバ光学系をファイババンドルで構成することにより構成を簡単にすることができる。
【0019】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、ファイバ光学系の射出開口数を小さくする光学系をファイバの射出端の直後に設けた蛍光分光分析装置である。
【0020】
光ファイバ射出端の直後に開口数を小さくする光学系を設けることで、通常光通信等で使われる開口数0.1程度の光ファイバを使用することが可能となる。
【0021】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光学系の倍率が10倍以下である蛍光分光分析装置である。
【0022】
通常のシングルモードファイバの射出開口数は通常0.1程度であり、統計分布解析に適した観測領域を作り出すのに最適な開口数1以上の対物レンズを用いる場合、レーザ光の利用効率を最適にするにはファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射する励起光学系の倍率が10倍以下に設定するのが望ましい。本発明によればレーザ光の有効利用により装置の小型化・低コスト化に貢献することができる。
【0023】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光源は、半導体レーザである蛍光分光分析装置である。
【0024】
ファイバの入射に適した半導体レーザを使用するのが好ましく、また、装置の小型化・低コストが達成できる。
【0025】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、励起光源は、異なる励起波長の複数のレーザ光源であり、複数のレーザ光源より発せられるレーザビームをビームコンバイナにより一つの光軸に混合してファイバ光学系のそれぞれのファイバにこの混合されたレーザ光を導入する分岐光学系を備えた蛍光分光分析装置である。
【0026】
本発明によって、容易に複数励起波長による統計分布解析を行うことができ、このことにより高性能な統計分布解析のできる蛍光分光分析装置を提供することができる。
【0027】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、複数の励起光が照射された試料を観察する観察手段と、その観察結果に応じて試料を移動可能な移動機構とを備えた蛍光分光分析装置である。
【0028】
本発明によって、試料を実際に観察しながら、励起光を試料の所望の個所に照射することができる。
【0029】
【発明の実施の形態】
図1は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第1の実施の形態を示す構成図である。
複数箇所の一分子蛍光分光測定による統計分布解析を行うため、本蛍光分光分析装置は複数のレーザ光源1を用いて構成されている。複数のレーザ光源1は光ファイバ2に接続され、その複数の光ファイバ2はその端面配列が結像レンズの結像面になるように設置される。すなわち、レンズの結像面にファイバ端が一次元或いは二次元に配置されそれが顕微鏡光学系によって試料内に縮小投影され複数の観測領域を作り出す。尚、この顕微鏡光学系が励起光学系に相当する。
【0030】
ファイバ端を発した複数本のレーザビームは、検出光学系への分岐を行うビームスプリッタ3、結像レンズ4、眼視観察用の分岐ビームスプリッタ5を透過し、対物レンズ6により試料容器7中の試料内に縮小投影される。この様子は、眼視光学系によって試料の透過画像と重ねて観察できる。観察者はこの透過画像を観察しながら試料中の任意の位置に、観測領域を移動することができる。この観察は、カメラ8を通して表示装置9で行っても良い。また、移動は電動ステージ10によって行うこともできる。
【0031】
このように本実施の形態の蛍光分光分析装置は、所謂倒立型顕微鏡を構成しており、観察用光源12とコンデンサ13で照明された試料容器7中の細胞等の試料を対物レンズ6で拡大して観察できる。そして、通常の生物観察用顕微鏡に備わっている位相差検鏡、微分干渉検鏡(DIC)なども観察可能であり、眼視観察だけでなくカメラ8によって撮像し表示装置9上に表示も可能となっている。すなわち通常の顕微鏡の機能を備えている。
【0032】
このようにして、試料中に形成された複数の観測領域で蛍光が発生する。発生した蛍光は、再び対物レンズ6、結像レンズ4、ビームスプリッタ3を経て検出光学系11で検出される。
【0033】
図2は、検出光学系を示す図である。検出光学系11は、ピンホール板14と対応した複数の検出器15で構成されており、共焦点(コンフォーカル)検出を行う。尚、本実施の形態では、複数の検出器15を用いて構成したが、この形態に限定されず複数の検出素子を有する一つの検出器によって構成しても良い。
【0034】
ピンホール板14の各ピンホールの位置は、観測領域に一致するように調整されている。即ち、ピンホールの位置は複数のファイバ端面で構成される複数光源と共役な位置にある。このようにして得られた複数の蛍光強度信号は解析装置16において、蛍光相関分光、蛍光強度分布解析などの統計分布解析処理が行われる。
【0035】
このようにして、観測領域内の蛋白質反応の様子、特定の蛋白質濃度の測定、特定分子の検出などに関する情報を得ることができる。
【0036】
図3は、試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図である。
