WO2015185767A1 - Etiquetas peptídicas para el marcaje de proteínas por fusión, y anticuerpos para su detección - Google Patents

Etiquetas peptídicas para el marcaje de proteínas por fusión, y anticuerpos para su detección Download PDF

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WO2015185767A1
WO2015185767A1 PCT/ES2014/070460 ES2014070460W WO2015185767A1 WO 2015185767 A1 WO2015185767 A1 WO 2015185767A1 ES 2014070460 W ES2014070460 W ES 2014070460W WO 2015185767 A1 WO2015185767 A1 WO 2015185767A1
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amino acid
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Martí ALDEA MALO
Modesto OROZCO LÓPEZ
Cristina COSTA LEJA
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Abbcn, S.L.
Immunostep, S.L.
Fundació Institut De Recerca Biomèdica (Irb Barcelona)
Instituto De Biología Molecular De Barcelona - Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention is related to peptide tags and their fusion to recombinant proteins for analysis, detection, separation and purification. It is also related to monoclonal antibodies that specifically bind to these peptide tagging labels.
  • the invention has potential applications in various fields such as protein engineering, cell biology, and proteomics.
  • Protein labeling is used in the separation and purification of proteins of therapeutic interest, and also in basic research in the field of cellular and molecular biology.
  • labels for marking are available, among which are small peptides such as FLAG, cMyc and HA, or proteins such as GFP or GST (Terpe K. "Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems "Appl. Microbiol Biotechnol. 2003, vol. 60., pp. 523-533).
  • Peptide tags have to meet a very strict standard requirements, especially if the goal is to use them in cell studies in situ. Ideally, they should not alter the structure or interfere with the biological activity of the protein of interest, and should be stable in a variety of cellular contexts. In addition, they have to be accessible to their corresponding antibodies to facilitate their easy localization, they should not have a tendency to complex with themselves or other proteins, and should not alter or interfere with the location, distribution or degradation rate of the protein of interest .
  • the tag can modify the structure, function, interactions, or location. It is still somewhat surprising that ca. 20% of the more than 400 proteins analyzed in a recent integrative study show different localization patterns when comparing the fluorescent protein mapping to conventional immunofluorescence methods (Stadler, C. et al.
  • the inventors have found that the mapping of proteins of interest with certain peptide tags that meet a series of structural and functional requirements allows the detection of said protein of interest even under the most demanding experimental conditions, without compromising its original biological function.
  • the peptide tag of the invention is selected from a group consisting of a Phl P 2 fragment from Phleum pratense (PDB 1 WHP), a Hev b 6.02 fragment from Hevea brasiliensis (PDB 1 WKX), and an Amb t fragment 5 of Ambrosia trifida (PDB 3BBG), or a combination thereof.
  • any of these three antigenic labeling tags is highly harmless in terms of altering the intrinsic properties of the proteins they mark.
  • These labels when fused in the same polypeptide chain with a wide variety of proteins, ensure that they do not give alterations in their diffusion, stability, cell location, degradation rate, biological activity and other parameters, unlike other labels widely used in the field of the art such as HA or FLAG tags, which often alter the functions of the proteins they mark.
  • the peptide tags of the invention make it possible to perform cellular studies on expression, location and / or intracellular traffic, protein-protein interaction or degradation of a wide variety of proteins with a much lower probability of altering their native behavior, that is, their behavior when they are not marked. This point will allow a great advance in the investigation of numerous proteins since for the first time they can be studied at the cellular level (and / or purified in
  • a first aspect of the invention is a recombinant fusion protein comprising a protein or peptide that is fused at its N-terminal or C-terminal end to a tracer protein, where the tracer protein is defined by the following properties :
  • VMD Visual Molecular Dynamics
  • Fluorescent and the fusion protein is expressed in HEK293T cells, the resulting recombinant fusion protein maintains expression levels, such levels measured by immunodetection; maintains the structural stability defined according to immunodetection levels during 12 hours of treatment with 100 ⁇ g / ml of cycloheximide; maintains intracellular diffusion in vivo measured by loss of fluorescence during photobleaching, fluorescence measured by confocal fluorescence microscopy; and maintains the solubility of GFP in cell extracts measured by centrifugation of extracts at 15,000 g for 15 minutes, in vitro and in vivo;
  • cytoskeleton beta-actin the Golgi apparatus STX6 protein, H01 of the endoplasmic reticulum, nuclear HDAC2 and GRB2 of the plasma membrane in mouse NIH3T3 cells, as well as FMRP of the neuronal synapse in hippocampal neurons; and where the screening protein is selected from the group consisting of a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 2 and a fragment of Amb tia of Ambrosia trifida with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 3, or
  • a second aspect of the invention is a nucleotide sequence encoding the recombinant fusion protein according to the first aspect of the invention.
  • a third aspect of the invention is an expression cassette by
  • a fourth aspect of the invention is an expression vector comprising a nucleotide sequence according to the second aspect of the invention or an expression cassette according to the third aspect of the invention.
  • a fifth aspect of the invention is a host cell transfected or transduced with the nucleotide sequence according to the second aspect of the invention.
  • a sixth aspect of the invention is a method of obtaining a recombinant fusion protein according to the first aspect of the invention, which comprises:
  • a seventh aspect of the invention is a method for purifying or isolating a recombinant fusion protein according to the first aspect of the invention, which comprises carrying out the steps according to the sixth aspect of the invention and additionally a step where the fusion protein It is purified or isolated.
  • An eighth aspect of the invention is a method for detecting a recombinant fusion protein according to the first aspect of the invention comprising the steps that are carried out in the sixth aspect of the invention and additionally a step where means are added for the screening protein detection.
  • a ninth aspect of the invention is a monoclonal antibody that specifically binds to a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, and which is produced by hybridoma. deposited on 03.23.2014 in the institution "Leibniz-lnstitut DSMZ - Academic Press
  • a tenth aspect of the invention is a monoclonal antibody that specifically binds to a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 2, and which is produced by hybridoma. deposited on 14.05.2014 at the institution "Leibniz-lnstitut DSMZ -
  • An eleventh aspect of the invention is a monoclonal antibody that specifically binds a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 3, and that is produced by hybridoma. deposited on 03.27.2014 at the institution "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von
  • mapping proteins of the invention together with the specifically developed monoclonal antibodies represent a powerful tool in immunodetection, separation, isolation and purification applications of proteins that require high sensitivity in the formation of the antigen-antibody complex.
  • FIG. 1 Expression and aggregation tests of the selected tags in the bioinformatic screening.
  • the entry codes in the PDB database are indicated as a reference. The bar indicates 20 ⁇ .
  • b) The expression levels of the GFP-tag fusions are shown as mean values (30 cells) and confidence intervals for the mean (a 0.05).
  • the axis of the ordinates indicates expression in units relative to the native GFP protein
  • c) As a measure of the degree of aggregation, the coefficient of variation (%) of the intracellular pixel values for the tag-GFP fusions analyzed was obtained, and the mean values (30 cells) and their confidence intervals are indicated
  • FLIP whitewashed
  • FIG. 3 Functional safety tests of the labeling labels of the invention and those of the prior art on Cdc28 and Ydj1, two essential proteins of the S. cerevisiae budding yeast.
  • a control strain (without label) is shown as a reference.
  • the bar is 10 ⁇ .
  • the critical individual volumes of budding of the cells found in section b (N> 200) are shown in the graph.
  • ET5-FMRP merger was expressed in the Mouse hippocampal neurons and analyzed by immunofluorescence (clearer signal in the figure) with aET5 antibodies.
  • An image of GFP co-transfected and treated to improve somatic and neuritic limits is also shown for reference. 25 ⁇ bar.
  • a 5x amplification of the region indicated in the central panel is also shown. 5 ⁇ bar.
  • a 3D projection of this region is shown on the right panel.
  • FIG. 5 Stability and integrity of the tags of the invention and other commonly used peptide tags when fused to essential proteins of the S. cerevisiae budding yeast.
  • Total yeast cell extracts expressing endogenous levels of Cdc28 (a) or Ydj1 (b) fused to ET5 (Phl P 2), ET6 (Hev b 6.02), 3HA or 6FLAG were analyzed by immunodetection with acdc28 or aYdjl antibodies, respectively.
  • a control strain is also shown as a reference.
  • FIG. 6 Integrity analysis of the tags of the invention after affinity purification from E. coli cells.
  • a) The 6His fused tags were purified by divalent metal affinity chromatography, and analyzed by SDS-PAGE. Due to their small size, the ET6 and ET10 tags were expressed and purified as dimers. A common contaminating protein is marked with an asterisk, b) The corresponding fusions to GFP-6His were expressed, purified and analyzed as in section a. Unlabeled GFP-6His fusion is shown for reference.
  • FIG. 7 Sensitivity analysis of antibodies that bind labels of the invention ET5 (Phl P 2) and ET6 (Hev b 6.02).
  • the ET5 and ET6 tags fused to GFP were expressed in HEK293T cells and analyzed by immunofluorescence (clearer signal in the lower panel image) with the corresponding aET5 and aET6 antibodies. The fluorescence of the GFP is also shown (clearer signal in the image of the upper panel). The bar is 20 ⁇ .
  • the percentages of GFP-positive cells that were also positive for immunofluorescence are also shown as open circles (right axis).
  • FIG. 8 Non-specific immunofluorescence signal of the monoclonal antibodies of the invention, against the labels ET5 (Phl P 2) and ET6 (Hev b 6.02). a) An immunofluorescence analysis of HEK293T cells not transfected with the aFLAG antibody was carried out at a
  • One aspect of the present invention is a recombinant fusion protein that comprises a protein or peptide that is fused at its N-terminal or C-terminal end to a tracer protein, where the tracer protein is defined by the following properties:
  • 1 .2) is immunogenic; 1 .3) has a globularity index greater than 0.5, defined the globularity index as the fraction of residues with
  • 1 .4) is free of enzymatic activity; 1.5) is free of binding sites for cofactors or effectors; 1 .6) is free of degradation sequences;
  • 1 .7) is free of localization sequences; 1 .8) is of plant origin; 1, 9) is free from homopolymerization or heteropolymerization sequences; ; and where the screening protein is selected from the group consisting of a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of as at least 70% identity with SEQ ID NO: 2 and a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 3, or a combination thereof.
  • the screening protein is selected from the group consisting of a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of as at least 70% identity with SEQ ID NO: 2 and a fragment of Am
  • a first aspect of the invention is a recombinant fusion protein that comprises a protein or peptide that is fused at its N-terminal or C-terminal end to a tracer protein, where the tracer protein is defined by the following properties:
  • 1 .1) comprises a number of amino acid residues less than 100; 1 .2) is immunogenic; 1 .3) has a globularity index greater than 0.5, defined the globularity index as the fraction of waste with solvent accessibility and calculated using the VMD program; 1 .4) is free of enzymatic activity; 1.5) is free of binding sites for cofactors or effectors; 1 .6) is free of degradation sequences; 1 .7) is free of localization sequences; 1 .8) is of plant origin; 1 .9) is free from homopolymethization or heteropolymehzation sequences; 1 .10) when the Fluorescent Green Protein is fused at the N-terminal end and the fusion protein is expressed in HEK293T cells, the resulting recombinant fusion protein maintains expression levels, such levels measured by immunodetection; maintains the structural stability defined according to immunodetection levels during 12 hours of treatment with 100 ⁇ g / ml of cycloheximide; maintains intra
  • the marking protein is selected from the group consisting of a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with a amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 2 and a fragment of Amb tia of Ambrosia trifida with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 3, or a combination of same.
  • the marking protein is a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 1
  • the marking protein is a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 80% identity with SEQ ID NO: 1
  • the marking protein is a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence of at least 90% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the marking protein is a Phl P 2 fragment of Phleum pratense with an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, or what is the same with 100% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the screening protein is a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 2
  • the marking protein is a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of at least 80% identity with SEQ ID NO: 2
  • the marking protein is a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence of at least 90% identity with SEQ ID NO: 2.
  • the marking protein is a Hev b 6.02 fragment of Hevea brasiliensis with an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2, or what is the same with 100% identity with SEQ ID NO: 2.
  • the mapping protein is a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence of at least 70% identity with SEQ ID NO: 3. In another particular embodiment of the first aspect, the mapping protein is a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence of at least 80% identity with SEQ ID NO: 3.
  • the mapping protein is a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence of at least 90% identity with SEQ ID NO: 3.
  • the marking protein is a fragment of Ambrosia trifida Amb t 5 with an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3, or what is the same with 100% identity with SEQ ID NO: 3.
  • mapping proteins fused with the protein or peptide of interest are encoded, according to the second aspect of the invention, by a nucleotide sequence.
  • a third aspect of the invention is a recombination expression cassette comprising the sequence. nucleotide according to the second aspect of the invention, operatively linked to an expression control sequence.
  • the expression cassette is such that the expression control sequence comprises a target sequence for transcriptional regulators, a ribosome binding sequence and a transciption terminator sequence.
  • the seventh aspect of the invention is a method for purifying or isolating a recombinant fusion protein according to the first aspect, which comprises carrying out the steps according to the sixth aspect of the invention and additionally a step where The fusion protein is purified or isolated.
  • the additional step of purification or isolation of the fusion protein comprises an antibody or fragment thereof that binds to the tagging protein.
  • an eighth aspect of the invention is a method of detecting a recombinant fusion protein according to the first aspect of the invention which comprises carrying out the steps according to the sixth aspect of the invention and additionally a step in where means are added for the detection of the tidal protein.
  • the means for detecting the screening protein comprise an antibody or a fragment thereof.
  • the means for detecting the screening protein comprise a monoclonal antibody.
  • the means are selected from the antibodies obtained by hybridomas deposited in the institution "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" with the deposit numbers DSM ACC3236 (deposited on 03/27/2014), DSM ACC3234 (deposited on 03/27/2014) and DSM ACC3242 (deposited on 05/14/2014).
  • fusion protein as used herein means a single polypeptide chain composed of: 1) a protein of interest
  • protein from which you want to study its cellular expression, distribution, compartmentalization, interaction, etc. or protein that you want to isolate, purify or separate and 2) a protein (label) for marking.
  • label protein for marking.
  • tactal protein or tidal tag (terms that are interchangeable herein and that on some occasions are also called “tags” for their English nomenclature) as used herein mean a protein for which there are antibodies or other high affinity ligands, which is expressed fused (in the same chain
  • polypeptide to a protein of interest, in such a way that the protein of interest can be separated, purified or located in cellular studies thanks to the interaction of the protein of labeling with its high ligand affinity.
  • immunogenic means a substance (in the case of the present invention, a protein) that is capable of inducing an immune response.
  • the term "globularity index” gives an idea of the compactness of the structure of a protein, and is related to its stability and structural integrity. It is known that numerous proteins (or some of their domains) are intrinsically disordered, that is, they do not acquire a fixed three-dimensional structure. The more disordered a protein is, the lower its globularity, and is defined as the fraction of waste with solvent accessibility. In a disordered protein, the average solvent accessibility of its waste increases. There are numerous programs that calculate solvent accessibility of protein residues. In the present invention the VMD program has been used.
  • degradation sequence means an amino acid sequence that, when present in a polypeptide chain, directs the latter towards a path of degradation or partial proteolysis.
  • a degradation sequence commonly known and referred to as PEST is composed of segments rich in proline, glutamic, serine and threonine.
  • location sequence means an amino acid sequence that, when present in a polypeptide chain, directs the latter to a specific location within the cellular compartments (such as the Golgi apparatus, the reticulum endoplasmic, cell nucleus, etc.).
  • a typical nuclear localization sequence is the KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ) sequence.
  • nucleoplasmin which is composed of two groups of positively charged residues, and which is recognized by ⁇ -importin;
  • a typical C-terminal end sequence that causes protein retention in the endoplasmic reticulum is KDEL (SEQ ID NO: 5).
  • homopolymerization or heteropolymerization sequence means a sequence that, when present in a polypeptide chain, causes it to form complexes with other polypeptide chains identical to it (homo) or different in sequence or structure (hetero).
  • effector as used herein is a protein, a small organic molecule (such as a hormone, a metabolite, etc.) or an ion, which selectively binds to a protein to regulate its function. The effector normally has a specific binding site in the protein it regulates.
  • structural stability means here that the protein does not lose the three-dimensional conformation responsible for its biological activity, is not degraded, metabolized, or eliminated by different cellular protein processing systems.
  • transduction means a process by which a foreign DNA (heterologous) is introduced into a host cell through the use of a viral vector.
  • the ultimate objective of this process is that the foreign DNA be integrated into the genome of the host cell in such a way that the RNA and / or the protein by which it encodes are stably expressed in this cell.
  • the transduction is performed with the DNA encoding the recombinant fusion proteins.
  • transfection as used herein, means a process by which a foreign (heterologous) DNA is introduced into a host cell by any non-viral method, such as electroporation or by chemical treatment. In the case of the present invention, transfection is performed with the DNA encoding the proteins.
  • the expression “operably linked” means that the product or products of interest is (are) expressed in the correct reading frame under the control of the control or regulatory expression sequences.
  • percent identity should be understood as the percentage of amino acids or nucleotides equal between two or more independent sequences that are compared or aligned in such a way that the best value of coincidences between positions is obtained.
  • the percentage of identity between peptide sequences and between nucleotide sequences is preferably calculated using the BLAST algorithm by "Basic Local Alignment Search ⁇ , accessible from the NCBI portal
  • antibody or fragment thereof means any polyclonal or monoclonal antibody, or a fragment derived therefrom that still retains the ability to bind to its antigen.
  • fragments are: a fragment (Fab) 2 derived from the digestion of an antibody with pepsin, a Fab fragment derived from the digestion of an antibody with papain, an scFv fragment derived from fusing the two variable domains of the heavy and light chains , nanobodies (nanobodies) derived from camelid antibodies or sharks, etc.
  • the Green Fluorescent Protein is a 238 residue protein isolated from the Aequorea victoria jellyfish, which has a marked green fluorescence when exposed to ultraviolet light. This protein is commonly used in molecular and cellular biology studies as a marker. Being so easily detectable, it is used to control the level of gene expression, to control cell development, prokaryotic division, etc. It is in the Uniprot database with the entry (code) P42212, version 1 18 of the entry of 14 of Mato of 2014 and version 1 of the sequence of November 1, 1995. Cdc28 of Saccharomyces cerevisiae (or "cell division control protein 28" also called cyclin dependent kinase 1), is an essential protein for the control of the yeast cell cycle. It is in the Uniprot database with the entry (code) P00546, version 160 of the entry of 14 of Mato of 2014 and version 1 of the sequence of July 21, 1986.
  • Ydj1 from Saccharomyces cerevisiae (or "yeast DNAJ protein 1, also called” mitochondrial protein import protein MA S5 ”) is a 409 amino acid protein involved in the importation of proteins into the yeast mitochondria. It is found in the Uniprot database with the entrance
  • Mus-musculus beta-actin is a 375 residue protein that is involved in various cell motility processes and is an integral part of the cytoskeleton. It is in the Uniprot database with the entry (code) P60710, version 1 10 of the entry of May 14, 2014 and version 1 of the sequence of April 1, 1988. STX6 of Mus musculus (also called Sintaxin- 6) It is a 255 residue protein involved in intracellular vesicular traffic. It is found in the Uniprot database with the entry (code) Q9JKK1, version 101 of the entry of May 14, 2014 and version 1 of the sequence October 1, 2000.
  • Mus1 musculus HO1 (Heme oxygenase 1, also called P32 protein) is a 289 residue protein that is located in the reticulum
  • Mus musculus HDAC2 (also called HD2, Histone deacetylase 2) is a 488 residue protein that is located in the cell nucleus, and is involved in the deacetylation of lysine residues at the N-terminal end of histones (H2A, H2B, H3 and H4), and therefore is involved in DNA packaging and epigenetic regulation of expression of numerous genes. It is in the Uniprot database with the entry (code) P70288, version 142 of the entry of May 14, 2014 and version 1 of the sequence of February 1, 1997.
  • GRB2 of Mus musculus (growth factor receptor-bou nd protein2, also called "Adapter protein GRB2”) is a 217 residue protein that can be located in the cytoplasm, in endosomes or in the Golgi apparatus, and that plays a role in the connection between surface growth factors and Ras signaling path. It is in the Uniprot database with entry (code) Q60631, version 155 of the entry of May 14, 2014 and version 1 of the sequence of November 1, 1996.
  • Musrculculus FMRP (Fragüe X mental retardation protein) is a 589 residue protein found in hippocampal neurons. It is found in the Uniprot database with the entry (code) Q547R0, version 51 of the entry of April 16, 2014 and version 1 of the sequence of May 24, 2005.
  • NASH3T3 refers to the cell line also called 3T3. It is a standard fibroblast cell line widely used in cell research. This line was established in 1962 by two scientists at the University of New York, George Todaro and Howard Green.
  • Phl P 2 is the allergen of Phl P 2 pollen derived from Phleum pratense, a perennial herb found in most of Europe. This protein is found in the Uniprot database with the entry (code) P43214 (last modified October 16, 2013, version 80 of the entry and version 1 of the sequence of November 1, 1995). Its three-dimensional structure has been solved by X-ray crystallography and is accessible in the Protein Data Bank (PDB) with the code 1 WHP.
  • the amino acid sequence of the Phl P 2 allergen fragment used in the present invention is (SEQ ID NO 1):
  • Hev b 6.02 is an allergen derived from Hevea brasiliens s (tree of rubber), the most important species of trees that produce latex in South America. This protein is found in the Uniprot database with the entry (code) Q6JYQ7 (last modified February 19, 2014, version 51 of the entry and version 1 of the sequence of July 5, 2004). Its three-dimensional structure has been solved by X-ray crystallography and is accessible in the Protein Data Bank (PDB) with the code 1 WKX.
  • PDB Protein Data Bank
  • the amino acid sequence of the Hev b 6.02 allergen fragment used in the present invention is (SEQ ID NO 2):
  • Amb t 5" is the Amb t 5 pollen allergen derived from Ambrosia trifida (a species of the genus Ambrosia, very common herbaceous plants in America). This protein is found in the Uniprot database with the entry (code) P10414 (last modified February 19, 2014, version 82 of the entry and version 2 of the sequence of August 1, 1992). Its three-dimensional structure has been resolved by Nuclear Magnetic Resonance and is accessible in the Protein Data Bank with the code 3BBG.
  • the amino acid sequence of the Amb t 5 fragment used in the present invention is (SEQ ID NO 3):
  • Protein structures containing the 63,424 epitopes listed in IEDB were obtained using BLASTP against PDB (se they used the standard parameters). Finally, the list was extended to include possible homologs using the corresponding PFAM domains (Punta, M. et.al. "The Pfam protein families datábase”. Nuc ⁇ . Acids Res. 2012, vol. 40, D290-D301). The final list included 3,500 antigenic proteins that covered 1,383 PFAM domains.
  • the method uses a combination of sequence-based estimates that include: hydrophilicity, flexibility, accessibility, propensity to form beta turns, antigenic propensity and polarity.
  • sequence-based estimates that include: hydrophilicity, flexibility, accessibility, propensity to form beta turns, antigenic propensity and polarity.
  • the domains considered antigenic by at least two of the mentioned criteria were accepted.
  • VMD Humphrey, et.al.
  • Fluorescence loss in photobleaching was lost with a Zeiss LSM780 confocal microscope. A small circular region of the cytoplasm (3.6 pm 2 ) was repeatedly photobleached at maximum laser power for 3 seconds at a time and, between periods of bleaching, the cell was examined by image with low intensity light to measure the loss of fluorescence. For the quantitative analysis, the background intensity was subtracted, and the
  • the expression of the monomeric ET5 (Phl P 2) tag labeled with the 6His hexapeptide, of the dimeric ET6 tag (Hev b 6.02), or of the fusions corresponding to GFP was induced in E. coli BL21 (DE3) with 0.5 mM IPTG and grown at 25 ° C for 18h at 220 rpm.
  • the expressed proteins were purified by affinity in Ni-NTA (Qiagen) following manufacturer's instructions.
  • mice Female BALB / c mice were immunized intraperitoneally with 75 g of each of the peptide tags of the invention, emulsified in adjuvant (Stimune Adjuvant; Prionics). 30 and 60 days later, the mice were injected with 75 g of each of the antigens in adjuvant. 4 days before the fusion procedure, each mouse received an intravenous injection of the same antigen in 20 mM PBS phosphate. The splenocytes were fused with the myeloma cell line Sp2 / 0-Ag14. The hybridoma clones were selected by conventional indirect ELISA, and cells from positive wells were cloned by limiting dilution. Monoclonal antibodies were purified from the supernatants by G protein affinity chromatography (HiTrap
  • the HEK293T or NIH3T3 cells were quickly washed with PBS and fixed in 4% formaldehyde and 4% sucrose for 30 minutes at room temperature. The fixed cells were permeabilized with 0.1% triton in PBS for 5 minutes, and blocked with 1% BSA in PBS. The hippocampal neurons were blocked in 5% goat serum in PBS.
  • Primary antibodies against HA (Roche 3F10 rat clone), FLAG (M2 mouse clone, Sigma), ET5 (R19 / 8-1 1/18 mouse clone) and ET6 (R19 / 4-1 mouse clone 1 / 15) were used with antibodies
  • the structure of the three labels (ET5 corresponding to the Phl P 2 protein, ET6 corresponding to the Hev b 6.02 protein and ET10 corresponding to the Amb t 5 protein) It is based on a compact packaging based on beta sheets which, in the case of ET6 and ET10, is stabilized by the presence of disulfide bridges.
  • the fusions of these three labels to the GFP were expressed in the HEK293T cells and were basically detected as a single band with the expected molecular weight expected for each case in western blot experiments (FIG.2d), and their stability in the presence of cycloheximide It was revealed to be practically identical to that of the control GFP (FIG. 2e).
  • the fusion of labeling tags at the N or C-terminal ends of the proteins of interest can produce unexpected effects on their functions, intracellular localization or association with macromolecular complexes, particularly if the tags do not have a clearly defined structure and are intrinsically disordered.
  • the three labels that are part of the invention contain clear structural determinants and hence they should have less propensity to produce unexpected effects on the fusion proteins under study when compared with other labeling tags such as FLAG or HA, two of the more widely used. To prove this last point, it was decided to carry out a series of comparative analyzes of the effects produced by the labeling in two essential proteins of the S. cerevisiae yeast, a cyclin dependent kinase and a chaperone of domain J.
  • the molecular chaperones use the energy derived from the hydrolysis of the phosphate bonds of the ATP to transmit conformational changes to their client proteins, thus facilitating their correct folding and promoting the assembly or disassembly of multiprotein complexes.
  • One of the most ubiquitous classes of chaperones is the Heat Shock 70 kDa (Hsp70s) family, which invariably requires the participation of the J-domain co-chaperones, which stimulate their ATPase activity and cooperate in protein binding client.
  • Ydj1 is the most abundant domain chaperone J in yeast and, apart from its activities in proteome homeostasis, plays a crucial role in the release of cyclin Cln3 from the reticulum endoplasmic to trigger entry into the cell cycle.
  • Ydj1 contains a dimerization domain at its C-terminal end that is essential for its function. Accordingly, it was decided to obtain fusions at the C-terminal end of the endogenous YDJ1 locus (FIG. 5b) and to test possible deleterious effects of the peptide tags ET5, ET6, 6xFLAG and 3xHA on the function of Ydj1. None of the peptide tags caused detectable effects on Ydj1 levels or their integrity. Similar to Cdc28, the fusion of Ydj1 with the 6xFLAG label produced the most severe effects, which could be observed even under normal growth conditions at 30 degrees Celsius (FIG. 3e).
  • both the 6xFLAG label and the 3xHA label produced a clear decrease in growth at high temperatures, where the function of co-chaperone Ydj1 becomes essential.
  • the fusion of Ydj1 with ET5 or ET6 produced very moderate effects on growth at 37 degrees Celsius (FIG. 3e).
  • Ydj1 is also very important to coordinate growth and entry into the cell cycle associated with size.
  • both the 6xFLAG label and the 3xHA label caused a marked increase in critical size in the G1 / S transition (FIG. 3f).
  • neither ET5 nor ET6 produced an obvious effect on critical size, which suggests that these marking labels are
  • the monoclonal antibodies that tested positive were tested at low concentrations in HIK293T cells by immunofluorescence to check their sensitivity and efficiency (FIG. 7) and, above all, a low background signal at high concentrations in control cells (FIG. 8) .
  • these results demonstrate the functional safety of the labels of the invention in terms of the distribution of a group of proteins found in various compartments of the cell such as the nucleus, the Golgi apparatus, the cytoskeleton, the endoplasmic reticulum , the plasma membrane or the neuronal synapse.

Abstract

Se proporcionan etiquetas peptídicas (tags), para su fusión a proteínas en su extremo N-terminal o C-terminal, las cuales están definidas por una serie de propiedades estructurales y funcionales que definen su inocuidad en cuanto a la modificación de la estructura o la función biológica de la proteína o péptidoal cual se fusionan, y en donde la proteína de marcaje se selecciona del grupo consistente en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense, un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensisy un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trifida, o una combinación de las mismas. También se proporcionan métodos para la producción y detección de estas proteínas recombinantes de fusión, así como anticuerpos específicos que se unen a estas etiquetas de marcaje.

Description

Etiquetas peptídicas para el mareaje de proteínas por fusión, y anticuerpos para su detección
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención está relacionada con etiquetas peptídicas {tags) y su fusión a proteínas recombinantes para su análisis, detección, separación y purificación. También está relacionada con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a estas etiquetas peptídicas de mareaje. La invención tiene aplicaciones potenciales en diversos campos como el de la ingeniería de proteínas, la biología celular, y la proteómica.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La ingeniería genética permite actualmente la manipulación y la expresión de prácticamente cualquier secuencia de DNA (y la producción de la proteína para la que codifica) en un número cada vez mayor de células huésped. La tecnología del DNA recombinante permite fusionar dos o más proteínas de tal manera que las dos son traducidas en una única secuencia polipeptídica. Esta es la ¡dea fundamental en la que se basa el etiquetado de proteínas. Una proteína de interés puede ser marcada (fusionada) con una segunda proteína antigénica de mareaje para la que existen anticuerpos específicos (u otro tipo de ligando de gran afinidad). La proteína de interés puede así ser fácilmente localizada, separada o purificada gracias a la interacción de la proteína antigénica fusionada y su anticuerpo o ligando.
El etiquetado de proteínas se utiliza en la separación y purificación de proteínas de interés terapéutico, y también en investigación básica en el ámbito de la biología celular y molecular. En la actualidad se dispone de un cierto número de etiquetas para el mareaje, entre las cuales se encuentran péptidos de pequeño tamaño como FLAG, cMyc y HA, o proteínas como GFP o GST (Terpe K. "Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentáis to commercial systems" Appl. Microbiol Biotechnol. 2003, vol. 60., pp. 523-533).
Las etiquetas peptídicas tienen que cumplir con una de serie requisitos muy estrictos, en especial si el objetivo es utilizarlas en estudios celulares in situ. Idealmente, no deben alterar la estructura ni interferir con la actividad biológica de la proteína de interés, y deben ser estables en una variedad de contextos celulares. Además, tienen que ser accesibles a sus anticuerpos correspondientes para propiciar su fácil localización, no deben tener tendencia a formar complejos con ellas mismas u otras proteínas, y no deben alterar o interferir con la localización, distribución o velocidad de degradación de la proteína de interés.
Aunque algunas etiquetas son más versátiles que otras, en general no todas tienen la misma fiabilidad en todo tipo de aplicaciones. Habitualmente su eficiencia se mueve en un rango de aceptable a alta en la separación y purificación de proteínas, pero su aplicación en estudios funcionales in vivo sigue ofreciendo a menudo problemas de difícil solución, pues las distintas estrategias de mareaje siempre implican el riesgo de alterar la función de la proteína nativa por interacciones impredecibles con la etiqueta peptídica. Las etiquetas de gran tamaño tienen mayor probabilidad de causar interferencia esférica. Por otra parte, y debido a su desorden estructural intrínseco, las etiquetas de pequeño tamaño pueden adoptar conformaciones muy diversas, lo cual facilita enormemente su interacción con la proteína diana con consecuencias negativas impredecibles sobre su función. En primer lugar, interacciones espurias de la etiqueta en fases intermedias de plegamiento pueden alterar la conformación final de la proteína diana y favorecer su acumulación en grandes agregados. En segundo lugar, la proteína de fusión puede ser más sensible a degradación. Finamente, si tienen lugar
interacciones no deseadas con dominios esenciales de la proteína diana, la etiqueta puede modificar la estructura, función, interacciones, o localización. No deja de ser un tanto sorprendente que ca. 20% de las más de 400 proteínas analizadas en un estudio integrativo reciente muestran patrones de localización distintos al comparar el mareaje con proteínas fluorescentes a los métodos de inmunofluorescencia convencionales (Stadler, C. et al.
"Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells" Nat. Methods 2013, vol. 10, pp. 315-323). Las limitaciones mencionadas para los pares etiqueta-anticuerpo de mareaje suponen con frecuencia un obstáculo para la investigación. Los estudios experimentales que se centran en determinar con precisión la localización, transporte, compartimentalización e interacción de diferentes proteínas en la célula se ven frenados con frecuencia por la falta de etiquetas inocuas en su función y de anticuerpos que sean de gran afinidad de tal manera que permitan su utilización en experimentos de inmunofluorescencia in situ.
Además, al recomendarse un único par etiqueta-anticuerpo para
determinadas aproximaciones expenmentales, los investigadores no pueden probar diferentes etiquetas para comprobar si su presencia, ausencia o intercambio repercute en la aparición o desaparición de funciones de la proteína de interés, o en la ganancia o pérdida de determinadas funciones biológicas. Así, hay una creciente necesidad en este campo de la técnica por descubrir etiquetas nuevas con mayor inocuidad funcional y aplicabilidad en diferentes aproximaciones experimentales, y cuyos anticuerpos exhiban tanto una mayor sensibilidad como una menor reactividad cruzada. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han hallado que el mareaje de proteínas de interés con determinadas etiquetas peptídicas que cumplen una serie de requisitos estructurales y funcionales permite la detección de dicha proteína de interés incluso bajo las condiciones experimentales más exigentes, sin comprometer su función biológica original. La etiqueta peptídica de la invención se selecciona de un grupo que consiste en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense (PDB 1 WHP), un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis (PDB 1 WKX), y un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida (PDB 3BBG), o una combinación de las mismas.
Sorprendentemente, se ha hallado que cualquiera de estas tres etiquetas antigénicas de mareaje es altamente inocua en cuanto a la alteración de las propiedades intrínsecas de las proteínas que marcan. Estas etiquetas, cuando se fusionan en la misma cadena polipeptídica con una gran variedad de proteínas, consiguen que no se den en ellas alteraciones en cuanto a su difusión, estabilidad, localización celular, velocidad de degradación, actividad biológica y otros parámetros, al contrario que otras etiquetas ampliamente utilizadas en el campo de la técnica como son las etiquetas HA o FLAG, las cuales sí alteran a menudo las funciones de las proteínas que marcan.
Por consiguiente, las etiquetas peptídicas de la invención permiten realizar estudios celulares sobre expresión, localización y/o tráfico intracelular, interacción proteína-proteína o degradación de una gran variedad de proteínas con una probabilidad mucho menor de alterar su comportamiento nativo, es decir, su comportamiento cuando no están marcadas. Este punto permitirá un gran avance en la investigación de numerosas proteínas ya que por primera vez se pueden estudiar a nivel celular (y/o purificar en
condiciones nativas) sin que su comportamiento se vea modificado por la presencia de la etiqueta. Así, un primer aspecto de la invención es una proteína recombinante de fusión que comprende una proteína o péptido que está fusionada en su extremo N-terminal o C-terminal a una proteína de mareaje, donde la proteína de mareaje está definida por las siguientes propiedades:
1 .1 ) comprende un número de residuos aminoacídicos inferior a 100;
1 .2) es inmunogénica;
1 .3) tiene un índice de globularidad superior a 0.5, definido el índice de globularidad como la fracción de residuos con accesibilidad al solvente y calculado mediante el programa Visual Molecular Dynamics (VMD);
1 .4) está libre de actividad enzimática;
1 .5) está libre de sitios de unión para cofactores o efectores;
1 .6) está libre de secuencias de degradación;
1 .7) está libre de secuencias de localización;
1 .8) es de origen vegetal;
1 .9) está libre de secuencias de homopolimerización o heteropolimerización; 1 .10) cuando está fusionada en el extremo N-terminal a la Proteína Verde
Fluorescente y se expresa la proteína de fusión en células HEK293T, la proteína recombinante de fusión resultante mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodetección; mantiene la estabilidad estructural definida según niveles por inmunodetección durante 12 horas de tratamiento con 100 μg/ml de cicloheximida; mantiene la difusión intracelular in vivo medida mediante pérdida de fluorescencia durante fotoblanqueado, la fluorescencia medida mediante microscopía confocal de fluorescencia; y mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 g durante 15 minutos, in vitro e in vivo;
1 .1 1 ) cuando está fusionada en el extremo C-terminal de la proteína Cdc28 o de la proteína Ydj1 de Saccharomyces cerevisiae, la proteína recombinante de fusión mantiene la morfología definida por microscopía de campo claro; y mantiene la viabilidad celular medida mediante plaqueo a 42°C;
1 .12) cuando está fusionada a la Proteína Verde Fluorescente y se expresa en Escherichia coli, mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodetección; mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 g durante 15 minutos; y mantiene la eficiencia en la purificación por
cromatografía de afinidad medida mediante inmunodetección;
1 .13) mantiene los niveles de expresión, esta expresión medida mediante inmunofluorescencia y mantiene la localización celular determinada mediante microscopía confocal de fluorescencia de proteínas que se encuentran en diferentes compartimentos celulares, dichas proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: beta-actina del citoesqueleto, la proteína STX6 del aparato de Golgi, H01 del retículo endoplasmático, la HDAC2 nuclear y GRB2 de la membrana plasmática en células NIH3T3 de ratón, así como FMRP de la sinapsis neuronal en neuronas del hipocampo; y donde la proteína de mareaje se selecciona del grupo consistente en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2 y un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3, o una combinación de las mismas.
Un segundo aspecto de la invención es una secuencia nucleotídica que codifica por la proteína recombinante de fusión según el primer aspecto de la invención. Un tercer aspecto de la invención es un cassette de expresión por
recombinación que comprende la secuencia nucleotídica según el segundo aspecto de la invención, operativamente unida a una secuencia de control de la expresión. Un cuarto aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica según el segundo aspecto de la invención o un cassette de expresión según el tercer aspecto de la invención. Un quinto aspecto de la invención es una célula huésped transfectada o transducida con la secuencia nucleotídica según el segundo aspecto de la invención.
Un sexto aspecto de la invención es un método para obtener una proteína recombinante de fusión según el primer aspecto de la invención, que comprende:
1 ) Fusionar al menos una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína o péptido con una secuencia nucleotídica que codifica para la etiqueta de mareaje;
2) Clonar la secuencia resultante del paso 1 en una célula huésped;
3) Expresar la secuencia clonada en el paso 2 en una célula. Un séptimo aspecto de la invención es un método para purificar o aislar una proteína recombinante de fusión según el primer aspecto de la invención, que comprende llevar a cabo los pasos según el sexto aspecto de la invención y adicionalmente un paso en donde la proteína de fusión se purifica o aisla.
Un octavo aspecto de la invención es un método para detectar una proteína recombinante de fusión según el primer aspecto de la invención que comprende los pasos que se llevan a cabo en el sexto aspecto de la invención y adicionalmente un paso en donde se añaden medios para la detección de la proteína de mareaje.
Asimismo, se ha comprobado que cuando las proteínas recombinantes de fusión que forman parte de la invención se detectan mediante el uso de los anticuerpos específicamente desarrollados contra ellas, permiten realizar estudios celulares in situ incluso de las proteínas que tienen niveles de expresión más bajos y que por ende requieren una sensibilidad
extremadamente alta para su detección.
Un noveno aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , y que se produce mediante el hibridoma depositado el 27.03.2014 en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3234. El hibhdoma de la invencón, fue depositado de acuerdo con el tratado de Budapest el 27.03.2014, en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", en Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, por los depositantes AbBCN S.L. (Campus UAB 08193 Bellaterra) y Immunostep S.L. (Campus Unamuno, 37007, Salamanca). El hibhdoma se identificó por el depositante mediante la referencia ET5-1 , y recibió el número de acceso DSM ACC3234 y fue declarado viable.
Un décimo aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2, y que se produce mediante el hibridoma depositado el 14.05.2014 en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3242. El hibhdoma de la invencón, fue depositado de acuerdo con el tratado de Budapest el 14.05.2014, en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", en Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, por los depositantes AbBCN S.L. (Campus UAB 08193 Bellaterra) y Immunostep S.L. (Campus Unamuno, 37007, Salamanca). El hib doma se identificó por el depositante mediante la referencia ET6-1 , y recibió el número de acceso DSM ACC3242 y fue declarado viable.
Un undécimo aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3, y que se produce mediante el hibridoma depositado el 27.03.2014 en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3236. El hibridoma de la invencón, fue depositado de acuerdo con el tratado de Budapest el 27.03.2014, en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", en Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, por los depositantes AbBCN S.L. (Campus UAB 08193 Bellaterra) y Immunostep S.L. (Campus Unamuno, 37007, Salamanca). El hibridoma se identificó por el depositante mediante la referencia ET10-1 , y recibió el número de acceso DSM ACC3236 y fue declarado viable.
La combinación de las proteínas de mareaje de la invención junto con los anticuerpos monoclonales desarrollados específicamente, representan una poderosa herramienta en aplicaciones de inmunodetección, separación, aislamiento y purificación de proteínas que requieren una alta sensibilidad en la formación del complejo antígeno-anticuerpo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG.1 . Tests de expresión y agregación de las etiquetas {tags) seleccionadas en el cribado bioinformático. a) Las etiquetas de mareaje ET1 a ET12 fueron fusionadas a GFP para analizar los efectos sobre su expresión y agregación en células HEK293T. Los códigos de entrada en la base de datos PDB se indican como referencia. La barra indica 20 μηι. b) Los niveles de expresión de las fusiones etiqueta-GFP se muestran como valores medios (30 células) e intervalos de confianza para la media (a=0.05). El eje de las ordenadas indica expresión en unidades relativas a la proteína GFP nativa, c) Como una medida del grado de agregación, se obtuvo el coeficiente de variación (%) de los valores intracelulares de pixel para las fusiones etiqueta-GFP analizadas, y se indican los valores medios (30 células) y sus intervalos de confianza
(a=0.05). En el eje de las coordenadas se indica la variabilidad intracelular como coeficiente de variación(%).
FIG.2. Tests de solubilidad y estabilidad para proteínas de mareaje de la invención. Representación estructural de ET5 (Phl P2, a), ET6 (Hev b 6.02, b) y ET10 (Hev t 5, c). d) Las fusiones de las etiquetas a GFP fueron expresadas en células HEK293Ty los extractos totales fueron analizados mediante inmunodetección con un anticuerpo aGFP. e) Los niveles de las fusiones etiqueta-GFP se analizaron 12 horas después de la adición de cicloheximida mediante inmunodetección y comparados con el control sin tratar. Los valores medios (N=3) y los intervalos de confianza para la media (a=0.05) se indican como barras (eje de la izquierda). Se obtuvo por centrifugación una fracción soluble de las celular HEK293T que expresaban la fusión etiqueta-GFP indicada, y los niveles obtenidos mediante
inmunobloting se compararon en relación con los del extracto celular total. Los valores medios (N=3) y los intervalo de confianza para la media (a=0.05) se indican como círculos abiertos (eje de la derecha), f) Las células HEK293T que expresaban las fusiones etiqueta-GFP indicadas se analizaron mediante microscopía confocal a lo largo del tiempo bajo condiciones de
fotoblanqueado (FLIP). Se muestra la fluorescencia relativa celular a diferentes tiempos (en segundos) durante el fotoblanqueado.
FIG.3. Pruebas de inocuidad funcional de las etiquetas de mareaje de la invención y de las del estado de la técnica sobre Cdc28 e Ydj1 , dos proteínas esenciales de la levadura de gemación S. cerevisiae. a) Imágenes de campo claro de células de la levadura que expresan niveles endógenos de Cdc28 fusionada con las etiquetas ET5 (Phl P 2), ET6 (Hev b 6.02), 3HA y FLAG. Se muestra una cepa control (sin etiqueta) como referencia. La barra es de 10 μΓΠ. b) Se muestran en la gráfica los volúmenes individuales críticos de gemación de las células que se encuentran en el apartado b (N>200). Se muestran también los valores medios (líneas verticales gruesas) y los intervalos de confianza (a=0.05, líneas verticales finas), c) Diluciones en serie de células de levadura que expresaban niveles endógenos de Ydj1 fusionada a las etiquetas de mareaje ET5 (Phl P 2), ET6 (Hev b 6.02), 3HA y FLAG se hicieron crecer en placas, y se incubaron a las temperaturas indicadas. Se muestra una cepa de control (sin etiqueta de mareaje) como referencia, d) Se muestran en la gráfica los volúmenes individuales críticos de gemación de las células que se encuentran en el apartado e (N>250). Se muestran también los valores medios (líneas verticales gruesas) y los intervalos de confianza (a=0.05, líneas verticales finas). FIG. 4. Inocuidad de las etiquetas de mareaje en la localización de proteínas que se encuentran en diferentes compartimentos celulares: citoesqueleto (Pactina), Golgi (STX6), retículo endoplasmático (H01 ), núcleo (HDAC2), membrana plasmática (GRB2), y sinapsis neuronal (FMRP). a) Las etiquetas ET5 (Phl P 2) y ET6 (Hev b 6.02) fusionadas a las proteínas indicadas fueron expresadas en células NIH3T3 y analizadas mediante inmunofluorescencia (señal más clara en la figura) con los correspondientes anticuerpos aET5 y aET6. La barra es de 10 μΓΠ. b) La fusión ET5-FMRP fue expresada en las neuronas de hipocampo de ratón y analizada mediante inmunofluorescencia (señal más clara en la figura) con anticuerpos aET5. Una imagen de GFP co- transfectada y tratada para mejorar los límites somáticos y neuríticos se muestra también para referencia. Barra de 25 μηι. Se muestra también una amplificación 5x de la región indicada en el panel central. Barra de 5 μηι. En el panel derecho se muestra una proyección 3D de esta región.
FIG. 5. Estabilidad e integridad de las etiquetas de la invención y otras etiquetas peptídicas comúnmente utilizadas cuando están fusionadas a proteínas esenciales de la levadura de gemación S. cerevisiae. Extractos totales de células de levadura que expresan niveles endógenos de Cdc28 (a) o de Ydj1 (b) fusionadas a ET5 (Phl P 2), ET6 (Hev b 6.02), 3HA o 6FLAG se analizaron mediante inmunodetección con anticuerpos aCdc28 o aYdjl , respectivamente. Se muestra también una cepa de control como referencia.
FIG. 6. Análisis de integridad de las etiquetas de la invención después de su purificación por afinidad a partir de células de E. coli. a) Las etiquetas fusionadas a 6His se purificaron mediante cromatografía de afinidad a metales divalentes, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Debido a su pequeño tamaño, las etiquetas ET6 y ET10 fueron expresadas y purificadas como dímeros. Una proteína contaminante común está marcada con un asterisco, b) Las correspondientes fusiones a GFP-6His fueron expresadas, purificadas y analizadas como en el apartado a. La fusión GFP-6His sin etiquetar se muestra como referencia.
FIG. 7. Análisis de sensibilidad de anticuerpos que unen a las etiquetas de la invención ET5 (Phl P 2 ) y ET6 (Hev b 6.02). a) Las etiquetas ET5 y ET6 fusionadas a GFP fueron expresadas en células HEK293T y analizadas mediante inmunofluorescencia (señal más clara en la imagen del panel inferior) con los anticuerpos aET5 y aET6 correspondientes. Se muestra también la fluorescencia de la GFP (señal más clara en la imagen del panel superior). La barra es de 20 μηι. b) Cuantificación de señales de
inmunofluorescencia producidas por los anticuerpos αΕΤ5 aET6
seleccionados relativa a la que se obtiene con un anticuerpo policlonal aGFP.
Los valores medios (>30 células) y los intervalos de confianza para la media (a=0.05) se muestran como barras (eje de la izquierda). Los porcentajes de células GFP-positivas que fueron también positivas por inmunofluorescencia se muestran también como círculos abiertos (eje de la derecha).
FIG. 8. Señal no específica de inmunofluorescencia de los anticuerpos monoclonales de la invención, contra las etiquetas ET5 (Phl P 2 ) y ET6 (Hev b 6.02). a) Se llevó a cabo un análisis de immunofluorescencia de las células HEK293T no transfectadas con el anticuerpo aFLAG a una
concentración 50 veces superior a la usual para evaluar su unión no específica a los diferentes componentes celulares (panel superior izquierdo). Las células incubadas únicamente con el anticuerpo secundario fueron utilizadas como control (panel superior derecho). Se muestran también las imágenes de campo brillante de los campos correspondientes (paneles inferiores). La barra es de 50 μηι. b) Cuantificación de la señal no específica de inmunofluorescencia producida por los anticuerpos αΕΤ5, aET6, aFLAG, HA, y aGFP a una concentración 50 veces superior a la usual. Los valores se relativizaron al valor obtenido con el anticuerpo secundario. También se indican los valores medios (>30 células) e intervalos de confianza para la media (a=0.05). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la presente invención es una proteína recombinante de fusión que comprende una proteína o péptido que está fusionada en su extremo N- terminal o C-terminal a una proteína de mareaje, donde la proteína de mareaje está definida por las siguientes propiedades:
1 .1 ) comprende un número de residuos aminoacídicos inferior a 100;
1 .2) es inmunogénica; 1 .3) tiene un índice de globularidad superior a 0.5, definido el índice de globularidad como la fracción de residuos con
accesibilidad al solvente y calculado mediante el programa VMD;
1 .4) está libre de actividad enzimática; 1 .5) está libre de sitios de unión para cofactores o efectores; 1 .6) está libre de secuencias de degradación;
1 .7) está libre de secuencias de localización; 1 .8) es de origen vegetal; 1 .9) está libre de secuencias de homopolimerización o heteropolimerización; ; y donde la proteína de mareaje se selecciona del grupo consistente en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2 y un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3 , o una combinación de las mismas. Como se ha descrito anteriormente,
un primer aspecto de la invención es una proteína recombinante de fusión que comprende una proteína o péptido que está fusionada en su extremo N- terminal o C-terminal a una proteína de mareaje, donde la proteína de mareaje está definida por las siguientes propiedades:
1 .1 ) comprende un número de residuos aminoacídicos inferior a 100; 1 .2) es inmunogénica; 1 .3) tiene un índice de globulandad superior a 0.5, definido el índice de globulandad como la fracción de residuos con accesibilidad al solvente y calculado mediante el programa VMD; 1 .4) está libre de actividad enzimática; 1 .5) está libre de sitios de unión para cofactores o efectores; 1 .6) está libre de secuencias de degradación; 1 .7) está libre de secuencias de localización; 1 .8) es de origen vegetal; 1 .9) está libre de secuencias de homopolimehzación o heteropolimehzación; 1 .10) cuando está fusionada en el extremo N-terminal a la Proteína Verde Fluorescente y se expresa la proteína de fusión en células HEK293T, la proteína recombinante de fusión resultante mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodeteccion; mantiene la estabilidad estructural definida según niveles por inmunodeteccion durante 12 horas de tratamiento con 100 μg/ml de cicloheximida; mantiene la difusión intracelular in vivo medida mediante pérdida de fluorescencia durante fotoblanqueado, la fluorescencia medida mediante microscopía confocal de fluorescencia; y mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 G durante 15 minutos, in vitro e in vivo,; 1 .1 1 ) cuando está fusionada en el extremo C-terminal de la proteína Cdc28 o de la proteína Ydj1 de Saccharomyces cerevisiae la proteína recombinante de fusión mantiene la morfología definida por microscopía de campo claro; y mantiene la viabilidad celular medida mediante plaqueo a 42°C; 1 .12) cuando está fusionada a la Proteína Verde Fluorescente y se expresa en Escherichia coli, mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodeteccion; mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 g durante 15 minutos; y mantiene la eficiencia en la purificación por cromatografía de afinidad medida mediante inmunodeteccion; 1 .13) mantiene los niveles de expresión, esta expresión medida mediante inmunofluorescencia y mantiene la localización celular determinada mediante microscopía confocal de fluorescencia de proteínas que se encuentran en diferentes compartimentos celulares, dichas proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: beta- actina del citoesqueleto, la proteína STX6 del aparato de Golgi, H01 del retículo endoplasmático, la HDAC2 nuclear y GRB2 de la membrana plasmática en células NIH3T3 de ratón, así como FMRP de la sinapsis neuronal en neuronas del hipocampo; y
donde la proteína de mareaje se selecciona del grupo consistente en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2 y un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3 , o una combinación de las mismas.
En una realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1
En una realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 80% de identidad con la SEQ ID NO: 1
En una realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1 . En otra realización particular de este primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica que consiste en la SEQ ID NO: 1 , o lo que es lo mismo con un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 . En otra realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2
En otra realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 80% de identidad con la SEQ ID NO:2
En otra realización particular del primer aspecto de la invención, la proteína de mareaje es un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 90% de identidad con la SEQ ID NO:2. En otra realización particular de este primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica que consiste en la SEQ ID NO: 2, o lo que es lo mismo con un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.
En otra realización particular del primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3. En otra realización particular del primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 80% de identidad con la SEQ ID NO:3.
En otra realización particular del primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 90% de identidad con la SEQ ID NO:3. En otra realización particular de este primer aspecto, la proteína de mareaje es un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica que consiste en la SEQ ID NO: 3, o lo que es lo mismo con un 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Todas estas secuencias de las proteínas de mareaje fusionadas con la proteína o péptido de interés están codificadas, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, por una secuencia nucleotídica.
Como se ha descrito más arriba, un tercer aspecto de la invención es un cassette de expresión por recombinación que comprende la secuencia nucleotídica según el segundo aspecto de la invención, operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
En una realización particular del tercer aspecto de la invención, el cassette de expresión es tal que la secuencia de control de la expresión comprende una secuencia diana para reguladores transcripcionales, una secuencia de unión al ribosoma y una secuencia terminadora de la transcipción.
Como se ha descrito más arriba, el séptimo aspecto de la invención es un método para purificar o aislar una proteína recombinante de fusión según el primer aspecto, que comprende llevar a cabo los pasos según el sexto aspecto de la invención y adicionalmente un paso en donde la proteína de fusión se purifica o aisla. En una realización particular del séptimo aspecto de la invención, el paso adicional de purificación o aislamiento de la proteína de fusión comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la proteína de mareaje.
Como también ha sido descrito más arriba, un octavo aspecto de la invención es un método para detectar una proteína recombinante de fusión según el primer aspecto de la invención que comprende llevar a cabo los pasos según el sexto aspecto de la invención y adicionalmente un paso en donde se añaden medios para la detección de la proteína de mareaje. En una realización particular del octavo aspecto de la invención, los medios para la detección de la proteína de mareaje comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo.
En otra realización particular del octavo aspecto de la invención, los medios para la detección de la proteína de mareaje comprenden un anticuerpo monoclonal.
En una realización particular de los aspectos séptimo y octavo de la invención, los medios se seleccionan de los anticuerpos que se obtienen mediante los hibridomas depositados en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con los números de depósito DSM ACC3236 (depositado el día 27.03.2014), DSM ACC3234 (depositado el día 27.03.2014) y DSM ACC3242 (depositado el día 14.05.2014).
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se
proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas. Definiciones.
Todos los términos utilizados en la presente solicitud deben ser entendidos en su significado comúnmente utilizado en el campo de la técnica. Sin embargo, con el objetivo de mejorar la claridad, se incluyen las siguientes definiciones. Las abreviaturas de las proteínas citadas en la presente solicitud también se listan a continuación, juntamente con su entrada en la base de datos Uniprot.
El término "proteína recombinante de fusión" como se utiliza aquí significa una única cadena polipeptídica compuesta de: 1 ) una proteína de interés
(proteína de la cual se quiere estudiar su expresión celular, distribución, compartimentalización, interacción, etc. o proteína que se quiere aislar, purificar o separar), y 2) una proteína (etiqueta) de mareaje. Los términos "proteína de mareaje" o "etiqueta de mareaje" (términos que son intercambiables en la presente memoria y que en alguna ocasión se denominan también "tags" por su nomenclatura en inglés) como se utilizan aquí significan una proteína para la cual existen anticuerpos u otros ligandos de alta afinidad, que se expresa fusionada (en la misma cadena
polipeptídica) a una proteína de interés, de tal manera que la proteína de interés puede ser separada, purificada o localizada en estudios celulares gracias a la interacción de la proteína de mareaje con su ligando de alta afinidad.
El término "inmunogénico" como se utiliza aquí, significa una substancia (en el caso de la presente invención, una proteína) que es capaz de inducir una respuesta inmune.
El término "índice de globularidad" da una ¡dea de la compacidad de la estructura de una proteína, y está relacionada con su estabilidad e integridad estructural. Es sabido que numerosas proteínas (o algunos de sus dominios) son intrínsecamente desordenadas, es decir, que no adquieren una estructura tridimensional fija. Cuanto más desordenada es una proteína, menor es su globularidad, y se define como la fracción de residuos con accesibilidad al solvente. En una proteína desordenada, el promedio de la accesibilidad al solvente de sus residuos aumenta. Existen numerosos programas que calculan la accesibilidad al solvente de los residuos de una proteína. En la presente invención se ha utilizado el programa VMD.
El término "secuencia de degradación" como se utiliza aquí significa una secuencia de aminoácidos que, cuando está presente en una cadena polipeptídica, dirige a ésta última hacia una ruta de degradación o proteólisis parcial. Por ejemplo, una secuencia de degradación comúnmente conocida y denominada como PEST se compone de segmentos ricos en prolina, glutámico, serina y treonina. El término "secuencia de localización" como se utiliza aquí significa una secuencia de aminoácidos que, cuando está presente en una cadena polipeptídica, dirige a ésta última a una localización concreta dentro de los compartimentos celulares (como puede ser el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático, el núcleo de la célula, etc.). Por ejemplo, una secuencia típica de localización nuclear es la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ
ID NO:4) de la nucleoplasmina, que se compone de dos grupos de residuos cargados positivamente, y que es reconocida por la α-importina; una secuencia típica del extremo C-terminal que provoca retención de la proteína en el retículo endoplasmático es KDEL (SEQ ID NO:5).
El término "secuencia de homopolimerización o heteropolimerización" como se utiliza aquí significa una secuencia que, cuando está presente en una cadena polipeptídica, propicia que ésta forme complejos con otras cadenas polipeptídicas idénticas a ella (homo) o diferentes en cuanto a secuencia o estructura (hetero). El término "efector" como se utiliza aquí es una proteína, una molécula orgánica de pequeño tamaño (como puede ser una hormona, un metabolito, etc.) o un ion, que selectivamente se une a una proteína para regular su función. El efector normalmente tiene un sitio de unión específico en la proteína que regula.
El término "libre de" como se utiliza aquí, significa "carente de".
El término "libre de actividad enzimática" significa aquí que la proteína no cataliza ninguna reacción bioquímica.
El término "estabilidad estructural" significa aquí que la proteína no pierde la conformación tridimensional responsable de su actividad biológica, no es degradada, metabolizada, o eliminada mediante diferentes sistemas celulares de procesamiento de proteínas.
El término "transduccion" como se utiliza aquí, significa un proceso mediante el cual un DNA foráneo (heterólogo) es introducido en una célula huésped mediante el uso de un vector vírico. El objetivo último de este proceso es que el DNA foráneo se integre en el genoma de la célula huésped de tal manera que el RNA y/o la proteína por la cual codifica se expresen de manera estable en esta célula. En el caso de la presente invención, la transduccion se realiza con el DNA que codifica para las proteínas recombinantes de fusión. El término "transfección" como se utiliza aquí, significa un proceso mediante el cual un DNA foráneo (heterólogo) es introducido en una célula huésped mediante cualquier método que no sea viral, tal como electroporación o mediante tratamiento químico. En el caso de la presente invención, la transfección se realiza con el DNA que codifica para las proteínas
recombinantes de fusión.
Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el producto o productos de interés es (son) expresado(s) en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión. En la presente invención debe entenderse por "porcentaje de identidad" el porcentaje de aminoácidos o de nucleótidos ¡guales entre dos o más secuencias independientes que se comparan o alinean de tal modo que se obtenga el mejor valor de coincidencias entre posiciones. El porcentaje de identidad entre secuencias peptídicas y entre secuencias nucleotídicas se calcula, preferentemente, mediante el algoritmo BLAST por "Basic Local Alignment Search Τοο , accesible desde el portal de la NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y descrito en Altschul S. "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 1990, vol. 215, pp. 403-410. Así, cuando en la presente invención se indica que dos secuencias tienen un mínimo de 70% de identidad, significa que una vez alineadas, las dos secuencias tienen un mínimo de 7 de cada 10 aminoácidos idénticos.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "anticuerpo o fragmento del mismo", cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal, o un fragmento derivado del mismo que aún retiene la capacidad para unirse a su antígeno. Ejemplos de fragmentos son: un fragmento (Fab)2 derivado de la digestión de un anticuerpo con pepsina, un fragmento Fab derivado de la digestión de un anticuerpo con papaína, un fragmento scFv derivado de fusionar los dos dominios variables de las cadenas pesada y ligera, nanocuerpos (nanobodies) derivados de anticuerpos de camélido o de escualos, etc.
La Proteína Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein, o "GFP"), es una proteína de 238 residuos aislada de la medusa Aequorea victoria, que tiene una marcada fluorescencia de color verde cuando se expone a luz ultravioleta. Esta proteína se utiliza habitualmente en estudios de biología molecular y celular como marcador. Al ser tan fácilmente detectable se utiliza para controlar el nivel de expresión génica, para el control del desarrollo celular, la división en procariotas, etc. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P42212, versión 1 18 de la entrada de 14 de Mato de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Noviembre de 1995. Cdc28 de Saccharomyces cerevisiae (o "cell división control protein 28" también llamada cyclin dependent kinase 1 ), es una proteína esencial para el control del ciclo celular de la levadura. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P00546, versión 160 de la entrada de 14 de Mato de 2014 y versión 1 de la secuencia de 21 de Julio de 1986.
Ydj1 de Saccharomyces cerevisiae (o "yeast DNAJ protein 1 , también llamada "mitocondrial protein import protein MA S5") es una proteína de 409 aminoácidos involucrada en la importación de proteínas a la mitocondria de la levadura. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada
(código) P25491 , versión 146 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Mayo de 1992.
Beta-actina de Mus musculus es una proteína de 375 residuos que está involucrada en diversos procesos de motilidad celular y que forma parte integral del citoesqueleto. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P60710, versión 1 10 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Abril de 1988. STX6 de Mus musculus (también llamada Sintaxin-6) es una proteína de 255 residuos involucrada en el tráfico vesicular intracelular. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) Q9JKK1 , versión 101 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia 1 de Octubre de 2000.
HO1 de Mus musculus (Heme oxigenase 1 , también llamada proteína P32) es una proteína de 289 residuos que se localiza en el retículo
endoplasmático, y que está involucrada en la rotura del anillo del grupo hemo. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P14901 , versión 1 19 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Abril de 1990.
HDAC2 de Mus musculus (también llamada HD2, Histone deacetylase 2) es una proteína de 488 residuos que se localiza en el núcleo celular, y que está involucrada en la deacetilación de residuos de lisina en el extremo N-terminal de las histonas (H2A, H2B, H3 y H4), y por consiguiente está involucrada en el empaquetamiento del DNA y en la regulación epigenética de la expresión de numerosos genes. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P70288, versión 142 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Febrero de 1997. GRB2 de Mus musculus (growth factor receptor-bou nd protein2, también llamado "Adapter protein GRB2") es una proteína de 217 residuos que se puede localizar en el citoplasma, en endosomas o en el aparato de Golgi, y que desarrolla un papel en la conexión entre los factores de crecimiento de superficie y la vía de señalización de Ras. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) Q60631 , versión 155 de la entrada de 14 de Mayo de 2014 y versión 1 de la secuencia de 1 de Noviembre de 1996.
FMRP de Mus musculus (Fragüe X mental retardation protein ) es una proteína de 589 residuos que se encuentra en neuronas del hipocampo. Se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) Q547R0, versión 51 de la entrada de 16 de Abril de 2014 y versión 1 de la secuencia de 24 de Mayo de 2005.
El término "NIH3T3" hace referencia a la línea celular también denominada 3T3. Es una línea celular estándar de fibroblastos ampliamente utilizada en investigación celular. Esta línea fue establecida en 1962 por dos científicos en la Universidad de Nueva York, George Todaro y Howard Green.
"Phl P 2" es el alérgeno del polen Phl P 2 derivado de Phleum pratense, una hierba perenne que se encuentra en la mayor parte Europa. Esta proteína se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P43214 (última modificación 16 de Octubre del 2013, versión 80 de la entrada y versión 1 de la secuencia de 1 de Noviembre de 1995). Su estructura tridimensional ha sido resuelta por cristalografía de rayos X y se encuentra accesible en el Protein Data Bank (PDB) con el código 1 WHP. La secuencia aminoacídica del fragmento del alérgeno Phl P 2 utilizado en la presente invención es (SEQ ID NO 1 ):
VPKV TFTVEKGSNE KHLAVLVKYE GDTMAEVELR EHGSDEVWAM TKGEGGVWTF DSEEPLQGPF NFRFLTEKGM KNVFDDWPE KYTIGATYAP EE
"Hev b 6.02" es un alérgeno derivado de Hevea brasiliens s (árbol del caucho), la especie más importante de árboles que producen látex en Sud América. Esta proteína se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) Q6JYQ7 (última modificación 19 de Febrero del 2014, versión 51 de la entrada y versión 1 de la secuencia de 5 de Julio de 2004). Su estructura tridimensional ha sido resuelta por cristalografía de rayos X y se encuentra accesible en el Protein Data Bank (PDB) con el código 1 WKX. La secuencia aminoacídica del fragmento del alérgeno Hev b 6.02 utilizado en la presente invención es (SEQ ID NO 2):
EQCGRQAGGKLCPDNLCCSQWGWCGSTDEYCSPDHNCQSNCKD
"Amb t 5" es el alérgeno del polen Amb t 5 derivado de Ambrosia trífida (una especie del género Ambrosia, plantas herbáceas muy comunes en América). Esta proteína se encuentra en la base de datos Uniprot con la entrada (código) P10414 (última modificación 19 Febrero del 2014, versión 82 de la entrada y versión 2 de la secuencia de 1 de Agosto de 1992). Su estructura tridimensional ha sido resuelta por Resonancia Magnética Nuclear y está accesible en el Protein Data Bank con el código 3BBG. La secuencia aminoacídica del fragmento Amb t 5 utilizado en la presente invención es (SEQ ID NO 3):
DDGLCYEGTNCGKVGKYCCSPIGKYCVCYDSKAICNK NCT
EJEMPLOS Material y Métodos
Cribado bioinformático.
El objetivo inicial del screening bioinformático fue obtener una lista de dominios de proteínas aptos para preparar proteínas de fusión. Debido a la dificultad de predecir antigenicidad basada en aproximaciones puramente teóricas, se empezó con ca. 2000 familias de proteínas reportadas en la base de datos VarDB (Hayes, C. N. et al. "varDB: a pathogen-specific sequence datábase of protein families involved in antigenic variation" Bioinformatics 2008, vol. 24, pp. 2564-2565) y epítopos reportados en la base IEDB (Vita, R. et al. "The immune epitope datábase 2.0" Nucí. Acids Res. 2010, vol. 38, D854-D862). Las estructuras de proteínas que contenían los 63.424 epítopos listados en IEDB se obtuvieron utilizando BLASTP contra el PDB (se utilizaron los parámetros estándar). Finalmente, la lista se extendió para incluir posibles homólogos usando los correspondientes dominios del PFAM (Punta, M. et.al. "The Pfam protein families datábase". Nucí. Acids Res. 2012, vol. 40, D290-D301 ). La lista final incluyó 3.500 proteínas antigénicas que cubrían 1 .383 dominios PFAM.
La lista inicial se chequeó para comprobar las propiedades siguientes:
- Antigenicidad utilizando BCIPRED (Saha, S. & Raghava, G. P. S.
"BcePred: prediction of continuous B-cell epitopes in antigenic sequences using physico-chemical properties" en Nicosia, G., Cutello, V., Bentley, P.J. & Timis, J. (eds.) pp. 197-204, Springer 2004,
Heidelberg). El método utiliza una combinación de estimaciones basadas en secuencia que incluyen: hidrofilicidad, flexibilidad, accesibilidad, propensión a formar giros beta, propensión antigénica y polaridad. Los dominios considerados antigénicos por al menos dos de los criterios citados, fueron aceptados.
- La accesibilidad al solvente, la distancia del epítopo a los extremos N y C-terminal, la accesibilidad del epítopo al solvente y el índice de globularidad fueron calculados con VMD (Humphrey, et.al. "VMD -
Visual molecular dynamics" J. Molec. Graphics 1996, vol. 14, pp. 33- 38.)
- La caracterización funcional fue obtenida de las anotaciones en PFAM {vide supra) y Gene Ontology (GO, The Gene Ontology Consortium. "Gene ontology annotations and resources", Nucí. Acids Res. 2013, vol. 41 , pp. D530-D535. Los términos GO descartados afectaban a las siguientes categorías: Solubilidad y relación con la membrana, actividad, unión, estado polimérico y promiscuidad en la unión a proteínas.
El cribado dio como resultado una lista de 226 dominios que fue
manualmente curada como se describe en el apartado de Resultados, para descartar actividades específicas o propiedades que no estaban anotadas en las bases de datos comentadas más arriba.
Cultivo de células de mamífero, vectores de expresión y análisis celular Se mantuvo a las células NIH3T3 and HEK293T en un medio DMEM
(Dulbecco's modified Eagle's médium) que contenía glutamina suplementado con antibióticos y 10% de FCS. Los DNAs sintéticos que codificaban las etiquetas peptídicas fueron sub-clonados en un plásmido derivado del pEGFP-N1 (Clontech) donde algunas de las secuencias polylinker habían sido sustituidas por el promotor T7, secuencias que unen el nbosoma para la expresión génica en E.coli y en células de mamífero, y un péptido 6His para la purificación por afinidad. Las células fueron transfectadas con
Lipofectamine 2000 siguiendo instrucciones del fabricante (Invitrogen), y analizadas 24 horas después de la transfección. Los niveles de expresión y el índice de agregación de las fusiones GFP en las células HEK293T fueron analizadas mediante microscopía de epifluorescencia con la ayuda del programa de análisis de imagen ImageJ (Wayne Rasband, NIH).
La pérdida de fluorescencia por fotoblanqueado (Fluorescence loss in photobleaching, FLIP) se realizó con un microscopio confocal Zeiss LSM780. Una pequeña región circular del citoplasma (3.6 pm2) fue repetitivamente fotoblanqueada a potencia de láser máxima durante 3 segundos cada vez y, entre los períodos de blanqueo, la célula fue examinada por imagen con luz de baja intensidad para medir la pérdida de fluorescencia. Para el análisis cuantitativo, la intensidad de fondo (background) fue restada, y las
intensidades fuera del área de fotoblanqueo fueron medidas a lo largo del tiempo y normalizadas a las de una célula transfectada no blanqueada.
Cepas de levadura, condiciones de crecimiento y medidas celulares
La cepa parental de levadura CML 128 y los métodos utilizados para sustitución génica por recombinación han sido descritos en Gallego, C, et.al. "The Cln3 cyclin is downregulated by translational repression and
degradation du ng the G1 arrest caused by nitrogen dep vation in budding yeast". EMBO J. 1997, vol. 16, pp. 7196-7206. Las células de levadura se hicieron crecer bajo condiciones exponenciales durante 7-8 generaciones en medio SC (Sambrook, J. & Russell, D. W. "Molecular cloning: A laboratory manual". 2001 3a edición, pp. 323-325, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY) con 2% de glucosa a 30°C, a no ser que se indique lo contrario. El volumen celular en el momento de la gemación fue determinado a partir de imágenes de campo brillante con la ayuda de un BudJ (Ferrezuelo, F. et al. "The critical size is set at a single-cell level by growth rate to attain homeostasis and adaptation". Nat. Comm. 2012, vol. 3, pp. 1012), un plugin ImageJ que se puede obtener en www.ibmb.csic.es\home\maldea.
Purificación de las etiquetas peptídicas
La expresión de la etiqueta ET5 (Phl P 2) monomérica marcada con el hexapéptido 6His, de la etiqueta ET6 (Hev b 6.02) dimérica, o de las fusiones correspondientes a GFP fue inducida en E. coli BL21 (DE3) con 0.5 mM IPTG y crecidas a 25°C durante 18h a 220 rpm. Las proteínas expresadas fueron purificadas por afinidad en Ni-NTA (Qiagen) siguiendo instrucciones del fabricante.
Producción de los anticuerpos monoclonales Ratones hembra BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con 75 g de cada una de las etiquetas peptídicas de la invención, emulsificadas en adyuvante (Stimune Adjuvant; Prionics). 30 y 60 días más tarde, los ratones fueron inyectados con 75 g de cada uno de los antígenos en adyuvante. 4 días antes del procedimiento de fusión, cada ratón recibió una inyección intravenosa del mismo antígeno en PBS 20 mM fosfato. Los esplenocitos fueron fusionados con la línea celular de mieloma Sp2/0-Ag14. Los clones de hibridoma fueron seleccionados mediante ELISA indirecto convencional, y las células provenientes de pocilios positivos fueron clonadas mediante dilución limitante. Los anticuerpos monoclonales fueron purificados a partir de los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad en proteína G (HiTrap
Protein G Sepharose High Performance; GE Healthcare).
Análisis por inmunodetección en membrana El análisis por inmunodetección en membrana fue realizado con aGFP
(clones de ratón 7.1 y 13.1 , Roche), aCdc28 (anticuerpos policlonales de conejo, cedidos por C. Mann), y aYdjl (clones de ratón 1 G10.H8, Abnova). Las solubilidades de las fusiones de las etiquetas de la invención junto con GFP fue evaluada por centrifugación a 20.800 g durante 15 minutos de los extractos celulares preparados en tampón de lisis (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCI, 2 mM DTT e inhibidores de proteasas y fosfatasas). Inmunofluorescencia
Las células HEK293T o NIH3T3 fueron rápidamente lavadas con PBS y fijadas en 4% formaldehído y 4% de sacarosa durante 30 minutos en temperatura ambiente. Las células fijadas fueron permeabilizadas con 0.1 % tritón en PBS durante 5 minutos, y bloqueadas con 1 % de BSA en PBS. El bloqueo de las neuronas del hipocampo se llevó a cabo en 5% de serum de cabra en PBS. Los anticuerpos primarios contra HA (clon de ratas 3F10 de Roche), FLAG (clon de ratón M2, Sigma), ET5 (clon de ratón R19/8-1 1/18) y ET6 (clon de ratón R19/4-1 1/15) fueron utilizados con anticuerpos
secundarios etiquetados con Alexa568 (Molecular Probes) en una solución bloqueante. aGFP (clones de ratón 7.1 y 13.1 , Roche) fue utilizada como referencia para el análisis de señal y de fondo. Resultados
Screenin bioinformático inicial para la selección de candidatos
Con el fin de identificar los polipéptidos con uso potencial como proteínas de mareaje con un mínimo riesgo de interferencia física o funcional con las proteínas de interés, se realizó una búsqueda de dominios de proteínas con estructura tridimensional conocida y con marcada capacidad inmunogénica, utilizando las bases de datos Protein Data Bank (PDB) y Protein Families Datábase (Pfam). Debido a la baja fiabilidad de la predicción sobre las propiedades antigénicas, la búsqueda utilizó como punto de partida las regiones inmunogénicas confirmadas experimentalmente obtenidas a partir del The Immune Epitope Datábase (IEDB) así como del Antigenic Variation Datábase (VarDB). Se aplicaron filtros funcionales para prevenir la selección de dominios insolubles, hidroliticos, poliméricos o promiscuos, y se seleccionaron aquéllos con un índice de globulandad alto, pequeño tamaño y gran capacidad como inmunógenos basado en una combinación de factores físico-químicos. Adicionalmente, se consideraron también los parámetros de área de superficie accesible y flexibilidad en los extremos N o C-terminal para facilitar la construcción de la proteína de fusión resultante. Estas estructuras fueron filtradas en una ronda posterior para descartar todos aquellos dominios que estuviesen anotados como dominios con capacidad enzimática o con capacidad para unir cofactores o efectores. También se rechazaron dominios con capacidad de formar homopolímeros o que tuviesen secuencias reguladoras o de degradación o localización celular. Finalmente, se descartaron los dominios derivados de un organismo vertebrado. Los 12 dominios resultantes con potencial para ser desarrollados como etiquetas antigénicas se listan en la Tabla 1 .
Tabla 1 | Proteínas antigénicas candidatas.
Epitag PDB id Descrición Organismo aa Globularidad
Horse chestnut (Aesculus
1 1 BK8 Antimicrobial protein 1 hippocastanum) 50 0.654
2 1 BW3 Barwin, basic seed protein Barley (Hordeum vulgare) 125 0.413
3 1 ICX Protein LLR18A Yellow lupin (Lupinus luteus) 155 0.450
4 1 PJW Envelope protein Encephalitis virus 1 1 1 0.389
5 1 WHP Allergen Phl p2 Timothy grass (Phleum pratense) 96 0.562
6 1 WKX Hevein isoform 2 Rubber tree (Hevea brasiliensis) 43 0.598
7 1X6R Fimbrial protein Pseudomonas aeruginosa 123 0.507
8 2JMH Mite allergen Blo t5 Mite (Blomia tropicalis) 1 19 0.371
Type-1 fimbrial protein , A
9 2JTY chain Escherichia coli 184 0.452
10 3BBG Pollen allergen 5 Great ragweed (Ambrosia trífida) 40 0.587
1 1 3FT9 Allergen Phl p3 Timothy grass (Phleum pratense) 100 0.568
Major pollen allergen Bet v1 -
12 3K78 D/H Birch (Betula verrucosa) 160 0.424
Tests de viabilidad bioquímica de las etiquetas de mareaje in vivo
Las proteínas plegadas incorrectamente se acumulan normalmente como agregados que pueden ser fácilmente observados en el microscopio como cuerpos de inclusión. Las alteraciones bioquímicas que caracterizan a los agregados normalmente incluyen una reducida solubilidad (en los extractos celulares), una densidad más alta y menor movilidad de difusión (medido en un microscopio de fluorescencia) y una menor accesibilidad a los anticuerpos (medido mediante métodos de inmunofluorescencia). Así, para evaluar si las etiquetas que forman parte de la invención contienen determinantes estructurales claros que les permiten plegarse rápida y eficientemente, éstas se expresaron en altas concentraciones como proteínas de fusión junto con la GFP en células de riñon embrionarias (HEK293T), y se analizaron las propensiones a formar agregados, así como sus patrones de localización en experimentos in vivo de microscopía de fluorescencia (FIG. 1 a). La mayor parte de las fusiones con las etiquetas de la invención adquirieron niveles de expresión similares al del experimento control con GFP (FIG.1 b). Sólo una etiqueta (ET8) no era detectable, y no fue analizada seguidamente. Con respecto a su patrón intracelular (FIG. 1 c), 3 de las etiquetas analizadas en profundidad (ET1 , ET2, y ET12) mostraron una marcada acumulación en las células, acoplada a unos niveles muy bajos de difusión en el citoplasma. Otras tres etiquetas (ET7, ET9 y ET1 1 ) mostraron agregados en la mayoría de las células, aunque una importante fracción de la proteína de fusión produjo un patrón difuso en la célula. ET3 y ET4 mostraron un patrón difuso en la mayoría de las células, pero mostraron claramente agregados en algunas de ellas. Finalmente, los 3 dominios restantes (ET5, ET6 y ET10) produjeron un patrón difuso en todas las células que era indistinguible de aquél producido en el experimento con GFP de control, lo que sugirió que estos 3 dominios no perturbarían las propiedades físico-químicas y bioquímicas de la GFP in vivo. Así estos 3 dominios fueron seleccionados para pruebas posteriores.
A pesar de su pequeño tamaño, se infirió que la estructura de las tres etiquetas (ET5 que se corresponde con la proteína Phl P 2, ET6 que se corresponde con la proteína Hev b 6.02 y ET10 que se corresponde con la proteína Amb t 5) está basada en un empaquetamiento compacto basado en hojas beta que, en el caso de ET6 y ET10 está estabilizado por la presencia de puentes disulfuro. Las fusiones de estas tres etiquetas a la GFP se expresaron en las células HEK293T y se detectaron básicamente como una única banda con el peso molecular aparente esperado para cada caso en experimentos de western blot (FIG.2d), y su estabilidad en presencia de cicloheximida se reveló como prácticamente idéntica a la de la GFP de control (FIG. 2e). Estos datos indican que estas tres etiquetas peptídicas no afectan significativamente per se a la integridad y a las tasas de degradación de la proteína de fusión. La presencia de cualquiera de estas tres etiquetas no afectó a la solubilidad de la GFP en extractos celulares (FIG.2e), ni tampoco modificó su tasa de difusión intracelular in vivo como muestran los resultados de análisis de pérdida de fluorescencia (FIG.2f), confirmándose así la ausencia de asociaciones estables de las etiquetas de la invención con estructuras del citoesqueleto u otras estructuras celulares de gran tamaño. Finalmente, ya que ni la fluorescencia ni los niveles de proteína no se vieron afectados por la presencia de ninguna de las etiquetas peptídicas de la invención, se concluyó que estas tres etiquetas no afectan ni a la maduración ni al plegamiento de la GFP como modelo de proteína de interés.
Inocuidad funcional de las etiquetas de mareaje de la invención en proteínas esenciales modelo
La fusión de etiquetas de mareaje en los extremos N o C-terminal de las proteínas de interés puede producir efectos inesperados en sus funciones, localización intracelular o asociación a complejos macromoleculares, particularmente si las etiquetas no tienen una estructura claramente definida y son intrínsecamente desordenadas. Las tres etiquetas que forman parte de la invención contienen claros determinantes estructurales y de ahí que deberían tener menos propensión a producir efectos inesperados en las proteínas de fusión bajo estudio cuando se comparan con otras etiquetas de mareaje como por ejemplo FLAG o HA, dos de las más ampliamente utilizadas. Para probar este último punto, se decidió realizar una serie de análisis comparativos de los efectos producidos por el etiquetaje en dos proteínas esenciales de la levadura S. cerevisiae, una quinasa dependiente de ciclina y una chaperona de dominio J.
Las quinasas dependientes de ciclina (Cdks) establecen múltiples
interacciones para llevar a cabo una serie de procesos que desencadenan el ciclo celular, y la modificación de estas interacciones tiene un impacto profundo en su consecución. La levadura depende de una única Cdk, la
Cdc28 para desencadenar todas las fases del ciclo celular de una manera coordinada con la maquinaria de crecimiento celular. El aislamiento de mutantes con un tamaño celular alterado ha sido crucial en el descubrimiento de procesos moleculares claves que gobiernan el ciclo celular y, a la vez, el tamaño celular es un indicador particularmente válido de los procesos moleculares en donde la Cdc28 juega un papel central. Así, se decidió etiquetar el locus CDC28 endógeno con fusiones en el extremo C-terminal con las etiquetas ET5 (Phl P 2, 96 residuos
aminoacídicos) y ET6 (Hev b 6.02 , 43 residuos aminoacídicos), así como con repeticiones tándem de FLAG (6x, 62 residuos aminoacídicos) y HA (3x, 32 residuos aminoacídicos), para obtener tags (etiquetas) similares en cuanto al tamaño. Ninguna de estas etiquetas causó efectos significativos en los niveles de Cdc28 ni en su integridad (FIG.5a). Sin embargo, como se deduce de una inspección visual de las células de levadura (FIG.3b), la fusión Cdc28-FLAG causó un cambio muy importante en el tamaño celular y en la forma, indicando importantes alteraciones en las vías de señalización mediadas por Cdc28 en fases G1 y G2 del ciclo celular. A destacar, los mismos efectos se vieron cuando sólo 3 copias de la etiqueta FLAG se utilizaron para marcar Cdc28 en el extremo C-terminal. Este último resultado apunta a que algún determinante intrínseco de secuencia en la etiqueta FLAG es el responsable de los efectos deletéreos sobre la función biológica de Cdc28. En cambio, mientras que ET5 tiene un tamaño similar a la etiqueta 6xFLAG, éste no produjo ningún cambio en la morfología de las células (FIG.3b) y únicamente produjo un mínimo efecto en el tamaño medio crítico en la transición G1/S cuando se comparó con la etiqueta 6xFLAG (FIG. 3c). La etiqueta 3xHA no produjo ningún defecto morfológico a gran escala, pero indujo un aumento significativo del tamaño crítico en la transición G1/S (FIG.3c), demostrando una alteración clara de los mecanismos que controlan la entrada del ciclo celular en función del crecimiento celular. Por contra, la etiqueta ET6 (Hev b 6.02) (de tamaño muy parecido a 3xHA) no causó cambios significativos ni en la media, ni en los valores de distribución del tamaño crítico.
Las chaperonas moleculares utilizan la energía derivada de la hidrólisis de los enlaces fosfato del ATP para transmitir cambios conformacionales a sus proteínas cliente, facilitando así su plegamiento correcto y promoviendo el ensamblaje o desensamblaje de complejos multiproteína. Una de las clases más ubicuas de chaperonas es la familia de la Heat Shock 70 kDa (Hsp70s), que invariablemente requiere de la participación de las co-chaperonas de dominio J, las cuales estimulan su actividad ATPasa y cooperan en la unión de las proteínas cliente. Ydj1 es la chaperona de dominio J más abundante en la levadura y, a parte de sus actividades en la homeostasis del proteoma, juega un papel crucial en la liberación de la ciclina Cln3 del retículo endoplasmático para desencadenar la entrada en el ciclo celular.
Adicionalmente a su dominio J localizado en el extremo N-terminal, Ydj1 contiene un dominio de dimerización en su extremo C-terminal que es esencial para su función. Por consiguiente, se decidió obtener fusiones en el extremo C-terminal del locus YDJ1 endógeno (FIG. 5b) y probar posibles efectos deletéreos de las etiquetas peptídicas ET5, ET6, 6xFLAG y 3xHA en la función de Ydj1 . Ninguna de las etiquetas peptídicas causaron efectos detectables en los niveles de Ydj1 o en su integridad. De manera similar a Cdc28, la fusión de Ydj1 con la etiqueta 6xFLAG produjo los efectos más severos, los cuales pudieron ser observados incluso bajo condiciones normales de crecimiento a 30 grados Celsius (FIG. 3e). Además, tanto la etiqueta 6xFLAG como la etiqueta 3xHA produjeron una disminución clara del crecimiento a altas temperaturas, donde la función de la co-chaperona Ydj1 se convierte en esencial. En claro contraste, la fusión de Ydj1 con ET5 o ET6 produjo efectos muy moderados en el crecimiento a 37 grados Celsius (FIG. 3e). Ydj1 es también muy importante para coordinar el crecimiento y la entrada en el ciclo celular asociado al tamaño. En línea con sus efectos en la velocidad de crecimiento, tanto la etiqueta 6xFLAG como la etiqueta 3xHA causaron un aumento marcado en el tamaño crítico en la transición G1/S (FIG. 3f). Muy al contrario, ni ET5 ni ET6 produjeron un efecto obvio en el tamaño crítico, lo cual sugiere que estas etiquetas de mareaje son
funcionalmente inocuas en cuanto al rol desempeñado por Ydj1 en los procesos de entrada del ciclo celular. Las etiquetas de mareaje como herramientas inocuas para el análisis de proteínas in situ.
Los prospectos que habitualmente acompañan a los anticuerpos
monoclonales disponibles en el mercado a menudo incluyen información sobre su uso para la detección de proteínas de interés en técnicas de inmunofluorescencia in situ. Sin embargo, muy raramente se proporciona una prueba fehaciente de su especificidad en células donde la expresión de la proteína de interés ha sido disminuida. Esta es una de las razones por las que etiquetas peptídicas como la FLAG o la HA son ampliamente utilizadas para confirmar la localización intracelular de la proteína bajo unas
condiciones muy determinadas. Teniendo presente lo anterior, los inventores han ideado y implementado la producción eficiente de anticuerpos monoclonales para la detección in situ de las etiquetas de mareaje de la invención, mediante técnicas de inmunofluorescencia.
Bien en forma monomérica (ET5, Phl P 2) o bien en forma dimérica (ET6 que corresponde a Hev b 6.02 y ET10 que corresponde a Amb 1 5), las etiquetas y sus correspondientes fusiones GFP fueron expresadas y purificadas en células de E. coli (FIG. 6), para posteriormente inmunizar ratones y realizar una criba inicial mediante métodos ELISA indirectos. Los anticuerpos monoclonales que dieron positivos fueron probados a concentraciones bajas en células HIK293T mediante inmunofluorescencia para comprobar su sensibilidad y eficiencia (FIG.7) y, por encima de todo, una baja señal de fondo a altas concentraciones en células control (FIG.8). Estos anticuerpos son los que se generan mediante los hibridomas depositados en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con los números de depósito DSM ACC3236, DSM ACC3234 y DSM ACC3242.Los anticuerpos monoclonales seleccionados fueron posteriormente utilizados para analizar una serie de fusiones con las etiquetas ET5 y ET6 a proteínas paradigmáticas que localizan en diferentes compartimentos celulares en fibroblastos 3T3 y neuronas del hipocampo de ratón (Mus musculus); en la FIG. 4 se muestran imágenes representativas. Independientemente de la etiqueta utilizada, todas las proteínas de fusión mostraron la localización intracelular esperada y, lo que es más importante, no se observaron agregados o fracciones de las proteínas en
compartimentos anómalos que se pudiesen interpretar como una
consecuencia de la interacción de las etiquetas peptídicas con las proteínas marcadas. En resumen, estos resultados demuestran la inocuidad funcional de las etiquetas de la invención en cuanto a la distribución de un vanado grupo de proteínas que localizan en diversos compartimentos de la célula como son el núcleo, el aparato de Golgi, el citoesqueleto, el retículo endoplasmático, la membrana plasmática o la sinapsis neuronal.
REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD
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Altschul S. "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 1990, vol. 215, pp. 403- 410
Hayes, C. N. et al. "varDB: a pathogen-specific sequence datábase of protein families involved in antigenic variation" Bioinformatics 2008, vol. 24, pp. 2564-2565
Vita, R. et al. "The immune epitope datábase 2.0" Nucí. Acids Res. 2010, vol. 38, D854-D862
Punta, M . et.al. "The Pfam protein families datábase". Nucí. Acids Res. 2012, vol. 40, D290-D301
Humphrey, et.al. "VM D - Visual molecular dynamics" J. Molec. Graphics 1996, vol. 14, pp. 33-38
GO, The Gene Ontology Consortium. "Gene ontology annotations and resources", Nucí. Acids Res. 2013, vol. 41 , pp. D530-D535
Gallego, C , et.al. "The Cln3 cyclin is downregulated by translational repression and degradation during the G1 arrest caused by nitrogen deprivation in budding yeast". EMBO J. 1997, vol. 16, pp. 7196-7206
Sambrook, J . & Russell, D. W. "Molecular cloning: A laboratory manual". 2001 3a edición, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY
Ferrezuelo, F. et al. "The critical size is set at a single-cell level by growth rate to attain homeostasis and adaptation". Nat. Comm. 2012, vol. 3, pp. 1012
Saha, S. & Raghava, G. P. S. "BcePred: prediction of continuous B-cell epitopes in antigenic sequences using physico-chemical properties" en Nicosia, G. , Cutello, V. , Bentley, P.J. & Timis, J . (eds.) pp. 197-204, Springer 2004, Heidelberg

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Proteína recombinante de fusión que comprende una proteína o péptido que está fusionado en su extremo N-terminal o C-terminal a una proteína de mareaje, donde la proteína de mareaje está definida por las siguientes propiedades:
1 .1 ) comprende un número de residuos aminoacídicos inferior a 100;
1 .2) es inmunogénica;
1 .3) tiene un índice de globularidad superior a 0.5, definido el índice de globularidad como la fracción de residuos con accesibilidad al solvente y calculado mediante el programa VMD;
1 .4) está libre de actividad enzimática;
1 .5) está libre de sitios de unión para cofactores o efectores;
1 .6) está libre de secuencias de degradación;
1 .7) está libre de secuencias de localización;
1 .8) es de origen vegetal;
1 .9) está libre de secuencias de homopolimerización o heteropolimerización;
1 .10) cuando está fusionada en el extremo N-terminal a la Proteína Verde Fluorescente y se expresa la proteína de fusión en células HEK293T, la proteína recombinante de fusión resultante mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodetección; mantiene la estabilidad estructural definida según niveles por inmunodetección durante 12 horas de tratamiento con 100 μg/ml de cicloheximida; mantiene la difusión intracelular in vivo medida mediante pérdida de fluorescencia durante fotoblanqueado, la fluorescencia medida mediante microscopía confocal de fluorescencia; y mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 g durante 15 minutos, in vitro e in vivo;
1 .1 1 ) cuando está fusionada en el extremo C-terminal de la proteína Cdc28 o de la proteína Ydj1 de Saccharomyces cerevisiae la proteína recombinante de fusión mantiene la morfología definida por microscopía de campo claro; y mantiene la viabilidad celular medida mediante plaqueo a 42°C;
1 .12) cuando está fusionada a la Proteína Verde Fluorescente y se expresa en Escherichia coli, mantiene los niveles de expresión, dichos niveles medidos mediante inmunodetección; mantiene la solubilidad de la GFP en extractos celulares medida mediante centrifugación de extractos a 15000 g durante 15 minutos; y mantiene la eficiencia en la purificación por
cromatografía de afinidad medida mediante inmunodetección;
1 .13) mantiene los niveles de expresión, esta expresión medida mediante inmunofluorescencia y mantiene la localización celular determinada mediante microscopía confocal de fluorescencia de proteínas que se encuentran en diferentes compartimentos celulares, dichas proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: beta-actina del citoesqueleto, la proteína STX6 del aparato de Golgi, H01 del retículo endoplasmático, la HDAC2 nuclear y GRB2 de la membrana plasmática en células NIH3T3 de ratón, así como FMRP de la sinapsis neuronal en neuronas del hipocampo; y donde la proteína de mareaje se selecciona del grupo consistente en un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2 y un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3 , o una combinación de las mismas.
2. Proteína recombinante de fusión según la reivindicación 1 , en donde la proteína de mareaje es un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1
3. Proteína recombinante de fusión según la reivindicación 1 , en donde la proteína de mareaje es un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2
4. Proteína recombinante de fusión según la reivindicación 1 , en donde la proteína de mareaje es un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3
5. Secuencia nucleotídica que codifica por la proteína recombinante de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Cassette de expresión por recombinación que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 5 operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
7. Cassette de expresión según la reivindicación 6, en donde la secuencia de control de la expresión comprende una secuencia diana para reguladores transcripcionales, una secuencia de unión al ribosoma y una secuencia terminadora de la transcipción.
8. Vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 5 o un cassette de expresión según la reivindicación 6.
9. Célula huésped transfectada o transducida con la secuencia nucleotídica según la reivindicación 5.
10. Método para obtener una proteína recombinante de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que comprende:
1 ) Fusionar al menos una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína o péptido con una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de mareaje;
2) Clonar la secuencia resultante del paso 1 en una célula huésped;
3) Expresar la secuencia clonada en el paso 2 en una célula.
1 1 . Método para purificar o aislar una proteína recombinante de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que comprende llevar a cabo los pasos según la reivindicación 10 y adicionalmente un paso en donde la proteína de fusión se purifica o aisla.
12. Método según la reivindicación 1 1 en donde el paso adicional de purificación o aislamiento de la proteína de fusión comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la proteína de mareaje.
13. Método para detectar una proteína recombinante de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que comprende llevar a cabo los pasos según la reivindicación 10 y adicionalmente un paso en donde se añaden medios para la detección de la proteína de mareaje.
14. Método según la reivindicación 13 en donde los medios para la detección de la proteína de mareaje comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo.
15. Método según la reivindicación 14 en donde los medios para la detección de la proteína de mareaje comprenden un anticuerpo monoclonal.
16. Método según las reivindicaciones 12-15 en donde los medios se seleccionan de los anticuerpos que se obtienen mediante los hibridomas depositados en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con los números de depósito DSM ACC3236, DSM ACC3234 y DSM ACC3242.
17. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Phl P 2 de Phleum pratense con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO: 1 , y que se produce mediante el hibridoma depositado en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3234.
18. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Hev b 6.02 de Hevea brasiliensis con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:2, y que se produce mediante el hibridoma depositado en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3242.
19. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de Amb t 5 de Ambrosia trífida con una secuencia aminoacídica de como mínimo 70% de identidad con la SEQ ID NO:3, y que se produce mediante el hibridoma depositado en la institución "Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de depósito DSM ACC3236.
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