CN117589731A - 改进的荧光相关光谱方法 - Google Patents

改进的荧光相关光谱方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117589731A
CN117589731A CN202311021642.5A CN202311021642A CN117589731A CN 117589731 A CN117589731 A CN 117589731A CN 202311021642 A CN202311021642 A CN 202311021642A CN 117589731 A CN117589731 A CN 117589731A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fcs
radiation
detector
bleaching
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311021642.5A
Other languages
English (en)
Inventor
D·胡塞
S·卡利宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Publication of CN117589731A publication Critical patent/CN117589731A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N2021/0106—General arrangement of respective parts
    • G01N2021/0112—Apparatus in one mechanical, optical or electronic block
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明涉及一种荧光相关光谱(FCS)方法，其中在漂白时间(B)内用激发辐射照射待测量的具有荧光标记的样品(48)，以便漂白选定的荧光标记；并且在漂白已经进行了至少一个测量周期(FCSint；FCStotal)之后，样品(48)的FCS测量数据通过用激发辐射照射样品并通过检测由激发辐射引起的检测辐射来采集。本发明的特征在于，在漂白时间(B)期间，连续地或重复地采集由为了漂白目的而指向样品(48)的激发辐射引起的荧光辐射的强度值，并与阈值(Sw)进行比较，并且当达到阈值(Sw)时，开始采集FCS测量数据。

Description

改进的荧光相关光谱方法
技术领域
本发明涉及一种荧光相关光谱方法(FCS方法)。
背景技术
荧光相关光谱(FCS)是共焦扫描显微镜领域中的一种方法，特别是共焦激光扫描显微镜，其已经证明了它的价值，例如用于检查细胞中分子行为的动力学。
举例来说，当使用激光扫描显微镜(LSM)时，可以确定荧光标记的分子或自发荧光分子扩散进入和离开LSM的共焦体积。FCS测量数据的采集被固定分子的漂白中断。这种分子不自由扩散，而是保持固定在测量点，因为它们被结合到例如生物结构上。
这种干扰漂白效应可以用各种方法减少。在一种方法中，在实际测量之前，通过在实际采集FCS测量数据之前用激发辐射照射相应的样品位点一段时间(例如10秒)，该时间通常基于经验选择，由FCS方法的用户有意漂白固定分子。选择激发辐射的波长，使得被充分强烈照射的分子永久地失去它们发射荧光辐射的能力，即被漂白。
例如，通过用户执行一系列重复的10次每次10秒的FCS测量，然后丢弃第一次测量或前两次测量，并且不再对它们进行评估，来完成这种漂白。这种程序的缺点是用户需要大量的经验来选择正确的漂白时间。否则，漂白时间必须选择足够大的时间安全缓冲，这不必要地延长了FCS测量过程。
可选地，已知随后通过合适的数学滤波器从采集的FCS测量数据中去除干扰漂白(DE 103 27 531B4)。这样做的缺点是，FCS测量数据在过程中发生变化，因此，如果有必要，测量结果被无意篡改。此外，滤波器必须适当地参数化，这带来了很大的复杂性。
发明内容
本发明的目的是提出一种减少不希望的漂白效应和有效实施相对于现有技术改进的FCS方法的选项。
该目的通过包括以下步骤的FCS方法来实现。用激发辐射照射具有荧光标记的待测样品，以便漂白至少一部分荧光标记。通过选择激发辐射的波长或波长范围以及它的强度和照射持续时间，漂白可以适应于已知的或预期的要被漂白的分子(荧光标记)及其性质，并且可以选择要被漂白的分子。在漂白之后，通过用迄今为止使用的激发辐射或具有不同波长的激发辐射持续照射样品，在至少一个测量周期内采集样品的FCS测量数据。由于激发辐射的影响而发射的荧光辐射被检测为检测辐射，并且确定FCS测量数据。
根据本发明的方法的特征在于，在漂白期间，连续地或重复地采集荧光辐射的强度值，并与阈值进行比较，荧光辐射是通过为了漂白目的而指向样品的激发辐射产生的。漂白的结果是，强度值从初始强度开始降低。如果强度值达到阈值，则开始采集FCS测量数据。
特别地，本发明的核心思想是以受控和可理解的方式引起并可选地记载用于有效地执行FCS方法的过程的开始条件。通过本发明，甚至在不同样品上的几个FCS测量的可比性得到改进。此外，避免了样品上不必要的负载和实验布置的空闲时间，并且改进了装备利用率。
当在漂白期间(漂白时间)采集样品的测量值时，它们在下面被称为强度值。相比之下，FCS测量数据是在进行漂白之后从样品中采集的数据，代表FCS方法的实际所需数据。
术语荧光标记物通常指荧光团、用荧光团标记的分子以及自身能够发射荧光辐射的分子。
可以通过将偏移量的一部分添加到由荧光标记的初始强度和漂白行为确定的偏移量来设定阈值。例如，阈值可以通过将偏移量的0.5％、1％、2％或高达5％的值添加到偏移量上来设定。
在进一步的过程中，确定样品的状态，从该状态开始，强度值在漂白期间每单位时间仅变化限定的少量或百分比(变化率)。然后，采集的强度值会以不变的值波动或接近不变的值(偏移量或极限值)。
在该方法的可能实施例中，可以通过将衰减函数适配于所采集的所引起的荧光辐射的强度值来确定这种状态，以便在时间上和/或在绝对值上确定或预测阈值的达到。通过基于衰减函数计算偏移量，或者通过基于衰减函数在连续适应强度值(拟合)期间的行为来估计或预测偏移量，可以将偏移量确定为极限值。
这种衰减函数的示例是
1)
其中:
A是指信号的可漂白部分的输出强度，
Offset是指信号的不可漂白部分(即实际的FCS信号)的强度，
t是指时间，
T是指漂白过程的时间常数。
在当前强度与偏移量值的偏差小于例如5％时，漂白停止。阈值是
2)阈值Sw＝Offset+(Offset/100)*5
为了能够使用现有的光学系统来执行根据本发明的方法，在有利的实施例中，漂白期间的强度值和FCS测量数据可以用相同的检测器来采集。
如果具有多个检测器元件的阵列被用作检测器，这在这里是有利的。有利的是，可以单独或一起读取检测器元件。例如，艾里扫描检测器(Airyscan detector)(Huff,2015,Nature Methods；Application Notes,December 2015,and Scipioni et al.,2018；Nature Communications；DOI:10.1038/s41467-018-07513-2；)或SPAD检测器阵列(单光子雪崩二极管)可以被使用。这种检测器可以布置在例如检测光束路径的中间像平面中，其中每个检测器元件充当针孔光阑(针孔)。
检测光束路径的这种设计使得检测器阵列的检测器元件能够在漂白期间相互连接，并且能够被额外地读取。以这种方式，可以高灵敏度地确定强度值的变化。然而，在采集FCS测量数据期间，或者单独读取和评估检测器元件，或者读取先前定义的检测器元件组，如下所述。
除了确定阈值之外，衰减函数的应用也可以用于确定用于采集的测量数据的下游处理的滤波器参数。例如，如在根据DE 103 27 531B4的方法中所使用的那样，可以导出滤波器参数。
本发明的优点在于漂白过程及其标准化的自动评估。用户可选地仅指定阈值或其与输出强度和/或现有偏移量的关系。本发明还允许用户改进装备的利用和操作，用户关于各个样品和FCS方法的丰富经验仍在收集中。
附图说明
下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明，其中：
图1示出了在准备FCS测量的漂白过程期间随时间变化的衰减函数的分布(衰减曲线)的示例的示意图；
图2示出了根据本发明的设备的示例性实施例的示意图；
图3示出了具有检测器元件的示例性编号的艾里扫描检测器的示意图；
图4示出了具有检测器元件的示例性编号的空间分辨2D检测器的示意图；
图5示出了艾里扫描检测器的第一组检测器元件的示意图；
图6示出了2D检测器的第一组检测器元件的示意图；
图7示出了艾里扫描检测器的四组检测器元件的示意图；和
图8示出了2D检测器的四组检测器元件的示意图。
附图被简化了很多，并且在图示中被限制于解释所需的技术元素。光束路径同样以非常简化的方式示出。
具体实施方式
在开始FCS测量之前，用具有合适波长的激发辐射照射待检查的样品48(见图2)，以便减少现有的不需要的荧光事件。这导致样品48中发射荧光辐射。
在这种所谓的漂白的时间段B(漂白时间B)期间，以强度值的形式记录所产生的荧光(例如用加号表示)。在漂白过程开始时获得的初始强度A随漂白时间B快速降低。所获得的强度值的时间分布通过衰减函数ZF来描述。衰减函数ZF有利地动态适配于已经获得的和新添加的强度值(“拟合”)，例如，通过应用最小化平方偏差总和的方法。
衰减函数ZF在漂白开始时呈指数下降，并接近极限值(偏移量)。为了在本发明的意义内定义阈值Sw，例如，可以定义每单位时间强度的变化率，从该变化率开始漂白过程完成并且FCS测量开始。也可以将阈值Sw定义为与极限值的容许偏差。例如，阈值Sw可以设定为Sw＝极限值+(极限值/100)n；其中n＝1，2，…，5。
当达到阈值Sw时，开始采集FCS测量的测量值(每个显示为十字)。例如，以连续的时间间隔FCSint执行这些测量，FCSint又可以组合成完整的FCS测量FCStotal。
用于采集样品48(图2)的亮度信息的设备的示例性实施例包括光源41，例如激光光源，激发辐射光束从光源41发射并沿激发光束路径42被引导。没有示出用于激发辐射的整形和/或准直的可选的光学元件。在激发光束路径42中，可选地布置装置44，用于光束范围的受控改变，在示例性实施例中，装置44是以受控方式可设定的光阑的形式。在进一步的实施例中，也可以存在转台或滑块，通过转台和滑块可以将不同的光阑引入激发光束路径42。替代地，装置44也可以是以受控方式设定的望远镜或声光元件。
装置44可以通过驱动器416(用虚线表示)移出激发光束路径42，以实现不同的数值孔径，在其各自的角度范围内，激发辐射可以被引导到要成像的样品48中。在进一步的实施例中，装置44可以关于其对激发辐射的透射率进行设定，特别是关于孔径(针孔、虹膜光圈)或狭缝的长度和宽度(可设定的狭缝孔径、声光元件)。
在穿过装置44之后，激发辐射入射到主分色器43，主分色器43透射激发辐射并允许它通过。在主分色器43的下游，激发辐射穿过该设备的光束路径的部分，该光束路径被称为公共光束路径4210，并且激发辐射和检测辐射(见下文)沿该光束路径被一起引导或者可以被一起引导。
通过布置在其后的扫描仪46，先前通过反射镜45偏转的激发辐射光束可以以受控的方式偏转，并且被引导到物镜47的入射光瞳EP中。反射镜45允许紧凑的设计，并且如果不需要或设想激发光束路径42的偏转，则在该设备的其他版本中可以省略反射镜45。
通过装置44在其横向范围内作用的设定并通过扫描仪46以受控方式偏转的激发辐射通过物镜47的作用聚焦在样品空间中，在样品空间中，待成像的样品48可以存在于样品台49上。由于激发辐射以这种方式聚焦，所以在与各自组检测器元件1至31或32的相互作用中产生了共焦激发体积(参见图3至8)。
由共焦激发体积中的激发辐射在样品48中引起的检测辐射用物镜47检测，并沿检测光束路径410(用虚线示出)被引导，检测光束路径410与激发光束路径42一致，直到主分色器43(公共光束路径4210)。
在根据本发明的设备的另一实施例中，检测辐射可以通过另一物镜(未示出)来检测。在这种情况下，激发光束路径42和检测光束路径410可以彼此完全地分离，或者例如通过另一分色器(未示出)再次组合，以形成公共光束路径4210。
在所示的示例性实施例中，由于穿过扫描仪46(“去扫描”)并且到达主分色器43，检测辐射被转换成静止光束。主分色器反射检测辐射的波长，该波长不同于激发辐射的波长。在主分色器43处反射的检测辐射到达可选地存在于检测光束路径410中的变焦单元411。变焦单元411可通过变焦驱动器412来设定。在进一步的实施例中，主分色器43的透射率和反射率也可以反过来实现，结果是激发辐射被反射而检测辐射被允许通过。然后必须相应地设计光束路径42和410。
装置44、扫描仪46、变焦驱动器412和驱动器415和416以及可选的光源41适当地连接到控制单元413，用于交换数据和控制命令。举例来说，控制单元413是计算机或合适的控制电路。控制单元413被设计用于生成控制命令。举例来说，这些控制命令用于控制光源41、装置44、扫描仪46、变焦驱动器412和/或样品台49的可选驱动器415。
控制单元413额外地被配置为执行根据本发明的方法。在这种情况下，控制单元413在漂白时间B期间接收采集的强度值，并通过确定是否接近或达到阈值Sw来评估它们。此外，控制单元413可以以这样的方式控制光源41，使得在漂白时间B期间或者在FCS测量FCStotal和FCSint的持续时间期间激发辐射的波长和/或强度被相应地设定，并且如果必要的话，被控制在闭环中。此外，可以存储FCS测量FCSint、FCStotal的采集的强度值和/或采集的测量值。这些采集的数据可选地相互分配并存储在存储器中，以便能够重复检索，结果是漂白过程的相关数据和/或阈值Sw的设定也可以在FCS测量值的后续评估期间被记载。
变焦单元411是用于受控改变检测辐射光束的范围的装置，该装置可以用于使检测到的检测辐射的光束范围适应空间分辨检测器414的检测区域的尺寸，检测器414同样地在检测光束路径410中布置在中间像(“针孔平面”)中。目的是尽可能完全照亮检测区域。相应地，检测辐射通过变焦单元411被引导到检测器414，并且通过变焦驱动器412关于其光束的范围被适配。
图3至图8举例示出FCS方法的步骤和改进，其中漂白和确定阈值Sw的步骤在采集FCS测量值之前并且已经完成。
图3示意性地示出了艾里扫描检测器的检测区域的俯视图，检测器可以用作空间分辨检测器414。检测器元件1至32的亮度信息可以单独读取，也可以根据需要彼此组合(“丢弃”)。可以选择检测辐射的光束的范围，使得它以1.25艾里单位(AU)入射到检测区域上。例如，检测器元件1至32中的每个可以检测0.2AU的部分。用附图标记“1”表示的中央检测器元件位于检测光束路径410的光轴oA上。
图4示出了检测器元件1至31的以行和列布置的空间分辨检测器414(下文中也称为2D检测器)的另一实施例，例如可以SPAD阵列、CMOS芯片或sCMOS芯片实现。