試料容器7中の細胞22の中に4つの観測領域23a、23b、23c,23dがある。上述のように、顕微鏡光学系による観察を行いながら任意の位置に観察領域23a〜23dを移動することができる。複数の観測領域23a〜23dにより同時に各点の統計分布解析情報を得ることができるため、例えば、観察領域A23aと観測領域B23bを比較することによって生化学反応の進行方向や速度などを分析することが可能となる。
【0037】
一分子検出による統計分布解析を行うためには、観測領域当たり観測時間中に1個程度の分子が存在することが望ましい。また、統計分布データ解析には非常に多くの測定数が必要となるので、分子のブラウン運動によって移動する時間を短時間で観測できる条件が好ましい。
【0038】
例えば、蛍光強度分布解析では、一観測時間40μ秒程度が使用される。また、蛍光相関分光法でもほぼ同等の観測時間が用いられる。この時間内に1分子が存在する観測領域の大きさは約1μm立方程度である。従って、励起用のレーザビーム24の径は0.5〜1μmに集光する必要がある。通常励起に用いられる可視光の波長は0.5μm程度であり、集光用の対物レンズ6の開口数は1.0程度が必要となる。通常のシングルモードファイバは、開口数は約0.1であり、ガウシアンビーム形状を保って対物レンズ6に入射するには、系の倍率を5倍程度にする必要がある。また、開口数を一致させる場合は、系の光学系を10倍にする必要がある。
【0039】
図4は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第2の実施の形態を示す構成図である。第1の実施の形態と同一機能を有する部分には同一の符号を付してその詳細の説明を省略する。
【0040】
本第2の実施の形態は、複数光源と検出系が一体になって構成されている点が異なっている。即ち、複数光源を形成するファイバ(ファイババンドルを含む)光学系を通して蛍光を検出する。このように構成することにより、第1の実施の形態で必要であった、複数光源を形成する複数の光ファイバ2の端面と検出光学系のピンホール板14の各ピンホールとを共役の位置に一致させる調整が不用になる。
【0041】
図4に示すように蛍光は光ファイバ2を透過した後、ビームスプリッタ3により検出器15に入射され蛍光強度が検出される。図4には、一本の光ファイバ2に対する構成のみが詳細に記入されているが、他の光ファイバ2についてもビームスプリッタ3とレーザ光源1、検出器15が組み合わされている。なお、レーザ光を光ファイバ2にカップリングするレンズは図4では省略してある。
【0042】
図5は、本発明に係る第3の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図である。本図の光源部は、光ファイバ2として一般的なシングルモードファイバをバンドル状に束ね、その端面にマイクロレンズアレイ28を設けた構成である。
【0043】
シングルモードファイバのコア25の径は通常数μm程度であり、クラッド26の径は125μmが用いられる。これは、通常の光ファイバは長距離の光伝送に用いられるので、できるだけ漏洩光を減らし光の減衰を少なくする為である。従って、この一般的なシングルモードファイバを用いて複数光源を構成すると、ファイバを直接束ねたファイババンドル27として構成しても光源の相互の間隔は、0.125mmが最小となる。
【0044】
第1の実施の形態で説明したようにファイバと対物レンズの開口数を考慮すると顕微鏡光学系の倍率は5〜10倍が望ましい。従って、試料中に投影される複数観測領域の間隔は、12.5〜25μmとなる。これは、試料の細胞の大きさから考えると大き過ぎ、2〜3μm程度に間隔を縮める必要がある。図5に示す光源部の構成はこの点を解決するためのものであり、光ファイバ2の射出開口数をレンズによって小さくすることにより顕微鏡の光学系の倍率を大きくすることができる。
【0045】
図5に示すマイクロレンズアレイ28によって、光ファイバ2の開口数0.1を0.01にすると、対物レンズ6の開口数1に合わせる顕微鏡光学系の倍率を50〜100倍にすることができる。すなわち試料中の観測領域の間隔を1.25〜2.5μmとすることができる。なお、ファイババンドル27は1次元に配列されている必要はなく、2次元に配列されていても良い。
【0046】
図6は、本発明に係る第4の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図である。第1の実施の形態と同一機能を有する部分には同一の符号を付してその詳細の説明を省略する。
【0047】
本実施の形態では、蛍光励起光源として複数波長のレーザ光源1を用い、蛍光も複数波長領域で検出を行うように構成した点が異なっている。複数の波長を使うことによって、一度に複数の蛍光色素についての計測が可能となり、複数の物質(蛋白質など)の量やその変化、生化学反応などを同時に観測することが可能になる。
【0048】
各波長の違うレーザ光源1から発生したレーザはダイクロイックミラー17などのビームコンバイナを用いて効率的に一本のビームに合成される。合成された励起光ビームは、ビームスプリッタ18によって分割されカップリングレンズ19により複数の光ファイバ2に導入される。
【0049】
光ファイバ2のもう一方の端面は、結像レンズ4の結像面に設けられており、この光ファイバ2の端面で形成される多波長の複数光源が対物レンズ6によって試料に照射されて、試料中に複数の観測領域を形成する。試料から発生した蛍光は再び対物レンズ6、結像レンズ4を通過して光ファイバ2の端面に入射する。このとき光ファイバ2のコアによってピンホールと同等の共焦点効果が生じる。即ち、共焦点検出が行われる。
【0050】
