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Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzkorrelationsspektroskopieverfahren (FCS-Verfahren) gemäß dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs.
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Auf dem Gebiet der konfokalen scannenden Mikroskopie, insbesondere der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie, ist die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy; FCS) eine bewährte Methode, um beispielsweise die Dynamik des Verhaltens von Molekülen in Zellen zu untersuchen.
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Dabei kann unter Verwendung eines Laserscanningmikroskops (LSM) beispielsweise die Diffusion eines fluoreszenzmarkierten Moleküls oder eines selbst-fluoreszierenden Moleküls in und aus dem konfokalen Volumen des LSM ermittelt werden. Die Erfassung von FCS-Messdaten wird dabei durch ein Bleichen immobiler Moleküle gestört. Solche Moleküle diffundieren nicht frei, sondern bleiben fest an einem Messpunkt, weil sie zum Beispiel an einer biologischen Struktur gebunden sind.
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Derartige störenden Bleicheffekte können auf verschiedenen Wegen reduziert werden. In einem Ansatz werden immobile Moleküle durch einen Anwender des FCS-Verfahrens vor der eigentlichen Messung bewusst gebleicht, indem über eine meist aus Erfahrung gewählte Zeitdauer (z. B. 10 Sekunden) die entsprechende Probenstelle vor der eigentlichen Erfassung von FCS-Messdaten mit einer Anregungsstrahlung beleuchtet. Die Wellenlänge der Anregungsstrahlung ist so gewählt, dass die hinreichend stark beleuchteten Moleküle ihre Fähigkeit zu Emission von Fluoreszenzstrahlung dauerhaft verlieren, also gebleicht sind.
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Ein solches Bleichen erfolgt beispielsweise, indem der Anwender eine Serie von zehn sich wiederholenden FCS-Messungen zu je 10 Sekunden durchführt und dann die erste Messung oder die ersten beiden Messungen verwirft und nicht weiter auswertet. Nachteilig bei dieser Vorgehensweise ist, dass der Anwender viel Erfahrung benötigt, um die Zeitdauern des Bleichens richtig zu wählen. Anderenfalls müssen die Zeitdauern des Bleichens mit genügend großem zeitlichen Sicherheitspuffer gewählt werden, wodurch der Vorgang der FCS-Messung unnötig verlängert wird.
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Alternativ ist bekannt, mittels geeigneter mathematischer Filter das störende Bleichen nachträglich aus erfassten FCS-Messdaten zu entfernen (
DE 103 27 531 B4 ). Nachteilig dabei ist, dass die FCS-Messdaten dabei verändert und dadurch gegebenenfalls die Messergebnisse ungewollt verfälscht werden. Zudem müssen die Filter geeignet parametrisiert werden, was mit einem hohen Aufwand verbunden ist.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Möglichkeit zur Reduzierung unerwünschter Bleicheffekte und einer effizienten Durchführung eines FCS-Verfahrens vorzuschlagen.
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Die Aufgabe wird mit einem FCS-Verfahren gelöst, das die nachstehenden Schritte umfasst. Eine zu vermessende und Fluoreszenzmarker aufweisende Probe wird mit einer Anregungsstrahlung beleuchtet, um zumindest einen Anteil der Fluoreszenzmarker zu bleichen. Anhand der Auswahl der Wellenlänge beziehungsweise des Wellenlängenbereichs der Anregungsstrahlung sowie ihrer Intensität und Beleuchtungsdauer kann das Bleichen auf die bekannten oder erwarteten zu bleichenden Moleküle (Fluoreszenzmarker) und deren Eigenschaften abgestimmt und die zu bleichenden Moleküle ausgewählt werden. Nach erfolgtem Bleichen werden über mindestens einen Messzeitraum FCS-Messdaten der Probe erfasst, indem diese weiterhin mit der bisherigen Anregungsstrahlung oder mit einer Anregungsstrahlung anderer Wellenlänge beleuchtet wird. Eine durch Wirkung der Anregungsstrahlung emittierte Fluoreszenzstrahlung wird als Detektionsstrahlung erfasst und die FCS-Messdaten ermittelt.
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Kennzeichnend für das erfindungsgemäße Verfahren ist, dass während des Bleichens kontinuierlich oder wiederholt Intensitätswerte einer mittels der zum Bleichen auf die Probe gerichteten Anregungsstrahlung bewirkten Fluoreszenzstrahlung erfasst und mit einem Schwellwert verglichen wird. Infolge des Bleichens fallen die Intensitätswerte ausgehend von einer Ausgangsintensität ab. Erreichen die Intensitätswerte den Schwellwert, wird mit der Erfassung der FCS-Messdaten begonnen.
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Kerngedanke der Erfindung ist es, insbesondere die Startbedingungen der Verfahrensdurchführung eines FCS-Verfahrens effizient und in kontrollierter und nachvollziehbarer Weise herbeizuführen und optional zu dokumentieren. Mittels der Erfindung wird die Vergleichbarkeit mehrerer FCS-Messungen auch über unterschiedliche Proben hinweg verbessert. Zudem werden unnötige Probenbelastungen und Leerlaufzeiten der Experimentieranordnungen vermieden und die Geräteauslastung verbessert.
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Im Folgenden wird von Intensitätswerten gesprochen, wenn während des Bleichens (Bleichdauer) Messwerte der Probe erfasst werden. Im Gegensatz dazu sind FCS-Messdaten solche Daten, die nach erfolgtem Bleichen von der Probe erfasst werden und die eigentlich gewünschten Daten des FCS-Verfahrens darstellen.
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Unter dem Begriff der Fluoreszenzmarker werden zusammenfassend Fluorophore, mit Fluorophoren markierte Moleküle sowie selbst zur Emission von Fluoreszenzstrahlung fähige Moleküle verstanden.
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Der Schwellwert kann festgelegt werden, indem auf einen anhand von Ausgangsintensität und Bleichverhalten der Fluoreszenzmarker ermittelten Offset ein Bruchteil des Offsets addiert wird. Beispielsweise kann ein Schwellwert festgelegt werden, indem zum Offset ein Wert von 0,5%, 1%, 2% oder bis zu 5% des Offsets addiert wird.
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In einer weiteren Vorgehensweise wird ein Zustand der Probe ermittelt, ab dem sich die Intensitätswerte während des Bleichens nur noch um einen festgelegten geringen Betrag oder Anteil je Zeiteinheit ändern (Änderungsrate). Die erfassten Intensitätswerte schwanken dann um einen nicht veränderlichen Wert beziehungsweise nähern sich diesem an (Offset oder Grenzwert).
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Ein solcher Zustand kann in einer möglichen Verfahrensausgestaltung ermittelt werden, indem eine Zerfallsfunktion an die erfassten Intensitätswerte der bewirkten Fluoreszenzstrahlung angepasst wird, um zeitlich und/oder absolut ein Erreichen des Schwellwertes festzustellen oder vorherzusagen. Der Offset kann als ein Grenzwert ermittelt werden, indem dieser anhand der Zerfallsfunktion berechnet oder anhand des Verhaltens der Zerfallsfunktion während des fortwährenden Anpassens an die Intensitätswerte (Anfitten) geschätzt beziehungsweise vorhergesagt wird.
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Ein Beispiel einer solchen Zerfallsfunktion ist durch
gegeben.
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Dabei bedeuten:
- A
- Ausgangsintensität des bleichbaren Anteils des Signals,
- Offset
- Intensität des nicht bleichbaren Anteils des Signals (also des eigentlichen FCS-Signals),
- t
- Zeit und
- T
- Zeitkonstante des Bleichvorgangs.
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Das Bleichen wird beendet, wenn die aktuelle Intensität weniger als zum Beispiel 5% vom Offsetwert abweicht. Der Schwellwert wäre dann durch
gegeben.
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Um für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein bereits vorhandenes optisches System verwenden zu können, können in einer vorteilhaften Ausgestaltung die Intensitätswerte während des Bleichens und die FCS-Messdaten mit demselben Detektor erfasst werden.