在下面的图5至图8中，基于艾里扫描检测器类型的检测器414的检测器元件1至31或32以及具有检测器元件1至31的近似矩形(即，行方向和列方向)布置的检测器414给出技术事实。在特定检测器元件的编号的后续说明中，分别参考图3和图4。为了更清楚，在下面的图5至图8中示出了填充有棋盘图案的中央检测器元件1。
为了实现FCS方法，检测器元件1至32的采集的亮度信息可以通过计算选择性地彼此组合。如下图5至图8所示，通过选择性地将检测器元件1至32同时采集的亮度信息相加，可以生成不同尺寸的虚拟针孔光阑(针孔)。有利地采集所有检测器元件1至32或1至31的亮度信息，并且使用所采集的亮度信息的目标选择来生成虚拟针孔。采集的亮度信息当然可以用于分析不同的针孔，这是这些针孔被有利地存储的原因。例如，检测器元件1的亮度信息用于评估所有针孔。
为了模拟具有最小可能直径的针孔，仅使用检测器元件1的亮度信息。因此，在每种情况下，该亮度信息形成艾里扫描检测器(图5)或2D检测器(图6)的第一组检测器元件。检测器元件1的亮度信息表示共焦激发体积内的第一测量体积。
选择检测器元件1至32(艾里扫描检测器，图7)或检测器元件1至31(2D检测器，图8)作为四组检测器元件，在每种情况下，导致具有最大可能直径的虚拟针孔的表示，这允许采集另一测量体积的亮度信息。
举例来说，用图案填充或黑色背景来显现四组检测器元件。在图7(艾里扫描检测器)中，检测器元件1在第一组中，检测器元件2至7在第二组中，检测器元件8至19在第三组中，检测器元件20至32在第四组中。在图8(2D检测器)中，检测器元件1在第一组中，检测器元件2至9在第二组中，检测器元件10至12、13至15、20至23和28至30在第三组中，检测器元件16至19、23至27和31在第四组中。
检测器元件1至32或1至31(图7和8)的互连可以在漂白时间B(图1)期间和FCS测量值的采集期间使用。
在本发明的进一步改进中，样品48也如上所述被漂白，阈值被设定并被监控以达到，并且当阈值Sw已经达到时，开始FCS测量FCStotal。可以在多个间隔FCSInt上采集FCS测量值，而不改变读取检测器元件1至31或32的数量。
在使用根据图2的根据本发明的设备执行根据本发明的方法时，可以执行第一测量块，作为其一部分，同时测量样品48的共焦激发体积的四个测量体积。在这种情况下，变焦单元411被设定为例如使得检测辐射以1.25AU入射在检测器414的检测区域上。上述四个虚拟针孔中的每个表示测量体积的直径，其中测量体积的直径(点直径)取决于显微镜的当前光学条件和当前选择的数值孔径(NA)，在该数值孔径的情况下，激发辐射落入物镜47的入射光瞳EP中(见下文)。
在步骤A中，使用物镜47用激发辐射的聚焦光束照射样品48。在该过程中，通过设定物镜47的入射光瞳EP中的光束横截面的第一范围，激发辐射在第一数值孔径的角度范围内被引导到样品48处和/或样品48中。为此，例如，装置44可以被移出激发光束路径42，或者以其自由孔径的第一设定布置在激发光束路径42中。
在步骤B中，在由照射引起的样品48中的共焦激发体积中产生检测辐射。
在步骤C中，通过物镜47在第一数值孔径的角度范围之下检测该检测辐射。
在步骤D中，检测到的检测辐射沿检测光束路径410被引导，并成像到空间分辨检测器414上。
检测器元件1至31和1至32的总体中的一组检测器元件的各自成员的亮度信息被采集并分配给各自的检测器元件或组，检测器元件特别地被布置为离光轴oA大约相等的距离。
在第二测量块中，重复步骤A至E，其中在步骤A中，设定物镜47的入射光瞳EP中的光束的第二范围(第二NA)，其不同于第一范围(第一NA)，特别是更低。这将第二数值孔径的角度范围内的激发辐射引导到样品48处和/或样品48中。为此，例如，装置44可以被移动到激发光束路径42中，或者以其自由孔径的第二设定布置在激发光束路径42中。
限制激发辐射光束的横向范围导致小于第一数值孔径的第二数值孔径，导致激发PSF(点扩展函数)的大小增加。
根据所选择的第二数值孔径，控制命令由控制单元413生成并被传输到变焦驱动器412，以便调节变焦单元411，从而再次实现检测器414的检测区域的有意义的照射。
有利地选择例如第一和第二数值孔径的实际值以及所引起的变焦单元411的放大率，使得测量体积导致光学参数的总和，这些光学参数既充分远离其他测量块的测量体积，又足够远离其他测量块的测量体积，以便能够进行进一步的有意义的测量过程。通过这种方式，只需一个进一步的测量过程，就可以获得四个额外的测量体积，用于评估这里描述的“斑点变化FCS”技术。
附图标记列表
1至32 检测器元件
41 光源
42 激发光束路径
4210 公共光束路径
43 主分色器
44 装置(用于受控改变激发辐射的光束的范围)
45 反射镜
46 扫描仪
47 物镜
48 样品
49 样品台
410 检测光束路径
411 变焦单元
412 变焦驱动器、致动器
413 控制单元
414 检测器
415 (样品台49的)驱动器
416 致动器、驱动器
EP (物镜47的)入射光瞳
oA (检测光束路径410的)光轴

Claims (8)

1.一种荧光相关光谱方法，其中
-用激发辐射在漂白时间(B)内照射待测量且包含荧光标记的样品(48),以便漂白选定的荧光标记；
-在漂白至少一个测量周期之后(FCSint；FCStotal)，所述样品(48)的荧光相关光谱测量数据通过用激发辐射照射所述样品并通过检测由所述激发辐射引起的检测辐射来采集；
其特征在于
-在所述漂白时间(B)期间，连续地或重复地采集荧光辐射的强度值，并与阈值(Sw)进行比较，所述荧光辐射通过为了漂白目的而指向所述样品(48)的激发辐射而引起；和
-当达到所述阈值(Sw)时，开始采集所述荧光相关光谱测量数据。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阈值(Sw)基于每单位时间的所述检测辐射的强度值的最大允许变化率来设定。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，衰减函数(ZF)适配于所导致的荧光辐射的所采集的强度值，以便预测所述阈值(Sw)的达到。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过基于所述衰减函数(ZF)(偏移量)确定所述衰减函数(ZF)的极限值，并向所述偏移量添加所述偏移量的0.5％、1％、2％或高达5％的值来设定所述阈值(Sw)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述漂白时间(B)期间采集所述强度值，并且在所述测量周期(FCSint；FCStotal)期间所述荧光相关光谱测量数据使用相同的检测器(414)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具有多个检测器元件(1至31、32)的检测器阵列被用作所述检测器(414)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所使用的检测器(414)的检测器元件(1至31、32)是
-在所述漂白时间(B)期间连接并额外地读取；和
-在在所述测量周期(FCSint；FCStotal)期间采集所述荧光相关光谱测量数据期间，单独或以预定义的组进行读取和评估。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，基于所述衰减函数(ZF)来确定用于采集的测量数据的下游处理的滤波器参数。
CN202311021642.5A 2022-08-15 2023-08-14 改进的荧光相关光谱方法 Pending CN117589731A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102022208445.4A DE102022208445A1 (de) 2022-08-15 2022-08-15 Verbessertes FCS-Verfahren
DE102022208445.4 2022-08-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117589731A true CN117589731A (zh) 2024-02-23

Family

ID=89809563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311021642.5A Pending CN117589731A (zh) 2022-08-15 2023-08-14 改进的荧光相关光谱方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240060894A1 (zh)
CN (1) CN117589731A (zh)
DE (1) DE102022208445A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10327531B4 (de) 2003-06-17 2006-11-30 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Messung von Fluoreszenzkorrelationen in Gegenwart von langsamen Signalschwankungen
SE526643C2 (sv) 2004-02-20 2005-10-18 Anders Hedqvist Metod för att undvika blekning vid tillämpning av fluorescenskorrelationsspektroskopi
FR2976586B1 (fr) 2011-06-15 2015-01-23 Centre Nat Rech Scient Methode pour generer des proteines fluorescentes cyans ayant une sensibilite reduite au ph
WO2015185767A1 (es) 2014-06-04 2015-12-10 Abbcn, S.L. Etiquetas peptídicas para el marcaje de proteínas por fusión, y anticuerpos para su detección

Also Published As

Publication number Publication date
DE102022208445A1 (de) 2024-02-15
US20240060894A1 (en) 2024-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5485289B2 (ja) 分解能増進顕微鏡法
JP6771490B2 (ja) 共焦点レーザ走査顕微鏡を使用した蛍光走査顕微鏡法の信号の評価
US6300639B1 (en) Process and arrangement for the device configuration of confocal microscopes
JP4783931B2 (ja) 検出器の分光学的及び空間分解能を増大させるための方法
DE60037184T2 (de) Abbildungssystem für optischen bildabtaster
JP4826586B2 (ja) スペクトル画像処理方法、コンピュータ実行可能なスペクトル画像処理プログラム、スペクトルイメージングシステム
JPWO2008087869A1 (ja) 蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法
US20110182529A1 (en) Methods and apparatuses for structured illumination microscopy
US8988771B2 (en) Method for evaluating fluorescence results in a microscope image
JP2006098419A (ja) 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法
JP2006119152A (ja) 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置
EP1228354A1 (en) Apparatus and method for calibration of a microarray scanning system
JP2018531433A6 (ja) 少なくとも２つのスペクトル幅を区別する高解像度走査顕微鏡法
JP2018531433A (ja) 少なくとも２つのスペクトル幅を区別する高解像度走査顕微鏡法
US7319520B2 (en) Method for separating fluorescence spectra of dyes present in a sample
US7645971B2 (en) Image scanning apparatus and method
US7257289B2 (en) Spectral microscope and method for data acquisition using a spectral microscope
JP4539342B2 (ja) 解析装置、顕微鏡、および、解析プログラム
US11199500B2 (en) Method and microscopy system for recording a microscopic fluorescence image of a sample region containing a biological sample
US7474403B2 (en) Device and method for measuring the optical properties of an object
US20130321814A1 (en) Systems and methods for screening of biological samples
US20100134511A1 (en) Process for Generating Display Images from Acquired Recorded Images, and Means for Carrying out the Process
CN116249891A (zh) 探测发射光的方法、探测设备和激光扫描显微镜
JPH07209187A (ja) レーザ走査式細胞分析装置
CN117589731A (zh) 改进的荧光相关光谱方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication