DE69635521T2

DE69635521T2 - Multiphoton-lasermikroskopie

Info

Publication number: DE69635521T2
Application number: DE69635521T
Authority: DE
Inventors: W. Watt WEBB; Chris Xu
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-18
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-09-19
Also published as: NZ318277A; EP0852716A1; EP0852716A4; CA2231222C; CA2231222A1; JPH10512959A; JP2002139436A; NO981032L; DE69635521D1; DE852716T1; US6166385A; EP0852716B1; WO1997011355A1; JP2006106004A; NO981032D0; AU6972496A; US6344653B1; AU700560B2

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Lasermikroskopieverfahren, das eine Molekülanregung in einem Targetmaterial durch simultane Absorption von drei oder mehr Photonen hervorruft. Die Erfindung ist eine Verbesserung gegenüber dem in US-A-5 034 613 von Denk et al. (nachstehend als '613-Patent bezeichnet) offenbarten Zweiphotonen-Lasermikroskopieverfahren.
US-A-5 034 613 offenbart ein Laserrastermikroskop, das eine Molekülanregung in einem Targetmaterial durch simultane Absorption von zwei Photonen hervorruft, um eine immanente dreidimensionale Auflösung bereitzustellen. Fluorophore mit Einzelphoton-Anregung im kurzwelligen (ultravioletten oder sichtbaren) Bereich werden durch einen Strom stark fokussierter Subpicosekunden-Laserlichtimpulse im relativ langwelligen (roten oder infraroten) Bereich angeregt. Die Fluorophore absorbieren etwa bei der halben Laserwellenlänge und erzeugen Fluoreszenzbilder von lebenden Zellen und anderen mikroskopischen Objekten. Die Fluoreszenzemission von den Fluorophoren nimmt quadratisch mit der Anregungsintensität zu, so daß Laserlicht, Fluoreszenz und Photobleichung durch Fokussieren auf die Nähe der Brennebene beschränkt werden. Dieses Merkmal liefert eine Schärfentiefe-Auflösung, die mit der durch konfokale Laserrastermikroskope erzeugten vergleichbar ist, und vermindert außerdem die Photobleichung. Die rasterartige Führung des Laserstrahls durch ein Laserrastermikroskop ermöglicht den Aufbau von Bildern durch Erfassung von Fluoreszenz mit Zweiphotonenanregung von jedem Punkt in dem abgetasteten Objekt, wobei die Bedingung einer sehr hohen Anregungsintensität, die man durch Fokussieren des Laserstrahls und durch Impulsdauerkompression des Strahls erhält, noch erfüllt wird. Die fokussierten Impulse sorgen außerdem für eine dreidimensionale räumlich aufgelöste Photochemie, die bei der photolytischen Freisetzung von sog. Caged-Effektormolekülen besonders nützlich ist.
Ein Nachteil des in US-A-5 034 613 offenbarten Zweiphotonen-Lasermikroskopieverfahrens ist, daß seine Anwendungen durch die verfügbare Lasertechnologie beschränkt sind. Insbesondere erfordert das Zweiphotonenverfahren den Einsatz eines Lasers bei bestimmten, anwendungsabhängigen Wellenlängen so daß die Summe der Energieniveaus der beiden Photonen das besondere Energieniveau liefert, das zur Erzeugung der gewünschten Fluoreszenzemission benötigt wird. Leider würden bestimmte Lasermikroskopieanwendungen den Einsatz eines Lasers mit einer Wellenlänge erfordern, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt technologisch nicht realisierbar ist. Zum Beispiel würde die Anregung von Chromophoren, die eine sehr kurzwellige Absorption aufweisen, wie z. B. Aminosäuren und Nucleinsäuren, bei Anwendung des Zweiphotonenverfahrens einen Laser mit einer Wellenlänge von 540 nm erfordern, und ein solcher Laser existiert gegenwärtig nicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Lösung des oben erwähnten Problems durch Anwendung einer Anregung mit drei oder mehr Photonen. Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Es ist auf die Fluoreszenz-Laserrastermikroskopie und auf räumlich aufgelöste photochemische Verarbeitung anwendbar, wie z. B. die Aktivierung von Caged-Verbindungen für die Mikropharmakologie und die Vernetzung von Polymeren für die Speicherung von optischen 3D-Informationen.
