DE2437984B2 - Verfahren zur kontrastverbesserung eines optischen mikroskopes - Google Patents
Verfahren zur kontrastverbesserung eines optischen mikroskopesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrastverbesserung eines optischen Mikroskopes.
Es ist bekannt, daß die Erkennbarkeit von Details in Objekten im wesentlichen vom Auflösungsvermögen
des verwendeten Mikroskops abhängt. Bei Verwendung normalen Lichtes liegt das Auflösungsvermögen etwa
bei 280 nm, bei Verwendung von ultraviolettem Licht etwa bei 140nm, d.h. Details mit kleineren Abmessungen
sind mit Hilfe eines optischen Mikroskops nicht mehr erkennbar.
Die Erkennbarkeit von Details ist darüber hinaus vom erzielbaren Kontrast, besonders bei Amplitudenobjekten
abhängig. Der Kontrast läßt sich verbessern, wenn man Dunkelfeld-, Phasenkontrast-, Interferenzkontrast-,
Polarisations- oder Fluoreszenzmikroskopie betreibt. Bei biologischen Objekten zieht man Färbemethoden
vor. Das Anfärben ist zeitraubend und ruft in vielen Fällen eine Schädigung oder sogar Tötung des
Objektes hervor.
Verwendet man Elektronenmikroskope, so kann man das Auflösungsvermögen wesentlich steigern. Es läßt
sich jedoch mit derartigen Mikroskopen einerseits kein Kontrast am lebenden Objekt erzielen, und zum
anderen halten die lebenden biologischen Objekte den Elektronenbeschuß im Vakuum nicht aus
Darüber hinaus ist die Herstellung von Präparaten für ein Elektronenmikroskop sehr aufwendig. Die Präparatdicken
sollen 100 nm nicht überschreiten, weshalb sehr
feine Schnitte angelegt werden müssen. Elektronenmikroskopisches Arbeiten setzt damit umfangreiche,
langwierige und teure Präparationsmethoden voraus, wie Fixierung, Einbettung des Objektes, Herstellung
von Ultramikrotomschnitten und Konstrastierung des Präparates.
Will man mikroskopisch den Feinbau einer Zelle und deren Organellen beobachten, also Plasmamembranen,
endoplasmatisches Reticulum und Ribosomen, Dictyosomen
und Golgi-Apparat, Cytosomen, Mitochondrien, Piastiden, Centriolen und Nudeolus, dann reicht die
Vergrößerung eines optisch arbeitenden Mikroskopes nicht aus, andererseits wurden aber die Organellen bei
rein optischer Betrachtung am Leben bleiben. Verwendet man ein Elektronenmikroskop, dann kann man
derartige Organellen und damit den Feinbau vieler Zelltypen erkennen. Die Organellen sterben aber mit
der Zelle ab. Damit sind bei Verwendung eines Elektronenmikroskopes grundsätzlich nur Aussagen
über Statik, nicht aber über die Genese und Dynamik einer Zelle möglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, bei dem die Objekte am Leben
bleiben und trotzdem in ausreichendem Kontrast beobachtbar sind.
Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß vom Objekt zwei reelle Bilder erzeugt
werden, die sich durch unterschiedliche Lichteigenschaften, wie Amplitude, Frequenz, Polarisation, Phase,
Zeitdauer, voneinander unterscheiden, daß diese Bilder elektronisch abgetastet und verstärkt werden und daß
die Differenz der Bildsignale wieder zu einem sichtbaren Bild zusammengesetzt wird.
Bei Anwendung dieses Verfahrens kommen die zu beobachtenden Objekte nicht mit Elektronenstrahlen in
Berührung, d. h. sie bleiben am Leben, da vom Objekt rein optisch Bilder erzeugt werden. Durch die
elektronische Beeinflussung der optisch erzeugten Bilder wird jedoch erreicht, daß Bilder des Objektes mit
guter Kontrastierung erhalten werden.
Grundsätzlich kann das Objekt mit Durchlicht oder Auflicht beaufschlagt werden und insbesondere auch
mit sichtbarem Licht.
Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, ultraviolettes Licht geeigneter Wellenlänge zu verwenden. Da das
ultraviolette Licht eine kürzere Wellenlänge aufweist als das sichtbare Licht, wird von vornherein das
Auflösungsvermögen größer. Das ultraviolette Licht bringt aber darüber hinaus weitere wesentliche Vorteile.
Erstens liegen die substanzspezifischen Teile der Absorptionsspektren mit hoher Extinktion im UV-Gebiet
und nicht im sichtbaren Bereich, wo nur die wenig substanzspezifischen langwelligen Ausläufer geringer
Extinktion zu finden sind. Damit werden Bilder lebender Zellen mit UV-Licht im Durchlichtverfahren wesentlich
kontrastreicher als solche mit sichtbarem Licht, außerdem sind sie bei geeigneter Vorfilterung des
durchstrahlenden Lichtes substanzspezifisch für die verschiedenen Zellinhaltsstoffe.
Zweitens kann die Fluoreszenz der meisten lumineszenzfähigen Zellinhaltsstoffe nur durch ultraviolettes
Licht angeregt werden. Auch dadurch ergeben sich weitere Differenzierungsmöglichkeiten zur bildlichen
Trennung der verschiedenen Zellinhaltsstoffe und damit Möglichkeiten zur Gewinnung neuer Erkenntnisse über
Genese und Dynamik, Biochemie und Energetik der Zelle sowie die Aufgliederung des Stoffwechsels auf
verschiedene Reaktionsräume und den Stofftransport durch Zellgrenzflächen.
Bei Verwendung von ultraviolettem Licht besteht jedoch die Gefahr, daß chemische Bindungen, insbesondere
energiearme Bindungen, aufbrechen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird die Intensität des Beleuchtungslichtes durch Reduzierung
bei gleichzeitiger Regelung der elektronischen Bildverstärkung bei helladaptiertem Betrachterauge an der
Grenze des Bildrauschens gehalten und anschließend
ίο die Wellenlänge des Beleuchtungslichtes bis zur
Erreichung des größten Kontrastes der zu betrachtenden Objektelemente geeignet geändert, d. h. das
Verhältnis der Ausgangssignalintensität zur Intensität des verwendeten Beleuchtungslichtes und die Intensität
des anregenden Lichtes werden optimal gehalten, vorzugsweise an der Grenze des Quantenrauschens.
Hält man diese Bedingung ein, kamm man intensitätsarmes Beleuchtungslicht im besonderen UV-Licht verwenden,
um das Objekt abzubilden. Ein Aufbrechen chemischer Bindungen in starkem Umfang ist damit bei
Verwendung von UV-Licht nicht mehr zu befürchten. Unter Ausgangssignalintensität ist die Lichtintensität
auf der ersten lichtempfindlichen Schicht des elektronischen Teiles zu verstehen, das ist die Schicht, auf die die
Lichtstrahlen zwecks Umwandlung in elektronische Signale treffen. Diese Schicht kann die Empfangsschicht
im Bildverstärker sein oder, wenn der Bildverstärker in der Fernsehbildaufnahmeröhre enthalten ist, die Aufnahmeschicht
der Fernsehbildaufnahmeröhre.
Bei der bisherigen Mikroskopie ist das Einhalten der genannten Bedingung nicht üblich, weil das Gebiet des
Quantenrauschens etwa durch Dunkeladaption des Beobachterauges nicht erreicht wird.
Beim Mikroskopieren wird gewöhnlich weder das Quantenrauschen als solches noch seine Bedeutung für
die untere Grenze der Beleuchtungsintensität erkannt.
Man kommt erfahrungsgemäß erst dann in die Nähe
des Sichtbarwerdens des Bildrauschens, wenn das Auge des Betrachters dunkeladaptiert werden muß. Dies gilt,
sofern im optischen Strahlengang kein zusätzliches bildverstärkendes Element, wie zum Beispiel ein
Bildverstärker, vorhanden ist.
Bei den üblichen mikroskopischen Verfahren wird ohne Bildverstärker bei helladaptiertem Betrachterauge
gearbeitet, so daß die zwecks Vermeidung von zu
starkem Bildrauschen erforderliche untere Grenze der Beleuchtungsintensität um mehrere Größenordnungen
überschritten wird.
Damit wird aber die für Vitalbeobachtungen angestrebte Reduzierung der Zellschädigung durch Strahlung
nicht erreicht. Da einer Optimierung des Verhältnisses mikroskopischer Informationsgewinn zu
Zellschädigung insbesondere bei der UV-Mikroskopie dringend erforderlich ist, wird dies im erfindungsgemäßen
Verfahren durch Verwendung von Bildverstärkern ermöglicht.
Mit kleiner werdender Wellenlänge tritt darüber hinaus eine steil ansteigende kontrastmindernde Streuung
des Lichtes auf, die sich bei Verwendung von ultraviolettem Licht üblicherweise bemerkbar macht.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird dieser Effekt
durch die ohnehin angewandte Differenzbildmethode von vornherein unterdrückt.
Die reellen Bilder des Objektes können nach der Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenköntrast-, Interferenzkontrast-
oder Fluoreszenzmethode erzeugt werden.
Für die Abtastung der vom optisch arbeitenden Mikroskopteil erzeugten reellen Bilder dienen Fernseh-
aufnahmeröhren, ζ. B. Vidikons, auf deren lichtempfindlichen Schichten die reellen Mikroskopbilder in
schwarz/weiß oder auch in Farbe erzeugt werden.
Das Differenzbild wird vorteilhaft auf dem Bildschirm eines Fernsehmonitors dargestellt Hierdurch wird eine
Verbesserung etwa der diagnostischen Sicherheit im zytologischen Labor durch ermüdungsfreies Arbeiten
erzielt
Außerdem ist durch die Einstellbarkeit von Kontrast und Helligkeit des Fernsehmonitors eine zusätzliche
Verbesserung der Auswertbarkeit des Mikroskopbildes möglich, so daß man zu einer Steigerung des
Informationsgewinnes kommt.
Die beschriebene Einrichtung läßt sich mit Vorteil auch zur Densitometrie verwenden, d. h. also auch zum
Nachweis und zur quantitativen Messung geringster Substanzmengen.
Nutzt man die Fluoreszenzabklingzeiten der Zellinhaltsstoffe aus, wird vorteilhaft das anregende Licht
zeitlich moduliert und das Fluoreszenzlicht unter gleichzeitiger Phasenverschiebung demoduliert.
Als anregendes Licht kann UV-Licht verwendet werden.
Das beschriebene Verfahren eignet sich mit Vorteil zur datenmäßigen Erfassung der Bilder oder Teilen
hiervon und zur Speicherung dieser Daten, wobei auch die Zeitraffertechnik angewendet werden kann, etwa
zur Untersuchung der Zelldynamik.
Das beschriebene Verfahren eignet sich besonders für die zytologische Krebs-Frühdiagnose bei regelmäßiger
Untersuchung breiter Bevölkerungsgruppen, insbesondere in Verbindung mit der genannten elektronischen
Speicherung und Datenverarbeitung der mikroskopischen Ergebnisse.
In der Zeichnung ist ein Gerät in verschiedenen Varianten zur Durchführung des Verfahrens dargestellt.
Es zeigen
F i g. 1 den optischen Geräteteil, teilweise im Schnitt; F i g. 2 ein Blockschaltbild des elektronischen Teiles
in einem ersten Ausführungsbeispiel; F i g. 3 ein geändertes Schaltbild; Fig.4 ein geändertes Ausführungsbeispiel für den
optischen Geräteteil.
Gemäß F i g. 1 wird das Objekt 1 entweder mit Hilfe einer Lichtquelle 2 im Durchlicht beleuchtet oder
wahlweise mit Hilfe einer Lichtquelle 3 im Auflicht. Das Abbildungsobjektiv 4 ist mit Hilfe einer Schwalbenschwanzführung 5 in das Gerät eingesetzt, so daß es
ausgewechselt werden kann. Dem Objektiv 4 ist ein teildurchlässiger Spiegel 6 nachgeschaltet. Spiegel 7 und
8 lenken die vom teildurchlässigen Spiegel durchgelassenen Lichtstrahlen in ein Projeküv 9, das ein reelles
Bild des Objektes auf der iichtempfindlichen Schicht einer Fernsehaufnahmeröhre 11 erzeugt (Fig.2). Die
am Spiegel 6 reflektierten Strahlen werden mit Hilfe eines Spiegels 12 und eines Projektivs 13 auf die
lichtempfindliche Schicht 14 einer Fernsehaufnahmeröhre 15 gelenkt und erzeugen dort ein reelles Bild des
Objektes. In die Teilstrahlengänge sind die die Lichteigenschaften ändernden Elemente 16 und
eingesetzt, beispielsweise unterschiedliche Farbfilter bei Verwendung natürlichen Lichtes oder Polarisatoren bei
polarisiertem Fluoreszenzlicht oder eine Demodulationseinrichtung, wie eine Pockelszelle zur Ausnützung
eventuell unterschiedlicher Fluöreszenzabklingzeiten
bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht. Im letzteren Fall wird man das verwendete ultraviolette Licht
zeitabhängig modulieren. Die genannten Elemente sind vorteilhaft auf einem Schieber od. dgl. angeordnet, um
wahlweise in das Mikroskop eingeführt zu werden.
Gemäß F i g. 2 wirkt auf die Fernsehaufnahmeröhren 11 und 15 ein Ablenksystem 31, so daß die auf den
lichtempfindlichen Schichten erzeugten Bilder synchron punkt- und zeilenmäßig richtig abgetastet werden. Die
von der Fernsehaufnahmeröhre 11 kommenden Signale werden in einen Verstärker 32 eingegeben, der
Bildausgangssignale an einen Logarithmierer 33 gibt. ο Der Logarithmierer 33 gibt seine Signale in eine
differenzbildende Einrichtung 34.
Die von der Fernsehaufnahmeröhre 15 kommenden Signale werden einem Verstärker 35 zugeführt, der
seine Signale an einen Logarithmierer 36 gibt, dessen Signale ebenfalls der Differenzbildungseinrichtung 34
zugeführt werden. Ein Synchrongenerator 37 steuert den Gleichlauf der Signale. Da die Lichteigenschaften
für jeden Bildpunkt auf den lichtempfindlichen Schichten 10 und 14 der Fernsehaufnahmeröhren unterschiedlieh
sein können, gelangen in die Einrichtung 34 zur Differenzbildung Signale unterschiedlicher Intensität, so
daß sich Signaldifferenzen für jeden abgetasteten Punkt bilden lassen.
Die Bildausgangssignale werden in einen Fernsehmonitor 38 eingegeben, so daß auf dessen Bildschirm ein
kontrastreiches Differenzbild der auf den lichtempfindlichen Schichten 10 und 14 erzeugten Bilder erscheint.
Damit die das Differenzbild erzeugenden Signale mit den Abtastsignalen in den Fernsehaufnahmeröhren
gleichlaufen, wirkt der Synchrongenerator 37 auf eine entsprechende dem Fernsehmonitor zugeordnete Additionsstufe
39.
Fig.3 zeigt die Ausbildung als Densitometer. Auf
den lichtempfindlichen Schichten 50 und 51 der Fernsehaufnahmeröhren 52 und 53 werden Meßbilder
des Objektes erzeugt und wie in den vorhergehenden Beispielen abgetastet. Die die Einrichtung 34 zur
Differenzbildung verlassenden Signale werden einerseits wiederum zur Einrichtung 39 gegeben und von hier
in den Fernsehmonitor 38, andererseits in ein Tor 54, das gleichzeitig von einem Fenstergenerator 55 gesteuert
wird. Die vom Tor gelieferten Signale können zum Beispiel in einer elektrischen Datenverarbeitungseinrichtung
registriert und gespeichert werden oder aber auch in eine Schreibeinrichtung od. dgl. eingegeben
werden, welche sie ausdruckt.
Die Fernsehaufnahmeröhren sind fest mit dem optischen Geräteteil verbunden, um Relativverschiebungen
der Bilder auf den lichtempfindlichen Schichten bei einer Erschütterung des Gerätes zu vermeiden.
Bei Verwendung von UV-Licht wird man die Linsen der F i g. 1 aus Quarz ausbilden. Es ist aber auch
möglich, gemäß F i g. 4 eine Spiegeloptik zu verwenden. Das UV-Licht wird mit Hilfe eines Spiegels 20 einem aus
den Spiegeln 21 und 22 bestehenden Kondensor zugeführt, mit dessen Hilfe das Objekt 1 ausgeleuchtet
wird. Das Objektiv besteht ebenfalls aus Spiegeln 23 und 24. Das Objektiv erzeugt in der Ebene 25 ein
Zwischenbild. Dem Objektiv 23 und 24 kann der bildaufteilende Spiegel 26 der Fig. 1 folgen. Im
vorliegenden Fall soll jedoch nur ein Bild des Objektes erzeugt werden. Das in der Zwischenbildebene
erzeugte reelle Bild wird mit Hilfe eines aus den Spiegeln 26 und 27 bestehenden Projektivs in die
Zwischenbildebene 28 abgebildet, in der die lichtempfindliche Schicht einer Fernsehaufnahmeröhre
angeordnet ist.
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
1. Verfahren zur Kontrastverbesserung eines optischen Mikroskopes, dadurch gekennzeichnet,
daß vom Objekt (1) zwei reelle Bilder erzeugt werden, die sich durch unterschiedliche
Lichteigenschaften, wie Amplitude, Frequenz, Polarisation, Phase, Zeitdauer, voneinander unterscheiden,
daß diese Bilder elektronisch abgetastet (11,15) und verstärkt (32, 35) werden und daß die Differenz der
Bildsignale wieder zu einem sichtbaren Bild (38) zusammengesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die lichtoptische Abbildung des
Objektes ultraviolettes Licht verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensität des Beleuchtungslichtes
durch Reduzierung bei gleichzeitiger Regelung der elektronischen Bildverstärkung bei
helladaptiertem Betrachterauge an der Grenze des Bildrauschens gehalten wird und anschließend die
Wellenlänge des Beleuchtungslichtes bis zur Erreichung des größten Kontrastes der zu betrachtenden
Objektelemente geeignet geändert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reellen Bilder des Objektes nach
der Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrast-, Interferenzkontrast- oder Fluoreszenzmethode erzeugt
werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtoptisch erzeugten Bilder auf
die lichtempfindlichen Schichten zweier Fernsehaufnahmeröhren, z. B. Vidikons, projiziert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung der Einrichtung zur Densitometrie.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anwendung der Fluoreszenzmethode
das anregende Licht zeitlich moduliert wird und das entstehende Fluoreszenzlicht unter
gleichzeitiger Phasenverschiebung demcduliert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als anregendes Licht UV-Licht
verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Differenzbild oder Teile davon
datenmäßig erfaßt und gegebenenfalls gespeichert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Speicherung von einzelnen Bildern oder
Bildteilen und deren Wiedergabe im Zeitrafferverfahren.
ί 1. Mikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
zwei reellen Bilder des Objektivs (1) über einen teildurchlässigen Spiegel (6) getrennt werden, daß in
wenigstens einem der beiden getrennten Strahlengänge ein Element (16, 17) angeordnet ist, welches
die Lichteigenschaften, wie Amplitude, Frequenz, Polarisation, Phase oder Zeitdauer des Lichtes
ändert, daß zwei Fernsehaufnahmeröhren (11,15) so
angeordnet sind, daß die beiden Bilder auf ihre lichtempfindliche Schicht (10,14) fokussiert werden,
daß zwei Verstärker (32,35) für die Verstärkung der Signale, ein Komperator (34) für die Differenzbildung
der Signale und ein Monitor (38) für die Sichtbarmachung des Differenzsignales vorgesehen
sind, sowie je ein Logarithmierer (33, 36) den
Verstärkern nachgeschaltet ist.
12. Mikroskop nach Anspruch 11, gekennzeichnet
durch eine wahlweise Durchlicht- oder Auflichtbeleuchtung für das Objekt (1) sowie durch auswechselbare
Objektive (4).
13. Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß das lichtoptische Mikroskop reelle Zwischenbilder erzeugt, die mit Hilfe von
Projektiven (9, 13) auf die lichtempfindlichen Schichten (40) der Fernsehaufnahmeröhren (30)
projiziert werden.
14. Mikroskop nach Anspruch 11, gekennzeichnet
durch die Verwendung von ultraviolettem Licht sowie durch eine Spiegeloptik.
15. Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente (16,17) wahlweise
in den Teilstrahlengängen anordbar sind.
16. Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Bildausgangssignal nach
der Differenzbildung einem durch einen Fenstergenerator (35) gesteuerten Tor zugeführt wird,
welches das Bildsignal eines am Fenstergenerator einstellbaren und zusätzlich auf dem Bildschirm des
Fernsehmonitors (38) markierten Teil des Gesamtbildes einer EDV-Anlage oder einer Registriereinrichtung,
z. B. einem Schreiber od. dgl., zugeführt.
17. Mikroskop nach Anspruch 11, gekennzeichnet
durch eine die bildabtastenden Strahlen in den Fernsehaufnahmeröhren und die bilderzeugenden
Strahlen im Monitor synchronisierende Einrichtung (37).
18. Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Abbildungselemente
(21, 22, 23, 24, 26, 27) insbesondere die Projektive (26,27) durch Spiegel gebildet sind.
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