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Dabei ist es vorteilhaft, wenn als Detektor ein Array mit einer Anzahl von Detektorelementen verwendet wird. Vorteilhaft können die Detektorelemente wahlweise einzeln oder gemeinsam ausgelesen werden. Beispielsweise kann ein sogenannter Airyscan-Detektor (Huff, 2015, Nature Methods; Application Notes, December 2015 sowie Scipioni et al., 2018; Nature Communications; DOI: 10.1038/s41467-018-07513-2) oder ein SPAD-Detektorarray (Single-Photon-Avalanche-Diode) verwendet sein. Solche Detektoren können beispielsweise in einer Zwischenbildebene des Detektionsstrahlengangs angeordnet sein, wobei jedes der Detektorelemente als eine Lochblende (Pinhole) fungiert.
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Eine derartige Ausführung des Detektionsstrahlengangs ermöglicht, dass die Detektorelemente des verwendeten Detektorarrays während des Bleichens zusammengeschaltet und additiv ausgelesen werden. Auf diese Weise kann mit einer hohen Sensitivität die Veränderung der Intensitätswerte ermittelt werden. Während der Erfassung der FCS-Messdaten werden dagegen die Detektorelemente entweder individuell ausgelesen und ausgewertet, oder es werden zuvor festgelegte Gruppen von Detektorelementen ausgelesen, wie dies weiter unten beschrieben wird.
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Die Anwendung einer Zerfallsfunktion kann zusätzlich zur Ermittlung des Schwellwertes auch genutzt werden, um Filterparameter für eine nachgeordnete Verarbeitung der erfassten Messdaten zu ermitteln. Beispielsweise können Filterparameter abgeleitet werden, wie sie in Verfahren gemäß der
DE 103 27 531 B4 verwendet werden.
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Die Vorteile der Erfindung liegen in einer automatisierten Auswertung des Bleichvorgangs und dessen Standardisierung. Durch einen Anwender wird lediglich und optional der Schwellwert beziehungsweise dessen Relation zur Ausgangsintensität und/oder zu einem vorliegenden Offset vorgegeben. Die Erfindung erlaubt eine verbesserte Geräteauslastung und deren Bedienung auch durch Anwender, deren Erfahrungsschatz hinsichtlich der jeweiligen Proben und des FCS-Verfahrens erst im Aufbau begriffen ist.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines Beispiels des zeitlichen Verlaufs einer Zerfallsfunktion (Zerfallskurve) während eines Bleichvorgangs in Vorbereitung einer FCS-Messung;
- 2 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
- 3 eine schematische Darstellung eines Airyscan-Detektors mit einer beispielhaften Nummerierung der Detektorelemente;
- 4 eine schematische Darstellung eines ortsauflösenden 2D-Detektors mit einer beispielhaften Nummerierung der Detektorelemente;
- 5 eine schematische Darstellung einer ersten Gruppe von Detektorelementen eines Airyscan-Detektors;
- 6 eine schematische Darstellung einer ersten Gruppe von Detektorelementen eines 2D-Detektors;
- 7 eine schematische Darstellung von vier Gruppen von Detektorelementen eines Airyscan-Detektors; und
- 8 eine schematische Darstellung von vier Gruppen von Detektorelementen eines 2D-Detektors;
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Die Abbildungen sind stark vereinfacht und beschränken sich in der Darstellung auf die zur Erläuterung erforderlichen technischen Elemente. Ebenso sind die Strahlengänge stark vereinfacht gezeigt.
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Vor Beginn einer FCS-Messung wird eine zu untersuchende Probe 48 mit einer Anregungsstrahlung einer geeigneten Wellenlänge (siehe 2) beleuchtet, um vorhandene unerwünschte Fluoreszenzereignisse zu reduzieren. Dabei wird eine Emission von Fluoreszenzstrahlung in der Probe 48 bewirkt.
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Während der Zeitdauer B (Bleichdauer B) dieses sogenannten Bleichens wird die dabei bewirkte Fluoreszenz als Intensitätswerte erfasst (beispielhaft durch Pluszeichen veranschaulicht). Eine zu Beginn des Bleichens erfasste Anfangsintensität A fällt dabei über die Bleichdauer B schnell ab. Der zeitliche Verlauf der erfassten Intensitätswerte wird mittels einer Zerfallsfunktion ZF beschrieben. Die Zerfallsfunktion ZF wird dabei vorteilhaft dynamisch an die erfassten und die neu hinzukommenden Intensitätswerte angepasst („fitting“), indem beispielsweise der Ansatz der Minimierung der Summe der Abweichungsquadrate angewandt wird.
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Die Zerfallsfunktion ZF fällt zu Beginn des Bleichens exponentiell ab und nähert sich einem Grenzwert (Offset) an. Um einen Schwellwert Sw im Sinne dieser Erfindung zu definieren, kann beispielweise eine Änderungsrate der Intensität je Zeiteinheit festgelegt werden, ab deren Erreichen der Bleichvorgang beendet und die FCS-Messung gestartet wird. Es ist auch möglich, den Schwellwert Sw als eine zulässige Abweichung vom Grenzwert zu definieren. Beispielsweise kann der Schwellwert Sw als Sw = Grenzwert + (Grenzwert / 100) n; mit n = 1, 2, ..., 5 festgelegt werden.
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Ist der Schwellwert Sw erreicht, beginnt die Erfassung von Messwerten der FCS-Messungen (jeweils als Kreuze dargestellt). Diese erfolgen beispielsweise in zeitlich aufeinanderfolgenden Intervallen FCSint, die wiederum zu einer vollständigen FCS-Messung FCStotal zusammengefasst werden können.
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Ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Erfassung von Helligkeitsinformationen einer Probe 48 (2) umfasst eine Lichtquelle 41, beispielsweise eine Laserlichtquelle, von der ausgehend ein Strahlenbündel einer Anregungsstrahlung ausgesendet und entlang eines Anregungsstrahlengangs 42 geführt wird. Optional vorhandene optische Elemente zur Formung und/oder Kollimation der Anregungsstrahlung sind nicht dargestellt. Im Anregungsstrahlengang 42 ist optional ein Mittel 44 zur gesteuerten Veränderung einer Ausdehnung des Strahlenbündels angeordnet, das im Ausführungsbeispiel als eine gesteuert einstellbare Blende ausgebildet ist. In weiteren Ausführungen kann auch ein Revolver oder ein Schieber vorhanden sein, mittels dem unterschiedliche Blenden in den Anregungsstrahlengang 42 eingebracht werden können. Alternativ kann das Mittel 44 auch ein gesteuert einstellbares Teleskop oder ein akustooptisches Element sein.
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Das Mittel 44 kann mittels eines Antriebs 416 aus dem Anregungsstrahlengang 42 herausbewegt werden (mit unterbrochener Volllinie angedeutet gezeigt), um unterschiedliche Numerische Aperturen zu bewirken, unter deren jeweiligen Winkelbereichen die Anregungsstrahlung in eine abzubildende Probe 48 gerichtet werden kann. Das Mittel 44 kann in weiteren Ausführungen hinsichtlich seiner Durchlässigkeit für die Anregungsstrahlung , insbesondere hinsichtlich eines Lochdurchmesser (Lochblende, Irisblende) oder der Länge und Breite eines Schlitzes (einstellbare Schlitzblende, akustooptisches Element) einstellbar sein.
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Die Anregungsstrahlung trifft nach dem Durchgang durch das Mittel 44 auf einen Hauptfarbteiler 43, der für die Anregungsstrahlung durchlässig ist und diese passieren lässt. Nach dem Hauptfarbteiler 43 durchläuft die Anregungsstrahlung einen Abschnitt des Strahlengangs der Vorrichtung, der als gemeinsamer Strahlengang 4210 bezeichnet wird und entlang dem die Anregungsstrahlung und eine Detektionsstrahlung (siehe unten) gemeinsam geführt sind beziehungsweise gemeinsam geführt werden können.
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Mittels eines nachfolgend angeordneten Scanners 46 kann das zuvor mittels eines Spiegels 45 umgelenkte Strahlenbündel der Anregungsstrahlung gesteuert abgelenkt und in die Eintrittspupille EP eines Objektivs 47 gerichtet werden. Der Spiegel 45 erlaubt eine kompakte Bauweise und kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung fehlen, wenn keine Umlenkung des Anregungsstrahlengangs 42 erforderlich oder vorgesehen ist.