Da die durch drei Photonen induzierte Fluoreszenz eine kubische Abhängigkeit von der Anregungsintensität und die Vierphotonen-Anregung eine Abhängigkeit vierten Grades aufweist, liefern beide eine intrinsische dreidimensionale Auflösung in der Laserrastermikroskopie. Obwohl diese 3D-Auflösung bereits durch das in US-A-5 034 613 offenbarte, auf Zweiphotonenanregung basierende nichtlineare Mikroskopieverfahren erreicht worden ist, bietet die Dreiphotonenanregung eine einzigartige Möglichkeit, Moleküle, die normalerweise im UV- Bereich (230–350 nm) anregbar sind, mit Nahinfrarotlicht (700–1100 nm) anzuregen. Interessante Biomoleküle, wie zum Beispiel die Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin, der Neurotransmitter Serotonin und Nucleinsäuren, weisen Maxima für Einzelphotonenanregung bei etwa 260–280 nm auf, und Fluoreszenz kann in diesen Biomolekülen durch Drei- und Vierphotonenanregung angeregt werden. Die Vorteile der Verwendung von langwelligem Nahinfrarotlicht sind eine möglicherweise geringere Photoschädigung lebender Zellen und bequem verfügbare Femtosekunden-Festkörperlaserquellen für Absorber im fernen UV-Bereich. In der Praxis kann die Konfiguration der Dreiphotonen-Laserrastermikroskopie mit den existierenden Zweiphotonensystemen identisch sein. Da jedoch Dreiphotonen- und Zweiphotonen-Absorptionsspektren im allgemeinen recht unterschiedlich sind, erweitert die Kombination der Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonen- und Drerphotonenanregung den nutzbaren Bereich der gegenwärtig in der Zweiphotonenmikroskopie verwendeten Lasersysteme.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung der Anregung mit drei oder mehr Photonen ist der Austausch von Excimerlasern für bestimmte Anwendungen, die eine Absorption von Wellenlängen von etwa 200 nm erfordern. Drei- und Vierphotonenanregung durch Laser, die viel längere Wellenlängen erzeugen (etwa 550–900 nm), dürften eine ähnliche Energieabsorption und außerdem eine räumliche 3D-Auflösung liefern. Da Excimerlaser sehr teuer und anwenderunfreundlich sind, könnte eine Anregung mit mehreren Photonen sehr wünschenswert sein.
Die Realisierbarkeit der vorgeschlagenen Dreiphotonenmikroskopie ist entscheidend von Dreiphotonenfluoreszenz-Anregungsquerschnitten verschiedener Fluorophore und Biomoleküle abhängig. Es sind jedoch sehr wenige Dreiphotonen-Absorptionsquerschnitte mitgeteilt worden. Eine einfache, auf der Störungstheorie basierende Berechnung zeigt, daß die Dreiphotonenanregung typischerweise weniger als das 10-fache der Maximalintensität benötigen würde, die gegenwärtig bei dem Zweiphotonenanregungsverfahren verwendet wird, um ein vergleichbares Anregungsniveau zu erzielen. Dieses erforderliche Intensitätsniveau ist leicht durch Femtosekunden-Laserquellen zugänglich, wie zum Beispiel den modengekoppelten Ti:Saphir-Laser. Durch drei Photonen induzierte Fluoreszenz von Tryptophan und Serotonin sind bei Anregungswellenlängen zwischen etwa 800 und 900 nm unter Verwendung eines modengekoppelten Ti:Saphir-Lasers beobachtet worden. Die gemessene Fluoreszenz gehorcht einer erwarteten kubischen Abhängigkeit von der Anregungsintensität. Messungen der Fluoreszenzleistung des Calcium-Indikatorfarbstoffs Fura II bei einer Anregungswellenlänge (etwa 911 nm) weit unter dem erwarteten Optimum für Dreiphotonenanregung zeigten, daß zufriedenstellende Fluoreszenzbilder beim nur etwa 5-fachen Wert der Laserleistung erreichbar wäre, die für Zweiphotonenanregung von Fura II bei dessen optimaler Anregungswellenlänge (etwa 730 nm) erforderlich ist. Der nach diesen vorläufigen Ergebnissen geschätzte Anregungsquerschnitt der Dreiphotonenfluoreszenz zeigt, daß Dreiphotonen-Laserrastermikroskopie mit einem vernünftigen Anregungsleistungsniveau ausgeführt werden kann. Wie breit anwendbar dieses Verfahren sein wird, bleibt noch festzustellen. Vierphotonenanregung ist unter Umständen durch das Einsetzen einer starken Einzelphotonenabsorption durch Wasser oberhalb etwa 1000 nm beschränkt.
