DE3873570T2 - Konfokales Laserabtastmikroskop. - Google Patents

Konfokales Laserabtastmikroskop.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Laserabtastmikroskop gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruches. Die Arbeitsweise von Laserabtastmikroskopen ist in dem Buch mit dem Titel "Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy" von T. Wilson und C. Sheppard, Academic Press, 1984 beschrieben.
  • Bei einem solchen Mikroskop wird der fokussierte Laserpunkt über ein feststehendes Objekt oder Präparat geführt. Im allgemeinen wird von einer galvanometrischen Ablenkung mittels eines Galvanometerspiegels bei der Abtastbewegung des fokussierten Laserpunktes sowohl für die zeilenweise Abtastung als auch für die bildweise Abtastung Gebrauch gemacht. Das Objekt wird auch oft mittels des sich bezüglich eines feststehenden fokussierten Laserpunktes bewegenden Objekttisches abgetastet. Der Nachteil solcher Abtastverfahren ist, daß sie mechanischer Natur und daher wesensgemäß langsam sind. Dies bewirkt lange Bildabtastzeiten.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Laserabtastmikroskop für konfokales Abbilden mit einer Ablenkung vorzusehen, die mit hoher Geschwindigkeit und Flexibilität arbeiten kann, d. h. mit variabler Abtastamplitude und für verschiedene Arten von konfokaler Mikroskopie, und die einen optisch relativ einfachen Aufbau aufweist. Als Folge der schnellen zeilenweisen und bildweisen Abtastung ist es dann möglich, in sehr kurzer Zeit elektronisch eine Anzahl dünner Bildausschnitte miteinander zu kombinieren, um ein Bild mit vergrößerter Tiefenschärfe zu erzeugen.
  • Dies wird bei einem Laserabtastmikroskop der eingangs erwähnten Art gemäß der Erfindung mit den im kennzeichnenden Teil des Hauptanspruches angegebenen Maßnahmen erreicht.
  • Die Verwendung einer akustooptischen Ablenkeinrichtung mit einem ihr anhaftenden kleinen Ablenkwinkel und daher einem kleinen Gesichtsfeld ist für sich für den Fall eines nicht-konfokalen Laserabtastmikroskops z. B. von AT & T Technical Journal, Bd. 65, Nr. 1, Seiten 68 bis 77 bekannt. Das in dieser AT & T Technical Journal beschriebene Mikroskop wird zur Untersuchung von Oberflächen gemusterter Halbleiterplättchen auf Teilchenverschmutzung verwendet. Es ist ein nicht-konfokales optisches System, bei dem ein Strahlteiler zwischen der ersten Ablenkeinrichtung, d. h. der akustooptischen Ablenkeinrichtung, und der zweiten Ablenkeinrichtung vorgesehen ist, um den Rückkehrlichtstrahl aufzuteilen. Um dieses optische System für konfokale Zwecke geeignet auszubilden, bei denen der Rückkehrlichtstrahl demselben optischen Weg wie der Laserlichtstrahl durch die Ablenkeinrichtung folgt, ist es erforderlich, unter dem Bragg-Winkel in die akustooptische Ablenkeinrichtung sowohl mit dem beleuchtenden als auch dem reflektierten Licht einzutreten. Diese strenge Forderung muß zum Erreichen eines hohen Wirkungsgrades und einer gleichmäßigen Ausleuchtung über das Gesichtsfeld und zum Enttasten des Laserlichtes für die konfokale Erfassung erfüllt sein. Der Fachmann in konfokaler Mikroskopie würde zahlreiche Probleme im Zusammenhang mit einer akustooptischen Ablenkeinrichtung erwarten, die einen ihr anhaftenden kleinen Ablenkwinkel und daher ein kleines Gesichtsfeld hat, wodurch die Auflösung und die Konfokalität des Systems in Mitleidenschaft gezogen wird.
  • Stufenloses Verstellen der Brennweite bzw. Zoomen bei einem solchen System ist schwierig wegen des Zylinderlinseneffektes. Auch auf das Verändern der Abtastgeschwindigkeit muß der Zylinderlinseneffekt korrigiert werden oder z. B. mechanisch beseitigt werden. Wenn davon bei der konfokalen Mikroskopie Gebrauch gemacht wird, treten die bekannten Nachteile dispersiver Natur und die Notwendigkeit der Verwendung mehrerer Linsen auf, wodurch entsprechend eine konfokale Mikroskopie, die zu beobachtendes Licht einer anderen Wellenlänge als derjenigen des auf das Objekt einfallenden Lichts (Fluoreszenz usw.) verwendet, nicht zuverlässig möglich und der Störeffekt durch Reflexionen an den Oberflächen der benutzten Linsen bei recht l ich ist. Darüber hinaus müssen letztere von guter Qualität sein, um Aberrationen zu vermeiden. Bei dem erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskop werden die genannten Probleme vermieden.
  • Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung besteht die zweite Ablenkeinrichtung des Ablenksystems aus einem Spiegelgalvanometer.
  • Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung, bei der ein Strahlteiler in den Lichtweg eingebracht ist, um den Rückkehrlichtstrahl zu teilen und auf die Detektoreinrichtung zu lenken, ist der Strahlteiler zwischen der akustooptischen Ablenkeinrichtung und der Punktlichtquelle angebracht, und das Ablenksystem mit der akustooptischen Ablenkeinrichtung und das Linsensystem sind derart aufgebaut, daß der Rückkehrlichtstrahl demselben optischen Weg folgt wie der Laserlichtstrahl bis zum Strahlteiler, wodurch die durch die akustooptische Ablenkeinrichtung bewirkte Zeilenabtastbewegung beseitigt wird, und das Ortsfilter ist nach einem weiteren Objektiv als Lochfilter angebracht, das eine Punktdetektoreinrichtung mit der nachfolgenden Detektoreinrichtung bildet.
  • Vorteilhafterweise kann bei dem erfindungsgemäßen konfokalen Laserabtastmikroskop ein Viertelwellenlängenplättchen im äußeren Lichtpfad vor dem Objektiv eingefügt sein, um den Störeffekt optischer Reflexionen in dem äußeren Weg zu unterdrücken, die durch die Verwendung der akustooptischen Ablenkeinrichtung mit der damit zusammenhängenden Notwendigkeit des Gebrauchs mehrerer Linsen verursacht werden. Ein Polarisationsfilter, dessen Polarisationsrichtung senkrecht zur Polarisationsrichtung des äußeren Lichts ist, sollte dann in den Weg des reflektierten Lichtstrahls eingefügt werden. Das äußere Linear polarisierte Licht wird in zirkular polarisiertes Licht durch das Viertelwellenlängenplättchen umgewandelt. Nach einer Reflexion durch das Objekt durchläuft das zirkular polarisierte Licht wieder das Viertelwellenlängenplättchen, so daß das Licht Linear polarisiert wird mit einer Polarisationsrichtung senkrecht zu der des Einfallsstrahls. Das in den Weg des reflektierten Lichts eingefügte Polarisationsfilter überträgt nur Licht mit einer Polarisationsrichtung senkrecht zu derjenigen des äußeren Strahls; dieses kann dann durch die Punktdetektoreinrichtung erfaßt werden.
  • Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße konfokale Laserabtastmikroskop in der Fluoreszenzmikroskopie oder anderen Formen der Mikroskopie verwendet werden, bei welchen die Wellenlänge des Rückkehrlichtstrahls von derjenigen des Laserlichtstrahls abweicht, wobei ein dichromatischer Spiegel in den Lichtweg zwischen der akustooptischen Ablenkeinrichtung und der zweiten Ablenkeinrichtung eingefügt ist, um den Rückkehrlichtstrahl mit unterschiedlichen Wellenlängen hinter der zweiten Ablenkeinrichtung abzulenken und ihn über ein weiteres Objektiv und das nachfolgende Ortsfrequenzfilter zu der folgenden Detektoreinrichtung zu lenken, wobei das nachfolgende Ortsfilter ein Schlitzfilter ist, das mit der nachfolgenden Detektoreinrichtung einen Liniendetektor bildet.