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Die durch Wirkung des Mittels 44 in seiner lateralen Ausdehnung eingestellte und mittels des Scanners 46 gesteuert abgelenkte Anregungsstrahlung wird durch Wirkung des Objektivs 47 in einen Probenraum fokussiert, in dem die abzubildende Probe 48 auf einem Probentisch 49 vorhanden sein kann. Durch die derart fokussiert eingestrahlte Anregungsstrahlung wird im Zusammenwirken mit den jeweiligen Gruppen von Detektorelementen 1 bis 31 beziehungsweise 32 (siehe 3 bis 8) ein konfokales Anregungsvolumen erzeugt.
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Eine in der Probe 48 durch die Anregungsstrahlung in dem konfokalen Anregungsvolumen bewirkte Detektionsstrahlung wird mit dem Objektiv 47 erfasst und entlang eines Detektionsstrahlengangs 410 (mit unterbrochenen Volllinien gezeigt), der bis zum Hauptfarbteiler 43 mit dem Anregungsstrahlengang 42 zusammenfällt (gemeinsamer Strahlengang 4210), geführt.
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In weiteren Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Detektionsstrahlung mittels eines weiteren Objektivs (nicht gezeigt) erfasst werden. In einem solchen Fall können Anregungsstrahlengang 42 und Detektionsstrahlengang 410 vollständig voneinander getrennt sein oder diese werden, beispielsweise mittels eines weiteren Farbteilers (nicht gezeigt), wieder zu dem gemeinsamen Strahlengang 4210 vereinigt.
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Die Detektionsstrahlung wird im dargestellten Ausführungsbeispiel infolge des Passierens des Scanners 46 in einen ruhenden Strahl überführt („descannt“) und gelangt zum Hautfarbteiler 43. Dieser ist für die Wellenlänge der Detektionsstrahlung, die von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung verschieden ist, reflektierend. Die am Hauptfarbteiler 43 reflektierte Detektionsstrahlung gelangt zu einer im Detektionsstrahlengang 410 optional vorhandenen Zoomoptik 411. Diese ist mittels eines Zoomantriebs 412 einstellbar. In weiteren Ausführungen können die Durchlässigkeit und die Reflektivität des Hauptfarbteilers 43 auch umgedreht umgesetzt sein, sodass die Anregungsstrahlung reflektiert und die Detektionsstrahlung durchgelassen wird. Entsprechend sind dann die Strahlengänge 42 und 410 zu gestalten.
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Das Mittel 44, der Scanner 46, der Zoomantrieb 412 und die Antriebe 415 und 416 sowie optional die Lichtquelle 41 stehen mit einer Steuereinheit 413 in einer zum Austausch von Daten und Steuerbefehlen geeigneten Verbindung. Die Steuereinheit 413 ist beispielsweise ein Rechner oder ein geeigneter Steuerschaltkreis. Die Steuereinheit 413 ist zur Generierung von Steuerbefehlen ausgebildet. Diese Steuerbefehle dienen beispielsweise dazu, die Lichtquelle 41, das Mittel 44, den Scanner 46, den Zoomantrieb 412 und/oder einen optionalen Antrieb 415 des Probentischs 49 anzusteuern.
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Die Steuereinheit 413 ist zudem zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert. Dabei erhält die Steuereinheit 413 während der Bleichdauer B die erfassten Intensitätswerte und wertet diese aus, indem eine Annäherung beziehungsweise das Erreichen des Schwellwertes Sw ermittelt wird. Zudem kann die Steuereinheit 413 die Lichtquelle 41 dahingehend ansteuern, dass die Wellenlängen und/oder die Intensitäten der Anregungsstrahlung während der Bleichdauer B beziehungsweise während der Dauer der FCS-Messungen FCStotal und FCSint entsprechend eingestellt und bei Bedarf geregelt werden. Zudem können die erfassten Intensitätswerte und/oder die erfassten Messwerte der FCS-Messungen FCSint, FCStotal gespeichert werden. Optional werden diese erfassten Daten einander zugeordnet und wiederholt abrufbar in einem Speicher abgelegt, sodass auch bei späteren Auswertungen der FCS-Messwerte die zugehörigen Daten des Bleichvorgangs und/oder der Festsetzung des Schwellwerts Sw dokumentiert werden können.
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Die Zoomoptik 411 stellt ein Mittel zur gesteuerten Veränderung einer Ausdehnung des Strahlenbündels der Detektionsstrahlung dar, mittels der die Ausdehnung eines Strahlenbündels der erfassten Detektionsstrahlung an die Größe einer Detektionsfläche eines ebenfalls im Detektionsstrahlengang 410 in einem Zwischenbild („Pinhole-Ebene“) angeordneten ortsauflösenden Detektors 414 angepasst werden kann. Ziel dabei ist es, die Detektionsfläche möglichst vollständig auszuleuchten. Dementsprechend wird die Detektionsstrahlung mittels der Zoomoptik 411 auf den Detektor 414 gerichtet und mittels des Zoomantriebs 412 hinsichtlich der Ausdehnung ihres Strahlenbündels angepasst.
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In den 3 bis 8 sind beispielhaft Schritte und Ausgestaltungen eines FCS-Verfahrens erläutert, bei dem die Schritte des Bleichens und der Ermittlung des Schwellwerts Sw dem Erfassen der FCS-Messwerte vorangestellt und bereits abgeschlossen sind.
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Die 3 zeigt schematisch die Draufsicht auf die Detektionsfläche eines Airyscan-Detektors, der als ein ortsauflösender Detektor 414 verwendet werden kann. Die Helligkeitsinformationen der Detektorelemente 1 bis 32 sind einzeln auslesbar und können zudem beliebig miteinander kombiniert werden („binning“). Die Ausdehnung des Strahlenbündels der Detektionsstrahlung kann so gewählt werden, dass diese mit 1,25 Airy-Units (AU) auf die Detektionsfläche fällt. Dabei kann beispielsweise jedes der Detektionselemente 1 bis 32 einen Ausschnitt von 0,2 AU erfassen. Das zentrale und mit dem Bezugszeichen „1“ bezeichneten Detektorelement befindet sich auf der optischen Achse oA des Detektionsstrahlengangs 410.
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In der 4 ist eine weitere Ausführung eines ortsauflösenden Detektors 414 in einer zeilen- und spaltenweisen Anordnung der Detektorelemente 1 bis 31 (nachfolgend auch: 2D-Detektor) gezeigt, wie diese beispielsweise in einem SPAD-Array, einem CMOS-Chip oder sCMOS-Chip realisiert sein kann.
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In den folgenden 5 bis 8 werden jeweils technische Sachverhalte anhand der Detektorelemente 1 bis 31 beziehungsweise 32 eines Detektors 414 des Typs eines Airyscan-Detektors und eines Detektors 414 mit etwa rechteckiger, also zeilen- und spaltenweiser, Anordnung der Detektorelemente 1 bis 31 angegeben. Bei einer nachfolgenden Angabe der Nummern der betreffenden Detektorelemente wird auf 3 beziehungsweise auf 4 Bezug genommen. Das zentrale Detektorelement 1 ist in den folgenden 5 bis 8 zum Zwecke der besseren Übersichtlichkeit mit einem Schachbrettmuster gefüllt dargestellt.
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Für die Durchführung eines FCS-Verfahrens können die erfassten Helligkeitsinformationen der Detektorelemente 1 bis 32 gezielt miteinander verrechnet werden. Wie in den folgenden 5 bis 8 gezeigt wird, können dabei verschieden große virtuelle Lochblenden (Pinholes) erzeugt werden, indem die zeitgleich erfassten Helligkeitsinformationen der Detektorelemente 1 bis 32 selektiv aufaddiert werden. Dabei werden vorteilhaft die Helligkeitsinformationen sämtlicher Detektorelemente 1 bis 32 beziehungsweise 1 bis 31 erfasst und die virtuellen Pinholes durch eine gezielte Auswahl der erfassten Helligkeitsinformationen erzeugt. Erfasste Helligkeitsinformationen können dabei natürlich für die Analyse verschiedener Pinholes verwendet werden, weshalb diese vorteilhaft gespeichert vorgehalten werden. So wird beispielsweise die Helligkeitsinformation des Detektorelements 1 bei der Auswertung aller Pinholes verwendet.
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Für die Simulation eines Pinholes mit einem möglichst geringen Durchmesser werden nur die Helligkeitsinformationen des Detektorelements 1 verwendet. Diese bilden damit jeweils eine erste Gruppe von Detektorelementen eines Airyscan-Detektors (5) beziehungsweise eines 2D-Detektors (6). Die Helligkeitsinformationen der Detektorelemente 1 repräsentieren ein erstes Messvolumen innerhalb eines konfokalen Anregungsvolumens.
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Eine Auswahl der Detektorelemente 1 bis 32 (Airyscan-Detektor, 7) beziehungsweise der Detektorelemente 1 bis 31 (2D-Detektor, 8) als vier Gruppen von Detektorelementen führt jeweils zur Darstellung eines virtuellen Pinholes mit einem größtmöglichen Durchmesser, welches die Erfassung von Helligkeitsinformationen eines weiteren Messvolumens erlaubt.
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Mit der Musterfüllung beziehungsweise schwarz hinterlegt sind beispielhaft vier Gruppen von Detektorelementen visualisiert. In 8 (Airyscan-Detektor) sind dies in der ersten Gruppe das Detektorelement 1, in der zweiten Gruppe die Detektorelemente 2 bis 7, in der dritten Gruppe die Detektorelemente 8 bis 19 und in der vierten Gruppe die Detektorelemente 20 bis 32. In 13 (2D-Detektor) sind dies in der ersten Gruppe das Detektorelement 1, in der zweiten Gruppe die Detektorelemente 2 bis 9, in der dritten Gruppe die Detektorelemente 10 bis 12, 13 bis 15, 20 bis 23 und 28 bis 30 und in der vierten Gruppe die Detektorelemente 16 bis 19, 23 bis 27 und 31.
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Ein Zusammenschalten der Detektorelemente 1 bis 32 beziehungsweise 1 bis 31 (7, 8) kann sowohl während der Bleichdauer B (1) als auch während der Erfassung von FCS-Messwerten genutzt werden.
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Auch in weiteren Ausgestaltungen der Erfindung wird die Probe 48 wie oben beschrieben gebleicht, der Schwellwert festgelegt und dessen Erreichen überwacht und die FCS-Messung FCStotal mit Erreichen des Schwellwerts Sw begonnen. Dabei können FCS-Messwerte über eine Anzahl von Intervallen FCSlnt erfasst werden, ohne dass die Anzahl der ausgelesenen Detektorelemente 1 bis 31 beziehungsweise 32 verändert wird.
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Bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 2 kann ein erster Messblock ausgeführt werden, in dessen Rahmen vier Messvolumina des konfokalen Anregungsvolumens der Probe 48 gleichzeitig gemessen werden. Dabei wird die Zoomoptik 411 beispielsweise so eingestellt, dass die Detektionsstrahlung mit 1,25 AU auf die Detektionsfläche des Detektors 414 fällt. Jedes der vier oben beschriebenen virtuellen Pinholes repräsentiert dabei einen Durchmesser eines Messvolumens, wobei die Durchmesser der Messvolumina (Spotdurchmesser) von den aktuellen optischen Gegebenheiten des Mikroskops und der aktuell gewählten Numerischen Apertur (NA) abhängen, mit der die Anregungsstrahlung in die Eintrittspupille EP des Objektivs 47 fällt (siehe unten).
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In einem Schritt A erfolgt ein Beleuchten der Probe 48 mit dem fokussierten Strahlenbündel der Anregungsstrahlung unter Verwendung des Objektivs 47. Dabei wird die Anregungsstrahlung unter dem Winkelbereich einer ersten Numerischen Apertur auf und/oder in die Probe 48 gerichtet, indem eine erste Ausdehnung des Querschnitts des Strahlenbündels in der Eintrittspupille EP des Objektivs 47 eingestellt wird. Dazu kann beispielsweise das Mittel 44 aus dem Anregungsstrahlengang 42 herausbewegt beziehungsweise mit einer ersten Einstellung seiner freien Öffnung im Anregungsstrahlengang 42 angeordnet sein.
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In Schritt B wird die Detektionsstrahlung in einem durch die Beleuchtung bedingten konfokalen Anregungsvolumen in der Probe 48 erzeugt.
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Mit dem Schritt C erfolgt ein Erfassen der Detektionsstrahlung unter dem Winkelbereich der ersten Numerischen Apertur mittels des Objektivs 47.
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Die erfasste Detektionsstrahlung wird in Schritt D entlang des Detektionsstrahlengangs 410 geführt und auf den ortsauflösenden Detektor 414 abgebildet.
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Die Helligkeitsinformationen der jeweiligen Mitglieder einer Gruppe von insbesondere annähernd gleich weit von der optischen Achse oA entfernt angeordneten Detektorelementen der Gesamtheit von Detektorelementen 1 bis 31 beziehungsweise 1 bis 32 werden erfasst und den jeweiligen Detektorelementen beziehungsweise Gruppen zugeordnet.
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In einem zweiten Messblock werden die Schritte A bis E wiederholt, wobei in Schritt A eine zweite Ausdehnung des Strahlenbündels (zweite NA) in der Eintrittspupille EP des Objektivs 47 eingestellt wird, die von der ersten Ausdehnung (erste NA) verschieden, insbesondere geringer, ist. Dadurch wird die Anregungsstrahlung unter dem Winkelbereich der zweiten Numerischen Apertur auf und/oder in die Probe 48 gerichtet. Dazu kann beispielsweise das Mittel 44 in den Anregungsstrahlengang 42 hineinbewegt beziehungsweise mit einer zweiten Einstellung seiner freien Öffnung im Anregungsstrahlengang 42 angeordnet sein.
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Eine Einschränkung der lateralen Ausdehnung des Strahlenbündels der Anregungsstrahlung führt zu einer gegenüber der ersten Numerischen Apertur geringeren zweiten Numerischen Apertur, wodurch eine Vergrößerung der Anregungs-PSF bewirkt wird (PSF = Punktbildverwaschungsfunktion; point spread function).
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Entsprechend der gewählten zweiten Numerischen Apertur werden mittels der Steuereinheit 413 Steuerbefehle generiert und an den Zoomantrieb 412 übermittelt, um die Zoomoptik 411 so anzupassen, dass erneut eine sinnvolle Ausleuchtung der Detektionsfläche des Detektors 414 erreicht ist.
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Die tatsächlichen Werte beispielsweise der ersten und der zweiten Numerischen Apertur sowie der bewirkten Vergrößerung der Zoomoptik 411 werden vorteilhaft so gewählt, dass sich in der Gesamtheit der optischen Parameter Messvolumina ergeben, die sowohl genügend weit voneinander als auch weit genug von den Messvolumina anderer Messblöcke entfernt sind, um weitere sinnvolle Messvorgänge zu ermöglichen. Auf diese Weise ist es möglich, mit nur einem weiteren Messvorgang vier weitere Messvolumina für die Auswertung der hier beschriebenen „spotvariation FCS“ - Technik zu erhalten.
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Bezugszeichen
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- 1 bis 32
- Detektorelemente
- 41
- Lichtquelle
- 42
- Anregungsstrahlengang
- 4210
- gemeinsamer Strahlengang
- 43
- Hauptfarbteiler
- 44
- Mittel (zur gesteuerten Veränderung der Ausdehnung des Strahlenbündels der Anregungsstrahlung)
- 45
- Spiegel
- 46
- Scanner
- 47
- Objektiv
- 48
- Probe
- 49
- Probentisch
- 410
- Detektionsstrahlengang
- 411
- Zoomoptik
- 412
- Zoomantrieb, Stellelement
- 413
- Steuereinheit
- 414
- Detektor
- 415
- Antrieb (des Probentischs 49)
- 416
- Stellelement, Antrieb
- EP
- Eintrittspupille (des Objektivs 7)
- oA
- optische Achse (des Detektionsstrahlengangs 410)
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 10327531 B4 [0006, 0022]