試料からの蛍光は、光ファイバ2から射出した後、ビームスプリッタ18を介して検出器20に入射する。図7は、検出器の詳細を示す図である。複数の蛍光波長領域を含んだ蛍光は、ダイクロイックミラー20aによって励起波長に対応する各蛍光波長領域の蛍光に分けられ、それぞれの励起波長毎に検出器20bによって検出される。ここで、検出器20bには、アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管などが用いられる。
【0051】
検出された蛍光強度信号は、解析装置16に送られ統計分布等の必要なデータが計算される。また、得られた複数のデータは、その空間分布に従って、通常顕微鏡画像に重ねて表示することもできる。これによって、例えば細胞のどの位置にどのような変化が生じているかなどをリアルタイムに表示することが可能となる。
【0052】
また、この実施形態によれば、照射される試料のそれぞれの個所がどの波長に対応する蛍光を発生するかを予め決める必要がなくなり、未知の試料に対しても本発明を適用することが可能となる。
【0053】
尚、本実施の形態の変形例として、「ファイバ光学系」が複数の異なる波長を混合して光束を上述のファイバ束によって伝播させて別々の測定対象を照射し、その測光データを同様に伝播させた後、上述の複数のダイクロイックミラーを用いずに1個のグレーティング手段によって波長別に分離して各受光素子にて受光するように構成しても良い。
【0054】
更に、本実施の形態の変形例として、「ファイバ光学系」が複数の異なる波長を混合して光束を上述のファイバ束によって伝播させて別々の測定対象を照射し、その測光データを単一のファイバを用いて伝播させた後、上述の複数のダイクロイックミラーを用いずに1個のグレーティング手段によって波長別に分離して各受光素子にて受光するように構成しても良い。
【0055】
尚、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれているため、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明を抽出することができる。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【0056】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の蛍光分光分析装置によれば、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明に係る蛍光分光分析装置の第1の実施の形態を示す構成図。
【図2】検出光学系を示す図。
【図3】試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図。
【図4】本発明に係る蛍光分光分析装置の他の実施の形態を示す構成図。
【図5】本発明に係る蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図。
【図6】本発明に係る蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図。
【図7】検出器の詳細を示す図。
【図8】従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図。
【符号の説明】
1…レーザ光源
2…ファイバ
3…ビームスプリッタ
4…結像レンズ
6…対物レンズ
11…検出光学系
15…検出器
17…ビームコンバイナ
20…検出器
22…細胞
23…観測領域
27…ファイババンドル
28…マイクロレンズアレイ
Claims (8)
- 試料に照射するための励起光を発生する励起光源と、
前記励起光を試料の複数個所に同時に照射するための光束をファイバを用いて形成するファイバ光学系と、
前記ファイバ光学系によって形成される複数光源を試料に照射するための励起光学系と、
前記励起光を照射された試料より発する蛍光を同時に検出する複数の検出器と、
前記検出器に蛍光を導く検出光学系と
を備えたことを特徴とする蛍光分光分析装置。 - 前記検出光学系は、前記ファイバ光学系を経由して前記検出器に蛍光を導くことを特徴とする請求項1記載の蛍光分光分析装置。
- 前記ファイバ光学系は、前記ファイバを複数本束ねたファイババンドルによってなることを特徴とする請求項1または2に記載の蛍光分光分析装置。
- 前記ファイバ光学系の射出開口数を小さくする光学系を前記ファイバの射出端の直後に設けたことを特徴とする請求項1乃至3の内いずれか1の請求項に記載の蛍光分光分析装置。
- 前記励起光学系の倍率が10倍以下であることを特徴とする請求項1乃至4の内いずれか1の請求項に記載の蛍光分光分析装置。
- 前記励起光源は、半導体レーザであることを特徴とする請求項1乃至5の内いずれか1の請求項に記載の蛍光分光分析装置。
- 前記励起光源は、異なる励起波長の複数のレーザ光源であり、
前記複数のレーザ光源より発せられるレーザビームをビームコンバイナにより一つの光軸に混合してファイバ光学系のそれぞれのファイバにこの混合されたレーザ光を導入する分岐光学系を備えたことを特徴とする請求項1乃至6の内いずれか1の請求項に記載の蛍光分光分析装置。 - 前記複数の励起光が照射された前記試料を観察する観察手段と、
その観察結果に応じて前記試料を移動可能な移動機構と
を備えたことを特徴とする請求項1乃至7の内いずれか1の請求項に記載の蛍光分光分析装置。
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