DE10327531A1 - Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen - Google Patents

Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen Download PDF

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Abstract

Es ist ein Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen mit einem Scanmikroskop offenbart. Ein Beleuchtungslichtstrahl wird mit dem Scanmodul für eine bestimmte Zeitspanne an einem Ort des Objekts positioniert. An den aufgenommenen Daten wird entweder eine direkte Filterung durchgeführt oder eine Fourieranalyse durchgeführt. Anschließend erfolgt mit einem geeigneten Filter eine Filterung der der Fourieranalyse unterzogenen Daten. Schließlich wird die Berechnung einer Korrelationsfunktion ausschließlich an den gefilterten Daten durchgeführt.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen. Im Besonderen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung Diffusions- und Transportprozessen mit einem Scanmikroskop, das ein Umlenkmittel zum Einkoppeln eines Beleuchtungslichtstrahls, ein Scanmodul zur bildlichen Darstellung eines Objekts auf einem Peripheriegerät sowie zur Positionierung des Beleuchtungslichtstrahls für eine bestimmte Zeitspanne an einem Ort des Objekts umfasst.
  • Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und verwandte Methoden mit ihrer Realisierung in einem Mikroskopaufbau eignen sich zur Untersuchung von molekularen Beweglichkeiten und Wechselwirkungen in mikroskopischen Messvolumina kleiner 1 fl (femtoliter, 10–15 Liter) und bei geringen Konzentrationsbereichen kleiner 1 μM (μMol). In typischen FCS-Experimenten mit stehendem Messvolumen und insbesondere in wässriger Lösung befindet sich im Messvolumen eine mittlere Zahl von wenigen (< 1000) fluoreszenzmarkierten Molekülen. Aufgrund der Brown'schen Bewegung der Moleküle fluktuiert ihre Zahl um diesen Mittelwert und erzeugt entsprechende Fluktuationen des Fluoreszenzsignals um einen Mittelwert. Mit der Autokorrelationsanalyse von einem Detektionskanal und/oder der Kreuzkorrelationsanalyse von mehr als einem Detektionskanal lassen sich z.B. die Konzentrationen und die Diffusionseigenschaften von mehreren fluoreszenzmarkierten Spezies sowie ihre Wechselwirkung miteinander quantitativ bestimmen.
  • Insbesondere in strukturierten Proben, wie zum Beispiel biologischen Zellen, kann es zu zusätzlichen, oft dominanten Fluktuationen und vor allem Drift im Signal kommen. Ein Beispiel sind die langsamen Bewegungen von zellulären Strukturen. Diese Bewegungen überlagern die diffusionsbedingten molekularen Bewegungen.
  • Einen weiteren Einfluss auf das Messergebnis nehmen fluoreszenzmarkierte Moleküle, die transient oder permanent durch Bindung an zelluläre Strukturen immobilisiert sind. Ihre Fluoreszenz wird typischerweise unter Beleuchtung nach Zeiten im 100 msec- bis sec-Bereich irreversibel ausgeschaltet. Dies bezeichnet man als Photobleaching.
  • Ebenso können fluoreszente, sehr langsame Aggregate vorliegen, die sich als singuläres Ereignis langsam durch das Messvolumen bewegen. Kombinationen aus den oben beschriebenen Einflüssen auf die Messergebnisse sind denkbar.
  • Bei der Berechnung der Korrelationsfunktion der Signale führen diese Drifts und Fluktuationen zu oft dominanten Beiträgen, die die interessierenden Beiträge von molekularer Diffusion überdecken und oft nicht auswertbar machen. Während außerdem für die Korrelationsfunktion von Signalfluktuationen in Folge molekularer Diffusion analytische oder numerische Modelle existieren, die eine quantitative Auswertung erlauben, ist dies für die erwähnten Fälle nicht oder sehr selten der Fall. Langsame Fluktuationen machen also in herkömmlicher FCS die Auswertung schwierig bis unmöglich.
