JP2004354348A

JP2004354348A - 分光分析装置

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Publication number: JP2004354348A
Application number: JP2003155635A
Authority: JP
Inventors: Yasuchika Ishibashi; 養親石橋
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: EP1630546A4; US7355701B2; WO2004106904A1; US20060109461A1; JP3999701B2; EP1630546A1

Abstract

【課題】共通に設けられた光学系により複数の測定地点間の相互相関解析を行うことが可能で、小型で価格的にも安価な分光分析装置を提供する。
【解決手段】励起光としてのレーザ光を発生するレーザ光源１からのレーザ光を対物レンズ５を介して試料６上に集光させるとともに、ＸＹスキャナー３によりレーザ光を試料６上で２次元走査し、レーザ光により発生する蛍光強度を光検出器８で測定するようになっていて、ＸＹスキャナー３によるレーザ光の走査にともなう試料６上での少なくとも２つの測定地点での光検出器８からの蛍光強度信号をＸＹスキャナー３の走査位置情報と関連づけて相関解析装置９により測定地点間の相互相関演算を行う。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物試料内の蛍光分子の揺らぎを解析することにより、蛍光分子の状態を解析する蛍光相関分光分析法が用いられ、特に、異なる測定地点間で蛍光強度の相関を解析する分光分析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自已相関関数を求め、分子毎の拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば、非特許文献１に詳述されている。ここでは、蛍光強度をＩ（ｔ）とすると、自已相関関数は、式１の形で表される。
【０００３】
【数１】

【０００４】
図１３は、このようなＦＣＳ法による測定に用いられる光学系の一例を示している。この場合、励起光源としてレーザ光源１００が用いられ、レーザ光源１００からのレーザ光をダイクロイックミラー１０１で反射した後、対物レンズ１０２に入射する。対物レンズ１０２の焦点位置には蛍光色素で標識された試料１０３が置かれている。対物レンズ１０２により焦点部分に集光されたレーザ光は蛍光色素を励起し蛍光を誘起する。試料１０３の蛍光色素から発した蛍光は、再び対物レンズ１０２で補足されダイクロイックミラー１０１に達する。ここでのダイクロイックミラー１０１には、励起光は反射するが蛍光を透過する光学特性を有するものが用いられている。これにより試料１０３からの蛍光はダイクロイックミラー１０１を通過し、集光レンズ１０４を経て集光される。この集光レンズ１０４の焦点位置にはピンホール１０５が配置されており、対物レンズ１０２の焦点位置以外からの蛍光を遮断することにより高い空間分解能を与えている。ピンホール１０５を通過した蛍光は光検出器１０６に入射し、蛍光強度の揺らぎが計測される。
【０００５】
また、図１４は、２つの測定地点で同時に計測できるようにした光学系の例を示している。この場合も、励起光源としてレーザ光源２００が用いられ、レーザ光源２００からの励起光であるレーザ光は、ビームスプリッタ２０１で２つの光束に分割され互いに僅かに光軸が傾けられた後、それぞれミラー２０２、２０３を介して再びビームスプリッター２０４で合成される。合成光束はダイクロイックミラー２０５で反射した後、対物レンズ２０６に入り、試料２０７上の僅かに離れた２点で、それぞれ焦点を結ぶ。そして、試料２０７上のそれぞれの焦点領域から発した蛍光は、再び対物レンズ２０６で補足され、ダイクロイックミラー２０５を通過し、集光レンズ２０８を経て、それぞれ対応する２点で焦点を結ぶ。そして、この焦点位置からは、それぞれ光ファイバー２０９ａ、２０９ｂを経て光検出器２１０ａ、２１０ｂに入射し、それぞれの蛍光強度の揺らぎが計測される。この例ではピンホールは用いていないが光ファイバー２０９ａ、２０９ｂのコア径がピンホールとして機能している。
【０００６】
