NL8700612A

NL8700612A - Confocale laserscanning microscoop.

Info

Publication number: NL8700612A
Application number: NL8700612A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1987-03-13
Filing date: 1987-03-13
Publication date: 1988-10-03
Also published as: JPH11135U; EP0284136A1; DE3873570D1; US4863226A; JPS63298211A; ATE79476T1; DE3873570T2; ES2034154T3; JP2607804Y2; EP0284136B1

Description

* J- 1 ^ N.0. 3^292 * t

Confocale Xaserscanning microscoop

Aanvraagstser noemt als uitvinders: ing A. Draayer enP.M. Houpt 5 De uitvinding heeft betrekking op een confocale laserscanning microscoop voorzien van een laser als puntlichtbron, een deflektiestelsel voor de lijn- en beeldscanning en een lenzenstelsel, tenminste een objektief, een objekttafel, een ruimtelijk filter en een detektor samen als puntdetektor, en een elektronische stuur- en beeld-10 verwerkingsinrichting, waarbij het objekt door de lichtbundel puntge-wijs wordt afgetast en met de puntdetektor alleen daar wordt gemeten waar de puntlichtbron wordt gefocusseerd, waarbij resolutie en contrast in drie dimensies, in het bijzonder axiaal op het beeldvlak, sterk verbeteren, en waarbij een aantal dunne beeldsecties elektronisch gecombi-15 neerd kan worden tot een beeld met verhoogde scherptediepte. Een dergelijke confocale laserscanning microscoop is in de praktijk bekend.

Bij een dergelijke microscoop wordt het laserfocus-punt gescand over het stilstaande objekt of preparaat. Veelal wordt bij deze scanbeweging van het laserfocuspunt zowel voor de Üjnscanning 20 als voor de beeldscanning gebruik gemaakt van galvanometrische deflek-tie met behulp van spiegelgalvanometers. Ook wordt vaak het objekt door middel van de bewegende objekttafel gescand ten opzichte van een stilstaand laserfocuspunt. Het nadeel van dergelijke methoden om te scannen is dat zij een mechanisch karakter hebben en dus inherent traag zijn.

25 De uitvinding beoogt deze problemen te ondervangen en bij een confocale laserscanning microscoop een deflektie te realiseren die met hoge snelheid en flexibiliteit, d.w.z. met variabele scanampli-tude en diverse soorten microscopie, kan werken en die een optisch relatief eenvoudige uitvoering heeft. Door de snelle lijn- en beeldscan-30 ning is het dan mogelijk om in zeer korte tijd een aantal dunne beeldsecties te combineren tot een beeld met verhoogde scherptediepte.

Dit wordt bij een confocale laserscanning microscoop van de in de aanhef genoemde soort volgens de uitvinding aldus bereikt dat de confocale laserscanning microscoop een optische lichtweg heeft 35 die geometrisch optisch gezien zowel voor het heengaande als voor het teruggaande licht gelijk is, en hierbij het deflektiestelsel voor de snellere lijnscanning een akoesto-optische deflektor en voor de langzamere beeldscanning een andere deflektor omvat, zodanig uitgevoerd dat de scannende beweging van de teruggaande lichtbundel volledig wordt op-40 geheven zodat het teruggaande licht op het stilstaande ruimtelijke fil- 8700612 2 ter wordt gefocusseerd.

Bij een voordelige uitvoeringsvorm kan de andere de-flektor in het deflektiestelsel uit een spiegelgalvanometer bestaan.

Toepassing van een akoesto-optische deflektor is op 5 zich bij niet-confocale laserscanning microscopie bekend. Bij toepassing in confocale microscopie treden dan echter de bekende nadelen op van het dispersieve karakter en de noodzaak om meerdere lenzen te gebruiken, waardoor respectievelijk confocale microscopie met het te observeren licht van een andere golflengte dan het op het objekt inval-10 lende licht (fluorescentie e.d.) niet zonder meer mogelijk is en de storende invloed van reflekties aan oppervlakken van de gebruikte lenzen aanzienlijk is. Bovendien moeten deze van goede kwaliteit zijn om aberraties te voorkomen.

Met voordeel kan in de confocale laserscanning mi-15 croscoop volgens de uitvinding in de heengaande weg voor het objektief een kwartlabdaplaatje zijn opgenomen om de storende invloed te onderdrukken van optische reflekties in de heengaande weg die ontstaan door het gebruik van de akoesto-optische deflektor met de daaraan gekoppelde noodzaak om meerdere lenzen te gebruiken. In de weg van de gereflek-20 teerde lichtbundel dient dan een polarisatiefilter te zijn opgenomen waarvan de polarisatierichting loodrecht staat op de polarisatierich-ting van het heengaande licht. Door het kwartlabdaplaatje wordt het heengaande lineair gepolariseerde licht omgezet in circulair gepolariseerd licht. Na reflektie door het objekt valt dit circulair gepolari-25 seerd licht nogmaals door het kwartlabdaplaatje zodat dat licht lineair gepolariseerd wordt met een polarisatierichting loodrecht op die van de invallende bundel. Het in de weg van het gereflekteerde licht opgenomen polarisatiefilter laat alleen licht door met een polarisatierichting loodrecht op die van de heengaande bundel hetgeen daarna gedetekteerd 30 kan worden door de puntdetektor.

De uitvinding zal aan de hand van een uitvoerings-voorbeeld nader worden toegelicht met verwijzing naar de tekeningen, waarin:

Figuur 1 een schematisch aanzicht geeft van de opbouw 35 van de confocale laserscanning microscoop volgens de uitvinding; en

Figuur 2 een schematisch aanzicht geeft van de wijze waarop de lichtbundel op het objektief invalt.

Met verwijzing naar figuur 1 wordt het volgende toegelicht. De laserlichtbundel 1 passeert eerst een bundelexpansieoptiek 40 3, vervolgens een bundelsplitser 4, een akoesto-optische deflektor 5 8 7 0 06 12 * $ 3 6 met een planocilindrische lens 5.1 en een planokonvexe lens 5.2 zowel aan de intree- als aan de uittreezijde, een lens 6, een deflektor 7 die een spiegelgalvanometer kan zijn, een lens 8, een kwartlabdaplaatje 16, en een objektief 9. In het objektvlak 10 is een verder niet aangegeven 5 objekt geplaatst op een stilstaande objekttafel. Door het gereflekteer-de licht wordt een aan de heengaande weg identieke teruggaande weg afgelegd tot aan de bundelsplitser 4, waarna het wordt afgeplitst naar een polarisatiefilter 11, een band- of kantfilter 12, een objektief 13, een ruimtelijk filter 14, en uiteindelijk een detektor 15.

10 De genoemde expansieoptiek met expansiefaktor drie zorgt in combinatie met de overige optische elementen ervoor dat het licht de intreepupil van het objektief 9 volledig vult. De bnndelsplit-ser 4 zorgt ervoor dat het door het objekt gereflekteerde licht wordt afgescheiden van het heengaande laserlicht. De akoesto-optische deflek-15 tor 5 zorgt voor de snellere lijnscanning over het objekt, en de spiegelgalvanometer 7 zorgt voor de relatief langzamere beeldscanning over het objekt. Hierbij kan de akoesto-optische deflektor een afbuiging van de laserbundel met zodanige hoge frequentie realiseren dat deze met videosnelheid of zelfs hogere snelheid plaatsvindt.

20 De lens 6 vergroot de hoek waaronder de laserbundel door de akoesto-optische deflektor wordt afgebogen. Het focuspunt van de laserbundel komt op een zodanige plaats te liggen dat het objektief op de juiste manier wordt gebruikt. De spiegelgalvanometer 7 staat in het brandpunt van deze lens en in het middelpunt van de lens 8. Hier-25 door staat de laserbundel zowel op de spiegelgalvanometer als op de achterkant van het objektief stil, zodat op deze plaatsen alleen de hoek van inval maar niet de plaats van inval van de laserbundel verandert. Vergelijk ook figuur 2 daartoe.

Het objektief 9 focusseert de laserbundel op het ob-30 jekt, dat bijvoorbeeld een biologisch preparaat of elk ander objekt kan zijn. Het door het objekt gereflekteerde of verstrooide laserlicht volgt dezelfde optische weg terug tot aan de bundelsplitser 4. Hierna volgt het gereflekteerde licht de reeds aangegeven weg door de elementen 11, 12, 13, 14 tot in de detektor 15. De door de akoesto-optische 35 detektor en de spiegelgalvanometer geïntroduceerde scannende X-Y beweging van de laserbundel wordt op de teruggaande weg weer opgeheven zodat het gereflekteerde licht op het stilstaande ruimtelijke filter 14 (gat van twee micron) gefocusseerd wordt. Hiermede heeft de microscoop confocale eigenschappen.

40 Bij deze uitvoering Volgens de uitvinding worden de 0700012 f door de akoesto-optische deflektor in de heengaande weg geïntroduceerde storende reflekties ondervangen met behulp van een voor het objektief 9 opgenomen kwartlabdaplaatje 16 en een na de bundelsplitser opgenomen polarisatiefilter. Het heengaande lineair gepolariseerde licht wordt 5 door het plaatje 16 omgezet in circulair gepolariseerd licht waarna dit licht na reflektie nogmaals door dit kwartlabdaplaatje valt en weer wordt omgezet in lineair gepolariseerd licht met een polarisatierich-ting loodrecht op de invallende bundel. Het na de bundelsplitser opgenomen polarisatiefilter 11 staat ook ingesteld op deze polarisatierich-10 ting zodat alleen reflekties van het objekt en het objektief 9 worden gedetekteerd.

Eventueel kunnen verdere nadelige effekten veroorzaakt door het dispersieve karakter van de akoesto-optische deflektor, waardoor teruggaand licht van een andere golflengte (bijv. fluorescen-15 tie) dan het laserlicht niet meer door het ruimtelijk filter valt, worden opgevangen door het ruimtelijk filter in die gevallen te verplaatsen. Een dergelijk ruimtelijk filter kan met voordeel door drie piëzo-kristallen, elk voor een van de drie assen uit het xyz-coördinatenstel-sel, worden verplaatst.

20 Met voordeel kan een dergelijke microscoop worden toegepast voor onderzoek van fluorescerende preparaten, die zelf deze eigenschap hebben of die daartoe zijn gemerkt. Het bij lichtinval op het objekt daardoor uitgezonden licht heeft een andere golflengte dan het heengaande laserlicht. Door in de teruggaande weg een bandfilter of 25 kantfilter toe te passen dat afgestemd is op de te verwachten golflengte van het teruggaande licht kan dit selektief worden doorgelaten zodat geen storende invloed van het gereflekteerde laserlicht wordt ondervonden. Daar het licht van afwijkende golflengte in de akoesto-optische deflektor ook een andere afbuiging ondergaat, moet het ruimtelijke fil-30 ter in een andere positie worden ingesteld overeenkomstig de hoekdis-persie van de akoesto-optische deflektor.

Het is bij deze microscoop mogelijk om bijvoorbeeld 20 beelden per seconde op te bouwen bij een lijnfrequentie van 20 kHz. Dat wil zeggen dat elk beeld 1000 lijnen omvat. Bij een dergelijk aan-35 tal van 20000 lijnen per seconde, en wanneer er 1000 beeldpunten of pixels per lijn dienen te zijn, zal de detektor en de daarachtervolgen-de elektronica, die de grijswaarde van een pixel meten, tenminste een respons van maximaal 50 nanosec moeten hebben. Met voordeel kan bij een dergelijke snelle beeldopbouw door combinatie van een aantal dunne 40 beeldsecties een beeld worden opgebouwd met verhoogde scherptediepte.

fl *.? Λ t· Λ 4 rt Ö / u U D 1 4 * 5 r

In één seconde kunnen volgens bovenstaand voorbeeld 20 onder elkaar liggende secties worden gecombineerd zodat een object, dat 20 secties dik is, volledig scherp kan worden weergegeven.

Een dergelijke microscoop volgens de uitvinding kan 5 behalve in het toepassingsgebied van de biologie, ook bij forensisch onderzoek en in de micro-elektronika industrie worden toegepast. In alle gevallen is het feit, dat men bij deze microscoop niet onder vacuüm voor het objekt behoeft te werken, van groot voordeel. Tevens is deze methode non-destructief in tegenstelling tot de 10 scanningelektronenmicroscoop, waarbij de preparaten met een dunne geleidende metaallaag dienen te worden bedekt. Ook een voordeel ten opzichte van stelsels waarbij het preparaat wordt gescand, is dat bij . de microscoop volgens de uitvinding geen mechanische krachten op het preparaat worden uitgeoefend. Bij de micro-elektronika industrie kan 15 deze microscoop worden ingezet voor produktiecontrole van LSI- en VLSI-chips, de produktie van "custom design" chips en eveneens de funktionele controle van chips met behulp van de zogenaamde "optical beam induced contrast" methode.

r λ ί 9 V , v .. · Π

Claims

4

1. Confocale laserscanning microscoop voorzien van een laser als puntlichtbron, een deflektiestelsel voor de lijn- en 5 beeldscanning en een lenzenstelsel, tenminste een objektief, een objekttafel, een ruimtelijk filter en een detektor samen als puntdetek-tor, en een elektronische stuur- en beeldverwerkingsinrichting, waarbij het objekt door de lichtbundel puntgewijs wordt afgetast en met de puntdetektor alleen daar wordt gemeten waar de puntlichtbron wordt ge-10 focusseerd, waarbij resolutie en contrast in drie dimensies, in het bijzonder axiaal op het beeldvlak, sterk verbeteren, en waarbij een aantal dunne beeldsecties elektronisch worden gecombineerd worden tot een beeld met verhoogde scherptediepte, met het kenmerk, dat de confocale laserscanning microscoop een optische lichtweg heeft, 15 die geometrisch optisch gezien zowel voor het heengaande als voor het teruggaande licht gelijk is en hierbij het deflektiestelsel voor de snellere lijnscanning een akoesto-optische deflektor en voor de langzamere beeldscanning een andere deflektor omvat, zodanig uitgevoerd dat de scannende beweging van de teruggaande lichtbundel volledig wordt op-20 geheven zodat het teruggaande licht op het stilstaande ruimtelijke filter wordt gefocusseerd.

2. Confocale laserscanning microscoop volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat de andere deflektor in het deflektiestelsel uit een spiegelgalvanometer bestaat.

3. Confocale laserscanning microscoop volgens conclu sie 1, waarbij in de teruggaande lichtweg een bundelsplitser is opgenomen om de teruggaande lichtbundel af te splitsen en via een verder objektief naar de detektor te richten, met het kenmerk, dat in de heengaande lichtweg voor het objektief een kwartlabdaplaatje is 30 opgenomen en dat in de teruggaande lichtweg na de bundelsplitser een polarisatiefilter is opgenomen om de storende invloed van reflekties aan optische componenten in de heengaande lichtweg te ondervangen.

4. Confocale laserscanning microscoop volgens een der voorgaande conclusies voor toepassing bij fluorescentiemicroscopie, of 35 andere vormen van microscopie, waarbij de golflengte van het teruggaande licht verschilt van die van het heengaande licht, met het kenmerk, dat het ruimtelijke filter op drie piëzokristallen is gemonteerd en dienovereenkomstig in een xyz-coördinatenstelsel verplaatsbaar is waardoor de invloed van het dispersieve karakter van de ö / ü U Ö I L . -t v akoesto-optische deflektor op het teruggaande licht van een afwijkende golflengte, dat onder een andere hoek wordt afgebogen dan het gereflek-teerde laserlicht, wordt ondervangen en dat in de teruggaande lichtweg een overeenkomstig afgestemd band- of kantfilter is opgenomen om het 5 gereflekteerde laserlicht weg te filteren. !"(0 0 12