DE4324681C2 - Verfahren zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus der US 4 078 229 bekannt.

Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 5, wie ebenfalls aus der US 4 078 229 bekannt.

Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt, bei denen das Anregungslicht einer Lichtquellenanordnung auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt, finden ihre Anwendung in der Praxis z. B. bei Mikroskopen, insbesondere aber bei Rastermikroskopen, da dort einzelne Probenpunkte abgetastet und gemessen werden. Mit einem solchen Rastermikroskop kann die Probe dreidimensional vermessen werden. Verwendet werden fluoreszierende oder phosphoreszierende Proben. Ferner können solche Verfahren und solche Vorrichtungen zur Definition von Punkten in einem optischen Speichermedium verwendet werden.

Nachteilig an solchen Verfahren und solchen Vorrichtungen gemäß dem Stand der Technik ist, daß die laterale Auflösung begrenzt ist, so daß eine feinere Unterteilung der Rasterung nicht sinn­ voll ist.

Es ist bekannt, daß bei Rastermikroskopen die Auflösung dadurch verbessert werden kann, daß das von der Probe emittierte Licht punktförmig auf den Detektor abgebildet wird. Dies kommt dadurch zustande, daß in diesem Fall zwei Punktabbildungsfunktionen die Abbildung im Rastermikroskop bestimmen, nämlich die Anregungspunkt- Abbildungsfunktion, welche die Intensitätsverteilung des Anregungslichts im Fokalbereich des Objektivs angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein Beleuchtungsphoton in einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs anzutreffen ist und die Detektionspunkt- Abbildungsfunktion, welche die Abbildung des Probenlichts in den Punktdetektor angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein aus dem Fokal­ bereich emittiertes Photon in den Punktdetektor gelangt. Da sowohl Beleuchtung und Detektion stattfinden müssen, ist die Punktabbildungsfunktion eines konfokalen Fluoreszenz- Rastermikroskops das Produkt aus beiden Wahrscheinlichkeits­ verteilungen, d. h. aus der Anregungspunkt-Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt-Abbildungsfunktion. Die Produktbildung führt zu einem etwa 40% schmaleren Hauptmaximum der konfokalen Abbildungsfunktion, verglichen mit einem nichtkonfokal angeord­ neten Mikroskop. Dies entspricht einer höheren Auflösung des konfokalen Mikroskops und bewirkt die Diskriminierung aller Punkte, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung des Fokus befinden. Letzteres ist Voraussetzung für die Erstellung drei­ dimensionaler Bilder im Rasterverfahren.

Eine verbesserte dreidimensionale Auflösung weisen auch das Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach dem Oberbegriff des Anspruchs 5 auf, die aus der US 4 078 229 bekannt sind. Dort wird durch die Lichtquellenanordnung mit Lichtanteilen wenigstens zweier voneinander verschiedener Wellenlängen zur Anregung des Energiezustands der Probe durch gemeinsames Wirken, deren Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzübergang gemessen werden soll, erreicht, daß an dem zu messenden Probenpunkt die Wahrscheinlichkeit der Anregung des Energiezustands des Probenpunkts durch das Produkt der Intensität der Anteile verschiedenem Wellenlängen gegeben ist. Die Punktabbildungs­ funktion eines solchen Mikroskops ist durch das Produkt der fokalen Intensitätsverteilungen gegeben, die zu den Anteilen unterschiedlicher Wellenlängen gehören. Durch die Produktbildung werden Probenpunkte, die sich nicht in unmittelbarer Umgebung des Fokus befinden, diskriminiert, so daß eine dreidimensionale Rasterung allein mit Hilfe des Anregungslichts ermöglicht.

Ferner ist es in der Optik bekannt, daß durch Verwendung einer Blende, deren Mittenbereich für das Einfallslicht undurchlässig ist und deren Außenbereich für das Einfallslicht durchlässig ist, ein schmaleres Hauptmaximum erreicht werden kann (Super­ resolution). Dies kommt dadurch zustande, daß eine solche Blende Licht aus dem Hauptmaximum in die Beugungsnebenmaxima verlagert. Dabei werden die Nebenmaxima aber unerwünscht hoch. Sie sind bei Verwendung in Rastermikroskopen störend, weil sie Geister- und Schattenbilder verursachen. Der potentielle Gewinn an Auflösung wird durch die hohe Nebenmaxima stark beeinträchtigt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach dem Oberbegriff des Anspruchs 5 derart zu verbessern, daß eine noch höhere laterale Auflösung erzielt wird.

Diese Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens durch die Merk­ male des Anspruchs 1 und hinsichtlich der Vorrichtung durch die Merkmale des Anspruchs 5 gelöst.

Durch die zusätzliche Anordnung des erfindungsgemäßen Filter­ elements wird eine weitere Verschmälerung des Hauptmaximums erzielt. Dieser Effekt wurde bereits im Zusammenhang mit der sogenannten Superresolution beschrieben. Jedoch wird durch die erfindungsgemäße Anordnung hier zusätzlich eine Unterdrückung der störenden Nebenmaxima erzielt. Dieser Effekt kommt dadurch zustande, daß die beiden Lichtanteile unterschiedlicher Wellen­ länge aufgrund des Wellenlängenunterschieds fokale Intensitäts­ verteilungen unterschiedlicher Ausdehnung ausbilden. Somit fallen die Hauptmaxima der fokalen Intensitätsverteilungen der verschiedenen Lichtanteile zusammen, jedoch sind die störenden Nebenmaxima gegeneinander verschoben. Somit wird durch die Überlagerung der Intensitätsverteilungen das Hauptmaximum verschmälert und gleichzeitig werden die Nebenmaxima unter­ drückt, da sie dich in ihrer Wirkung nicht ergänzen. Durch diese vorteilhaften erfindungsgemäßen Merkmale kann eine Verbesserung in der lateralen Auflösung von 30% erzielt werden.

Die Anregung des Energiezustands der Probe durch Zusammenwirken von mindestens zwei Lichtanteilen unterschiedlicher Wellenlängen kann sowohl über einen Zwischenzustand, als auch in direkter Anregung (resonante oder nichtresonate Zweiphotonenabsorption) des Endzustands erzielt werden. Gängige Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung biologischer Proben oder auch Phosphoreszenzfarb­ stoffe lassen sich in diesem Zweiphotonenmodus anregen.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Unteransprüchen offenbart.

Vorteilhafterweise weist die Vorrichtung ein Separationselement zum Abtrennen des von der Probe abgestrahlten Emissionslichts von dem Anregungslicht und einen Detektor zum Nachweis des Emissionslichts auf. In dieser Anordnung wird die Vorrichtung vorteilhafterweise als Mikroskop verwendet. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Definition von Punkten in optischen Speichermedien kann eine entsprechende Detektor­ anordnung zum Auslesen der Punkte verwendet werden, d. h. als Leseeinheit. Der übrige Teil der Vorrichtung, nämlich der gemäß Anspruch 5, bildet die Schreibeinheit für solche optischen Speichermedien. Gemäß der Erfindung werden diese Punkte, die Bits darstellen, verkleinert. Dies ist selbstverständlich bereits beim Schreibvorgang mit der Vorrichtung gemäß Anspruch 5 oder dem Verfahren gemäß Anspruch 1 der Fall.

Eine besonders gute Verbesserung in der lateralen Auflösung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhält man bei einem Wellenlängenunterschied der Lichtanteile von 20 nm.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kann der Mittenbereich des Filterelements für zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen des Anregungslichts undurchlässig sein. Hierdurch wird eine weitere Verschmälerung des Haupt­ maximums ohne Entstehen von Nebenmaxima erzielt, da die die sogenannte Superresolution bewirkende Filterwirkung für zwei Wellenlängen ausgenutzt wird.

Vorteilhafterweise ist das Filterelement in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs angeordnet. Durch diese Anordnung wird erreicht, daß eine Strahlbegrenzung vermieden wird, so daß eine gleich hohe Lichtintensität beim Bewegen des Strahls in der Fokalebene gewährleistet ist. Dieser Vorteil kann erfindungs­ gemäß auch dadurch erreicht werden, daß das Filterelement am Ort oder in der Nähe einer zu der Eintrittspupille des Objektivs optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Mittenbereich des Filter­ elements die Form einer Kreisscheibe hat, an welche sich der Außenbereich anschließt. Hierbei wird die Symmetrie des Anregungslichts am gleichförmigsten ausgenutzt. Auch ist es günstig, wenn das Filterelement derart angeordnet ist, daß die Strahlachse des Anregungslichts etwa durch den Mittelpunkt der Kreisscheibe verläuft und die Kreisscheibe unter einem Winkel von weniger als 90° schneidet. Dabei werden störende Refle­ xionen an dem Filterelement in den Strahlengang vermieden.

Vorteilhafterweise kann der Mittenbereich durch eine auf das Filterelement aufgebrachte dielektrische Schicht gebildet werden. Dies macht die Filterherstellung in der Praxis besonders einfach. Das Filterelement kann durch Aufdampfen eines dielektrischen Materials erzeugt werden. Auch kann das Filterelement günstigerweise durch Farbglas optischer Güte gebildet werden.

Ferner kann es vorteilhaft sein, wenn das Filterelement für das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht durchlässig ist. Dann kann die erfindungsgemäße Vorrichtung im vorteilhaften Aufbau verwirklicht werden, bei dem das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht mit dem Objektiv gesammelt wird (im folgenden Rückstrahlaufbau genannt). Dabei wird verhindert, daß eine Verringerung der Intensität des Emissionslichts aufgrund der Wirkung des Filterelements auftritt.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Lichtquellenanordnung einen Laser umfassen, der Lichtanteile mindestens zweier voneinander verschiedener Wellenlängen emittiert. In diesem Fall ist der Strahlaufbau besonders einfach. Es kann beispielsweise ein Mischgaslaser verwendet werden.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Lichtquellenanordnung mindestens zwei Laser umfassen, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Dabei kann die Lichtquellenanordnung ein Verbindungselement zum Zusammen­ führen des Lichts zweier Laser aufweisen, so daß die Strahlen der beiden Laser zuverlässig auf den gleichen Probenpunkt fokussiert werden, wodurch ein besonders günstige Intensitäts­ verteilung erfolgt.

Als Verbindungselement der Anregungslichtstrahlen kann günstigerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet werden, der das Licht des einen Lasers reflektiert und das Licht des anderes Lasers passieren läßt. Auch kann die Verwendung eines dichroiti­ schen Würfels vorteilhaft sein.

Auch ist es vorteilhaft, gepulste Laser zu verwenden. Hierdurch wird eine besonders hohe Intensität in den Probenpunkten erzielt.

Die Lichtquellenanordnung kann vorteilhafterweise ein Fokussier­ element zum Fokussieren des zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen enthaltenden Anregungslichts auf eine Beleuchtungs­ blende umfassen. Typischerweise werden Lochblenden verwendet. Die Blende bildet den Ausgang der Lichtquellenanordnung.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn das Separationselement ein dichroitischer Spiegel ist. Dann kann die Anordnung in dem platzsparenden Rückstrahlaufbau verwendet werden. Es kann auch vorteilhaft sein, wenn das Separationselement mindestens ein Filter umfaßt; dies ist für einen einfachen Transmissionsaufbau der Vorrichtung günstig. Ferner kann das Separationselement eine Kombination von Farbfiltern und dielektrischen Filtern enthalten.

Auch kann der Detektor in kurzer Entfernung hinter der Probe angeordnet sein. Das ist besonders vorteilhaft, wenn das nachzuweisende Fluoreszenzlicht im UV-Bereich liegt, da in diesem Fall eine Strahlfokussierung sehr schwierig ist. Die Entfernung ist so bestimmt, daß wenigstens ein Separations­ element, jedoch kein abbildendes optisches Element zwischen der Probe und dem Detektor angeordnet werden kann.

Ebenfalls kann es günstig sein, wenn der Detektor ein Punkt­ detektor ist. Dann kann vorteilhafterweise vor dem Detektor ein Fokussierelement, z. B. ein weiteres Objektiv, angeordnet sein, welches das Emissionslicht auf eine dem Detektor vorgeschaltete Detektorblende, für welche beispielsweise eine Lochblende verwendet wird, in den Detektor fokussiert. Der Durchmesser der Blende ist vorzugsweise so groß, daß deren Bild im Probenbereich von der Größenordnung des Airyscheibchens ist, das bei der Wellenlänge des zu detektierenden Lichts auftritt. In diesem Fall ergibt sich die im Detektor registrierte Intensität aus dem Produkt der Intensitätsverteilungen der Anteile des Beleuch­ tungslichts unterschiedlicher Wellenlängen, die gemeinsam zum Anregen des Energiezustands beitragen, und der Detektorpunkt- Abbildungsfunktion für das zu detektierende Emissionslicht. Somit wird eine zusätzliche Verschmälerung des Hauptmaximums und damit eine weitere Verbesserung der lateralen Auflösung erzielt.

Günstigerweise kann zwischen der Lichtquellenanordnung und der Probe eine Strahlrastereinrichtung (Strahlscanningeinrichtung) zum gesteuerten Abrastern der Probe mit dem Anregungslicht vorgesehen sein. Die Strahlrastereinrichtung bewirkt, daß der Anregungslichtstrahl eine Richtungsänderung erfährt, die so erfolgt, daß der Drehpunkt in der Eintrittspupille eines auf die Probe gerichteten Objektivs ruht, und der fokussierte Anregungs­ lichtstrahl im Probenbereich eine Bewegung in der Fokalebene durchführt. In einer bevorzugten Ausführung umfaßt die Strahl­ rastereinrichtung darüber hinaus auch eine mechanische Trans­ lationseinheit, welche am beleuchteten Objektiv angebracht ist und zur axialen Bewegung desselben dient. Damit ist ein Abrastern der gesamten Probe möglich. Die erfindungsgemäßen Vorteile können in einem typischen Rastermikroskop ausgenutzt werden. Im Rückstrahlaufbau befindet sich die Strahlraster­ einrichtung günstigerweise zwischen dem Separationselement und dem Filterelement.

Erfindungsgemäß kann die Probe auf einem Positioniertisch angeordnet sein, der eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchführt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Zeichnungen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungs­ beispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 2 die Intensitätsverteilung der Lichtanteile zweier verschiedener Wellenlängen des Anregungslichts am Probenpunkt und

Fig. 3 die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion des Anregungs­ lichts am Probenpunkt (Produkt der Intensitätsvertei­ lungen der Lichtanteile aus Fig. 2).

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Ausführungsbeispiel bezieht sich auf ein Rastermikroskop. Durch dieses Ausführungsbeispiel soll die Verwendung der Vorrichtung und des Verfahrens als normales Mikroskop und insbesondere die Anwendung zur Definition von Punkten in optischen Speichern, die Bits darstellen, nicht ausgeschlossen werden.

Das Licht einer Lichtquellenanordnung 1 wird mittels eines Objektivs 2 auf einen Probenpunkt 3 einer Probe 4 abgebildet. In dem hier gezeigten Rückstrahlaufbau wird das von der Probe 4 emittierte Emissionslicht, das durch das Anregungslicht erzeugte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht, über ein Separations­ element 5 auf einen Detektor 6 abgebildet. Als Separations­ element 5 wird typischerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet. Die Lichtquellenanordnung 1 umfaßt zwei Laser 7 und 8, von welchen der Laser 7 Licht der Wellenlänge L₁ und der Laser 8 Licht der Wellenlänge L₂ emittiert, wobei L₁ ungleich L₂ ist. Ein typischer Unterschied in den Wellenlängen beträgt 20 nm. Das Licht der beiden Laser 7 und 8 wird mittels eines Verbindungs­ elements 9, beispielsweise eines dichroitischen Spiegels, zusammengeführt und über eine Linse als Fokussierungselement 10 auf eine Beleuchtungs­ blende 11, beispielsweise ein Lochblende, abgebildet. Dabei bildet die Beleuchtungsblende 11 den Ausgang der Lichtquellen­ anordnung 1. Als Laser 7 und 8 können gepulste Laser verwendet werden, um eine höhere Intensität zu erzielen.

Das aus der Lichtquellenanordnung 1 austretende Laserlicht der Wellenlängen L₁ und L₂ durchläuft, bevor es von dem Objektiv 2 auf dem Probenpunkt abgebildet wird, ein Filterelement 12. Das Filterelement 12 weist einen Mittenbereich 13 auf, der für die Lichtanteile einer oder beider Wellenlängen L₁, L₂ undurchlässig ist. Ferner weist das Filterelement 12 einen Außenbereich 14 auf, der für beide Wellenlängen L₁, L₂ durchlässig ist. Das Filterelement 12 ist in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs 2 angeordnet. Als Filterelement 12 wird ein Filter verwendet, auf dem der Mittenbereich 13 durch Aufdampfen einer dielektrischen Schicht erzeugt wird oder das ein Farbglas optischer Güte ist. Ferner sind der Mittenbereich 13 und der Außenbereich 14 des Filterelements 12 für das von der Probe 4 abgestrahlte Emissionslicht durchlässig. Typischerweise ist der Mittenbereich 13 kreisförmig. Die Lichtstrahlachse verläuft durch den Kreismittelpunkt und das Filterelement 12 weist hinsichtlich der Strahlachse einen Neigungswinkel von ein paar Grad auf, um störende Reflexionen zu vermeiden. Vor dem Detektor 6 ist ein Filter 20 zum Abblocken des restlichen Anregungslichts vorgesehen.

Ferner ist zwischen dem als dichroitischer Spiegel ausgebildeten Separationselement 5 und dem Filterelement 12 eine Strahlraster­ einrichtung 16 vorgesehen, mit der die Probenpunkte der Probe 4 dreidimensional abgerastert werden können. Zwischen dem Separa­ tionselement 5 und der Strahlrastereinrichtung 16 ist eine weitere Linse 22 angeordnet, durch deren Wirkung der von der Lichtquellenanordnung 1 kommende Lichtstrahl parallelisiert wird. Dabei entspricht die Summe des Abstands der Linse zu dem als dichroitischen Spiegel ausgebildeten Separationselement 5 und des Abstands des dichroitischen Spiegel zu der Beleuchtungs­ blende 11 der Brennweite der Linse 22.

Fig. 2 zeigt die Intensitätsverteilung der von der Lichtquel­ lenanordnung 1 auf den Probenpunkt 3 fokussierten Lichtanteile der Wellenlängen L₁ und L₂. Die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion in der Fokalebene der beschriebenen Vorrichtung zur Anregung eines Energiezustands durch Lichtanteile verschiedener Wellen­ längen ergibt sich aus dem Produkt der Intensitätsverteilungen (hier zwei) für L₁ und L₂. Bei der Überlagerung der beiden Intensitätsverteilungen von L₁ und L₂ entsteht durch die Überlagerung der zusammentreffenden Hauptmaxima in der Gesamt­ funktion der Fig. 3 ein schmaleres Hauptmaximum und somit eine bessere laterale Auflösung der Vorrichtung. Aufgrund der verschiedenen Wellenlängen fallen die Nebenmaxima in Fig. 2 nicht übereinander, so daß sich die von dem Filterelement 12 herrührenden Nebenmaxima nicht in ihrer Wirkung ergänzen und die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion außerhalb des Hauptmaximums kleine oder verschwindende Werte aufweist. Wie man Fig. 3 entnimmt, sind die störenden Nebenmaxima unterdrückt. Mit Hilfe einer solchen Anregungspunkt-Abbildungsfunktion erhält man einen effektiven Fokus des Rastermikroskops, der in der Fokalebene schmaler ist und durch Detektion des Emissionslichts im Detektor 6 eine höher auflösende Abbildung der Probe 4 erlaubt.

Um eine weitere Verbesserung der Auflösung zu erzielen, ist vor dem Detektor 6 ein in Fig. 1 nicht dargestelltes Fokussierungs­ element, etwa ein weiteres Objektiv, angeordnet, welches das Emissionslicht der Probe 4 über eine ebenfalls nicht darge­ stellte Detektorblende in den Detektor 6 fokussiert. Üblicher­ weise wird als Detektorblende eine Lochblende verwendet, oder die Öffnung des Detektors dient als Blende, wobei der Durch­ messer der Blende so groß ist, daß ihr Bild im Probenbereich von der Größenordnung des ersten Hauptmaximums der Punktabbildungs­ funktion des Fokussierungselements zur Fokussierung des Emissionslichts ist. Als Detektor 6 wird ein Photomultiplier oder ein Halbleiterdetektor benutzt. Aufgrund der Punktabbildung des Probenpunkts 3 auf den Detektor 6 wird der Intensitäts­ verteilung aus Fig. 3 eine Detektionspunkt-Abbildungsfunktion überlagert, welche zu einer weiteren Verschmälerung des Haupt­ maximums führt. Somit kann insgesamt eine Verbesserung der Auflösung um 30 bis 40% im Vergleich zu herkömmlichen Vorrich­ tungen erzielt werden.

Ferner ist im Strahlengang zwischen dem Separationselement 5 und dem Filterelement 12 eine Strahlrastereinrichtung 16 angeordnet. Damit kann der Anregungslichtstrahl über die Probe 4 gelenkt werden, so daß weitere Probenpunkte 3′ gemessen werden können.

Damit entspricht die Vorrichtung einem Rastermikroskop mit einer erheblichen Verbesserung der lateralen Auflösung.

Es ist möglich, an Stelle der beiden Laser 7 und 8 und des Verbindungselements 9 nur einen Laser zu verwenden, etwa einen Mischgaslaser, welcher die Wellenlängen L₁ und L₂ emittiert.

Ferner kann statt des Rückstrahlaufbaus eine Transmissions­ anordnung verwendet werden, bei welcher das Separationselement 5 durch ein Filter ersetzt wird, welches hinter der Probe 4 angeordnet ist, wobei der Detektor 6 hinter dem Filter anzu­ ordnen ist. Im letzteren Fall kann der Detektor 6 direkt hinter der Probe angeordnet werden. Dies ist dann vorteilhaft, wenn das Fluoreszenzlicht der Probe 4 im UV-Bereich liegt, da dann eine Strahlfokussierung schwierig ist. Bei der Transmissionsanordnung ist es zudem nicht erforderlich, daß das Filterelement 12 für das Emissionslicht der Probe 4 durchlässig ist.

Die Probe 4 ist auf einem Positioniertisch 21 befestigt, der vorzugsweise eine Mikroskoppositionierung der Probe 4 in axialer Richtung und damit ein axiales Rastern erlaubt. Aufbau und Justierung des Rastermikroskops erfolgen, soweit nicht explizit beschrieben auf dem Fachmann bekannte Art und Weise.

Im folgenden wird die Verwendung der Vorrichtung anhand des Verfahrens beschrieben. Die Probe 4 und die Laser 7 und 8 werden so ausgewählt, daß Photonen aus beiden Lasern 7 und 8 und damit Photonen unterschiedlicher Wellenlänge zusammenwirken, um einen energetisch anregten Zustand der Probe 4 zu erreichen. Dabei ist die Summe der Energien von einem Photon aus dem einen Laser 7 und einem Photon aus dem anderen Laser 8 gleich der Anregungs­ energie und in etwa gleich der Differenz zwischen dem Energie­ zustand vor der Anregung und dem angeregten Zustand. Das infolge der Anregung emittierte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht wird gemessen. Die Probe 4 wird im Fokalbereich des Objektivs der Vorrichtung positioniert, wobei im Strahlengang das Filter­ element 12 angeordnet ist. Der Strahlengang wird so ausge­ richtet, daß das aus der Lichtquellenanordnung 1 austretende Anregungslicht durch die Blende 12 verläuft und über das Objektiv 2 auf den Probenpunkt 3 abgebildet wird. Das Emissions­ licht des Probenpunkts 3 wird über das als dichroitischer Spiegel ausgebildete Separationselement 5 in den Detektor 6 abgebildet. Dabei wird der Probenpunkt 3 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung gemessen. Mittels der Strahlrastereinrich­ tung 12 wird der Anregungslichtstrahl automatisch zu einem weiteren Probenpunkt 3′ gelenkt, dessen Emissionslicht ebenfalls in dem Detektor 6 gemessen wird. Entsprechend werden durch Steuern der Strahlrastereinrichtung 16 die übrigen gewünschten Probenpunkte angesteuert, so daß die gesamte Probe 4 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung gemessen wird.

Claims (28)

1. Verfahren zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt, bei dem das Anregungslicht einer Lichtquellenanordnung auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt, wobei der Energiezustand der Probe in dem Probenpunkt durch Zusammenwirken von wenigstens zwei in dem Anregungslicht enthaltenen Licht­ anteilen verschiedener Wellenlängen angeregt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zum Erhalt einer hohen Ortsauflösung der optischen Anregung mindestens der Lichtanteil der einen Wellenlänge (L₁) aus einem Mittenbereich des Anregungslichtkegels herausgefiltert wird, bevor das Anregungslicht auf die Probe (4) fokussiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von dem Probenpunkt (3) aufgrund der Anregung emittierte Emissionslicht aus dem Anregungslicht abgetrennt und in einem Detektor (6) nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwei in der Wellenlänge (L₁, L₂) verschiedene Lichtanteile des Anregungslichts aus dem Mittenbereich des Anregungslicht­ kegels herausgefiltert werden, bevor das Anregungslicht auf die Probe (4) fokussiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der axiale Querschnitt des aus dem Anregungslicht­ kegel herausgefilterten Mittenbereichs (13) die Form einer Kreisscheibe hat.

5. Vorrichtung zur optischen Anregung eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einer Lichtquellenanord­ nung und mit einem Objektiv, das das von der Lichtquellenanord­ nung kommende Anregungslicht zur Anregung des Energiezustands auf den zu messenden Probenpunkt einer im Fokalbereich des Objektivs anordbaren Probe fokussiert, wobei das Anregungslicht der Lichtquellenanordnung Lichtanteile mit wenigstens zwei voneinander verschiedenen Wellenlängen aufweist, die geeignet sind, durch gemeinsames Wirken den Energiezustand der Probe anzuregen, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Lichtquellenanordnung (1) und dem Objektiv (2) ein Filterelement (12) angeordnet ist, welches einen für mindestens den Licht­ anteil der einen Wellenlänge (L₁) des Anregungslichts undurch­ lässigen Mittenbereich (13) und einen für die Lichtanteile des Anregungslichts durchlässigen Außenbereich (14) aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Separationselement (5) zum Abtrennen des von der Probe (4) abgestrahlten Emissionslichts von dem Anregungslicht und ein Detektor zum Nachweis des Emissionslichts vorgesehen sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängen (L₁, L₂) der Lichtanteile sich um etwa 20 nm unterscheiden.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) des Filterelements (12) für zwei Lichtanteile verschiedener Wellenlängen (L₁, L₂) des Anregungslichts undurchlässig ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Filterelement (12) am Ort oder in der Nähe der Eintrittspupille des Objektivs (2) angeordnet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Filterelement (12) am Ort oder in der Nähe einer zu der Eintrittspupille des Objektivs (2) optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) des Filterelements (12) die Form einer Kreisscheibe hat, an welche sich der Außenbereich (14) anschließt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12) derart angeordnet ist, daß die Strahlachse des Anregungslichts durch den Mittenbereich (13) der Kreisscheibe verläuft und die Kreisscheibe unter einem Winkel, der kleiner als 90° ist, schneidet.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) durch eine auf das Filter­ element (12) aufgebrachte dielektrische Schicht oder durch ein Farbglas optischer Güte gebildet ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Mittenbereich (13) und der Außenbereich (14) des Filterelements (12) für das von der Probe (4) abge­ strahlte Emissionslicht durchlässig sind.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) einen Laser (7, 8) umfaßt, der Lichtanteile mindestens zweier Wellenlängen (L₁, L₂) des Anregungslichts emittiert.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) mindestens zwei Laser (7, 8) umfaßt, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen (L₁, L₂) emittieren.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) ein Verbindungselement (9) zum Zusammenführen des Anregungslichts der zwei Laser (7, 8) aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Verbindungselement (9) ein dichroitischer Spiegel ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch ge­ kennzeichnet, daß gepulste Laser (7, 8) verwendet werden.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) ein Fokus­ sierungselement (10) zum Fokussieren des zwei Wellenlängen (L₁, L₂) enthaltenden Anregungslichts auf eine Beleuchtungsblende (11) umfaßt.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Separationselement (5) ein dichroitischer Spiegel ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Separationselement (5) mindestens einen Farbfilter aufweist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Separationselement (5) eine Kombination von Farbfiltern und dielektrischen Filtern enthält.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 23, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Detektor (6) im Strahlengang vor der Probe oder in kurzer Entfernung hinter der Probe (4) angeordnet ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 23, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Detektor (6) ein Punktdetektor ist.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 25, dadurch ge­ kennzeichnet, daß vor dem Detektor (6) ein Fokussierungselement angeordnet ist, welches das Emissionslicht in den Detektor (6) fokussiert.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 26, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zwischen der Lichtquellenanordnung (1) und dem Objektiv (2) eine Strahlrastereinrichtung (16) zum gesteuerten Abrastern der Probe (4) mit dem Anregungslicht vorgesehen ist.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 27, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Probe (4) auf einem Positioniertisch angeordnet ist, der geeignet ist, eine mechanische Raster­ bewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchzu­ führen.