Untersuchungen der Molekülanregung von Fluoreszenz durch Prozesse mit drei oder mehr Photonen sind selten, da erwartet wurde, daß die Anregungsquerschnitte ziemlich klein sind. Daher erfordern brauchbare Anregungsraten gewöhnlich sehr hohe momentane Beleuchtungsstärken. Eine einfache Extrapolation von Mehrphotonenquerschnitten wird durch die Struktur von Matrixelement-Produkten in den störungstheoretischen Lösungen der Quantenmechanik der Dipolübergangswahrscheinlichkeit für Molekülanregung durch ein Strahlungsfeld nahegelegt. Grundsätzlich erfordern die Mehrphotonenprozesse die gleichzeitige (innerhalb eines durch die Lebensdauern der Zwischenzustände festgelegten Zeitintervalls δτ~10^–16s erfolgende) Wechselwirkung von drei oder mehr Photonen mit dem Molekül (innerhalb der Querschnittsfläche eines Moleküls, A~10^–16 cm²). Diese kurze Koinzidenzzeit ist durch die großen Energieunsicherheiten beschränkt, die durch die Energie-Nenner der Störungstheorie eingebracht werden.
Fluoreszenzanregung durch mehrere Photonen erhöht die Auflösung der Lasermikroskopie nicht wesentlich, da die längere Anregungswellenlänge (für einen gegebenen Fluorophor) die Auflösung um annähernd so viel vermindert, wie sie durch Erheben der Einzelphoton-Punktverwaschungsfunktion in die n-te Potenz für Mehrphotonenprozesse erhöht wird. Ohne die Wellenlängenfaktoren wäre die Zunahme der Auflösung bei Dreiphotonenanregung im wesentlichen die gleiche, wie sie durch Hinzufügen eines idealen konfokalen räumlichen Filters zur Zweiphotonenmikroskopie erreicht wird.
Jüngste Berichte über unerwartet hohe Dreiphotonenquerschnitte sind im Verlauf von Untersuchungen gefunden worden, die auf eine Verbesserung der optischen Grenzabsorption gerichtet waren (die veränderliche Tönungen zum Schutz des menschlichen Sehvermögens gegen zu helle Lichtblitze liefern soll). In letzter Zeit ist über einen Dreiphotonenabsorptionsquerschnitt von etwa 10^–75 cm⁶s² für die Absorption und Fluoreszenz von 2,5-Benzothiazo-3,4-didecyloxythiophen in Tetrahydrofuran berichtet worden. Ein weiteres, kürzlich durchgeführtes Experiment zeigt die Dreiphotonenanregung von Fluoreszenz von einem konjugierten organischen Polymer. Dieser Prozeß scheint jedoch zwei Anregungszustände zu beinhalten, im Unterschied zu den meisten Fluoreszenzanregungen. Obwohl die Bedingungen dieser Experimente für Fluoreszenz-Laserrastermikroskopie oder für den größten Teil der Mikrophotochemie kaum geeignet sind, sind die großen Querschnitte vielversprechend. Zu beachten ist jedoch, daß so große Querschnitte für die Drei- oder Mehrphotonenmikroskopie nicht wesentlich sind.
Die Abhängigkeit der Photoschädigungsrate lebender Zellen von der Anregungswellenlänge bei der Fluoreszenzmikroskopie und der Photomikropharmakologie ist weitgehend unbekannt und kann für verschiedene Anwendungen stark variieren. Empirische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Zweiphotonenanregung bei vergleichbarer Fluoreszenzbilderfassung eine viel geringere Schädigung hervorruft. als die Einzelphotonenanregung. Es ist nicht klar, ob durch den Übergang zur Drei- oder Vierphotonenanregung eine weitere Verbesserung erreicht werden kann. Denkbar ist, daß mit Hilfe dieses Wissens und der Kennt nis der nichtlinearen Absorptionsspektren in Zukunft für jedes individuelle System der optimale Anregungsmodus ermittelt und genutzt werden kann. Eine besonders verlockende Möglichkeit ist die Verwendung einer Laserwellenlänge zur Einleitung photochemischer Vorgänge durch Dreiphotonenanregung und zur gleichzeitigen Zweiphotonenanregung eines begleitenden Fluoreszenzsignals. Die Dreiphotonenanregung wird sehr wahrscheinlich eine brauchbare Verbesserung des existierenden Zweiphotonenanregungsverfahrens werden, dieses Verfahren aber wahrscheinlich nicht ersetzen.
Alternativ kann für mikroskopische photochemische Aktivierung, Photoablation und optische Chirurgie die Photoanregung vorteilhaft durch Mehrphotonenanregung von intrinsischen Chromophoren oder sogar zugesetzten Chromophoren mit sehr kurzwelliger Absorption erreicht werden, wie zum Beispiel von Aminosäuren und Nucleinsäuren. Mehrphotonenanregung ermöglicht die Auswahl von mehr verfügbaren Lasern, die Subpicosekundenimpulse bei langen Wellenlängen liefern, und die Übertragung von langwelligem Licht zu dem mikroskopischen Fokalvolumen, wo die Photoanregung gewünscht wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorstehenden und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden. Dabei zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Laserrastermikroskops, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung genutzt wird;
die 2 und 3 Diagramme der mittleren Fluoreszenzintensität als Funktion der angelegten maximalen Laserflußdichte, die man durch Anwendung der Dreiphotonenanregung von Fura-2 bzw. Indo-1 erhält.
Beste Ausführungsart der Erfindung
In der nun folgenden ausführlichen Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht 1 in schematischer Form ein herkömmliches La serrastermikroskop 10, das drei Nachweisalternativen aufweist. Eine Subpicosekunden-Impulslaserquelle 12 liefert die notwendige Anregung eines Probe- oder Targetmaterials 14 das auf einem beweglichen Objekttisch oder einem anderen geeigneten Träger 15 angeordnet ist. Das Laser 12 kann beispielsweise ein modengekoppelter Stoßimpuls- oder Kollisionsimpuls-Farbstofflaser oder ein Festkörperlaser sein, der Lichtimpulse mit einer Wellenlänge im roten Spektralbereich erzeugen kann, zum Beispiel bei etwa 630 nm, wobei die Impulse eine Dauer von weniger als 100 fs (1 fs = 10^–15 s) bei einer Impulsfolgefrequenz von 80 MHz aufweisen. Es können auch andere helle Impulslaser verwendet werden, um Licht bei verschiedenen relativ langen Wellenlängen im infraroten oder sichtbaren roten Spektralbereich zu erzeugen, zum Beispiel um die notwendigen Anregungsphotonenenergien zu erzeugen, deren Summe gleich der gleich dem geeigneten, für die Fluorophore in der Probe erforderlichen Absorptionsenergieband ist. Bei einem Einzelphoton-Anregungsverfahren werden diese Fluorophore durch Absorption eines einzelnen Photons in dem Spektralbereich mit Wellenlängen angeregt, die etwa ein Drittel oder ein Viertel der Wellenlänge des einfallenden Lichts für Drei- bzw. Vierphotonenanregung betragen. Daher würden beispielsweise drei Photonen im sichtbaren roten Bereich bei 945 nm zusammen einen Fluorophor anregen, der normalerweise Licht im ultravioletten Bereich bei 315 nm absorbiert, während drei Photonen bei 1070 nm ein Molekül anregen würden, das bei 357 nm im sichtbaren Lichtbereich absorbiert.
In einer modifizierten Form der Erfindung kann der Laser 12 mit einer Wellenlänge durch zwei oder mehrere Laserquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen ausgetauscht werden, so daß der einfallende Lichtstrahl aus zwei oder mehreren überlagerten Impulslichtstrahlen mit hoher Momentanleistung und unterschiedlichen Wellenlängen besteht. Die Wellenlängen des einfallenden Strahls werden so ausgewählt, daß sie einen Fluorophor anregen, der bei einer kurzen Wellenlänge absorbiert, die sich wie folgt beschreiben läßt: 1/λabs = 1/λ1 + 1/λ2 + 1/λ3 wobei λ_abs die kurze Wellenlänge des Absorbers ist und λ₁, λ₂ und λ₃ die Wellenlängen des einfallenden Laserstrahls für den Fall mit drei Wellenlängen sind.
Der Laser 12 erzeugt einen Impulsausgangsstrahl 16, der durch eine XY-Abtasteinrichtung 18 mit einem Satz von Schwingspiegeln abgelenkt und dann durch ein Okularlinsenpaar 20 und 22 und eine Objektivlinse 24 auf einen Brennpunkt oder ein Fokalvolumen 19 in der Probe 14 fokussiert wird. Die hintere Apertur der Objektivlinse ist ein Bezugspunkt für den abgelenkten Strahl, so daß unter Vernachlässigung von Aberrationen alle Punkte in der Rasterstruktur äquivalente Abbildungsbedingungen erfahren. Die Abtasteinrichtung 18 bewirkt eine Abtastung des Brennpunkts oder Fokalvolumens 19 durch das Material 14 hindurch und verursacht dadurch eine Fluoreszenzanregung des Materials 14 in oder nahe dem Brennpunkt oder Fokalvolumen 19.
Bevor der Ausgangsstrahl 16 in die XY-Abtasteinrichtung 18 gerichtet wird, erfährt er sowohl einen Dispersionsausgleich als auch eine Impulsdiagnose. Eine Komplikation der Femtosekundenimpulsbeleuchtung ist die Dispersion. Beim Durchgang durch optisch wirksame Materialien neigen kurze Impulse zur Verbreiterung wegen unterschiedlicher Frequenzkomponenten des Impulsbands, die sich innerhalb der Materialien mit unterschiedlicher Geschwindigkeit ausbreiten. Der Dispersionsausgleich für optisch wirksame Materialien ist für Impulse mit einer Dauer von mehr als 120 fs nicht wesentlich, da diese Impulse eine kleine Frequenzbandbreite (etwa 4 nm) aufweisen und daher eine geringe Verbreiterung erfahren. Bei einem 700 nm-Impuls von 70 fs Dauer findet man jedoch eine etwa 1,5-fache Verbreiterung durch eine gute Objektivlinse und eine erheblich größere Verbreiterung durch akusto-optische Modulatoren, die zur Strahlmodulation und als Blenden eingesetzt werden können. Die Impulsverbreiterung verringert die beobachtete Proportionalität der Fluoreszenz. In dem Mikroskop 10 erfolgt der Dispersionsausgleich für optisch wirksame Materialien durch einen doppelten Durchgang durch ein Paar Glasprismen 26 und 28, die das Licht so lenken, daß die höheren (im allgemeinen langsameren) Frequenzen weniger Glas durchlaufen und daher wieder auf die entsprechende Phasenverzögerung gebracht werden. Um den Rücklauf durch die Prismen 26 und 28 zu bewirken, wird ein totalreflektierender Spiegel 30 verwendet.
Für quantitative Messungen ist die Kenntnis der Wellenlänge und Impulsdauer des Anregungsstrahls notwendig, und daher werden zur Analyse des Impulsausgangsstrahls 16 verschiedene Impulsdiagnoseformen 32 bereitgestellt. Als Grobüberwachungsgerät für Wellenlänge und Impulsdauer ist ein einfacher Monochromator ausreichend, der in seiner Standardkonfiguration eine Wellenlängenmessung liefert. Wenn der Ausgangsspalt entfernt und das entstehende Spektrum auf einen Bildschirm oder einen eindimensionalen Detektor projiziert wird, kann der Impulswellenlängenbereich überwacht werden. Für eine genauere Impulsanalyse kann die Impulsdiagnoseeinrichtung 32 einen Autokorrelator aufweisen, der eine direkte, detaillierte Messung der Impulsbreite und eine Anzeige seines Phasenkohärenzprofils ermöglicht.
Das Lasermikroskop 10 weist außerdem erste, zweite und dritte dichroitische Spiegel 34, 36 und 38 auf, die zur Trennung des Fluoreszenzwegs für jede der drei Detektor-Alternativen verwendet werden. Die erste dieser Alternativen ist als entrasterte (descanned) konfokale Detektion bekannt. Bei der konfokalen Detektion wird der Fluoreszenzstrahl entrastert, um an einer Lochblende 40, die vor einem konfokalen Sekundärelektronenvervielfacher bzw. Photomultiplier (PMT) 42 angebracht ist, eine stationäre Bildebene zu erzeugen. In jeder Position in der Abtastung wird der gerade beleuchtete Punkt in der Probe scharf auf die Apertur in der Detektorebene abgebildet oder ist konfokal dazu. Zwischen der Lochblende 40 und dem ersten dichroitischen Spiegel 34 ist ein Emissionsbandfilter 44 angeordnet, um unerwünschte Frequenzen aus den erfaßten Signalen zu eliminieren.
Das zweite Detektionsverfahren ist als Nachweis in der Fourierebene bekannt, bei dem die hintere Apertur des Objektivs durch eine Linse 46 und ein Emissionsbandfilter 48 ohne Entrasterung (descanning) auf einen Fourier-Sekundärelektronenvervielfacher 50 fokussiert wird. Da die hintere A pertur ein Bezugspunkt in der Abtastung ist, ist das Fluoreszenzbild an der Photokathode stationär.
Schließlich ist das dritte Detektionsverfahren als Rasterabbildungsdetektion bekannt, wobei die gesamte Fokalebene in der Probe 14 durch ein Emissionsbandfilter 52 und eine Sammellinse 54 auf einen bildgebenden Detektor 56, wie z. B. eine CCD-Kamera, fokussiert wird, dessen Erfassungsgeschwindigkeit mit der Bildabtastzeit synchronisiert ist.
Die anfängliche Wahl des Detektionsverfahrens kann durch. eine vorhandene Mikroskopanordnung oder durch das für die konkreten geplanten Experimente notwendige Mikroskopieverfahren festgelegt sein. Jedes Detektionsszenario bietet seine eigenen besonderen Vorteile und Nachteile. Bei all diesen Detektionsszenarien wird die erfaßte Fluoreszenz durch einen geeignet beschichteten dichroitischen Spiegel ausgeblendet. Da die. Differenz zwischen Anregungs- und Emissionswellenlängen typischerweise viel größer ist als die Stokes-Verschiebung, braucht die dichroitische Beschichtung nicht den gewöhnlichen scharfen Einschnitt zwischen den Reflexions- und Transmissionsbereichen aufzuweisen. Die Emissionsfilter 44, 48 und 52 sind gewöhnlich Standardfilter, müssen allerdings auf die richtige Sperrung bei den Mehrphotonenanregungswellenlängen kontrolliert werden. Da das Verhältnis der mittleren Anregungsleistung zur Fluoreszenzleistung bei der Mehrphotonen-Lasermikroskopie höher ist als bei linearer Mikroskopie, ist ein höheres Unterdrückungsverhältnis erforderlich. Die Auswahl des Sekundärelektronenvervielfachers für einen rotunempfindlichen Photoelektronenemitter ist daher vorteilhaft.
Für Mehrphotonenanregung mit mehr als zwei Photonen, etwa mit N Photonen, läßt sich die Anzahl der pro Impuls pro Fluorophor absorbierten Photonen wie folgt ausdrücken:
wobei der vorangestellte obere Index N in Analogie zu dem oben beschriebenen Fall der Zweiphotonenanregung mit N = 2 die Anzahl der simultan absorbierten Photonen bezeichnet. Das Ver hältnis ^Nn_a/^(N–1)n_a aufeinanderfolgender Raten für den Mehrphotonenabsorptionsprozeß liefert einen brauchbaren Vergleichsparameter in der Form:
Günstige Werte der erwarteten Absorptionsquerschnitte sind in der untenstehenden Tabelle dargestellt.
Mit diesen typischen Werten der Mehrphotonenquerschnitte und der für die obige Zweiphotonenanregung beschriebenen Geräteparameter ist der Absorptionsgrad bei einer Laserleistung von etwa 3 W gleich eins. Diese gleiche Emissionsleistung ist jedoch konkret von den wellenlängenabhängigen Querschnitten abhängig. Höhere Verhältnisse ^Nδ/^N–1δ existieren für bekannte günstige Fluorophore, und weitere können in durch die vorliegende Erfindung motivierten Untersuchungen und durch andere Anwendungen der Mehrphotonenabsorption ermittelt werden. Bei Anwendungen auf biologische Zellen und Gewebe bieten die Auswahl eines Mehrphotonenanregungsprozesses höherer Ordnung und die Optimierung der Anregungswellenlänge ein Mittel, geeignete Bedingungen zur Minimierung der biologischen Photoschädigung während der Fluoreszenzmikroskopie und der mikroskopischen Aktivierung von Caged-Verbindungen auszuwählen. Für Mehrphotonen-Lasermikroskopie oder -Photochemie umfaßt die Auswahl von Mehrphotonenprozessen höherer Ordnung die Wahl verfügbarer Laserwellenlängen.
Bei Mehrphotonenanregung mit N > 2 wird die Bildauflösung gegenüber der Zweiphotonenanregung verbessert, da die Punktverwaschungsfunktion des Mikroskops, welche die Auflösung de finiert, in die N-te Potenz erhoben wird. Daher wird für die Dreiphotonenanregung die Auflösung um nahezu den gleichen Faktor weiter verbessert wie durch das Einsetzen einer infinitesimalen konfokalen Blende, wobei Wellenlängenfaktoren vernachlässigt werden, die mit zunehmenden Wellenlängen die Auflösung reduzieren.
Die 2 und 3 veranschaulichen die Fluoreszenzintensität der einfallenden Photonenflußdichte für Dreiphotonenanregung von Fura-2 bei 1,0 μm bzw. Indo-1 mit Ca bei 1,0 μm. In beiden Fällen steigt die Fluoreszenzintensität proportional zur dritten Potenz der einfallenden Photonenflußdichte, was eindeutig auf Dreiphotonenanregung in den Testmaterialien schließen läßt.
Ein weiterer Vorteil der Mehrphotonenanregung durch drei oder mehr Photonen ist, daß die vorteilhaften Eigenschaften der Zweiphotonenanregung in Prozessen höherer Ordnung weiter verstärkt werden, da mit steigenden Werten der Photonenordnung N die Abhängigkeit der außerfokalen Anregung entsprechend schrittweise höheren Potenzen N der Intensität abnimmt.
Da die Anregung mit drei oder mehr Photonen gemäß der vorliegenden Erfindung durch sichtbares oder infrarotes Licht Zugang zu Anregungsenergien bietet, die der Anregung mit einem Ultraviolett-Photon entsprechen, wird eine ganze neue Klasse von Fluorophoren und Fluoreszenzindikatoren für die dreidimensional aufgelöste Laserrastermikroskopie zugänglich. Drei- oder Mehrphotonenquerschnitte sind zwar noch nicht für viele Verbindungen bekannt, und für Drei- oder Mehrphotonenabsorption gelten unterschiedliche Auswahlregeln, aber die molekulare Asymmetrie läßt oft ungeradzahlige und geradzahlige Photonenübergänge in den gleichen angeregten Zustand zu. Es hat sich gezeigt, daß Symmetrieeffekte angeregter Zustände anscheinend die relativen Werte maximaler Absorptionsquerschnitte von ungeradzahligen und geradzahligen Photonen verschieben. Daher tritt ein Absorptionsmaximum für Zweiphotonenabsorption manchmal bei einer wesentlich kürzeren als der doppelten Wellenlänge des dominanten Absorptionsmaximums für den Einzelphotonenprozeß auf, und die Wellenlängenabhängigkeit der Dreiphoto nenabsorption kann auf eine Wellenlängenabhängigkeit ähnlich dem Dreifachen des Einzelphotonen-Falles hinauslaufen.
Gegenwärtig werden alle obigen Fluorophore routinemäßig für die Abbildung der Verteilungen fluoreszierender Markierungssubstanzen in lebenden Zellen mittels Zweiphotonenanregung genutzt. Die Dreiphotonenanregung vergleichbarer Fluoreszenzintensitäten ist mit Indo-1, FURA-2, DAPI und Darnyl erreicht worden. Die Dreiphotonenabsorptionsquerschnitte betragen annähernd ³δ ~ 2 × 10^–82 cm⁶ (S/Photon)². Drei- und Vierphotonenanregung fluoreszierender Aminosäuren in Serotonin, Norepinepherin und Tryptophan sind bei Anregung mit rotem Licht durch Einzelphotonenabsorption unterhalb 300 nm gemessen worden. Die Anwendung der Drei- und Vierphotonenanregung durch verfügbare Laser bietet eine Vorteil beim mikroanalytischen Nachweis und der Abbildung seltener Neurotransmitter und Hormone.
Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung einer mikroskopisch lokalisierten Abtragung von Gewebe oder Gewebeorganellen für deren Zerstörung oder chirurgische Entfernung. Dies wird durch Anwendung der Drei- oder Mehrphotonenabsorption entweder durch intrinsische Chromophore oder durch extrinsisch bereitgestellte Chromophore erreicht, die das Gewebe markieren und erste charakteristische Energien für die Absorption von Subpicosekunden-Laserlichtimpulsen liefern, welche die zweite charakteristische Energie liefern, die annähernd gleich einem Bruchteil, d. h. einem Drittel, einem Viertel usw. oder weniger, der ersten charakteristischen Energie ist. Alternativ können die Moleküle, welche die notwendige Fluoreszenz liefern, intrinsische Gewebe-Fluorophore sein.

Claims

Verfahren zur Mikroskopie durch Anregung mit drei oder mehr Photonen bei einem Targetmaterial (14), das Moleküle enthält, die durch ein Photon mit einer charakteristischen Energie anregbar sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Beleuchten des Materials (14) mit einem Strahl (16) von intensiven Subpicosekunden-Laserlichtimpulsen, der auftreffende Photonen mit einer niedrigeren Energie als der charakteristischen Energie aufweist, und Fokussieren der Beleuchtung auf ein Fokalvolumen innerhalb des Materials (14), um eine Beleuchtungsstärke zu erzeugen, die ausreichend hoch ist, um durch simultane Absorption von n der auftreffenden Photonen eine Molekülanregung zu bewirken, wobei n größer oder gleich drei ist und die Energiesumme der n Photonen gleich der charakteristischen Energie ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die auftreffenden Photonen eine Energie von etwa 1/n der charakteristischen Energie aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Material biologisch aktive Caged-Moleküle enthält, die bei der Molekülanregung freigesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Material Fluoreszenzmoleküle enthält, die bei der Molekülanregung fluoreszieren.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner die folgenden Schritte aufweist: rasterartige Führung des Strahls (16) durch das Material (14), um das Fokalvolumen (19) abzutasten, und Nachweis der durch das Material erzeugten Fluoreszenz.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Material (14) ein Gewebe ist und die simultane Absorption an intrinsi schen Chromophoren, extrinsisch bereitgestellten Chromophoren oder intrinsischen Fluorophoren innerhalb des Gewebes auftritt.
Vorrichtung (10) für Laserrasterfluoreszenzmikroskopie, die aufweist: eine Objekttischeinrichtung (15) und auf der Objekttischeinrichtung ein Targetmaterial (14), das eine Fluoreszenzkomponente enthält, die als Reaktion auf Anregung durch ein Photon mit der charakteristischen Energie ein Fluoreszenzphoton erzeugt; mindestens eine Quelle (12) von kohärenten Subpicosekunden-Lichtimpulsen mit auftreffenden Photonen von einer Energie, die etwa 1/n der charakteristischen Energie beträgt, wobei n größer oder gleich drei ist; eine Einrichtung (20, 22, 24) zur Fokussierung von kohärenten Lichtimpulsen auf das Targetmaterial (14), so daß das Targetmaterial gleichzeitig n auftreffende Photonen absorbiert und ein entsprechendes Fluoreszenzphoton erzeugt; eine Detektoreinrichtung (42, 50, 56) zum Nachweis des Fluoreszenzphotons; und eine Einrichtung (34, 36, 38), um das Fluoreszenzphoton zur Detektoreinrichtung zu richten.
Vorrichtung nach Anspruch 7 ferner mit einer Abtasteinrichtung (18) zum rasterartigen Ablenken der Lichtimpulse durch das Material.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Detektoreinrichtung einen konfokalen Sekundärelektronenvervielfacher (42) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Detektoreinrichtung einen Fourierebenen-Detektor (50) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Detektoreinrichtung einen abbildenden Detektor (56) aufweist.