DE4324681A1 - Verfahren und Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung, bei dem das Anregungslicht einer Punktlichtquelle auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt.

Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung, mit einer Punktlichtquelle, mit einem Objektiv, das das von der Punktlichtquelle kommende Anregungslicht zum Anregen des Energiezustandes auf den zu messenden Probenpunkt einer im Fokalbereich des Objektivs anordenbaren Probe fokussiert.

Ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung sind aus der Praxis bekannt. Sie finden ihre Anwendung zum Beispiel bei Mikroskopen, insbesondere aber bei Rastermikroskopen, da dort einzelne Probenpunkte abgetastet und gemessen werden. Mit einem solchen Rastermikroskop kann die Probe dreidimensional vermessen werden. Verwendet werden fluoreszierende oder phosphoreszierende Proben. Ferner können ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung zur Definition von Punkten in optischen Speichermedien verwendet werden.

Nachteilig an einer solchen Vorrichtung und einem solchen Verfahren gemäß dem Stand der Technik ist, daß die laterale Auflösung begrenzt ist, so daß eine feinere Unterteilung der Rasterung nicht sinnvoll ist.

Es ist bekannt, daß bei Rastermikroskopen die Auflösung dadurch verbessert werden kann, daß das von der Probe emittierte Licht punktförmig auf dem Detektor abgebildet wird. Dies kommt dadurch zustande, daß in diesem Fall zwei Punktabbildungsfunktionen die Abbildung im Rastermikroskop bestimmen: die Anregungspunkt- Abbildungsfunktion, welche die Intensitätsverteilung des Anregungslichts im Fokalbereich des Objektivs angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein Beleuchtungsphoton in einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs anzutreffen ist, und die Detektions- Abbildungsfunktion, welche die Abbildung des Probenlichts in den Punktdetektor angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein aus dem Fokalbereich emittiertes Photon in den Punktdetektor gelangt. Da sowohl Beleuchtung und Detektion stattfinden müssen, ist die Punktabbildungsfunktion eines konfokalen Fluoreszenz- Rastermikroskops das Produkt aus beiden Wahrscheinlichkeitsverteilungen, d. h. aus der Anregungspunkt- Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt-Abbildungsfunktion. Die Produktbildung führt zu einem etwa 40% schmaleren Hauptmaximum der konfokalen Punktabbildungsfunktion, verglichen mit einem nicht konfokal angeordneten Mikroskop. Dies entspricht einer höheren Auflösung des konfokalen Mikroskops und bewirkt die Diskriminierung aller Punkte, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung des Fokus befinden. Letzteres ist Voraussetzung für die Erstellung dreidimensionaler Bilder im Rasterverfahren.

Ferner ist es in der Optik bekannt, daß durch Verwendung einer Blende, deren mittlerer Bereich für das Einfallslicht undurchlässig ist und deren äußerer Bereich für das Einfallslicht durchlässig ist, zu einem schmaleren Hauptmaximum (superresolution) führt. Dies kommt dadurch zustande, daß eine solche Blende Licht aus dem Hauptmaximum in die Beugungsnebenmaxima verlagert. Dabei werden die Nebenmaxima aber unerwünscht hoch. Sie sind bei der Verwendung in Rastermikroskopen störend, weil sie Geister- und Schattenbilder verursachen. Der potentielle Gewinn an Auflösung wird durch die hohen Nebenmaxima stark beeinträchtigt.

Im Hinblick auf diesen Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, das gattungsgemäße Verfahren und die gattungsgemäße Vorrichtung derart zu verbessern, daß eine bessere laterale Auflösung erzielt wird.

Hinsichtlich des Verfahrens wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Energiezustand der Probe in dem Probenpunkt durch Zusammenwirken von wenigstens zwei in dem Anregungslicht enthaltenen Lichtanteilen verschiedener Wellenlängen angeregt wird und daß mindestens der Lichtanteil der einen Wellenlänge aus einem Mittenbereich eines Anregungslichtkegels herausgefiltert wird, bevor das Anregungslicht auf die Probe fokussiert wird.