  • Die US 4 634 880 beschreibt ein konfokales Mikroskop, in dem ein Viertelwellenlängenplättchen zum Beseitigen störender Reflexionen benutzt wird.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
  • Fig. 1 eine Ansicht eines ersten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen konfokalen Laserabtastmikroskops,
  • Fig. 2 eine Ansicht, in welcher Weise der Lichtstrahl auf das Objektiv einfällt,
  • Fig. 3 eine genauere Ansicht des Ortsfilters des Mikroskops nach Fig. 1, und
  • Fig. 4 eine Ansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen konfokalen Laserabtastmikroskops.
  • Das erste Ausführungsbeispiel wird anhand der Fig. 1 erläutert. Der Laserlichtstrahl 1 durchläuft zuerst die Linsen 2 und 3, die zusammen ein optisches Strahlaufweitungssystem bilden, gefolgt von einem Strahlteiler 4, einer akustooptischen Ablenkeinrichtung 5 mit einer planzylindrischen Linse 5.1 und einer plankonvexen Linse 5.2, die sich beide an der Eingangsseite befinden, und an der Ausgangsseite mit einer Linse 6, einer Ablenkeinrichtung 7, die ein Spiegelgalvanometer sein kann, einer Linse 8, einem Viertelwellenlängenplättchen 16 und einem Objektiv 9. In der Objektebene 10 ist weiterhin ein nicht gezeigtes Objekt auf einem feststehenden Objekttisch angeordnet. Das reflektierte Licht durchläuft einen Rückkehrweg, der identisch zu dem äußeren Weg bis zu dem Strahlteiler 4 ist, wonach es aufgeteilt wird auf ein Polarisationsfilter 11, ein weiteres Objektiv 13, ein Ortsfilter 14, eine Linse 17, ein Bandpaß oder Begrenzungsfilter 12 und schließlich eine Detektoreinrichtung 15.
  • Das erwähnte optische Aufweitungssystem, das einen Aufweitungsfaktor von 3 hat, stellt in Verbindung mit den anderen optischen Elementen sicher, daß das Licht vollständig in die Eingangspupille des Objektivs 9 fällt. Der Strahlteiler 4 stellt sicher, daß das von dem Objekt reflektierte Licht von dem äußeren Laserlicht getrennt wird. Die akustooptische Ablenkeinrichtung 5 bewirkt eine schnellere zeilenweise Abtastung über das Objekt, und das Spiegelgalvanometer 7 stellt eine verhältnismäßig langsamere bildweise Abtastung über das Objekt sicher. In diesem Zusammenhang kann die akustooptische Ablenkeinrichtung eine Ablenkung des Laserstrahls mit einer derart hohen Frequenz ausführen, daß letztere mit Videogeschwindigkeit oder sogar höherer Geschwindigkeit vor sich geht.
  • Die Linse 6 vergrößert den Winkel, unter dem der Laserstrahl durch die akustooptische Ablenkeinrichtung abgelenkt wird. Der fokussierte Punkt des Laserstrahls endet in einer solchen Position, daß das Objektiv in einer korrekten Weise benutzt wird. Das Spiegelgalvanometer 7 befindet sich in dem Brennpunkt dieser Linse und dem Mittelpunkt der Linse 8. Demzufolge ist der Laserstrahl sowohl an dem Spiegelgalvanometer als auch an der rückwärtigen Seite des Objektivs feststehend, so daß an diesen Positionen nur der Eintrittswinkel aber nicht die Einfallsposition des Laserstrahls sich ändert. In diesem Zusammenhang vergleiche auch Fig. 2.
  • Das Objektiv 9 fokussiert den äußeren Laserstrahl 18 auf dem Objekt, das z. B. ein biologisches Präparat oder ein anderes Objekt sein kann. Das von dem Objekt reflektierte oder gestreute Laserlicht 19 folgt demselben optischen Weg rückwärts bis zu dem Strahlteiler 4. Danach folgt das reflektierte Licht dem schon beschriebenen Weg durch die Elemente 11, 13, 14, 17 und 12 bis zur Detektionseinrichtung 15. Die X-Y-Abtastbewegung des Laserstrahls, die durch die akustooptische Ablenkeinrichtung und das Spiegelgalvanometer bewirkt wird, wird wieder auf dem Rückkehrweg beseitigt, so daß das reflektierte Licht auf dem festgelegten Ortsfilter 14 fokussiert wird, das ein Lochfilter (2 um-Loch) ist. Dieses Filter, hinter dem sich unmittelbar die Detektoreinrichtung befindet, bildet eine Punktdetektoreinrichtung. Dadurch hat das Mikroskop konfokale Charakteristiken.
  • Bei diesem ersten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel werden die störenden Reflexionen, die in dem äußeren Strahlengang durch die akustooptische Ablenkeinrichtung verursacht werden, mittels eines vor dem Objektiv 9 eingefügten Viertelwellenlängenplättchens 16 und eines nach dem Strahlteiler eingefügten Polarisationsfilters 11 beseitigt. Das äußere linear polarisierte Licht wird in zirkular polarisiertes Licht durch das Plättchen 16 umgewandelt, wonach das Licht im Anschluß an die Reflexion wiederum durch das Viertelwellenlängenplättchen hindurch geht und wieder in linear polarisiertes Licht mit einer zum Einfallsstrahl senkrechten Polarisationsrichtung umgewandelt wird. Der hinter dem Polarisationsfilter 11 eingefügte Strahlteiler wird auch auf diese Polarisationsrichtung eingestellt, so daß nur Reflexionen von dem Objekt und dem Objektiv 9 erfaßt werden.
  • Weitere nachteilige Wirkungen, die möglicherweise durch die streuende Natur der akustooptischen Ablenkeinrichtung verursacht werden, wodurch Rückkehrlicht (z. B. Fluoreszenz) einer anderen Wellenlänge als das Laserlicht nicht mehr durch das Ortsfilter hindurch geht, werden berücksichtigt, indem das Ortsfilter 14 in diesen Fällen verstellt wird. Ein solches Ortsfilter kann vorteilhafterweise durch drei piezoelektrische Kristalle verstellt werden, jeder für eine der drei Achsen des X-Y-Z-Koordinatensystems, wie in Fig. 3 gezeigt.
  • Vorteilhafterweise kann ein solches Mikroskop zum Untersuchen fluoreszierender Präparate benutzt werden, denen diese Eigenschaft innewohnt oder die zu diesem Zweck markiert worden sind. Das infolge des auf das Objekt einfallenden Lichts emittierte Licht hat eine andere Wellenlänge als dasjenige des äußeren Laserlichts. Durch Verwendung eines Bandfilters oder Begrenzungsfilters 12 in dem Rückwärtsweg, das an die erwartete Wellenlänge des Rückwärtslichts angepaßt ist, kann letzteres selektiv übertragen werden, so daß kein Störeffekt im reflektierten Laserlicht bemerkt wird. Da das Licht unterschiedlicher Wellenlänge auch eine abweichende Ablenkung in der akustooptischen Ablenkeinrichtung 5 erfährt, muß das Ortsfilter 12 an einer anderen Position angeordnet werden, entsprechend dem Dispersionswinkel der akustooptischen Ablenkeinrichtung.
  • Fig. 4 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel. Ein dichromatischer Spiegel 20 ist in den Lichtweg zwischen der planzylindrischen Linse 5.1 und der Linse 6 eingefügt. Dieser Spiegel überträgt das (kurzwellige) Laserlicht und lenkt das langwellige Rückkehrlicht ab, das z. B. von einer Fluoreszenz herrührt. Dieses Licht wird durch eine Korrekturlinse 21 geführt und mit dem Objektiv 22 und einem speziellen Ortsfilter 23 fokussiert, welches ein Schlitzfilter (330 m · 1 m) ist, wodurch dieses System konfokale Eigenschaften hat. Auf diese Weise wird mit der nachfolgenden Linse 24 und der Detektoreinrichtung 26 eine Liniendetektoreinrichtung gebildet. Zwischen der Linse 24 und der Detektoreinrichtung 26 sind ein oder mehr Bandpaß- oder Begrenzungsfilter 25 eingefügt, die dieselbe Funktion haben wie das Bandpaß- oder Begrenzungsfilter 12. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann Rückkehrlicht, das eine andere Wellenlänge hat als das des äußeren Lichts, vorteilhaft untersucht werden, wenn die akustooptische Ablenkeinrichtung einen zu geringen Wirkungsgrad für dieses Licht hat, d. h. eine zu starke Schwächung hervorruft.
  • Mit dem Mikroskop ist es möglich, z. B. 20 Bilder pro Sekunde bei einer Zeilenfrequenz von 20 kHz zusammenzufügen. D.h., jedes Bild enthält 1.000 Zeilen. Mit einer derartigen Anzahl von 20.000 Zeilen pro Sekunde und wenn 1.000 Bildpunkte oder Pixels pro Zeile vorhanden sein sollen, müssen die Detektoreinrichtung und die nachfolgende Elektronik, die den Halbton eines Pixels messen, wenigstens eine Antwortgeschwindigkeit von nicht mehr als 50 nsec haben. Bei einem derart schnellen Bildaufbau kann ein Bild mit vergrößerter Tiefenschärfe vorteilhaft dadurch aufgebaut werden, daß eine Anzahl von dünnen Bildausschnitten miteinander verbunden werden. Gemäß dem obigen Beispiel können 20 untereinanderliegende Ausschnitte in einer Sekunde miteinander verbunden werden, so daß ein Objekt, das 20 Ausschnitte dick ist, vollkommen scharf wiedergegeben werden kann.
  • Neben der Anwendung in der Biologie kann ein solches erfindungsgemäßes Mikroskop mit einer Zeilenabtastfrequenz von beispielsweise 20-30 kHz und einer Bildabtastfrequenz von beispielsweise 90 Hz auch bei gerichtlichen Untersuchungen und in der mikroelektronischen Industrie verwendet werden. In allen Fällen ist die Tatsache von großem Vorteil, daß es nicht notwendig ist, bei der Arbeit mit dem Mikroskop das Objekt unter Vakuum vorliegen zu haben. Im Gegensatz zum Abtastelektronenmikroskop, für welches die Präparate mit einer dünnen leitenden Metallschicht bedeckt werden müssen, ist das Verfahren nicht-zerstörend. Die Tatsache, daß bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop keine mechanischen Kräfte auf das Präparat ausgeübt werden, ist ebenfalls vorteilhaft gegenüber Systemen, bei denen das Präparat abgetastet wird. In der mikroelektronischen Industrie kann das Mikroskop für die Fertigungsüberwachung von LSI und VLSI-Chips verwendet werden, die Herstellung von kundenspezifischen Chips (Custom Design Chips) und auch zur Funktionskontrolle von Chips mittels des Verfahrens des optischen-strahl-induzierten Stroms (optical beam induced current).
  • Das vorliegende Mikroskop kann auch vorteilhaft zum Untersuchen optischer Speicher verwendet werden.

Claims (5)

1. Laserabtastmikroskop mit einem Laser als Lichtquelle (1), einem Ablenksystem zum zeilen- und bildweisen Abtasten, das eine akustooptische Ablenkeinrichtung (5) für die Zeilenabtastung aufweist, einem ersten Linsensystem (5. 1; 5.2), einem Objekttisch, mindestens einem Objektiv (9) nahe dem Objekttisch zum Fokussieren des Laserstrahles (18) auf ein Objekt, einer zweiten Ablenkeinrichtung (7), die im Strahlengang zwischen der akustooptischen Ablenkeinrichtung (5) und dem Objektiv (9) für die langsamere bildweise Abtastung angeordnet ist, wobei die zweite Ablenkeinrichtung und das Objektiv so positioniert sind, daß der Rückkehrlichtstrahl (19) vom Objekt demselben Strahlengang folgt wie das auf das Objekt fokussierte Laserlicht bis einschließlich zu der zweiten Ablenkeinrichtung, einer im Rückkehrlichtstrahl hinter der zweiten Ablenkeinrichtung (7) angeordneten Detektoreinrichtung (15; 26) zum Erfassen des Rückkehrlichts vom Objekt, und einem elektronischen Steuer- und Bildverarbeitungssystem, wobei das Objekt Punkt für Punkt mit dem Laserlichtstrahl abgetastet wird und Messungen mit der Detektoreinrichtung durchgeführt werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ortsfilter (14; 23) vor der Detektoreinrichtung (15; 26) zwischen der zweiten Ablenkeinrichtung und der Detektoreinrichtung im Strahlengang von dem Objekt zu der Detektoreinrichtung angeordnet ist, um eine konfokale Abbildung zu verwirklichen, und
daß eine Linse (8) in dem Strahlengang zwischen dem Objektiv (9) und der zweiten Ablenkeinrichtung (7) angeordnet ist, um den Lichtstrahl von dem Objektiv auf die zweite Ablenkeinrichtung zu richten, wodurch die von der zweiten Ablenkeinrichtung bewirkte Bildabtastbewegung beseitigt wird, wodurch das Rückkehrlicht auf dem Ortsfilter fokussiert werden kann.
2. Laserabtastmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Ablenkeinrichtung (7) in dem Ablenksystem aus einem Spiegelgalvanometer besteht.
3. Laserabtastmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, in dem ein Strahlteiler (4) in den optischen Weg eingebracht ist, um den Rückkehrlichtstrahl zu teilen und auf die Detektoreinrichtung (15) zu richten, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (4) zwischen der akustooptischen Ablenkeinrichtung (5) und der Punktlichtquelle (1) angebracht ist und
daß das Ablenksystem mit der akustooptischen Ablenkeinrichtung (5) und dem ersten Linsensystem (5.1, 5.2) derart aufgebaut sind, daß der Rückkehrlichtstrahl demselben optischen Weg wie der Laserlichtstrahl bis zu dem Strahlteiler (4) folgt, wodurch die durch die akustooptische Ablenkeinrichtung (5) bewirkte Zeilenabtastbewegung beseitigt wird, und
daß das Ortsfilter (4) nach einem weiteren Objektiv (13) als ein Lochfilter angebracht ist, das eine Punktdetektoreinrichtung mit der nachfolgenden Detektoreinrichtung bildet.
4. Laserabtastmikroskop nach Anspruch 1 oder 2 zur Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie oder anderen Formen der Mikroskopie, in der die Wellenlänge des Rückkehrlichtstrahls (19) von derjenigen des Laserlichtstrahles (18) abweicht, wobei das Ortsfilter (14) auf drei piezoelektrischen Kristallen aufgebracht ist und demgemäß in einem 3D-Koordinatensystem bewegt werden kann, wodurch die Wirkung der dispersiven Natur der akustooptischen Ablenkeinrichtung (5) auf das Rückkehrlicht unterschiedlicher Wellenlänge, das in einem anderen Winkel abgelenkt wird als das reflektierte Laserlicht, beseitigt wird, und wobei ein entsprechend angepaßtes Bandpaß- oder Begrenzungsfilter (12) in den Rückkehrlichtweg eingebracht ist, um das reflektierte Laserlicht auszufiltern.
5. Laserabtastmikroskop nach Anspruch 1 oder 2 zur Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie oder anderen Formen der Mikroskopie, bei der die Wellenlänge des Rückkehrlichtstrahles (19) von derjenigen des Laserlichtstrahls (18) abweicht, wobei ein dichromatischer Spiegel (20) in dem Lichtweg zwischen der akustooptischen Ablenkeinrichtung (5) und der zweiten Ablenkeinrichtung (7) eingebracht ist, um den Rückkehrlichtstrahl mit unterschiedlichen Wellenlängen hinter der zweiten Ablenkeinrichtung abzulenken und ihn über ein weiteres Objektiv (22) und das nachfolgende Ortsfilter (23) zu der nachfolgenden Detektoreinrichtung (26) zu richten, wobei das nachfolgende Ortsfilter ein Schlitzfilter ist, das eine Liniendetektoreinrichtung mit der nachfolgenden Detektoreinrichtung (26) bildet.
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