  • Stand der Technik entspricht der Realisierung von FCS-Experimenten mit den kommerziell erhältlichen FCS-Geräten/Korrelatoren von ALV (ALV-Laser-Vertriebsgesellschaft mbH, Langen, Deutschland), ISS (ISS Inc., Champaign, Illinois/USA), Zeiss (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland).
    •
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem die molekulare Diffusion in einem Objekt oder einer Probe bestimmbar ist, ohne dass ebenfalls im Objekt vorherrschende Störeinflüsse das Messergebnis der molekularen Diffusion verfälschen würden.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, das die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst.
  • Das Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen mit einem Scanmikroskop ist vorteilhaft, da ein Umlenkmittel zum Einkoppeln eines Beleuchtungslichtstrahls, ein Scanmodul zur bildlichen Darstellung eines Objekts auf einem Peripheriegerät und mindestens ein Detektor für das Photonenzählen, beispielsweise eine Avalanche-Photo-Diode, vorgesehen ist. Zunächst erfolgt das Aufnehmen der Daten, wobei der Beleuchtungslichtstrahl mit dem Scanmodul für eine bestimmte Zeitspanne an einem Ort des Objekts positioniert wird. Die aufgenommenen Daten werden entweder direkt einer Filterung unterzogen oder an den aufgenommenen Daten wird eine Fourieranalyse durchführt. Anschließend erfolgt mit einem geeigneten Filter eine Filterung, der der Fourieranalyse unterzogenen Daten. Schließlich wird die Berechnung einer Korrelationsfunktion ausschließlich an den gefilterten Daten durchgeführt. Die Filterung der Daten ist in Software oder in einer Kombination aus Hard-/und Software realisiert.
  • Ein wählbarer Filter kann einen Kurzpassfilter umfassen, der langsame Fluktuationen (Prozesse > 100 ms) aus den aufgenommenen Daten herausfiltert. Eine weitere Möglichkeit für einen Filter ist ein Langpassfilter, der schnelle Fluktuationen (Prozesse, typischerweise im μs- ms-Bereich) herausfiltert, was einer Vergrößerung der Samplingzeit bei der Aufzeichnung des Fluoreszenzsignals entspricht. Die berechnete Korrelationsfunktion beschreibt nur noch langsame Fluktuationen, deren Zeitbereich liegt weit oberhalb einer msec und somit ist die Verknüpfung der Methode mit Time-Lapse-Imaging ermöglicht, so dass die Messwerte für die Korrelationsanalyse direkt aus den mit dem Scanmikroskop aufgenommenen Bildern verwendet werden. Die langsamen Fluktuationen dienen zur Analyse der Dynamik zellulärer Strukturen.
  • Ein weitere vorteilhafte Methode der Filterung ist, dass ein Bandpassfilter vorgesehen ist, der eine obere und eine untere Grenze definiert, so dass Fluktuationen unterhalb der unteren und oberhalb der oberen Grenze herausgefiltert werden. Zusätzlich kann man mit einem Bandblock- bzw. einem Notchfilter Fluktuationen zwischen einer unteren und einer oberen Grenze bzw. um eine mittlere Frequenz herausfiltern, so dass bei der Berechnung der Korrelationsfunktion nur noch die interessierenden Fluktuationen unterhalb der unteren und oberhalb der oberen Grenze beschreiben werden. Vorübergehende signifikante Abweichungen der aufgenommenen Daten über ein statistisch zu erwartendes Maß hinaus werden durch Setzen einer oberen und unteren Schwelle automatisch erkannt, so dass diese Bereiche dann aus den aufgenommenen Daten herausgeschnitten und nicht für Korrelationsanalyse verwendet werden. Die vorübergehenden signifikanten Abweichungen durch fluoreszierende molekulare Aggregate oder durch die Anlagerung der fluoreszierenden Moleküle an weniger bewegliche Bestandteile des Objekts (15) werden dadurch eliminiert.
  • Die Verwendung einer empirischen Trendkurve dient dazu, langsame Fluktuationen und insbesondere Drift durch Photobleaching zu detektieren und einer Auswertung zuzuführen. Die empirische Trendkurve ist dabei ein Polynom oder eine Summe von Exponentialkurven. Eine skalierte Differenz aus den aufgenommenen Daten und der Trendkurve wird berechnet, die dann nur noch die interessierenden, diffusionsbedingten Fluktuationen enthält, die mit einer Korrelationsanalyse erfasst werden.
    •
  • Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung können den Unteransprüchen entnommen werden.
  • In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
  • 1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops mit einem SP-Modul;
  • 2 eine schematische Darstellung der Anordnung der Gerätekomponenten für die FCS-Analyse in einem Scanmikroskop;
  • 3 eine graphische Darstellung der gemessenen FCS Rohdaten im Vergleich zu den Daten, die mit einem Tiefpass gefiltert wurden;
  • 4 eine graphische Darstellung der gemessenen FCS Rohdaten, die mit einem Hochpass gefiltert wurden;
  • 5 eine graphische Darstellung der gemessenen FCS Rohdaten, die durch Setzen einer oberen und unteren Schwelle, sowie durch Maskierung vor der Korrelationsberechnung gefiltert werden;
  • 6 eine graphische Darstellung der durch Photobleaching abfallenden Rohdaten im Vergleich zu den Daten, die mit einem Modell angepasst wurden;
  • 7 eine graphische Darstellung eines korrigierten Signals aus 6;
  • 8 eine graphische Darstellung der nach schnellem Bleichen erfolgende Anstieg der Rohdaten im Vergleich zu den Daten, die mit einem Modell angepasst wurden eine graphische Darstellung der; und
  • 9 eine graphische Darstellung eines korrigierten Signals aus 8.
  • In 1 zeigt den schematischen Aufbau eines konfokalen Scanmikroskops 100, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung findet. Der von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Bevor der Beleuchtungslichtstrahl 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft, passiert dieser ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 durch eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch ein Objekt 15 führt. Der Beleuchtungslichtstrahl 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann der Beleuchtungslichtstrahl 3 auch durch das Objekt 15 geführt werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem geeigneten Farbstoff (Fluoreszenzmarker) präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt vorhandenen Farbstoffe werden durch den Beleuchtungslichtstrahl 3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Dieses vom Objekt 15 ausgehende Licht definiert einen Detektionslichtstrahl 17. Dieser gelangt durch die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole 18 auf mindestens einen Detektor 19, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren, eingesetzt werden können. Der vom Objekt 15 ausgehende bzw. definierte Detektionslichtstrahl 17 ist in 1 als gestrichelte Linie dargestellt. Im Detektor 19 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt 15 Licht nicht nur einer Wellenlänge ausgesandt wird, ist es sinnvoll, vor dem mindestens einen Detektor 19 ein Selektionsmittel für das von der Probe ausgehende Spektrum einzufügen. Das Selektionsmittel ist in der hier gezeigten Ausführungsform ein SP-Modul 20. Das SP-Modul 20 ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda-Scan aufnehmen kann, d.h., dass alle vom Objekt 15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Die vom Detektor 19 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät 27 kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z.B. aus einer Tastatur 28, einer Einstellvorrichtung 29 für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus 30 besteht. Der Detektionslichtstrahl 17 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
  • 2 ist eine schematische Darstellung der Anordnung von mehreren Gerätekomponenten für die FCS-Analyse in dem Scanmikroskop 100. Für die FCS-Analyse wird ein herkömmliches Scanmikroskop 100, dem ein herkömmliches SP-Modul 20 zugeordnet ist, verwendet. Das Scanmikroskop 100 ist mit einem mit einem Umlenkmittel 5 versehen, das als Hauptstrahlteiler fungiert und als Strahlteilerschieber oder AOBSTM ausgeführt ist. Als Lichtquellen können, wie bereits in 1 beschrieben, sowohl alle verfügbaren sichtbaren Laserlinien über einen ersten Eingang 40 eingekoppelt werden. Über einen zweiten Eingang 41 erfolgt die Einkopplung von UV-Strahlung oder IR-Strahlung, die für Mehr-Photonenanwendungen (auch FCS) nutzbar ist. In 2 ist die Strahlrichtung zum SP-Modul 20 mit einem gestrichelten Pfeil dargestellt. Das Detektionslicht (von dem Objekt 15 ausgehendes Licht) passiert die Mikroskopoptik (in 2 nicht dargestellt), den Scanspiegel 9, das Umlenkmittel 5, das Detektionspinhole 18, optional ein Filterrad 21 zum Ausblenden des Anregungslichtes, sowie einen verstellbaren Strahlteilerschieber 43, der einen Spiegel, zum vollständigen Ablenken ins SP-Modul 20, einen Strahlteiler oder ein einfaches Substrat, zum teilweisen Ablenken ins SP-Modul 20, oder eine Leerstelle beinhaltet. Durch eine nachfolgende Linse 44 wird der Strahl des Detektionslichts kollimiert. Hinter dieser Linse 44 befindet sich ein Ausgang 45 aus dem Stativ des Scanmikroskops 100. Oberhalb dieses Ausgangs 45 ist ein Gehäuse 46 angebracht, in dem sich ein wechselbarer Filterwürfel 47 befindet. An dem Strahlteiler 48 (auswechselbar), der in dem Filterwürfel 47 vorgesehen ist, wird das Detektionslicht in zwei Anteile aufgeteilt; z.B. in einen „roten" Anteil 50a und einen „blauen" Anteil 50b. Zusätzliche Filter 49 dienen zum weiteren Ausblenden des Anregungslichtes, bzw. anderer nicht gewollter Lichtanteile. Diese sind beim Gebrauch eines AOBSTM als Umlenkmittel 5 optional. Ein Teilstrahl, wie z.B. der „rote" Anteil 50a, wird dann mit einer Linse 51 direkt auf den ersten Detektionskanal 52 fokussiert. Der zweite Teilstrahl, wie z.B. der „blaue" Anteil 50b, wird über einen zusätzlichen Umlenkspiegel 53, ebenfalls mit einer Linse 51 auf einen zweiten Detektionskanal 55 fokussiert. Jeder setzt sich aus einer Standard-FC-Buchse 54, einer Standard-Multimodefaser 56 mit lichtdichtem Mantel, die an beiden Enden jeweils mit einem FC-Stecker versehen ist, einer weiteren FC-Buchse 54 und einer Avalanche-Photo-Diode 57 (APD) zusammen. Die APD's 57 zeichnen sich durch ihre besonders hohe Detektionseffizienz speziell im sichtbaren Wellenlängenbereich im Vergleich zu Photomultiplier-Röhren aus. Die beiden APD's 57 sind in einem Gehäuse 58 zusammen untergebracht, damit für eine ausreichende Kühlung und Lichtdichtheit der Detektoren gesorgt ist. Die Signale der APD's 57 werden dann in einen Computer 60 geleitet, der für die FCS-Analyse zuständig ist. Im Computer 60 ist eine Detektorkarte 61 vorgesehen. Mit dem Computer 62 ist ein zusätzlicher Monitor 62 verbunden, auf dem die Messergebnisse in verschiedenster Art und weise darstellbar sind. Das Scanmikroskop 100 hat, wie bereits in 1 beschrieben ein „eigenes" Rechnersystem 23, das ebenfalls mit einem eigenen Peripheriegerät 27 versehen ist. Das Peripheriegerät umfasst z.B. zwei Monitore, die standardmäßig zum Scanmikroskop 100 gehören. Über das Rechnersystem 23 läuft die gesamte Ansteuerung des Scanmoduls 7 und der darin vorgesehenen Scanspiegel 9 und die Detektion mit dem SP-Modul 20.
  • Das Verfahren läuft im Allgemeinen so ab, dass vom Objekt 15 zunächst ein konfokales Übersichtsbild aufgenommen wird. Dann sucht man sich, z.B. durch Markierung mit dem Cursor, eine oder mehrere interessante Stellen im Bild und parkt oder positioniert dort den oder die Beleuchtungslichtstrahlen für eine bestimmte Zeit. Der Strahlteilerschieber 43 direkt vor dem Ausgang 45 wird dann auf die Leerstelle oder das einfache Substrat gestellt. Das einfache Substrat hat den Vorteil, dass man schneller zwischen konfokaler Bildaufnahme und FCS umschalten kann, da zwischen den Aufnahmen keine Spiegelschieber bewegt werden müssen. FCS – Aufnahmen und das SP-Modul 20 können dann quasi simultan genutzt werden. Dann wird das Fluoreszenzlicht auf die beiden Detektionskanäle 52 und 55 fokussiert. Die APD's dienen zum Photon-Counting. Das Signal wird dann der Detektorkarte 61 zugeführt. Mit Hilfe einer Software wird dann eine Auswertung (u.a. Berechnung der Auto- bzw. Kreuzkorrelation) des Signals vorgenommen und das Ergebnis wird auf dem zusätzlichen Monitor 62 dargestellt. Typischerweise werden mit diesem Verfahren Diffusionsgeschwindigkeiten, Konzentrationen, chemische Bindungen, usw. bestimmt.
  • 3 zeigt eine graphische Darstellung der durch die Avalanche-Photo-Diode 57 (APD) gemessenen Daten 65, die FCS Rohdaten sind, im Vergleich zu den Daten 66, die mit einem Tiefpass gefiltert wurden. Dabei ist auf der Abszisse die Zeit in Mikro-Sekunden (μs) aufgetragen. Die Zeit beschreibt diejenige Zeitspanne, innerhalb der Daten mit der Avalanche-Photo-Diode 57 aufgenommen werden. Auf der Ordinate ist die Intensität bzw. die Zahl der pro Zeiteinheit registrierten Photonen aufgetragen. Die gemessenen Daten 65 sind durch die Rauten repräsentiert. Die mit dem Tiefpass gefilterten Daten 66 sind durch die Quadrate dargestellt. Aufgrund der Filterung ergibt sich ein in den Spitzen reduzierter Verlauf. Die Fluoreszenzkorrelationen werden in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen mit einem Scanmikroskop 100 bestimmt, wobei das Scanmikroskop ein Umlenkmittel 5 zum Einkoppeln eines Beleuchtungslichtstrahls 3, ein Scanmodul 7 zur bildlichen Darstellung eines Objekts 15 auf einem Peripheriegerät 27 und mindestens eine Avalanche-Photo-Diode 57 für Photonenzählen umfasst. Bei der Bestimmung der Fluoreszenzkorrelationen werden die Daten aufgenommen, wobei der Beleuchtungslichtstrahls mit dem Scanmodul 7 für eine bestimmte Zeitspanne an einem Ort des Objekts 15 positioniert wird. Nach einem direkten Filtern oder einem Filtern der einer Fourieranalyse unterzogenen Daten erfolgt die Berechnung einer Korrelationsfunktion. Wie in 3 dargestellt, ist in einer Ausführungsform die Filterung mit einen Kurzpassfilter, um langsame Fluktuationen aus den aufgenommenen Daten herauszufiltern.
  • 4 ist eine graphische Darstellung von gefilterten Daten, wobei die gemessenen FCS Rohdaten mit einem Hochpass gefiltert wurden. Dabei ist auf der Abszisse die Zeit in Mikro-Sekunden (μs) aufgetragen. Die Zeit beschreibt diejenige Zeitspanne, innerhalb der Daten mit der Avalanche- Photo-Diode 57 aufgenommen werden. Auf der Ordinate ist die Intensität bzw. die Zahl der pro Zeiteinheit registrierten Photonen in relativen Einheiten aufgetragen. Die mit dem Hochpass gefilterten Daten 67 sind in 4 durch Rauten dargestellt. Die Filterung umfasst einen Langpassfilter, der schnelle Fluktuationen herausfiltert, was einer Vergrößerung der Samplingzeit bei der Aufzeichnung des Fluoreszenzsignals entspricht. Die berechnete Korrelationsfunktion beschreibt nur noch langsame Fluktuationen, deren Zeitbereich liegt weit oberhalb einer msec und somit ist die Verknüpfung dieser Methode mit Time-Lapse-Imaging möglich, so dass die Messwerte für die Korrelationsanalyse direkt aus den mit dem Scanmikroskop aufgenommenen Bildern verwendet werden. Die langsamen Fluktuationen dienen zur Analyse der Dynamik zellulärer Strukturen.
  • 5 ist eine graphische Darstellung der gemessenen FCS-Rohdaten (in 5 sind die aufgenommenen Daten 68 durch Rauten dargestellt), die durch Setzen einer oberen und unteren Schwelle 69 und 70, sowie durch mindestens eine Maskierung 71 vor der Korrelationsberechnung gefiltert werden. Dabei ist auf der Abszisse die Zeit in Sekunden aufgetragen. Die Zeit beschreibt diejenige Zeitspanne, innerhalb der die Daten mit der Avalanche-Photo-Diode 57 aufgenommen werden. Auf der Ordinate ist die Intensität bzw. die Zahl der pro Zeiteinheit registrierten Photonen aufgetragen. Die Maskierung 71 wird in denjenigen Bereichen der aufgenommenen Daten 68 durchgeführt, an denen Unregelmäßigkeiten im Vergleich zu den übrigen aufgenommenen Daten 68 auftreten. Die vorübergehende signifikante Abweichung der aufgenommenen Daten 68 über ein statistisch zu erwartendes Maß hinaus kann durch Setzen der oberen und unteren Schwelle 69 und 70 automatisch erkannt werden, so dass die durch Maskierung 71 gekennzeichneten Bereiche dann aus den aufgenommenen Daten 68 herausgeschnitten werden und nicht für die Korrelationsanalyse verwendet werden können. Der Computer 60 dient zur automatischen Ermittlung der oberen und unteren Schwelle 69 und 70 und der Maskierung 71, so dass diese automatisch auf dem Display eingetragen und dem Benutzer angezeigt werden kann.
  • 6 ist eine graphische Darstellung der durch Photobleaching abfallenden Rohdaten im Vergleich zu den Daten, die mit einem Modell angepasst wurden. Die gemessenen Daten 72 sind durch Rauten und die mit dem Modell angepassten Daten 73 sind durch Quadrate dargestellt. Die gemessenen Daten 72 werden durch eine empirische Trendkurve angepasst, das ein Polynom oder eine Summe von Exponentialkurven sein kann. 7 zeigt eine graphische Darstellung eines korrigierten Signals 74 aus 6. Die geeignet skalierte Differenz von den gemessenen Daten und der Trendkurve enthält dann nur noch die interessierenden diffusionsbedingten Fluktuationen, die mit einer Korrelationsanalyse erfasst werden können.
  • 8 ist eine graphische Darstellung, des nach schnellem Bleichen (Photobleaching) erfolgenden Anstiegs der Rohdaten oder der gemessenen Daten 75. Im Vergleich zu den angepassten Daten 76, die mit einem Modell angepasst wurden, sind ebenso die gemessenen Daten 75 dargestellt. In einem FCS-geeigneten experimentellen Setup, kann ein Spot-FRAP-Experiment durchgeführt werden. Der zeitliche Verlauf des erneuten Anstiegs nach dem Bleichen wird durch die Diffusion und die permanente oder transiente Immobilisierung der fluoreszenten Moleküle bestimmt und kann mit dem Modell angepasst werden. Die geeignet skalierte Differenz der angepassten Modellfunktion und des Originalsignals enthält dann nur noch die interessierenden diffusionsbedingten Fluktuationen, die mit einer Korrelationsanalyse erfasst werden können. Damit lassen sich gleichzeitig der diffusions- und der bindungsbedingte Beitrag zur molekularen Beweglichkeit quantitativ beschreiben. 9 zeigt eine graphische Darstellung des korrigierten Signals 77 aus 8.
  • Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
    • 1
    Beleuchtungssystem
    3
    Beleuchtungslichtstrahl
    5
    Umlenkmittel
    6
    Beleuchtungspinhole
    7
    Scanmodul
    9
    Scanspiegel
    12
    Scanoptik
    13
    Mikroskopoptik
    15
    Objekt
    17
    Detektionslichtstrahl
    18
    Detektionspinhole
    19
    Detektor
    20
    SP-Modul
    21
    Filterrad
    23
    Rechnersystem
    27
    Peripheriegerät
    28
    Tastatur
    29
    Einstellvorrichtung
    30
    Maus
    31
    Prisma
    32
    Lichtfächer
    33
    Fokussiermittel
    34
    Spiegelblendenanordnung
    35
    Spiegelblendenanordnung
    36
    Detektor
    37
    Detektor
    40
    erster Eingang
    41
    zweiter Eingang
    43
    Strahlteilerschieber
    44
    Linse
    45
    Ausgang
    46
    Gehäuse
    47
    Filterwürfel
    48
    Strahlteiler
    49
    Filter
    50a
    roter Anteil
    50b
    blauer Anteil
    51
    Linse
    52
    erster Detektionskanal
    53
    Umlenkspiegel
    54
    FC-Buchse
    55
    zweiter Detektionskanal
    56
    Multimodefaser
    57
    Avalanche-Photo-Diode
    58
    Gehäuse
    60
    Computer
    61
    Detektorkarte
    62
    Monitor
    65
    gemessenen Daten
    66
    Tiefpass gefilterte Daten
    67
    Hochpass gefilterte Daten
    68
    aufgenommene Daten
    69
    obere Schwelle
    70
    untere Schwelle
    71
    Maskierung
    72
    gemessene Daten
    73
    angepasste Daten
    74
    korrigiertes Signal
    75
    gemessene Daten
    76
    angepasste Daten
    77
    korrigiertes Signal
    100
    Scanmikroskop

Claims (21)

  1. Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen mit einem Scanmikroskop (100), das ein Umlenkmittel (5) zum Einkoppeln eines Beleuchtungslichtstrahls (3), ein Scanmodul (7) zur bildlichen Darstellung eines Objekts (15) auf einem Peripheriegerät (27), mindestens einen Detektor für Photonenzählen umfasst, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – Aufnehmen der Daten, wobei der Beleuchtungslichtstrahls (3) mit dem Scanmodul (7) für eine bestimmte Zeitspanne an einem Ort des Objekts (15) positioniert wird, – direkte Filterung der aufgenommenen Daten, und – Berechnen einer Korrelationsfunktion.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zuerst eine Fourieranalyse an den aufgenommenen Daten und anschließend eine Filterung, der der Fourieranalyse unterzogenen Daten durchgeführt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterung einen Kurzpassfilter umfasst, der langsame Fluktuationen aus den aufgenommenen Daten herausfiltert.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Filterung einen Langpassfilter umfasst, der schnelle Fluktuationen herausfiltert, was einer Vergrößerung der Samplingzeit bei der Aufzeichnung des Fluoreszenzsignals entspricht.
  5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass die berechnete Korrelationsfunktion, nur noch langsame Fluktuationen beschreibt, deren Zeitbereich weit oberhalb einer msec liegt und somit die Verknüpfung der Methode mit Time-Lapse-Imaging ermöglicht, so dass die Messwerte für die Korrelationsanalyse direkt aus den mit dem Scanmikroskop (100) aufgenommenen Bildern verwendet werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass die langsamen Fluktuationen zur Analyse der Dynamik zellulärer Strukturen dienen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Filterung einen Bandpassfilter umfasst, der eine obere und eine untere Grenze definiert, so dass Fluktuationen unterhalb der unteren und oberhalb einer oberen Grenze herausgefiltert werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass mit einem Bandblock- bzw. einem Notchfilter Fluktuationen zwischen einer unteren und einer oberen Grenze bzw. um eine mittlere Frequenz herausgefiltert werden, so dass bei der Berechnung der Korrelationsfunktion, nur noch die interessierenden Fluktuationen unterhalb der unteren und oberhalb der oberen Grenze beschreiben werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass vorübergehende signifikante Abweichungen der aufgenommenen Daten über ein statistisch zu erwartendes Maß hinaus durch Setzen einer oberen und unteren Schwelle automatisch erkannt werden, so dass diese Bereiche werden dann aus den aufgenommenen Daten herausgeschnitten werden und nicht für Korrelationsanalyse verwendet werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass die vorübergehenden, signifikanten Abweichungen durch fluoreszierende molekulare Aggregate oder durch die Anlagerung der fluoreszierenden Moleküle an weniger bewegliche Bestandteile des Objekts (15) verursacht werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass eine empirische Trendkurve verwendet wird, damit langsame Fluktuationen und insbesondere Drift durch Photobleaching angepasst werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die empirische Trendkurve ein Polynom oder eine Summe von Exponentialkurven ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass eine skalierte Differenz aus den aufgenommenen Daten und der Trendkurve berechnet wird, die dann nur noch die interessierenden diffusionsbedingten Fluktuationen enthält, die mit einer Korrelationsanalyse erfasst werden.
  14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe geeigneter analytischer Modellfunktionen mit dem Scanmikroskop (100), durch Photobleaching bedingt, ein kontinuierlicher Abfall des Signals, der durch permanent oder transient immobilisierter Moleküle verursacht wird, angepasst wird, wobei eine geeignet skalierte Differenz der angepassten Modellfunktion und der aufgenommenen Daten dann nur noch die interessierenden diffusionsbedingten Fluktuationen enthält.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass hieraus gleichzeitig der diffusions- und der bindungsbedingte Beitrag zur molekularen Beweglichkeit quantitativ beschreiben wird.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Scanmikroskop (100) ein Spot-FRAP-Experiment durchgeführt wird, wobei der zeitliche Verlauf des erneuten Anstiegs eines Signals nach dem Bleichen durch die Diffusion und die permanente oder transiente Immobilisierung der fluoreszierenden Moleküle bestimmt und mit Modellfunktionen angepasst wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geeignet skalierte Differenz der angepassten Modellfunktion und der aufgenommenen Daten nur noch die interessierenden, diffusionsbedingten Fluktuationen enthält, die mit einer Korrelationsanalyse erfasst werden, wobei gleichzeitig der diffusions- und der bindungsbedingte Beitrag zur molekularen Beweglichkeit quantitativ beschreiben wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionslichtstrahl (17) auf einen in einem Gehäuse (46) vorgesehenen Strahlteiler (48) gerichtet wird und von dort zu einem ersten und zweiten Detektionskanal (52 und 55) gelangt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionslichtstrahl (17) mit jeweils einer Multimodefaser (56) vom ersten und zweiten Detektionskanal (52 und 55) zu der mindestens einen Avalanche-Photo-Diode (57) geleitet wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Detektionssignalen, die durch den ersten Detektionskanal (52) und den zweiten Detektionskanal (55) gewonnenen Daten, eine Autokorrelationsfunktion berechnet wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionssignale mit mindestens einer Avalanche-Photo-Diode (57) gewonnen werden, und dass die aufgenommenen Daten zu einen Computer (60) geleitet werden, der die FCS-Analyse durchführt.
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