Hinsichtlich der Vorrichtung wird die Aufgabe dadurch erfindungsgemäß gelöst, daß das Anregungslicht der Punktlichtquelle wenigstens zwei voneinander verschiedene Wellenlängen aufweist, die geeignet sind, durch gemeinsames Wirken den Energiezustand der Probe anzuregen, und daß zwischen der Punktlichtquelle und dem Objektiv ein Filterelement angeordnet ist, welches einen für mindestens den Lichtanteil der einen Wellenlänge des Anregungslichts undurchlässigen Mittenbereich und einen für die Lichtanteile des Anregungslichts durchlässigen Außenbereich aufweist.

Durch die erfindungsgemäße Anordnung der Punktlichtquelle mit Lichtanteilen wenigstens zweier voneinander verschiedener Wellenlängen zur Anregung des Energiezustandes der Probe durch gemeinsames Wirken, dessen Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzübergang gemessen werden soll, wird erreicht, daß an dem zu messenden Probenpunkt die Wahrscheinlichkeit der Anregung des Energiezustandes des Probenpunktes durch das Produkt der Intensität der Anteile verschiedener Wellenlängen gegeben ist. Die Punktabbildungsfunktion eines solchen Mikroskops ist durch das Produkt der fokalen Intensitätsverteilungen gegeben, die zu den Anteilen unterschiedlicher Wellenlängen gehören. Durch die Produktbildung werden Probenpunkte, die sich nicht in unmittelbarer Umgebung des Fokus befinden, diskriminiert, was eine dreidimensionale Rasterung allein mit Hilfe des Anregungslichts ermöglicht. Durch die zusätzliche Anordnung des erfindungsgemäßen Filterelements wird eine weitere Verschmälerung des Hauptmaximums erzielt. Dieser Effekt wurde bereits im Zusammenhang mit der sogenannten Superresolution beschrieben. Jedoch wird durch die erfindungsgemäße Anordnung hier zusätzlich eine Unterdrückung der störenden Nebenmaxima erzielt. Dieser Effekt kommt dadurch zustande, daß die beiden Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlänge aufgrund des Wellenlängenunterschieds fokale Intensitätsverteilungen unterschiedlicher Ausdehnung ausbilden. Somit fallen die Hauptmaxima der fokalen Intensitätsverteilungen der verschiedenen Lichtanteile zusammen, jedoch sind die störenden Nebenmaxima gegeneinander verschoben. Somit wird durch die Überlagerung der Intensitätsverteilungen das Hauptmaximum verschmälert und gleichzeitig werden die Nebenmaxima unterdrückt, da sie sich in ihrer Wirkung nicht ergänzen. Durch diese vorteilhaften erfindungsgemäßen Merkmale kann eine Verbesserung in der lateralen Auflösung von 30% erzielt werden.

Die Anregung des Energiezustandes der Probe durch Zusammenwirken von mindestens zwei Lichtanteilen unterschiedlicher Wellenlängen kann sowohl über einen Zwischenzustand, als auch in direkter Anregung (resonante oder nichtresonante Zweiphotonenabsorption) des Endzustandes erzielt werden. Gängige Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung biologischer Proben oder auch Phosphoreszenzfarbstoffe lassen sich in diesem Zweiphotonenmodus anregen.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Unteransprüchen offenbart.

Vorteilhafterweise weist die Vorrichtung ein Separationselement zum Abtrennen des von der Probe abgestrahlten Emissionslichts von dem Anregungslicht und einen Detektor zum Nachweis des Emissionslichts auf. In dieser Anordnung wird die Vorrichtung vorteilhafterweise als Mikroskop verwendet. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Definition von Punkten in optischen Speichermedien kann eine entsprechende Detektoranordnung zum Auslesen der Punkte verwendet werden, d. h. als Leseeinheit. Der übrige Teil der Vorrichtung, nämlich der gemäß Anspruch 1, bildet die Schreibeinheit für solche optischen Speichermedien. Gemäß der Erfindung werden die Punkte, die die Bits darstellen, verkleinert. Dies ist selbstverständlich bereits beim Schreibvorgang mit der Vorrichtung gemäß Anspruch 5 oder dem Verfahren gemäß Anspruch 1 der Fall.

Eine besonders gute Verbesserung in der lateralen Auflösung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhält man bei einem Wellenlängenunterschied von 20 nm der Lichtanteile.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kann der Mittenbereich des Filterelements für zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen des Anregungslichts undurchlässig sein. Hierdurch wird eine weitere Verschmälerung des Hauptmaximums ohne Entstehen von Nebenmaxima erzielt, da die die sogenannte Superresolution bewirkende Filterwirkung für zwei Wellenlängen ausgenutzt wird.

Vorteilhafterweise ist das Filterelement in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs angeordnet. Durch diese Anordnung wird erreicht, daß eine Strahlbegrenzung vermieden wird, so daß eine gleich hohe Lichtintensität beim Bewegen des Strahls in der Fokalebene gewährleistet ist. Dieser Vorteil kann erfindungsgemäß auch dadurch erreicht werden, daß das Filterelement am Ort oder in der Nähe einer zu der Eintrittspupille des Objektivs optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Mittenbereich des Filterelements die Form einer Kreisscheibe hat, an welche sich der Außenbereich anschließt. Hierbei wird die Symmetrie des Abbildungslichts am gleichförmigsten ausgenutzt. Auch ist es günstig, wenn das Filterelement derart angeordnet ist, daß die Strahlachse des Anregungslichts etwa durch den Mittelpunkt der Kreisscheibe verläuft und die Kreisscheibe unter einem Winkel von weniger als 90° schneidet. Dabei werden störende Reflexionen an dem Filterelement in den Strahlengang vermieden.

Vorteilhafterweise kann der Mittenbereich durch eine auf das Filterelement aufgebrachte dielektrische Schicht gebildet werden. Dies macht die Filterherstellung in der Praxis besonders einfach. Das Filter kann durch Aufdampfen eines dielektrischen Materials erzeugt werden. Auch kann das Filterelement günstigerweise durch ein Farbglas optischer Güte gebildet werden.

Ferner kann es vorteilhaft sein, wenn das Filterelement für das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht durchlässig ist. Dann kann die erfindungsgemäße Vorrichtung im vorteilhaften Aufbau verwendet werden, bei dem das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht mit dem Objektiv gesammelt wird (im folgenden Rückstrahlaufbau genannt). Dabei wird verhindert, daß eine Verringerung der Intensität des Emissionslichts aufgrund der Wirkung des Filterelements auftritt.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsart der Erfindung kann die Punktlichtquelle einen Laser umfassen, der Lichtanteile mindestens zweier voneinander verschiedener Wellenlängen emittiert. In diesem Fall ist der Strahlaufbau besonders einfach. Es kann beispielsweise ein Mischgaslaser verwendet werden.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsart der Erfindung kann die Punktlichtquelle mindestens zwei Laser umfassen, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Dabei kann die Punktlichtquelle ein Verbindungselement zum Zusammenführen des Lichts zweier Laser aufweisen, so daß die Strahlen der beiden Laser zuverlässig auf den gleichen Probenpunkt fokussiert werden, wodurch eine besonders günstige Intensitätsverteilung erfolgt.

Als Verbindungselement der Anregungslichtstrahlen kann günstigerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet werden, der das Licht des einen Lasers reflektiert und das Licht des anderen Lasers passieren läßt. Auch kann die Verwendung eines dichroitischen Würfels vorteilhaft sein.

Auch ist es vorteilhaft, gepulste Laser zu verwenden. Hierdurch wird eine besonders hohe Intensität in den Probenpunkten erzielt.

Die Punktlichtquelle kann vorteilhafterweise ein Fokussierungselement zum Fokussieren des zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen enthaltenden Anregungsstrahls auf eine Beleuchtungsblende umfassen. Typischerweise werden Lochblenden verwendet. Die Blende bildet den Ausgang der Punktlichtquelle.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn das Separationselement ein dichroitischer Spiegel ist. Dann kann die Anordnung in dem platzsparenden Rückstrahlaufbau verwendet werden. Es kann auch vorteilhaft sein, wenn das Separationselement mindestens ein Filter umfaßt; dies ist für einen einfachen Transmissionsaufbau der Vorrichtung günstig. Ferner kann das Separationselement eine Kombination von Farbfiltern und dielektrischen Filtern enthalten.

Auch kann der Detektor in kurzer Entfernung hinter der Probe angeordnet sein. Das ist dann besonders vorteilhaft, wenn das nachzuweisende Fluoreszenzlicht im UV-Bereich liegt, da in diesem Fall eine Strahlfokussierung sehr schwierig ist. Die Entfernung ist so bestimmt, daß wenigstens ein Separationselement, jedoch kein abbildendes optisches Element zwischen der Probe und dem Detektor angeordnet werden kann.

Ebenfalls kann es günstig sein, wenn der Detektor ein Punktdetektor ist. Dann kann vorteilhafterweise vor dem Detektor ein Fokussierungselement, z. B. ein weiteres Objektiv, angeordnet sein, welches das Emissionslicht auf eine dem Detektor vorgeschaltete Detektorblende, für welche beispielsweise eine Lochblende verwendet wird, in den Detektor fokussiert. Der Durchmesser der Blende ist vorzugsweise so groß, daß der deren Bild im Probenbereich in der Größenordnung des Airyscheibchens ist, das man bei der Wellenlänge des zu detektierenden Lichts hat. In diesem Fall ergibt sich die im Detektor registrierte Intensität aus dem Produkt der Intensitätsverteilungen der Anteile des Beleuchtungslichts unterschiedlicher Wellenlängen, die gemeinsam zum Anregen des Energiezustandes beitragen, und der Detektorpunkt- Abbildungsfunktion für das zu detektierende Emissionslicht. Somit wird eine zusätzliche Verschmälerung des Hauptmaximums und damit eine weitere Verbesserung der lateralen Auflösung erzielt.

Günstigerweise kann zwischen der Punktlichtquelle und der Probe eine Strahlrastereinrichtung (Strahlscanningeinrichtung) zum gesteuerten Abrastern der Probe mit dem Anregungslicht vorgesehen sein. Die Strahlrastereinrichtung bewirkt, daß der Anregungslichtstrahl eine Richtungsänderung erfährt, die so erfolgt, daß der Drehpunkt in der Eintrittspupille eines auf die Probe gerichteten Objektivs ruht, und der fokussierte Anregungslichtstrahl im Probenbereich eine Bewegung in der Fokalebene durchführt. In einer bevorzugten Ausführung umfaßt die Strahlrastereinheit darüberhinaus auch eine mechanische Translationseinheit, welche am beleuchtenden Objektiv angebracht ist und zur axialen Bewegung desselben dient. Damit ist ein Abrastern der gesamten Probe möglich. Die erfindungsgemäßen Vorteile können in einem typischen Rastermikroskop ausgenutzt werden. Im Rückstrahlaufbau befindet sich die Strahlrastereinrichtung günstigerweise zwischen dem Separationselement und dem Filterelement.

Erfindungsgemäß kann die Probe auf einem Positioniertisch angeordnet sein, der eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchführt.

Im folgenden ist die Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 2 die Intensitätsverteilung der Lichtanteile zweier verschiedener Wellenlängen des Anregungslichts am Probenpunkt und

Fig. 3 die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion des Anregungslichts am Probenpunkt gemäß der Erfindung (Produkt der Intensitätsverteilungen der Lichtanteile aus Fig. 2).

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Ausführungsbeispiel bezieht sich auf ein Rastermikroskop. Durch dieses Ausführungsbeispiel soll die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens als normales Mikroskop und insbesondere die Anwendung zur Definition von Punkten in optischen Speichermedien, die Bits darstellen, nicht ausgeschlossen werden.

Das Licht einer Punktlichtquelle 1 wird mittels eines Objektivs 2 auf einem Probenpunkt 3 einer Probe 4 abgebildet. In dem hier gezeigten Rückstrahlaufbau wird das von der Probe 4 emittierte Emissionslicht, das durch das Anregungslicht erzeugte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht, über ein Separationselement 5 auf einen Detektor 6 abgebildet. Als Separationselement 5 wird typischerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet. Die Lichtquelle 1 umfaßt zwei Laser 7 und 8, von welchen der Laser 7 Licht der Wellenlänge L₁ und der Laser 8 Licht der Wellenlänge L₂ emittiert, wobei L₁ ungleich L₂ ist. Ein typischer Unterschied in den Wellenlängen beträgt 20 nm. Das Licht der beiden Laser 7 und 8 wird mittels eines Verbindungselements 9, beispielsweise eines dichroitischen Spiegels, zusammengeführt und über eine Linse 10 auf eine Beleuchtungsblende 11, beispielsweise eine Lochblende, abgebildet. Dabei bildet die Beleuchtungsblende 11 den Ausgang der Punktlichtquelle 1. Als Laser 7 und 8 können gepulste Laser verwendet werden, um eine höhere Intensität zu erzielen.