一方、このような蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）を拡張した解析法として、蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）が考えられている。この蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法である。蛍光相互相関分光分析（ＦＣＣＳ法）は、同一の測定地点に於いて２色の蛍光色素間について関連性を求める場合や、２つの測定地点間において関連性を求める場合があるが、これらの相互相関関数は式２の形で表される。ここでＩ_Ａ（ｔ）、Ｉ_Ｂ（ｔ）は、それぞれの蛍光強度信号を表している。
【０００７】
【数２】

【０００８】
同一の測定地点に於いて２色の蛍光色素間の相互相関分析は、非特許文献２に詳述されているが、２色の蛍光色素で標識した分子間の相互作用の解析等に用いられる。異なる地点間での相関を解析する方法は、非特許文献３に記載があり、流体の流れの速度と方向を測定する方法が紹介されている。
【０００９】
これら蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）や蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、測定が非侵襲に行える利点が注目され、近年では細胞系などの不均質な試料にも用いられるようになってきている。吸着等の特異現象が発生しやすい容器界面の近傍を避けると、溶液系では基本的に全ての場所が均一であるため、溶液中の１点を測定すれば系全体の様子を把握することができる。しかし、細胞のように不均質な系では、個々の場所で起っている事象が異なり、測定結果は測定場所に大きく依存する。また、このような系、特に細胞系では、異なる地点間の事象が互いに関連をもっており、ある地点のある事象が別の地点の別の事象を引き起すと言った時間的空問的な関連を持っている場合も多い。このような系を的確に把握しようとすると、異なる地点間で同時に測定を行うことが不可欠であり、近年研究者の間でこの要望が高まってきている。
【００１０】
複数の測定地点間で同時に蛍光測定を行うため光学系としては、例えば、特許文献１に開示されているように、複数の励起光源と複数の検出器を用いる方法が提案されている。
【００１１】
また別の方法としては、特許文献２に開示されているように一つの励起光源をビームスプリッターで分割し、この分割した励起光源を複数の測定点に供給する光学系を用いる方法が提案されている。
【００１２】
【特許文献１】
米国特許第６３２０１９６号明細書
【００１３】
【特許文献２】
特開平９−１１３４４８号公報
【００１４】
【非特許文献１】
「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素，１９９９，ｖｏ１．４４ＮＯ９１４３１−１４３８
【００１５】
【非特許文献２】
Ｄｕａ１−Ｃｏ１ｏｒＦ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅ１ａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒＭｕ１ｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔＤｉｆｆｕｓｉｏｎａ１Ａｎａ１ｙｓｉｓｉｎＳｏ１ｕｔｉｏｎ，Ｐ．Ｓｃｈｗｉ１１ｅｅｔａ１，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ１Ｊｏｕｒｎａ１１９９７，７２，１８７８−１８８６
【００１６】
【非特許文献３】
”Ｔｗｏ−ＢｅａｍＣｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅ１ａｔｉｏｎ：ＡｍｅｔｈｏｄＴｏＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅＴｒａｎｓｐｏｒｔＰｈｅｎｏｍｅｎａｉｎＭｉｃｒｏｍｅｔｅｒＳｉｚｅｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ” Ｍ．Ｂｒｉｎｋｍｅｉｅｒｅｔａ１．Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，６０９−６１６
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献１に開示される方法では、励起光源と検出器を有する光学系を複数配置するため装置が複雑化するという欠点がある。また、検出器間の間隔により測定地点の距離が制限を受け、非常に近接した測定点を計測することは困難である。
【００１８】
特許文献２に開示される方法では、検出器は測定地点毎に独立して用いるようにしているため、検出光学系の複雑化は避けられない。
【００１９】
蛍光相関分光分析で用いられる光学系は、レーザと単光子計測が可能な超高感度の光検出器とを組合わせて用いられるが、一般にこれらの光学部品は非常に高価である。このため、これらの測定系を複数設置することは装置が極めて高価になるとともに、大型化するといういう問題を生じる。さらに、複数の測定地点を単一の細胞に設定する場合、測定点の間隔は非常に近接し、また、常に一定ではないく、測定対象の細胞によっても異なってくることがあり、従来の方法では、これらの要求への対応が困難であるという問題もあった。
【００２０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、共通に設けられた光学系により複数の測定地点間の相互相関解析を行うことが可能で、小型で価格的にも安価な分光分析装置を提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、光源と、前記光源からの光を試料上に集光させる集光手段、前記光を前記試料上で走査する光走査手段と、前記光により発生する光強度を検出する光検出手段と、前記光走査手段による前記光の走査にともなう前記試料上での少なくとも２つの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記測定地点間の相互相関演算を行う相互相関演算手段とを具備したことを特徴としている。
【００２２】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記光走査手段は、２つの測定地点を繰返し走査し、前記相互相関演算手段は、前記２つの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記測定地点間の相互相関演算を行うことを特徴としている。
【００２３】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記光走査手段は、閉じたループ状で繰返し走査を行ない、前記相互相関演算手段は、前記ループの一周を複数の領域に分割し、これら分割した領域の少なくとも２つの領域内のそれぞれの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記領域間の相互相関演算を行うことを特徴としている。
【００２４】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記相互相関演算手段は、前記測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を単一または複数の統計値に一旦変換し、これらの統計値を用いて相互相関演算を行うことを特徴としている。
【００２５】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記光走査手段は、前記試料の画像取得の走査系を兼ねることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分光分析装置。
【００２６】
請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載の発明において、光走査手段は、測定点の数に応じて走査パターンを変更することを特徴としている。
【００２７】
この結果、本発明によれば、共通に設けられた光学系の光走査手段により複数の測定点の蛍光強度情報を測定できるので、これら測定点間における相互相関解析を簡単な構成で実現できる。
【００２８】
また、本発明によれば、光走査手段を用いることにより、複数の測定点を近接して配置することが可能となり、細胞を対象とした測定に最適な効果を発揮できる。
【００２９】
さらに、本発明によれば、光走査手段の走査をループ状で繰り返し行い、複数の領域間の相互相関関数を求めることで、各領域間の相互相関の対称性の比較、解析などを行なうことができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００３１】
図１は、本発明が適用される分光分析装置の一実施の形態の概略構成を示すものである。図において、１は励起光源としてのレーザ光源で、このレーザ光源１からのレーザ光の光路には、ダイクロイックミラー２が配置されている。このダイクロイックミラー２には、励起光を反射し、励起光と比べ波長の長い蛍光を透過するような光学特性を有するものが用いられている。
【００３２】
ダイクロイックミラー２の反射光路には、光走査手段としてのＸＹスキャナー３が配置されている。ＸＹスキャナー３は、直交する２方向に光を偏向するための不図示の２枚のガルバノミラーを有し、これらのガルバノミラーによりダイクロイックミラー２で反射されるレーザ光を２次元方向に偏向するようになっている。つまり、ＸＹスキャナー３は、入射光を任意の角度だけＸ軸、Ｙ軸方向にそれぞれ偏向可能にしたもので、ここでは、後述する対物レンズ５の視野内をラスタースキャンすることもできるし、任意の一つまたは複数の測定点を順次走査したり停止させることもできるようになっている。
【００３３】
このようなＸＹスキャナー３の各種の動きは、ＸＹスキャナー駆動装置１０により制御されるようになっている。
【００３４】
ＸＹスキャナー３の反射光路には、ミラー４を介して対物レンズ５が配置されている。対物レンズ５の焦点位置には、蛍光色素で標識された試料６が配置されている。
【００３５】
一方、ダイクロイックミラー２の蛍光の透過光路には、ピンホール７を介して光検出手段としての光検出器８が配置されている。ピンホール７は、対物レンズ５の焦点位置以外からの蛍光を遮断して高い空間分解能を与えるためのものである。光検出器８は、ピンホール７を通過した蛍光の強度を検出するもので、ここでは、ＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）、ＰＭＴ（フォトマルチプライア）などが用いられている。
【００３６】
光検出器８には、相互相関演算手段としての相関解析装置９が接続されている。また、相関解析装置９には、ＸＹスキャナー駆動装置１０が接続されている。相関解析装置９は、光検出器８からの蛍光の強度信号とＸＹスキャナー駆動装置１０からの試料６上の測定地点の位置情報とを対応づけて相関演算を実行し、各測定点の間の相互相関関数を求めるようになっている。
【００３７】
相関解析装置９には、コンピュータ（ＰＣ）１１が接続されている。ＰＣ１１は、相関解析装置９での解析結果を処理し、モニタ表示などをするようになっている。
【００３８】
このような構成において、まず、装置全体の動作を簡単に説明する。
【００３９】
レーザ光源１より励起光としてのレーザ光が発せられると、レーザ光は、ダイクロイックミラー２で反射して、ＸＹスキャナー３に入射する。ＸＹスキャナー３で偏向されたレーザ光は、対物レンズ５により集光され、ＸＹスキャナー３のＸＹ偏向に対応した試料６上の位置に焦点を結ぶ。
【００４０】
この状態で、試料６中の蛍光色素が励起され、蛍光を発する。蛍光色素から発した蛍光は、対物レンズ５で補足され、逆の光路を通りダイクロイックミラー２に導かれ、ダイクロイックミラー２を透過してピンホール７に入射される。
【００４１】
ピンホール７では、対物レンズ５の焦点位置以外からの蛍光を遮断し、ピンホール７を通過した蛍光のみが光検出器８に入射する。
【００４２】
光検出器８で光電変換された蛍光の強度信号は、相関解析装置９に入力される。相関解析装置９は、光検出器８からの蛍光の強度信号とＸＹスキャナー駆動装置１０からの試料６上の測定点の位置情報とを対応づけた相関演算を実行し、測定点の間の相互相関関数を求める。
【００４３】
次に、相関解析装置９での相互相関演算を説明する。ここでは、試料６上の２つの測定地点を繰返し走査して、それぞれの測定地点での蛍光強度を検出する場合について説明を行う。
【００４４】
この場合、ＸＹスキャナー３は、図２に示すように、一方の測定地点Ａで一定時間（ｔｗ）、例えば１ｍｓ停止し、その後、次の測定地点Ｂに移動して、この測定地点Ｂで一定時間（ｔｗ）、例えば１ｍｓ停止し、その後、測定地点Ａに戻るようになっており、このような動作を繰返し走査するようになっている。
【００４５】
このときの時間と位置の関係を模式的に表したものが図３であり、時間ｔとともに、測定点が測定地点ＡとＢを交互に移動しながら、それぞれの測定地点Ａ、Ｂでの蛍光強度が測定される。このため、光検出器８から出力される信号は、図４に示すように測定地点Ａで測定される蛍光強度信号ＡＳと測定地点Ｂで測定される蛍光強度信号ＢＳの他に、測定地点Ａから測定地点Ｂに移動するまでの間の無効信号Ｃが混じったものになる。
【００４６】
相関解析装置９には、これら測定地点Ａの蛍光強度信号ＡＳと測定地点Ｂの蛍光強度信号ＢＳの他、無効信号Ｃが混入したものが入力信号とし与えられる。そして、蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳと測定地点Ａ、Ｂの位置情報（ＸＹスキャナー駆動装置１０によるＸＹスキャナー３の測定地点Ａ、Ｂでの位置情報）とを対応づけた相関演算を行うことにより、２点間相互相関関数を求めることになる。
【００４７】
この場合、２点間相互相関関数を求める方法として、第１の方法を図５に従い説明する。
【００４８】
この第１の方法では、測定地点Ａの蛍光強度信号ＡＳからτだけ時間が経過した所に測定地点Ｂからの蛍光強度信号ＢＳが存在することから、この時間τを経過した範囲について、部分的に集積演算することによって２点間相互相関関数を求めるようにしている。この場合、測定地点Ａ、Ｂでの測定時間をｔｗ、測定地点Ａから測定地点Ｂに移動するまでの無効信号Ｃを有する無効時間をｔｖ、測定周期をｔｃで表すと、時間τの最小値は、無効時間ｔｖで、測定地点Ａの蛍光強度信号ＡＳの最後データと測定地点Ｂの蛍光強度信号ＢＳの最初データの間で得られる。それより大きな時間τの値は、２ｔｗ＋ｔｖまで、連続的に求まる（式３参照）。
【００４９】
さらに、それより大きな時間τは、次に測定地点Ｂの蛍光強度信号ＢＳが現れるまで存在しない。このようにして時間τは、不連続な形で得られるようになり、これを式３を含めて一般化すると式４で表される。
【００５０】
【数３】

【００５１】
さらに、式４の範囲の時間τであっても、測定地点Ａの蛍光強度信号ＡＳからτだけ時間が経過した所に測定点Ｂの蛍光強度信号ＢＳが存在する組合せは全体の一部であるので、これを満たす組み合せの範囲のみを部分集積すれば、該当する時間τに対する相互相関値を求めることができる。この部分集積についての例を式５に表す。なお、式３〜式５は、図５に対応した場合の例であり、部分的な集積の演算は、必ずしも同じ形態を取るとは限らない。
【００５２】
【数４】

【００５３】
なお、測定地点Ｂから測定地点Ａに向う方向の場合は、負のτ値とし表す。以上の方法は、時間τが無効時間ｔｖより大きな範囲でしか求めることができないが、測定事象に比べて無効時間ｔｖが十分に小さければ、事実上τ＝０と見なすことができる。
【００５４】
次に、２点間相互相関関数を求める第２の方法について説明する。この第２の方法では、測定地点Ａ、Ｂにおいて、それぞれ時間ｔｗ内で取得される蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳ（蛍光強度値）を単一または複数の統計値に一旦変換し、これらの統計値を用いて相関関数を演算するようにしている。この場合の統計値としては、図６に示すように各時間ｔｗ内で取得される各測定地点Ａ、Ｂの蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳの平均値が用いられている。また、演算例としては、式６で表わされる。
【００５５】
【数５】

ここでの時間τの最小値はｔｃとなり、以後、この整数倍で離散的に与えられる。
【００５６】
このような第２の方法は、第１の方法に比べると最小のτ値が大きくなるが、ｔｃが測定事象に比べ十分に小さい場合には、事実上τ＝０と見なすことができる。また、この第２の方法は、集積演算数が少なく演算の高速化に適している。また、蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳを取得する時間ｔｗの間だけ、不図示のゲートを開けて、光検出器からの出力をカウントし、その値を直接相関演算に用いればよいため、装置の構成を簡単にできるという利点も有する。
【００５７】
上述では、統計値として平均値を用いたが、平均値に限らない。例えば、蛍光強度の積分値またはフォトンカウントの総和を用いてもよい。さらに時間に対して重みづけをした平均を用いたり、あるいは、しきい値を越えた値のみ選別して使用するなどの統計処理を行なうことにより、Ｓ／Ｎ比を向上することが可能である。
【００５８】
従って、このようにすれば、ＸＹスキャナー３により複数の測定地点Ａ、Ｂを交互に移動しながら、それぞれの測定地点Ａ、Ｂでの蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳを光検出器８により測定し、これらの蛍光強度信号ＡＳ、ＢＳをＸＹスキャナー３の測定地点Ａ、Ｂでの位置情報と関連づけて測定地点Ａ、Ｂ間の相互相関演算を行うようにしたので、共通に設けられた光学系、ここでは、一つの光学系により複数の測定点間に於ける相互相関解析を行うことができる。これにより、装置の構成の簡単化を実現でき、装置の小型化とともに、価格的にも安価な装置を実現できる。
【００５９】
また、ＸＹスキャナー３によるＸＹ方向の走査により試料６上の測定点を設定しているので、複数の測定点を近接して配置することも可能となり、このことは、特に試料６として細胞を対象とした測定には、生きたまま迅速に結果が得られたり、走査長が所望の地点間距離に応じた長さに設定されるので、無駄なデータが最小限になって、解析の精度が向上するなど、生体分子の解析にとって最適な効果を発揮できる。
【００６０】
なお、上述した実施の形態では、測定地点が２点（１次元）の場合について述べたが、測定地点の数は３点でも、またそれ以上の場合（２次元または３次元）であっても構わない。なお、測定地点が３点以上の場合には、全ての点を最短で通過し終える経路に設定するようにプログラムを設計するのが好ましい。
【００６１】
また、上述した実施の形態では、各測定値点でＸＹスキャナー３の走査を一時停止して蛍光強度信号を測定するようにしたが、常に動かしながら（走査しながら）、蛍光強度信号を測定し、特定の位置に対してのみ相関演算を行なうようにしてもよい。
【００６２】
さらに、ＸＹスキャナー３の停止時にリンギングが大きいような場合は、目的位置に停止後、リンギングが収まってから蛍光強度信号を測定するようにしてもよい。
【００６３】
（変形例１）
測定事象が高速のため走査によって生じるτの時間差が問題になる場合は、２つのＸＹスキャナーを用いるようにすればよい。
【００６４】
図７は、このような他のＸＹスキャナーを用いた変形例の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００６５】
この場合、図１で述べた対物レンズ５および試料６を共通にして、その他の構成を２組用意し、第１の光学系２１の第１のＸＹスキャナー２２と、第２の光学系３１の第２のＸＹスキャナー３２を同期させて走査するようにしている。
【００６６】
このようにすると、光学系は多少複雑になるが、第１のＸＹスキャナー２２と第２のＸＹスキャナー３２を同期して走査させ、例えば、図８に示すように第１のＸＹスキャナー２２により測定地点ＡとＣの間を繰返して１次元的に走査し、第２のＸＹスキャナー３２により測定地点ＢとＤの間を繰返して１次元的に走査することにより、τ＝０の相互相関値を精度よく得ることができる。
【００６７】
測定周期ｔｃや測定時間ｔｗは、固定値ではなく可変値としてもよい。図９は、測定周期ｔｃを時間とともにｍａｘからｍｉｎまでの間で可変した場合の例を示している。このようにすれば、τ値の存在しない区問を減少させることも可能となる。
【００６８】
（変形例２）
ＸＹスキャナー３の走査を閉じたループ状で繰り返して行い、このループ一周を複数の領域に分割し、これら分割した領域間で相関演算を行ってもよい。図１０（ａ）は、走査ループの形状が円形の場合で、このような円形のループの一周をＡ１、Ｂ１の２つの等しい領域に分け、これら領域Ａ１、領域Ｂ１内で取得した蛍光強度信号間で相関演算を行うようにしている。この場合の時間と位置の関係を模式的に表したものが図１１であり、領域Ａ１とＢ１を交互に通過しながら、領域Ａ１、Ｂ１内のそれぞれの測定地点での蛍光強度が測定される。なお、図１１において、ｔｗは領域Ａ１、Ｂ１での測定時間、ｔｃは測定周期である。そして、領域Ａ１、Ｂ１間の相互相関関数を求める方法としては、第２の方法を用いるとよいが、第１の方法でもよい。
【００６９】
図１０（ｂ）は、円形のループ走査を、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１の３つの等しい領域に分割した例、同図（ｃ）は、三角形のループ走査をＡ１、Ｂ１、Ｃ１の３つの等しい領域に分割した例である。このようにループ走査の形状は円形でも多角形でも構わない。また、走査パターンは、ループ以外にも一筆書きの軌跡を辿る形状でもよいし、２次元的走査でも、３次元的走査でもよい。
【００７０】
勿論、分割数は、４以上でも構わない。各領域を均等に分割すると、環境の差がなければ、各領域間の相互相関関数は対称形となる。また、分割数、地点間距離、走査形状乃至パターンを多様に組み合わせてもよい。従って、相関解析のための地点間走査は、ランダムな走査ということができる。
【００７１】
従って、このようにすれば、各領域間の相互相関の対称性を比較、解析することにより、例えば、試料６が細胞やマイクロフローセル等のような測定対象物質を溶液中に含んだ状態の生物学的試料である場合に、細胞やマイクロフローセル内部の対流、拡散、その他信号伝達の方向や速度に関する情報を得ることができる。
【００７２】
（変形例３）
蛍光強度信号の測定系は、顕微鏡画像取得系と組合わせて用いると、その効果が大きく発揮できる。特に、光学系が類似であるため、共焦点レーザー走査型顕微鏡と組合わせると一層効果が大きい。例えば、画像取得の際は、サーボ系のラスタースキャンを網羅的に実行して、画像中の複数の測定点については上述したようなランダムな走査を行なうことにより、ラスタースキャンだけで実行する場合に比べて迅速である。このことは、相関解析における複数の測定点から効率よく多くの測定値を得ることかになるので、高精度の結果につながる。この場合、図１と同一部分には同符号を付した図１２に示すように相関解析装置９の他に、画像取得用の画像処理装置１２が設けられ、これら相関解析装置９および画像処理装置１２に対し光検出器８からの蛍光強度信号を入力するようになる。そして、これら相関解析装置９および画像処理装置１２での結果は、ＰＣ１１に出力される。
【００７３】
この場合、相関解析装置９および画像処理装置１２に対し光検出器８を共通に用いているが、相関解析装置９には、アバランシェフォトダイオード、画像処理装置１２には、光電子増倍管のように別々の光検出器を用いてもよい。
【００７４】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、走査装置としてガルバノミラーを採用しているが、高速な走査装置であれば、光ファイバを振動させるなどの他の手段であってもよい。また、使用する蛍光色素は、単色でも多色でもよい。さらに測定する光強度は、上述した以外の光信号、例えば、電気化学発光、蛍光共鳴エネルギー転移などによる複数地点間の相互作用についての相関であってもよい。さらに、上述した実施の形態では、光源としてレーザ光源について述べたが、キセノンランプや水銀ランプなどを光源として用いることもできる。
【００７５】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００７６】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、共通に設けられた光学系により複数の測定地点間の相互相関解析を行うことが可能で、小型で価格的にも安価な分光分析装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の走査の様子を平面的な模式図で表した図。
【図３】第１の実施の形態の走査の時間と位置の関係を模式的に表した図。
【図４】第１の実施の形態の光検出器から出力される信号状態を示す図。
【図５】第１の実施の形態の２点間相互相関関数を求める第１の方法を説明する図。
【図６】第１の実施の形態の２点間相互相関関数を求める第２の方法を説明する図。
【図７】第１の実施の形態の変形例１の概略構成を示す図。
【図８】変形例１の走査の様子を平面的な模式図で表した図。
【図９】変形例１の測定周期を可変した場合の例を示す図。
【図１０】第１の実施の形態の変形例２のＸＹスキャナー走査を閉じたループ状で行なう場合の例を示す図。
【図１１】変形例２の光検出器から出力される信号状態を示す図。
【図１２】第１の実施の形態の変形例３の概略構成を示す図。
【図１３】従来のＦＣＳ法による測定に用いられる光学系の一例の概略構成を示す図。
【図１４】従来のＦＣＳ法による測定に用いられる光学系の他例の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ダイクロイックミラー
３…ＸＹスキャナー
４…ミラー
５…対物レンズ
６…試料
７…ピンホール
８…光検出器
９…相関解析装置
１０…ＸＹスキャナー駆動装置
１１…ＰＣ
１２…画像処理装置
２１…第１の光学系
２２…第１のＸＹスキャナー
３１…第２の光学系
３２…第２のＸＹスキャナー

Claims

光源と、
前記光源からの光を試料上に集光させる集光手段、
前記光を前記試料上で走査する光走査手段と、
前記光により発生する光強度を検出する光検出手段と、
前記光走査手段による前記光の走査にともなう前記試料上での少なくとも２つの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記測定地点間の相互相関演算を行う相互相関演算手段と
を具備したことを特徴とする分光分析装置。
前記光走査手段は、２つの測定地点を繰返し走査し、
前記相互相関演算手段は、前記２つの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記測定地点間の相互相関演算を行うことを特徴とする請求項１記載の分光分析装置。
前記光走査手段は、閉じたループ状で繰返し走査を行ない、
前記相互相関演算手段は、前記ループの一周を複数の領域に分割し、これら分割した領域の少なくとも２つの領域内のそれぞれの測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を前記光走査手段の走査位置情報と関連づけて前記領域間の相互相関演算を行うことを特徴とする請求項１記載の分光分析装置。
前記相互相関演算手段は、前記測定地点での前記光検出手段からの光強度情報を単一または複数の統計値に一旦変換し、これらの統計値を用いて相互相関演算を行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の分光分析装置。
前記光走査手段は、前記試料の画像取得の走査系を兼ねることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分光分析装置。
前記光走査手段は、測定点の数に応じて走査パターンを変更することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の分光分析装置。