Das aus der Punktlichtquelle 1 austretende Laserlicht der Wellenlängen L₁ und L₂ durchläuft, bevor es von dem Objektiv 2 auf den Probenpunkt 3 abgebildet wird, ein Filterelement 12. Das Filterelement 12 weist einen Mittenbereich 13 auf, der für die Lichtanteile einer oder beider Wellenlängen L₁, L₂ undurchlässig ist. Ferner weist das Filter 12 einen Außenbereich 14 auf, der für beide Wellenlängen L₁, L₂ durchlässig ist. Das Filterelement 12 ist in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs 2 angeordnet. Als Filterelement 12 wird ein Filter verwendet, auf das der Mittenbereich 13 durch Aufdampfen einer dielektrischen Schicht erzeugt wird oder ein Farbglas optischer Güte ist. Ferner ist der Mittenbereich 13 und der Außenbereich 14 des Filterelements 12 für das von der Probe 4 abgestrahlte Emissionslicht durchlässig. Typischerweise ist der Mittenbereich 13 kreisförmig. Die Lichtstrahlachse verläuft durch den Kreismittelpunkt und das Filter weist hinsichtlich der Strahlachse einen Neigungswinkel von ein paar Grad auf, um störende Reflexionen zu vermeiden. Vor dem Detektor 6 ist ein Filter 20 zum Abblocken des restlichen Anregungslichts vorgesehen.

Ferner ist zwischen dem dichroitischen Spiegel 5 und dem Filterelement 12 eine Strahlrastereinrichtung 16 vorgesehen, mit der die Probenpunkte 3 der Probe 4 dreidimensional abgerastert werden können. Zwischen dem dichroitischen Spiegel und der Strahlrastereinheit 16 ist eine weitere Linse 22 angeordnet, durch deren Wirkung der von der Punktlichtquelle 1 kommende Lichtstrahl parallelisiert wird. Dabei entspricht die Summe des Abstandes der Linse zu dem dichroitischen Spiegel und des Abstandes des dichroitischen Spiegels 5 zu der Beleuchtungsblende 11 der Brennweite der Linse 22.

Fig. 2 zeigt die Intensitätsverteilungen der von der Lichtquelle 1 auf den Probenpunkt 3 fokussierten Lichtanteile der Wellenlängen L₁ und L₂. Die Anregungspunkt- Abbildungsfunktion in der Fokalebene der erfindungsgemäßen Anordnung zum Anregen eines Energiezustandes durch Lichtanteile verschiedener Wellenlängen ergibt sich aus dem Produkt der Intensitätsverteilungen (hier zwei) für L₁ und L₂. Durch die Überlagerung der beiden Intensitätsverteilungen von L₁, L₂ entsteht durch die Überlagerung der zusammentreffenden Hauptmaxima in der Gesamtfunktion der Fig. 3 ein schmaleres Hauptmaximum und somit eine bessere laterale Auflösung der Vorrichtung. Aufgrund der verschiedenen Wellenlängen in Fig. 2 fallen die Nebenmaxima nicht übereinander, so daß sich die von dem Filterelement herrührenden Nebenmaxima nicht in ihrer Wirkung ergänzen und die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion außerhalb des Hauptmaximums kleine oder verschwindende Werte aufweist. Wie man Fig. 3 entnimmt, sind die störenden Nebenmaxima unterdrückt. Mit Hilfe einer solchen Anregungspunkt- Abbildungsfunktion erhält man einen effektiven Fokus des Rastermikroskops, der in der Fokalebene schmaler ist und durch Detektion des Emissionslichts im Detektor 6 eine höher auflösende Abbildung der Probe 4 erlaubt.

Um eine weitere Verbesserung der Auflösung zu erzielen, ist vor dem Detektor 6 ein in der Figur nicht dargestelltes Fokussierungselement, etwa ein weiteres Objektiv, angeordnet, welches das Emissionslicht der Probe 4 über eine ebenfalls nicht dargestellte Detektorblende in den Detektor 6 fokussiert. Überlicherweise wird als Detektorblende eine Lochblende verwendet, oder die Öffnung des Detektors dient als Blende, wobei der Durchmesser der Blende so groß ist, daß ihr Bild im Probenbereich in der Größenordnung des ersten Hauptmaximums der Punktabbildungsfunktion des Fokussierungselements zur Fokussierung des Emissionslichts ist. Als Detektor 6 wird ein Photomultiplier oder ein Halbleiterdetektor benutzt. Aufgrund der Punktabbildung des Probenpunktes 3 auf den Detektor 6 wird der Intensitätsverteilung aus Fig. 3 eine Detektionspunkt- Abbildungsfunktion überlagert, welche zu einer weiteren Verschmälerung des Hauptmaximums führt. Somit kann insgesamt eine Verbesserung der Auflösung um 30 bis 40% im Vergleich zu herkömmlichen Vorrichtungen erzielt werden.

Ferner ist im Strahlengang zwischen dem Spiegel 5 und dem Filterelement 12 eine Strahlrastereinrichtung 16 angeordnet. Damit kann der Anregungslichtstrahl über die Probe 4 gelenkt werden, so daß weitere Probenpunkte 3′ gemessen werden können.

Damit entspricht die erfindungsgemäße Vorrichtung einem Rastermikroskop mit einer erheblichen Verbesserung der lateralen Auflösung.

Es sei darauf hingewiesen, daß das in der Fig. 1 dargestellte Ausführungsbeispiel keine Einschränkung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist. Beispielsweise ist es möglich, anstelle der beiden Laser 7 und 8 und dem Verbindungselement 9 nur einen Laser zu verwenden, etwa einen Mischgaslaser, welcher die Wellenlängen L₁, L₂ emittiert.

Ferner kann statt dem Rückstrahlaufbau eine Transmissionsanordnung verwendet werden, bei welcher der Spiegel 5 durch ein Filter ersetzt wird, welches hinter der Probe 4 angeordnet ist, wobei der Detektor 6 hinter dem Filter anzuordnen ist. Im letzteren Fall kann der Detektor 6 direkt hinter der Probe angeordnet werden. Dies ist dann vorteilhaft, wenn das Fluoreszenzlicht der Probe 4 im UV-Bereich liegt, da dann eine Strahlfokussierung schwierig ist. Bei der Transmissionsvorrichtung ist es zudem nicht erforderlich, daß das Filterelement 12 für das Emissionslicht der Probe 4 durchlässig ist.

Die Probe 4 ist auf einem Scantisch 21 befestigt, der vorzugsweise eine Mikroskoppositionierung der Probe 4 in axialer Richtung und damit ein axiales Rastern erlaubt. Aufbau und Justierung des Rastermikroskops erfolgt, soweit nicht explizit beschrieben, auf dem Fachmann bekannte Art und Weise.

Im folgenden wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Die Probe 4 und die Laser 7 und 8 werden so ausgewählt, daß Photonen aus beiden Lasern 7 und 8 und damit Photonen unterschiedlicher Wellenlänge, zusammenwirken, um einen energetisch angeregten Zustand der Probe 4 zu erreichen. Dabei ist die Summe der Energien von einem Photon aus dem einen Laser 7 und einem Photon aus dem anderen Laser 8 gleich der Anregungsenergie und in etwa gleich der Differenz zwischen dem Energiezustand vor der Anregung und im angeregten Zustand. Das infolge der Anregung emittierte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht wird gemessen. Die Probe 4 wird im Fokalbereich des Objektivs der erfindungsgemäßen Vorrichtung positioniert, wobei im Strahlengang das Filterelement 12 erfindungsgemäß angeordnet ist. Der Strahlengang wird so ausgerichtet, daß das aus der Punktlichtquelle 1 austretende Anregungslicht durch die Blende 12 verläuft und über das Objektiv 2 auf den Probenpunkt 3 abgebildet wird. Das Emissionslicht des Probenpunktes 3 wird über den dichroitischen Spiegel 5 in den Detektor 6 abgebildet. Dabei wird der Probenpunkt 3 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung gemessen. Mittels der Strahlrastereinrichtung 16 wird der Anregungslichtstrahl automatisch zu einem weiteren Probenpunkt 3′ gelenkt, dessen Emissionslicht ebenfalls in dem Detektor 6 gemessen wird. Entsprechend werden durch Steuern der Strahlrastereinheit die übrigen gewünschten Probenpunkte gemessen, so daß die gesamte Probe 4 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung gemessen wird.

Claims (28)

1. Verfahren zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung, bei dem das Anregungslicht einer Punktlichtquelle auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt, dadurch gekennzeichnet, daß der Energiezustand der Probe (4) in dem Probenpunkt (3) durch Zusammenwirken von wenigstens zwei in dem Anregungslicht enthaltenen Lichtanteilen verschiedener Wellenlängen (L₁, L₂) angeregt wird, und daß mindestens der Lichtanteil der einen Wellenlänge (L₁) aus einem Mittenbereich eines Anregungslichtkegels herausgefiltert wird, bevor das Anregungslicht auf die Probe (4) fokussiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von dem Probenpunkt (3) aufgrund der Anregung emittierte Emissionslicht aus dem Anregungslicht abgetrennt und in einem Detektor nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwei in der Wellenlänge (L₁, L₂) verschiedene Lichtanteile des Anregungslichts aus dem Anregungslichtkegel herausgefiltert werden, bevor das Anregungslicht auf die Probe (4) fokussiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der axiale Querschnitt des aus dem Anregungslichtkegel herausgefilterten Mittenbereichs (13) die Form einer Kreisscheibe hat.

5. Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung mit einer Punktlichtquelle, mit einem Objektiv, das das von der Punktlichtquelle kommende Anregungslicht zum Anregen des Energiezustands auf den zu messenden Probenpunkt einer im Fokalbereich des Objektivs anordenbaren Probe fokussiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Anregungslicht der Punktlichtquelle (1) Lichtanteile mit wenigstens zwei voneinander verschiedenen Wellenlängen (L₁, L₂) aufweist, die geeignet sind, durch gemeinsames Wirken den Energiezustand der Probe (4) anzuregen und daß zwischen der Punktlichtquelle (1) und dem Objektiv (4) ein Filterelement (12) angeordnet ist, welches einen für mindestens den Lichtanteil der einen Wellenlänge (L₁) des Anregungslichts undurchlässigen Mittenbereich (13) und einen für die Lichtanteile des Anregungslichts durchlässigen Außenbereich (14) aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Separationselement (5) zum Abtrennen des von der Probe (4) abgestrahlten Emissionslichts von dem Anregungslicht und ein Detektor zum Nachweis des Emissionslichts vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängen (L₁, L₂) der Lichtanteile sich um etwa 20 nm unterscheiden.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) des Filterelements (12) für zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen (L₁, L₂) des Anregungslichts undurchlässig ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12) am Ort oder in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs angeordnet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12) am Ort oder in der Nähe einer zu der Eintrittspupille des Objektivs optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) des Filterelements (12) die Form einer Kreisscheibe hat, an welche sich der Außenbereich (14) anschließt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12) derart angeordnet ist, daß die Strahlachse des Anregungslichts etwa durch den Mittenbereich der Kreisscheibe (13) verläuft und die Kreisscheibe (13) unter einem Winkel, der kleiner als 90° ist, schneidet.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Mittenbereich durch eine auf das Filterelement (12) aufgebrachte dielektrische Schicht oder durch ein Farbglas optischer Güte gebildet ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) und der Außenbereich (14) des Filterelements (12) für das von der Probe (4) abgestrahlte Emissionslicht durchlässig sind.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktlichtquelle (1) einen Laser (7, 8) umfaßt, der Lichtanteile mindestens zweier Wellenlängen (L₁, L₂) des Anregungslichts emittiert.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktlichtquelle (1) mindestens zwei Laser (7, 8) umfaßt, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen (L₁, L₂) emittieren.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktlichtquelle (1) ein Verbindungselement (9) zum Zusammenführen des Anregungslichts zweier Laser (7, 8) aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Verbindungselement (9) ein dichroitischer Spiegel ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß gepulste Laser (7, 8) verwendet werden.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktlichtquelle (1) ein Fokussierungselement (10) zum Fokussieren des zwei Wellenlängen (L₁, L₂) enthaltenden Anregungslichts auf eine Beleuchtungsblende (5) umfaßt.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Separationselement (5) ein dichroitischer Spiegel ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Separationselement mindestens ein Farbfilter aufweist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Separationselement eine Kombination von Farbfiltern und dielektrischen Filtern enthält.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (6) in kurzer Entfernung hinter der Probe (4) angeordnet ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (6) ein Punktdetektor ist.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Detektor (6) ein Fokussierungselement angeordnet ist, welches das Emissionslicht in den Detektor (6) fokussiert.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Lichtquelle (1) und dem Objektiv (4) eine Strahlrastereinrichtung (16) zum gesteuerten Abrastern der Probe (4) mit dem Anregungslicht vorgesehen ist.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (4) auf einem Positioniertisch angeordnet ist, der geeignet ist, eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchzuführen.