DE102011055639A1

DE102011055639A1 - Verfahren und Vorrichtung zur simultanen Multikanal- und Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in systemübergreifenden Fluoreszenzlebensdaueranwendungen

Info

Publication number: DE102011055639A1
Application number: DE102011055639A
Authority: DE
Inventors: Klaus Kemnitz
Original assignee: Europhoton Gesellschaft fuer Optische Sensorik GmbH
Current assignee: Europhoton Gesellschaft fuer Optische Sensorik GmbH
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2013-05-23
Anticipated expiration: 2031-11-24
Also published as: DE102011055639B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur simultanen Multikanal-, Multimethoden-Akquisition synchronisierter systemübergreifender Parameter in Fluoreszenzlebensdaueranwendungen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, welches eine quantitative Verknüpfung simultan ermittelter Parameter, welche mittels mehrerer synchronisierter aber unabhängiger Methoden gewonnen wurden, ermöglicht. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Multikanal-Akquisitionssystem gelöst, wobei synchronisiert Daten eines TSCSPC-Systems und des peripheren Systems erfasst, kombiniert und geeigneter Weise ausgegeben werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur simultanen Erzeugung von zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenzbildern auf Basis einer zeit- und ortskorrelierten Einzelphotonenzählung zur systemübergreifenden Multiparamterbestimmung von Proben, in einer synchronisierten Multikanal- sowie Multimethoden Konfiguration.
Fluoreszenzspektroskopische Messmethoden erlangen aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit und Spezifität eine wachsende Bedeutung, insbesondere in der biotechnologischen und medizinischen Diagnostik, jedoch sind Kombinationen mit unabhängigen Methoden wünschenswert, um die Anzahl der beobachtbaren Parameter zu erhöhen, die das untersuchte System so vollständig als möglich beschreiben.
Zellen besitzen die Eigenschaft, eine charakteristische Fluoreszenz nach Bestrahlung mit kurzwelligem Licht auszusenden. Für dieses Verhalten sind insbesondere zelleigene, am Stoffwechsel beteiligte Moleküle verantwortlich, wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH), Flavine, Porphyrine. Das Emissionsspektrum der zelleigenen Fluoreszenz kann vom blauen bis zum roten Bereich des sichtbaren Spektrums (400–700 nm) reichen. Die zelleigene DADH Fluoreszenz kann als Indikator für den Zellstoffwechsel dienen.
Diese sogenannte Autofluoreszenz kann aber auch sehr störend sein, da sie allgegenwärtig bei Messungen von lebenden Zellen ist und die Fluoreszenz der externen bzw. zellfabrizierten Fluoreszenzproben überlagert, die Emissionsbande der Autofluoreszenz sehr breit ist (> 2000 cm <–1>, im Gegensatz zum Spektrum von normalen Fluoreszenzproben, z.B. GFP mit ca. 1500 cm <–1>) und zudem die Fluoreszenzdynamik multiexponentiell (≥ 3 Komponenten für FAD (K. Kemnitz et. al, J. Fluorescence, 7(1997)93)) ist.
Um Fluoreszenz anzuregen, werden die Fluorophore mit monochromatischem Licht in der Nähe des Absorptionsmaximum bestrahlt. Als Anregungsquellen werden entweder gefilterte Lampen oder Laser verwendet. Durch spektrale Filterung der Emission wird die gewünschte Fluoreszenzbande ausgewählt.
Darüber hinaus können laserinduzierte Fluoreszenzsignale allgemein zur Charakterisierung eines Untersuchungsgegenstandes, zum Beispiel von Lösungen oder Oberflächen fester Körper ausgewertet werden.
Die üblichen Verfahren zur Fluoreszenzdetektion sind statische Verfahren, welche Informationen über die Intensität bei einer begrenzten Anzahl von Emissionswellenlängen liefert (z.B. zwei, wie beim "Ratio-Imaging") oder in einem modernen 3D-Spektroskopie-Verfahren sogar das statische Fluoreszenzspektrum in jedem einzelnen Orts-Pixel darstellt (Spectral Diagnostics Ltd., P.O. Box 147, Migdal Haemek, 10551 Israel).
Über das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzen können in der Regel dabei keine Aussagen getroffen werden.
Um die Empfindlichkeit und Selektivität der statischen Fluoreszenzmessmethoden zu steigern, wurde in neuerer Zeit die Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Mikroskopie (FLIM) entwickelt, die in der Phasen- und Zeit-Domäne Anwendung findet.
Die Phasen-Domäne verwendet eine periodische Modulation der Laser-Anregung und/oder Emissionsdetektion.
Die Zeitdomäne verwendet gepulste Laser und stellt eine direkte Methode dar, im Gegensatz zur Phasenfluoremetrie, die eine Transformation vom Phasenraum in den Zeitraum erfordert.
Verfahren und Anordnungen zur Erzeugung von zeitaufgelösten Fluoreszenzbildern in der "Zeit-Domäne" sind bekannt.
Ein bekanntes Verfahren ist das Verfahren "ZOKEPZ" (zeit und ortskorrelierte Einzelphotonenzählung bzw. auf englisch "TSCSPC" (time- and space-correlated single photon counting) (K.Kemnitz et.al: Time- and Space-Correlated Single Photon Counting Spectroscopy, SPIE Proc., 2628 (1995)2.), welches eine Weiterentwicklung von "ZKEPZ" (zeit-korrelierte Einzelphotonenzählung) bzw. auf englisch "TCSPC" (time-correlated single photon counting) ist (D.V. O'Connor and D. Phillips, 1984, Academic Press) und das Verfahren "ZKEPZ in Kombination mit einem Punkt-Scan-Mechanismus" (Becker und Hickl GmbH, Nahmitzer Damm 30, 12277 Berlin).
TSCSPC ist allen vergleichbaren Methoden in allen Bereichen, wie z.B. Dynamischer Bereich, Zeitauflösung, und Hochqualitätskinetik überlegen, mit Ausnahme der Quanteneffizienz der Photokathode (CCD besser).
Die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (ZKEPZ und ZOKEPZ) weist eine Ultra-Empfindlichkeit, einen extrem hohen dynamischen Bereich von > 10 <6> und eine Hochqualitätskinetik auf (bei bis zu 16.000 Punkten auf der Zeitachse), vereinigt mit einer Zeitauflösung von bis zu 2 ps (nach Dekonvolution).
Das Verfahren "ZKEPZ in Kombination mit einem Punkt-Scan-Mechanismus" weist den Nachteil auf, dass im Fokus des Einzelpunkts, der wiederholt über die Probe gescannt wird, sehr hohe Peakpower herrscht, die entweder zu Zellschäden (Zweiphotonenabsorption: K. König et al., Cell damage in twophoton microscopes, Proc. SPIE, 2926(1996)172) oder zu unbemerkten photodynamischen Reaktionen und damit zu irreführenden Fluoreszenzdynamiken in lebenden Zellen führen kann (Einphotonenabsorption: K. Kemnitz et al., EC Demonstration Projekt BIO4-CT97-2177).
Zusätzlich gibt es noch ein drittes Verfahren, das eine schaltbare (gated) CCD-Kamera verwendet (LaVision BioTech GmbH, Höfeweg 74, 33619 Bielefeld). Die CCD-Technologie scheidet aber durch den geringen dynamischen Bereich und durch die kleine Anzahl von Punkten auf der Zeitachse für anspruchsvolle Anwendungen aus.
Es werden MCP-Detektoren mit speziellen Anoden verwendet, die simultan Orts- und Zeit-Informationen liefern. Diese ortsauflösenden Anoden für MCP-Detektoren sind als Delay-Line (DL)-Anoden, gekreuzte DL (GDL), Wedge-and-Strip(WS)-Anoden, crossed-strip-Anoden, Quadrant-Anoden (QA) und Multianoden (MA)(Stepanov et al, SPIE) ausgebildet, die in Vakuumanwendungen (d.h. ohne Photokathode)(M. Lampton and R.F. Malina, Quadrant anode image sensor, Rev.Sci.Instr., 47(1976)1360; C.Martin, P.Jelinsky, M.Lampton, R.F.Malina, Wedge-and-strip anodes for centroid-finding position-sensitive photon and particle detectors, Rev.Sci.Instr., 52(1981)1067), als auch in MCP-PMTs (DL und MA, Stepanov et al, SPIE) zum Einsatz kommen.
QA und MA können aus leitendem bzw. nichtleitendem Material gefertigt werden und unterscheiden sich in ihren Eigenschaften.
Allgemein spricht man von Coded-Anode(CA)-Detektoren, wenn sie Ladungen messen und durch segmentierte Anoden die Ortskoordinaten bestimmen: Wedge-and-Strip (WS) Anode, QA, MA, crossed-strip etc. Unter Verwendung einer DL-Anode (Messung der Laufzeitdifferenz von zwei elektrischen Impulsen) wurde ein Photomultiplier (PMT) mit Photokathode (Einzelphotonen-Detektor) entwickelt, der sehr gut für lineare Anwendungen geeignet ist (Eldy Ltd.: Simultaneous spectral and temporal resolution in single photon counting technique, M.R.Ainbund et al., Rev.Sci.Intr., 63(1992)3274); US-Patent No. 5,148,031 ), bzw. für Imaging-Anwendungen, wenn gekreuzte (2-dimensional) DL Anoden verwendet werden (RoentDek GmbH, Im Vogelshaag 8, 65779 Kelkheim, O. Jagutzki et al., Fast Position and Time Sensitive Readout of Image Intensifiers for Single Photon Detection, Proc. SPIE, 3764(1999)61., US Patent 6,686,721 ).
Des Weiteren wurde ein 4-Anoden-QA-MCP-PMT (4QA) (leitende Anode) entwickelt (Eldy Ltd.; EuroPhoton GmbH im Projekt INTAS-94-4461), der jedoch Bildverzerrungen und eine Limitierung des Gesichtsfeldes aufweist (M. Lampton and R.F. Malina, Quadrant anode image sensor, Rev.Sci.Instr., 47(1976)1360; C. Martin, P. Jelinsky, M. Lampton, R.F. Malina, Wedge-and-strip anodes for centroid-finding position-sensitive photon and particle detectors, Rev.Sci.Instr., 52(1981)1067).
Aus dem DE-G 94 21 717.3 ist eine Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie mit einer gepulsten Strahlungsquelle, einem Strahlungsteiler, einer Einheit zur Ortsauflösung, einer Einheit zur zeitlichen Auflösung bekannt, bei welcher der Strahlungsquelle ein zu untersuchendes Objekt und ein Referenzobjekt zugeordnet sind, und die mindestens eine einem Polychromator mit der Probe bzw. der Referenz optisch verbindende Einrichtung aufweist (keine Mikroskopanwendung).
Die EP 1 291 627 A1 offenbart ein Verfahren und eine Anordnung Verfahren zur simultanen Erzeugung von zeit-aufgelösten Fluoreszenzbildern (Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging) und zeit- aufgelösten Emissionsspektren, basierend auf zeit- und ortskorrelierter Einzelphotonenzählung (TSCSPC, time and space correlating single photon counting) zur Bestimmung von Parametern bei Proben wie lebenden Zellen, in multi-well, in-vitro Fluoreszenz-Assays, in DNA-Chips, bei dem ein gepulster, hochfrequenter, polarisierter Laserstrahl auf eine Fluoreszenzprobe geleitet wird und das von der Fluoreszenzprobe emittierte Fluoreszenzlicht auf einen Strahlteiler (Intensitäts-, Farb-, bzw. Polarisationsteiler) gelenkt und dort in zwei Strahlteile gespalten wird, wobei in den zwei Strahlzweigen
mindestens zwei auf TSCSPC-basierende Listmode-Detektoren zu einem Multiparameter-Aquisitionssystem kombiniert werden, mit welchem zur maximalen Informationsgewinnung simultan alle physikalischen Parameter eines jeden Einzelphotons erfasst und in einer Kontroll-Elektronik gespeichert und ausgewertet werden. Ein solches System ist in der Lage, simultan ps/ns zeitaufgelöste Fluoreszenzintensitäts-, Fluoreszenzlebensdauer- und Fluoreszenzanisotropie-Bilder samt Diffusionstrajektorien zu liefern. Das vorgeschlagene System ermöglicht jedoch lediglich eine Ein-Kanal-Messung.
Weiterhin wurde vorgeschlagen eine Multiparameter-Akquisition auf Basis einer Widefield-TSPSPC-Anwendung dadurch zu erzielen, dass neben den Listmode-Parametern auch Parameter peripherer Systeme einbezogen werden, wobei diese Parameter synchronisiert sind (Stepanov et al., Widefield TSCSPC-Systems with Large-Area-Detectors: Application in simultaneous Multi-Channel-FLIM, Proc. SPIE 7376, 73760Z (2010)).
Trotz der fortlaufenden Entwicklung im Bereich der Fluoreszenzlebensdaueranwendungen besteht weiterhin ein Bedarf an einer weitergehenden Verknüpfung der über Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging erzeugten Daten mit anderen Detektionsmethoden, um mittels einer systemübergreifenden Korrelation dieser Daten neue Aussagen zu strukturellen und funktionalen Gegebenheiten der zu untersuchenden Probe zu treffen.
Die Listmode-Datenabspeicherung der klassischen TSCSPC-Methode enthält folgende Parameter jedes Einzelereignisses: Ortskoordinaten x und y (bzw. die zugrundeliegenden TAC oder TDC Zeitdifferenzen bei DL- oder die Einzelladungen bei MA-Detektoren), die korrelierte Zeitdifferent Δt (Zeitdifferenz zwischen Einzelquant und dem nächstliegenden Anregungs-Laserpuls), sowie die absolute Ankunftszeit t(abs), gemessen mittels einer Quartzuhr bzw. der Anzahl der periodischen Laserpulse.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, welches eine quantitative Verknüpfung simultan ermittelter Parameter, welche mittels mehrerer synchronisierter aber unabhängiger Methoden gewonnen wurden, ermöglicht.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren gemäß Anspruch 9 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß weist die Vorrichtung eine Anordnung (Fluoreszenz-Mikro-, Makro- und Nano-Spektroskop) zur Erzeugung von zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenzbildern basierend auf zeit- und ortskorrelierter Einzelphotonenzählung (TSCSPC) zur Bestimmung von Parametern bei Proben wie lebenden Zellen, in multi-well, in-vitro Fluoreszenz-Assays, DNA-Chips, umfassend

– ein Fluoreszenz-Mikroskop, -Makroskop, -Nanoskop
– zumindest eine gepulste Laserquelle,
– zumindest einen Strahlteiler,
– zumindest ein synchronisiertes peripheres Gerät,
– zumindest einen TSCSPC-Detektor (orts- und zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählungs-Detektor),
– sowie ein synchronisiertes externes System zur Bestimmung weiterer Parameter der Probe, wobei das externe System die Parameter synchronisiert erfassend ausgebildet oder modifiziert ist und zumindest einen gepulsten oder ungepulsten Laser als externes Gerät umfasst.

Durch die Verwendung zumindest eines Strahlteilers werden zumindest zwei Strahlzweige erzeugt, welche dann von dem zumindest einem TSCSPC-Detektoren erfasst werden können.
Unter dem peripheren System oder der Peripherie werden alle elektronisch-steuerbaren Module eines Nano-, Mikro- oder Makroskops verstanden. Beispielsweise können dies im Falle eines Epi/TIRF Fluoreszenzmikroskops nachfolgende Module sein:

– Position eines Anregungs- oder Emissionsfilterrads
– Position des Dichroiten-Karousels,
– Position des Ausgangsports,
– z-Position des Objektivs,
– xyz-Position eines Nano- oder Mikro-Verschiebetisches,
– Epi- oder TIRF-Position, wobei beide Ports mit unterschiedlichen Lasern angeregt werden können,
– Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters (z.B. AOTF, acusto-optical tunable filter).

In einer Ausführungsform der Erfindung können bei Verwendung von nur einem TSCSPC-Detektor beide Bilder, die durch den Strahlteiler gewonnen werden, simultan auf ein und dieselbe Photokathode nebeneinander abgebildet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung weist der zumindest eine TSCSPC-Detektor eine Anode auf, welche ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus DL-Anoden, gekreuzte DL (GDL), Wedge-and-Strip(WS)-Anoden, crossed-strip-Anoden, Quadrant-Anoden (QA) und Multianoden (MA).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können ein Farbteiler und ein Polarisationsteiler hintereinander geschaltet werden, sodass vier Teilbilder in einer quadratischen Anordnung erhalten werden. Diese Anordnung ermöglicht echt-simultane Dual- Anisotropie-Abbildung. Werden dabei zwei oder vier Sets von crossed-DL oder anderen ortsabbildenen Anoden neben- und übereinander einander eingesetzt, kann zwei- bzw. vier-Kanal- Koinzidenz-Abbildung mit lediglich einem Detektorkopf betrieben werden. Optische 4-Kanalabbildung ist möglich bei großflächigen Detektoren von 25–40 mm Durchmesser.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Vorrichtung TSCSPC-Detektoren, wobei diese zum wahlweise simultanen oder sequentiellen Einsatz mit einfachen oder abbildenden Polychromatoren (auch scannenden konfokalen Polychromatorsystemen) zum Einsatz kommen. Alternativ können auch Gated CCD-Detektoren verwendet werden, die als Externgerät synchronisiert werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die zumindest zwei Strahlteile auf zumindest zwei TSCSPC-Detektoren gelenkt. Die TSCSPC-Detektoren können dabei so ausgestaltet sein, dass einer der TSCSPC-Detektoren im ersten Zweig zeitaufgelöste Emissionsspektren misst, während der zweite TSCSPC-Detektor im zweiten Zweig zeitaufgelöste Fluoreszenzbilder aufnimmt.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann im ersten Zweig entweder ein linearer DL-Detektor verwendet werden (liefert ein Spektrum des Zentrums der Probe) bzw. abbildende Detektoren (GDL, WS, 4QA, 5QA, CA, gated CCD), die simultan bis zu 250 individuelle Spektren liefern, entlang der Diagonalen durch die Probe (Verwendung eines abbildenden Polychromators als Dispersionselement). Im zweiten Zweig kann entweder ein linearer DL-Detektor verwendet werden (liefert ein Linienbild durch das Zentrum der Probe) bzw. abbildende Detektoren (GDL, WS, 4QA, 5QA, CA, gated CCD).
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Anordnung dadurch gekennzeichnet, dass der eine Detektor mit einer linearen Delay-Line (DL) (einfacher Polychromator) bzw. mit einer gekreuzten Delay-Line (GDL), QA, WS oder allgemein CA-Anode, aber auch mit einer gated CCD (abbildender Polychromator) ausgerüstet ist und hinter dem Strahlteiler, einem Dispersionselement und einem Neutral- sowie Polarisationsfilter im Strahlengang des einen Zweiges des emittierten Fluoreszenzlichts angeordnet ist und dass als ein weiterer Detektor ein GDL-, 4QA-, 5QA-, WS- oder CA-MCP-PMT (auch gated CCD) verwendet wird und hinter dem Strahlteiler und einem Neutral- sowie Farb- und Polarisationsfilter im Strahlengang des zweiten Zweiges des emittierten Fluoreszenzlichts angeordnet ist.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiterhin gepulste oder ungepulste Laser zur Manipulation und Aktivierung, womit z.B Lasertrapping und Photo-Switch-Anwendungen möglich werden.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst das externe System ein Rastersondenmikroskop, Laser Scanning Zytometer, ein konfokales Ein- oder Zweiphotonen Laser Scanning Mikroskop, eine Farb-CCD Kamera, eine S/W-CCD Kamera, eine gated CCD-Kamera, in Verbindung von RGB Filtern in einem synchronisierten Filterrad, die Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters (z.B. AOTF, acustooptical tunable filter), ein Laser in einer multiplen Laseranregung (bzw. Farbe eines elektronisch regelbaren ps-Kontinuum-Lasers), welcher direkt kontrolliert (Diodenlaser, Fianium) oder über Shutter gesteuert werden kann, Fiber Switchers, die fasergekoppelte Laser kontrollieren, die Eigenschaften eines oder mehrerer zusätzlichen Manipulationslaser (trapping, cutting, activation, conversion, bleaching), xyz-Position und zugehöriger Meßwert eines Scanning-Probe Mikroskops (SPM), rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen (z.B. Yokogawa CSU-x1), Laserstrahlmodifikatoren, wie in 3D-SIM- und PAM-Mikroskopie, als Beispiele für Beleuchtung mit Strukturiertem Licht, ROI (region of interest) und andere Eigenschaften eines konfokalen Scanningspektrographen (z.B. Nikon C1-si) oder Rotatoren zur Kontrolle von zirkularen Neutralfiltern zur Einstellung der Laserintensität, Prismen zur Verdrehung der Polarisationsrichtung.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist der Strahlteiler als ein Intensitäts-, Farb-, oder Polarisationsteiler ausgebildet. Bei Ausgestaltung des Strahlteilers als Farbteiler (dichroitischer Spiegel), der z.B. die FRET-Donor und FRET-Akzeptor Emissionsbande trennt, kann ein FRET-System aufgebaut werden, das keine Photonen verliert, da auf Polychromator und Farbfilter verzichtet werden kann. Als ein dichroitischer Spiegel (dichroic mirror) wird im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Spiegel bezeichnet, welcher nur einen Teil des Lichtspektrums reflektiert und den Rest durchlässt. Dabei trennt dieser Spiegel das einfallende Licht nach der Wellenlänge und somit nach der Farbe. Bei Ausgestaltung des Strahlteilers als Polarisationsteiler dagegen, der die parallele und senkrechte Polarisationsrichtungen trennt, kann ein verlustfreies Anisotropie-System aufgebaut werden, da auf die Polarisationsfilter verzichtet werden kann.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst die Vorrichtung weiterhin zumindest eine Nipkowscheibe. Als Nipkow-Scheibe wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Spirallochscheibe bezeichnet, mit der Bilder in Hell-Dunkel-Signale zerlegt und wieder zusammensetzt werden können. Die rotierende Scheibe wandert dazu zeilenweise am Bild (bei der Zerlegung) bzw. der Projektionsfläche (bei der Zusammensetzung) vorbei. Sie ist mit spiralförmig angeordneten quadratischen Löchern versehen.
Beide Strahlengänge (Strahlzweige) können simultan oder sequentiell verwendet werden, oder aber auch getrennt, wenn z.B. das Autofluoreszenzproblem vernachlässigbar ist, bzw. sehr gut verstanden ist, und auf das zeitaufgelöste Spektrum zur FRET-Verifizierung verzichtet werden kann.
Mit der Anordnung nach der Erfindung kann ein Multi-Parameter-Fluoreszenzmikroskop aufgebaut werden, das zeitgleich alle verfügbaren physikalischen Parameter (Ortskoordinaten x und y, Δt(TAC), t(abs), Polarisation und Wellenlänge) eines jeden individuellen Photons messen und speichern kann. Durch synchronisierte Akquisition der Parameter externer Geräte einer anderen Methode und Einstellungen der Anordnung, wie etwa Parameter der CCD Kamera, Position eines Filterrads und/oder eines Dichroiten-Karousels, Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters, Laser in einer multiplen Laseranregung (Farbe eines elektronisch regelbaren ps-Kontinuum-Lasers), Eigenschaften eines oder mehrerer zusätzlichen Manipulationslaser (trapping, cutting activation), xy-Position und Z-Parameter eines Scanning-Probe Mikroskops (SPM), Position eines Nano-, Mikro- oder Makroskop-xy-Verschiebetisches, Laserstrahlmodifikatoren (Strukturierte Beleuchtung), rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen, etc. können jedem Einzelereignis neben den direkten physikalischen Parametern des jeweiligen Einzelphotons die synchronisierten Parameter externer Geräte und Einstellungen der Anordnung zugewiesen werden.
Die Zeitkorrelation des zumindest einen TSCSPC-Detektors erfolgt mittels jeweils eines TAC (time-to-amplitude converter) bzw. TDC (time-to-digital converter) sowie mittels Standard-Elektronikmodulen (z.B. CFD usw., wie sie in der Standard-Einzelphotonen-Zählung nach dem Stand der Technik verwendet werden). Der jeweilige TAC bzw. TDC misst die Zeitdifferenz zwischen Startsignal (Fluoreszenzphoton) SS und einem gemeinsamen Stopsignal StS (vom Laserpuls, der das Fluoreszenzphoton erzeugt hatte).
Die Einzelereignisse werden in einer Kontroll-Elektronik zwischengespeichert, sortiert und synchronisiert und anschließend über ein Smart Interface und Synchronisator in einem PC nacheinander abgespeichert (List Modus), können aber auch zu Histogrammen verarbeitet werden, die dann schnell und Speicherplatz schonend gespeichert werden können.
Die TSCSPC-Detektoren sind in der Lage, simultan Orts- (bzw. Wellenlängen-) und Zeitkoordinaten zu bestimmen und die Kontroll-Elektronik kann zusätzliche Parameter, wie Polarisationsrichtung, Emissionswellenlänge, absolute Ankunftszeit, etc. jedes einzelnen Ereignisses abspeichern. Da alle gemessenen Parameter jedes einzelnen Photons sowie die synchronisierten Parameter der externen Geräte sowie der Einstellungen der Anordnung auf Festplatte verfügbar sind, kann jedes beliebige Diagramm erstellt werden, welches die einzelnen Parameter zueinander in Beziehung setzt (Replay Modus) und somit neuartige Anwendungen ermöglicht, wie beispielsweise xy-ortsaufgelöste Einzel- oder Multi-Kanal ps/ns dynamische Fluoreszenzanwendungen, TSCSPC-Nanotracking, TSCSPC-PSF (point spread function)-Analysen: TSCSPC-Palmira-FLIN (photoactivated localisation microscopy with independently running acquisition – fluorescence lifetime imaging nanoscopy), TSCSPC-STICS (spatio-temporal image correlation spectroscopy), TSCSPC-OLID (optical-lock-in detection), TSCSPC-PALM/FPALM (photoactivation light microscopy), TSCSPC-STORM (stochastic reconstruction optical microscopy), TSCSPC-STED (stimulated emission depletion), TSCSPC-PAM (programmable array microscope), optical sectioning microscopy (structures illumination), TSCSPC-FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching), TSCSPC-FRET (Förster Energie Resonanz Transfer) oder TSCSPC-SPM, als funktionell-strukturelle Korrelation bei Kombination von Daten z.B. eines AFM (als Bestandteil des synchronisierten peripheren Systems) mit denen eines widefield TSCSPC-System).
Dadurch entstehen neuartige Methoden, die durch Anwendung der Multi-Kanal-, Multi-Methoden- und systemübergreifende Multiparameter-Akquisition und Replay der Listmode-Datensätze ermöglicht werden. Zusätzlich zu den TSCSPC-FLIM Information erhält man dabei die korrelierte Information der jeweils unabhängigen zusätzlichen Methode:

– TSCSPC-Nanotracking: ps/ns FLIM + Tracking von Einzelmolekülen, Qdots und Nanodomänen mit 1 nm Auflösung, basierend auf Gauss-Fits und xy Bestimmung des Schwerpunktes,
– TSCSPC-PSF(point spread function)-Methode: ps/ns-FLIM + Nanometerdistanzmessung, basierend auf Gauss-Fits von Einzelmolekülen, Qdots und Nanodomänen unterschiedlicher Fabe,
– TSCSPC-Palmira (photoactivated localisation microscopy with independently running acquisition – fluorescence lifetime imaging nanoscopy), ps/ns-FLIM + Subresolution Fluoreszenzbilder,
– TSCSPC-PALM/FPALM (photoactivation light microscopy), ps/ns-FLIM + Subresolution Fluoreszenzbilder,
– TSCSPC-STORM (stochastic reconstruction optical microscopy), ps/ns-FLIM, + Subresolution-Fluoreszenzbilder, wobei PALM/PALMIRA/STORM Beispiele der sogenannten Photo-Switching Mikroskopie sind, die auf Aktivierung/Deaktivierung eines photoschaltbaren Moleküls beruht,
– TSCSPC-STICS (spatio-temporal image correlation spectroscopy): ps/ns FLIM + zeit-räumliche Korrelationen zur Bestimmung von Diffusionskonstanten, Aggregation, u.a. intrazellulärer Eigenschaften des fluoreszierenden Moleküls,
– TSCSPC-OLID (optical-lock-in detection): ps/ns FLIM + selektive Beobachtung eines gewünschten Moleküls inmitten anderer Moleküle von hohem Fluoreszenzhintergrund,
– TSCSPC-STED (stimulated emission depletion): ps/ns-FLIM + Subresolution-Fluoreszenzbilder,
– TSCSPC-SIM (structured illumination microscopy): ps/ns-FLIM + Subresolution-Fluoreszenzbilder,
– TSCSPC-PAM (programmable array microscope): ps/ns-FLIM + Subresolution-Fluoreszenzbilder, wobei SIM und PAM ein Beispiel ist für Anwendung der strukturierten Beleuchtung in Fluoreszenzmikroskopie/Spektroskopie sind,
– TSCSPC-FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching): ps/ns-FLIM + Diffusionsverhalten von Biomolekülen in lebenden Zellen, basierend auf Ausbleichen der Chromophore durch einen optischen Manipulationslasers und Beobachtung der Wiederkehr der Fluoreszenz,
– TSCSPC-FRET (Förster Energie Resonanz Transfer): ps/ns-FLIM + FRET-Verifikation durch simultane Beobachtung von Donor- und Akzeptoremission und deren Intensitätsverhältnisses, sowie alternierende Laseranregung von Donor und Akzeptor,
– TSCSPC-SPM: ps/ns-FLIM + Meßwerte eines synchronisierten Sondenmikroskops, wie z.B. AFM. Die TSCSPC-AFM Kombination liefert Funktions(TSCSPC)-Struktur(AFM)-Korrelationen, die sonst nicht zugänglich sind,
– TSCSPC-CALM: ps/ns-FLIM + complementation-activated light microscopy, zur selektiven Detektion von Einzelmolekülen in der natürlichen Umgebung lebender Zellen.

Polarisations- und Farbfilter können manuell, bzw. optional elektro-mechanisch bzw. elektronisch gesteuert werden und sind mit der Kontroll-Elektronik und Synchronisator verbunden.
Die Neutralfilter können ebenfalls elektromechanisch gesteuert werden und mit der Kontrollelektronik/Synchronisator verbunden sein.
Opto-elektronische Farb- und Polarisations-Filter können im ms-Bereich gesteuert werden, Standardfilter dagegen elektromechanisch im Sekundentakt (pseudo-simultan), was aber bei einer Messdauer im Minutenbereich einer simultanen Akquisition gleichkommt. Durch Verwendung mehrerer Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen und/oder Farb- und Polarisationsfilter können Multi-Kanal-Akqusitionssysteme aufgebaut werden, die aufgrund pseudosimultaner Messung umfangreiche Datenerfassungen für Fluoreszenzanwendungen ermöglichen. Durch Multi-Kanal-Akquisition können aufgrund der synchronisierten Parametererfassung insbesondere der externen Geräte und entsprechender Kombinationsmöglichkeit der der einzelnen Parameter im Replay-Modus neuartige Aussagen hinsichtlich funktioneller und struktureller Zusammenhänge der Probe generiert werden. Durch die synchronisierte Akquisition der Parameter wird eine Korrelation der entsprechenden Parameter anwenderspezifisch ermöglicht, was Mehrfachmessungen der Probe auf unterschiedlichen Messvorrichtungen vermeidet und den weiteren großen Vorteil einer synchronen Erfassung bei dynamisch veränderlichen Proben bietet. Dies ist insbesondere vor dem Hintergrund möglicher Bleich- und Alterungseffekte bei Mehrfachmessungen interessant.
Echt-simultane Akquisition wird erreicht, wenn man den Strahlteiler als Farb- bzw. Polarisationsteiler ausführt und auf Dispersionselement, Farb- bzw. Polarisationsfilter vor den beiden Detektoren verzichtet. Der Farbteiler kann zum Beispiel so gestaltet werden, dass er FRET-Donor- und FRET-Akzeptor-Bande trennt, um ein verlustfreies (filterloses) FRET-System zu erreichen. Analog kann der Strahlteiler die Polarisationsrichtungen separieren, um ein verlustfreies Anisotropiesystem zu erlangen.
Die hier vorgestellte Kombination von Zeit-, Spektral- und Orts- Analyse kombiniert mit funktionellen und strukturellen Aussagen zur Probe mittels externer synchronisierter Geräte ermöglicht eine höchstmögliche Sensitivität und Selektivität, wie sie mit herkömmlichen Methoden nicht erreicht werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur simultanen Multikanals-Akqusition synchronisierter Parameter aus TSCSPC und externen Methoden in Fluoreszenzlebensdaueranwendungen umfassend die Schritte:

– Bestrahlung einer Probe mit mindestens einem gepulsten, hochfrequenten, polarisierten oder unpolarisierten ps-Laserstrahl,
– Emission der Fluoreszenzstrahlung von der Probe, wobei die Fluoreszenzstrahlung auf zumindest einen Strahlteiler geleitet wird, sodass zumindest zwei Strahlteile ausgebildet werden,
– der eine oder die beiden Strahlteile mindestens auf einem auf orts- und zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählung basierenden Listmode-Detektor gelenkt werden, wobei der zumindest eine Listmode-Detektor simultan alle physikalischen Parameter eines jeden Einzelphotons erfasst und in einer Kontroll-Elektronik speichert,
– simultan eine Bestimmung weiterer Parameter durch zumindest ein peripheres Gerät und ein externes Gerät eines externen Systems erfolgt, wobei die Parameter-Akquisition durch die peripheren und externen Geräte des externen Systems synchronisiert erfolgt und die durch das externe Gerät des externen Systems ermittelten Parameter der Probe gespeichert werden und
– die gespeicherten Parameter der Listmode-Detektoren, der Peripherie und des externen Geräts zu einem Multiparameter-Multi-Methoden-Aquisitionssystem in einer 1-File-Methode kombiniert werden.

Unter einer 1-File-Methode wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Hinterlegung der synchronisierten Datensätze aus TSCSPC-System, peripheren System und externen System in einer Datei auf einem Datenverarbeitungsgerät verstanden.
Die hier beschriebenen Systeme können mit lediglich einem TSCSPC Detektor betrieben werden, doch können ein zweiter TSCSPC Detektor (oder gated-CCD Kamera) synchronisiert werden.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung werden die zumindest zwei Strahlteile auf zumindest zwei Listmode-Detektoren gelenkt, wobei diese simultan alle physikalischen Parameter eines jeden Einzelphotons erfassen und in der Kontroll-Elektronik speichern.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird als externes Gerät, welches weitere Parameter der Probe mittels unabhängiger Methoden ermittelt ein Rasterkraftmikroskop, ein Laser Scanning Zytometer, ein konfokales Ein- oder Zweiphotonen Laser Scanning Mikroskop, verwendet wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind Einzelanwendungen eines jeden Zweiges möglich, wie etwa in einem im TSCSPC-Polychromator-Fluoreszenzmikroskop, bei Verwendung z.B. eines abbildenden Transmissionspolychromators oder eines fasergekoppelten konfokalen Spektrographen, wie etwa ein Nikon C1si Spectral Imaging Confocal System.
Durch simultane Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz-Bilder und der zeitaufgelösten Fluoreszenz-Spektren gelingt es, die negativen Effekte der Autofluoreszenz zu eliminieren (z.B. FRET-Verifizierung). Die schnellste Komponente (ca. 100 ps) der Autofluoreszenz kann Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vortäuschen, kann aber durch das viel breitere Emissionsspektrum, als Autofluoreszenz erkannt werden. Desweiteren kann durch Verwendung zweier Anregungslaser simultane Multikanal-Akquisition der Donor- und Akzeptor-angeregten Emissionen erreicht werden, zum besseren Verständnis des intrinsischen FRET-Mechanismus.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden weiterhin synchronisierte Koordinaten und/oder Parameter der Peripherie und externer Geräte des externen Systems erfasst und mit den gespeicherten Parametern der Listmode-Detektoren zu einem Multikanal-, Multi-Methoden und Multiparameter-Aquisitionssystem kombiniert, wobei zur Peripherie alle elektronisch-steuerbaren Module eines Nano-, Mikro- oder Makroskops, wie etwa eines Epi/TIRF Fluoreszenzmikroskops, gehören (Position eines Filterrads und/oder eines Dichroiten-Karousels, Position des Ausgangsports, z-Position des Objektivs, xyz-Position eines Nano- oder Mikro-Verschiebetisches, Epi- oder TIRF-Position) und die externen Vorrichtungen ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus CCD Kamera, gated-CCD-Kamera, Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters, Laser in einer multiplen Laseranregung (Farbe eines elektronisch regelbaren ps-Kontinuum-Lasers), Eigenschaften eines oder mehrerer zusätzlichen Manipulationslaser (trapping, cutting activation, conversion, bleaching), xyz-Position und zugehöriger Meßwert eines Scanning-Probe Mikroskops (SPM), Laserstrahlmodifikatoren (Strukturierte Beleuchtung), rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen, 3D-SIM-Mikroskop, ROI eines konfokalen Scanningspektrographen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die synchronisierten Daten und Parameter des TSCSPC-Systems, der Peripherie und des externen Systems zu einem Multikanal-, Multi-Methoden und Multiparamter-Akquistionssystem kombiniert und in einem Replay-Modus für funktionelle und/oder strukturelle Analysen verwendet, wobei nachfolgende Methoden verwendet werden können: TSCSPC-Nanotrackig, TSCSPC-PSF (point spread function)-Analysen: TSCSPC-Palmira-FLIN (photoactivated localisation microscopy with independently running acquisition – fluorescence lifetime imaging nanoscopy), TSCSPC-STICS (spatio-temporal image correlation spectroscopy), TSCSPC-OLID (optical-lock-in detection), TSCSPC-PALM/FPALM (photoactivation light microscopy), TSCSPC-STORM (stochastic reconstruction optical microscopy), TSCSPC-STED (stimulated emission depletion), TSCSPC-PAM (programmable array microscope), Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (optical sectioning microscopy), TSCSPC-FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching), TSCSPC-FRET (Förster Energie Resonanz Transfer) oder auch funktionell-strukturelle Korrelation, wie etwa bei Kombination von Daten eines AFM (als Bestandteil des synchronisierten externen Systems) mit denen eines TSCSPC-Systems.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt gleichzeitig eine Änderung der Anregungswellenlänge, der Emissionswellenlänge sowie des dichroitischen Mikroskopspiegels. Dadurch wird es möglich, den für jede Anregungswellenlänge optimierten Filtersatz zu verwenden, resultierend in helleren und kontrastreicheren Fluoreszenzbilder.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße System in Makroskopie-Anwendungen eingesetzt. Diese können beispielsweise Multi-well Platten-Anwendungen im medizinisch, biotechnologischen Bereich umfassen, sowie abbildende Endoskopie in medizinischen Anwendungen, wobei durch Einsatz des erfindungsgemäßen Systems Echtzeit-Bild-Aufnahmen generiert werden können als auch in Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen für Kleintiere im veterniärmedizinischen Bereich oder zu Forschungszwecken.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden mittels 2-File-Methode synchronisierte Datenmengen auf dem Datenverarbeitungsgerät hinterlegt werden, wobei zwei PC oder ein PC mit Multicore-Prozessor verwendet werden kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird bei hohem Datendurchsatz > 0,25 × 10⁶ cps des TSCSPC-Zweigs kann ps/ns-zeitaufgelöstes Time-Lapse Imaging im Bereich der Videoqualität mit 25 Bilder/s oder höher erziel, um schnelle Änderungen der Fluoreszenzdynamiken während oder nach der Messung festzustellen. Bei hohem Datendurchsatz, z. B. von > 10⁶ cps des TSCSPC-Zweigs, kann so ps/ns-zeitaufgelöstes Imaging im Bereich der Videoqualität mit 25 Bilder/s oder höher erzielt erreicht werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die absolute Ankunftszeit aus dem TSCSPC-Parametersatz zur Synchronisation mit Peripherie- und externen Systemen verwendet wird, wobei die Ankunftszeit durch eine Quarzuhr oder mittels der gezählten Anzahl von periodischen Anregungslaserpulsen bestimmt wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Weitfeld 2-Photonanregung in einem externen TIRF-Prisma mit > 100 mW IR-Laserpower, wobei zwischen 1-Photonen und 2-Photonenanregung durch synchronisiertes Umschalten eines Frequenzverdopplers des Anregungslasers gewechselt wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung stellt eine Fokuslinse vor dem TIRF-Prisma die gewünschte Beleuchtungsfläche und damit die Anregungsintensität ein.
TSCSPC ist die Imaging-Variante von TCSPC (time-correlated single photon counting), eine altbewährte ultra-empfindliche Methode, um Fluoreszenzdynamiken höchster Qualität zu akquirieren, basierend auf einem MCP-PMT Punktdetektor mit Scheibenanode. Der Ersatz der Scheibenanode durch eine ortsempfindliche Delay-Line oder Multi-Anode führt zu TSCSPC (time- and space-correlated single photon counting), die abbildende Variante von TCSPC. FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) wurde bisher mit TCSPC und durch Scanning des fokussierten Laserstrahls ausgeführt, was zu unerwünschten Nebeneffekten wie photodynamischen Reaktionen und Bleichung der Probe, etc führen kann, aufgrund der sehr hohen Anregungsintensitäten innerhalb des Fokus. Die TSCSPC Methode dagegen verwendet abbildende Weitfelddetektoren mit minimalinvasiver Weitfeldbeleuchtung, die erstmals Fluoreszenzmessungen von lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen erlaubt. Die TSCSPC-Methode ist ultra-empfindlich (Einzelmolekül) und hat einen ultra-dynamische Bereich (> 10⁶), bei einer Zeitauflösung < 5 ps sowie Ortsauflösung < 80 Mikron an der Photokathode (1200 × 1200 Pixel), bei einem Durchsatz von 10⁶ cps, wobei Video-Geschwindigkeit erreicht wird. Die neue Weitfeld-FLIM Methode erreicht, bei einer Instrument-Response-Funktion (IRF) von 25 ps FWHM, eine effektive Zeitauflösung von bis zu ca. 3 ps in multiexponentiellen Fluoreszenzdynamiken nach Dekonvolution. Neben der hohen Zeitauflösung hat diese innovative Weitfeld-Methode gegenüber den bereits etablierten optischen Verfahren, die auf dem Scanning-Prinzip beruhen, den Vorteil der sehr geringen Anregungsintensität (minimal-invasiv). Es werden für die Anregung nur sehr niedrige Photonendichten von 10¹⁰ Photonen/cm²/Anregungspuls und geringe mittleren Intensitäten von 10 mW/cm² bei multiparametriger Datenakquisition benötigt d.h. 10³–10⁴ mal weniger Anregungsintensität als in der klassischen Fluoreszenz- bzw Laserscanningmikroskopie. Dadurch eröffnet sich ein bisher unerreicht hohes Potenzial für die minimal-invasive, physiologisch-relevante Langzeitbeobachtung von (biologischen) Interaktions-prozessen, simultan an einer größeren Anzahl von individuellen lebenden Zellen sowie an Mikro- und Nanostrukturen. Dadurch werden lange Beobachtungszeiten (Long-Period Observation, LPO) von makromolekularen Komplexen in ihrer natürlichen Umgebung ohne Induktion von photodynamischen Reaktionen bzw. Bleichen von Fluorophoren ermöglicht.
Durch Anwendung der hier vorgestellten Multikanal und Multi-Methoden Konfiguration entsteht eine neuartige zeitaufgelöste Weitfeld-Fluoreszenzbilderfassung für ultra-parallele und minimalinvasive Anwendungen in Makro-, Mikro- und Nanoskopie, wobei sich unter den neuen makroskopische Anwendungen Ultra-Parallele Optische Tomographie, Nanoprozeßkontrolle, Echtzeitkontrolle Radioaktiver Verunreinigungen (Sr⁹⁰) in Trinkwasser, Ultra-Parallele Mikroarray-Lesegeräte für Pharmazie und Bioanalytik wie Genom und Proteomforschung sowie Arzneistoffentwicklung und Überwachung und Erforschung von Schäden an Kulturpflanzen durch Umweltgifte oder erhöhte UV-Belastung befinden und systemübergreifende multiparametrige Messdatenerfassung in der Zellbiologie ermöglicht wird.
Durch synchronisierte Kombination von TSCSPC mit modernen Nanoskopiemethoden wird zum ersten Mal ps/ns-zeitaufgelöste Nanoskopie erreicht, d.h. FLIN (fluorescence lifetime imaging nanoscopy) als Erweiterung zum klassischen FLIM. Durch Synchronisation mit Weitfeld-nanoskopiemethoden wie STORM, PALM, PALMIRA kann minimal-invasives Weitfeld-FLIN erreicht werden, zur simultanen nm-Distanzbestimmung und ps-Zeitmessung.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschrieben ohne diese zu beschränken. Es zeigen in
1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Multikanal-, Multimethoden-Akqusitionssystems mit 1-File Abspeicherung für einfache Peripherie- und externe Gerätekonfiguration, in
2 eine alternative Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Multikanal-, Multimethoden-Akqusitionssystems mit 2-File Abspeicherung für komplexe Peripherie- und Externe Gerätekonfiguration, in
3 eine schematische Darstellung einer möglichen Laseranordnung in einer Multikanal-, MultiMethoden-Akquisitionsanordnung mit individuellen Anregungslasern, in
4 eine schematische Darstellung einer weiteren Laseranordnung mit Breitband ps-Laser und Wellenlängenselektor in einer Multikanal-, Multimethoden-Akquisitionsanordnung, in
5 eine beispielhafte Darstellung eines Ausschnitts aus einer Liste mit „schnellen“ und „langsamen“ Kanälen, in
6 eine Kombination von Freistrahl- und Faser-Mikroskopeinkopplung des Anregungslasers, in
7 eine beispielhafte typische Multi-Peripherie-, Multi-Externgerät-Anordnung eines erfindungsgemäßen Akquisitionssystems, in
8 eine schematische Darstellung einer simultanen Beobachtung eines Fluoreszenzbildes mittels TSCSPC- und Extern-Detektoren und in
9 eine schematische Darstellung einer Makroskopie-Anwendung mit einer Multi-Well-Probe.
In der 1 ist beispielhaft ein Multikanal-, Multimethoden-Akqusisitionssystem dargestellt. Dieses umfasst ein TSCSPC-System 1 mit angekoppeltem optischem System (Nano-, Mikro- oder Makroskop) und Detektorkopf-Photoverschluss 1b, welches beispielsweise als TSCSPC-Weitfeldfluoreszenz-System ausgestaltet sein kann. Weiterhin sind nicht näher dargestellte periphere Vorrichtungen und ein externes-System 2, wobei das externe System 2 zur Akquisition weiterer Parameter der Probe mittels unabhängiger nicht invasiver Methoden ausgestaltet sind. Solch ein externes System 2 kann dabei Extern-Geräte umfassen, wie etwa Scanning Spektrometer, Rastersondenmikroskope, Laser-Scanning Mikroskope, Laser-Scanning Zytometer, konfokale Ein- oder Zweiphotonen Laser-Scanning Mikroskope, etc. bzw. Kombinationen dieser Geräte, wobei die Extern-Geräte des externen Systems 2 solche sind, die eine Detektion der Parameter der Probe mittels nichtinvasiver Methoden ermöglichen. Das System umfasst dabei weiterhin beispielsweise zwei ps-Anregungslaser 3, 4 die jeweils in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen emittieren und so verschiedene Anregungsbereiche in der Probe realisieren können. Die emittierten Strahlen der beiden Laser 3, 4 können kolinear überlagert werden mittels eines Strahlteilers 5, welcher als dichroitischer Spiegel ausgeführt ist, zu einem gemeinsame Strahl vereint werden und in das optische Teilsystem (Nano-, Mikro, Makroskop) des TSCSPC-Systems 1 nach Durchlauf eines optionalen Lichtmanipulators 6 (strukturiertes Licht) eingekoppelt werden, wobei ein Teil des Laserstahls mittels eines Teilerspiegels 11 abgezweigt und in das Externgerät 2 eingekoppelt werden kann.
Sowohl das TSCSPC-System 1 samt Peripherie als auch das externe System 2 sind über einen Synchronisator 7 miteinander synchronisiert, sodass die in dem TSCSPC-System 1, dessen Peripherie und dem externen System 2 erhobenen Daten und Parameter nachfolgend miteinander korreliert werden können. Dabei werden die Daten und Parameter des TSCSPC-Systems 1, dessen Peripherie und des externen Systems 2 mittels des Synchronisators 7 synchronisiert, wobei der Synchronisator 7 eine Feedbackfunktion an das TSCSPC-System 1 und das Extern-System 2 aufweist, um eine Synchronisation der Akquisitionsabläufe der jeweiligen Systeme 1, 2 zu gewährleisten.
Die kombinierten synchronisierten Daten des TSCSPC-Systems 1 und des Extern-Systems 2 werden vom Synchronisator 7 in das synchronisierte Datenformat 8 gebracht. Das Datenformat der TSCSPC-Methode schreibt die TSCSPC-Parameter x, y, t(abs) und Δt (TSCSPC) eines jeden Einzelereignisses zusammen mit den zugehörigen Werten der Peripherie (z.B Position eines Filterrads) und der Externgeräte des extenren Systems 2 (z.B. Ortskoordinaten und zugehöriger Messwert eines AFM) hintereinander in eine Liste. Die Daten werden dann an eine Datenverarbeitungsanlage 9, wie etwa einen PC, weiterleitet, wobei eine Liste der Einzelereignisse abgespeichert wird, wobei jedes Einzelereignis den vollen Parametersatz trägt, bestehend aus synchronisierten Daten der einzelnen TSCSPC/Peripherie-Kanäle sowie der Externgeräte des externen Systems 2. Die synchronisierten Daten des TSCSPC-Systems 1, der Peripherie und des externen Systems 2 können dann im Replay-Modus 10 in jeder gewünschten Zusammenstellung wiedergegeben werden. Diese 1-File-Methode ist insbesondere bei limitierter Peripherie und externem System 2 geeignet.
Aufgrund der Multikanal-, Multimethoden-Akquisition, welche durch das erfindungsgemäße System realisiert werden kann, können verschiedenartige neue Anwendungen wie TSCSPC-Nanotracking, TSCSPC-PSF (point spread function)-Analysen, TSCSPC-Palmira-FLIN (photoactivated localisation microscopy with independently running acquisition – FLIN = fluorescence lifetime imaging nanoscopy), TSCSPC-STICS (spatio-temporal image correlation spectroscopy), TSCSPC-OLID (optical-lock-in detection), TSCSPC-PALM/FPALM (photoactivation light microscopy), STORM (stochastic reconstruction optical microscopy), TSCSPC-STED (stimulated emission depletion), TSCSPC-PAM (programmable array microscope), optical sectioning microscopy (structures illumination), TSCSPC-FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching), TSCSPC-FRET (Förster Energie Resonanz Transfer) oder auch funktionellstrukturelle Korrelation, wie etwa bei Kombination von Daten eines Rastersondenmikroskops (z.B. AFM, als Bestandteil des synchronisierten externen Systems 2 mit denen eines Weitfeldfluoreszenz-TSCSPC-System 1) realisiert werden. Dadurch sind anwenderspezifisch neue Untersuchungsmöglichkeiten einer Probe mit nicht-invasiven Methoden gegeben, wobei aufgrund der Möglichkeit der simultanen oder pseudo-simultanen Multikanal-, Multimethoden-Akquisition eine mehrfache Beanspruchung der Probe vermieden werden und sehr schnell ablaufende Prozesse verfolgt werden kann. Durch die Synchronisation der Daten und Parameter können neben Zeit- und Ortsinformationen in Bezug auf Fluoreszenzanwendungen auch unterschiedliche Parameter externer Geräte des externen Systems 2 mit in die Betrachtung einbezogen werden. Dadurch sind simultane bzw. pseudo-simultane Multikanal- und Multimethoden-Akquisitionen von Daten und Parametern möglich. Im Falle eines TSCSPC-AFM wäre dies eine simultane Beobachtung von Funktions(TSCSPC)- und Struktur(AFN)-Information, die anderweitig nicht zugänglich ist. Die AFM-Sonde befindet sich dabei auf der gegenüberliegenden Seite der laserbeleuchteten Probe.
Die 2 zeigt schematisch eine mögliche Ausgestaltung eines Multikanal-, Multiparameter-Akquisitionssystems, welches ein TSCSPC-System 1 sowie eine Peripherie und ein externes System 2 umfasst. Die vom TSCSPC-System 1 detektierten Daten und Parameter eines jeden Photons (Quants) werden an die entsprechende Elektronik zur Bestimmung der Zeit- und Ortsinformation 11a übermittelt, welche ihrerseits eine Feedbackfunktion zum TSCSPC-System 1 aufweist. Die so gewonnen Daten des TSCSPC-Systems 16 werden an die high-resolution „fast-channels“ des TDC 14a übermittelt. Neben der Akquisition der Zeit- und Ortsinformationen sowie der absoluten Ankunftszeit eines jeden Photons durch das TSCSPC-System 1 werden in der Peripherie weitere Daten und Parameter des Peripheriestatus PSN (periphery state number) erhoben, welche von der Peripherieelektronik 11b an die beispielsweise zwölf low-resolution, „slow-channels“ 14b des TDC geleitet werden und im Datenformat 8 an den TSCSPC-PC 18 zur Abspeicherung weitergeleitet wird. Zeitgleich erhalten die „slow-channels“ 14b eine binäre Codenummer ESN (external state number), die den aktuellen Status der Externgeräte des externen Systems 2 beschreibt und von der Externelektronik 11c im vom Datenverarbeitungsgerät 19 kontrollierten ESN-Generator 15 erzeugt wird. Diese ESN-Codenummer wird auch zeitgleich, zusammen mit der vollen Information ES-Informationen 15a, an den Extern-PC 19 zur Abspeicherung geleitet und garantiert volle Synchronisation von TSCSPC-, Peripherie- und Externdaten im Replaymodus 10, wo sie, wie bereits oben ausgeführt, in jeder gewünschten anwenderspezifischen Zusammenstellung kombiniert und wiedergegeben werden können. Dabei werden die vollen ES-Informationen 15a, welche sämtliche Daten und Parameter der externen Geräte des externen Systems 2 beinhalten, an die Datenverarbeitungsanlage des externen Geräts 19 geleitet und dort gespeichert, wobei der aktuelle Status der externen Geräte des externen Systems 2 durch die ESN codiert und an die slow-channel-Elektronik 14b geleitet wird. Dadurch ist eine Zuordnung der synchronisierten Daten und Parameter zwischen TSCSPC-System 1 und externen Geräten des externen Systems 2 möglich, wobei die einzelnen Daten und Parametersätze des TSCSPC-Systems 1 sowie der externen Geräte des externen Systems 2 auf verschiedenen Datenverarbeitungsanlagen 18, 19 als getrennte Daten- und Parametersätze hinterlegt sind und eine Kombination der gewünschten synchronisierten Daten und Parameter im Replay-Modus möglich ist, wobei die Zuordnung über die ESN erfolgt. Durch diese 2-File-Methode können bei komplexer Externgerätekonfiguration 2 große synchronisierte Datenmengen auf dem Datenverarbeitungsgerät 19 oder auf einem Peripherie-Datenverarbeitungsgerät hinterlegt werden, ohne den hohen Durchsatz von > 10⁶ cps (counts per second) des TSCSPC-Zweigs zu behindern. Dadurch sind auch ps/ns-zeitaufgelöstes Time-Lapse Imaging im Bereich der Videoqualität möglich, wobei bei > 0,25 × 10⁶ cps 25 Bilder/s oder mehr erzielt werden, um schnelle Änderungen der Fluoreszenzdynamiken währen der Messung feststellen zu können.
Die PSN sind dabei kleine binäre Zahlen, derzeit auf 12 Kanäle begrenzt, und die ESN eine fortlaufende Zahl im binären oder ähnlichen Format.
Bevor die beiden Datenströme auf den schnellen Festplatten beider Datenverarbeitungsanlagen 18, 19 (oder auch eines einzigen Multicore PC) gespeichert werden, werden die Daten in das RAM der PCs geladen, wo sie für schnelle visuelle Inspektion zur Verfügung stehen.
Der Slow-Channel-Eingang eines TAC/ADC (Time-to-Amplitude-Converter (Zeit-Amplituden-Wandler)/Analog-Digitalwandler) oder TDC (Time-to-Digital-Converter(Zeit-Digitalwandler) 14, wie etwa eine TDC8HP card of Roentdek GmbH, wird auch „Low-Resolution“ Channel genannt, da die Zeitauflösung sich im Mikrosekundenbereich bewegt, wogegen die Zeitauflösung der „schnellen Kanäle“ des TSCSPC-System unter 1 ps betragen kann.
Die 3 zeigt ein eine mögliche Ausgestaltung einer Laseranordnung für ein Multikanal-, Multimethoden-Akquisitionssystem umfassend ein Makro-, Mikro-, oder Nanoskop 21 mit einem TSCSPC-System 1 samt Detektorkopf mit synchronisiertem Schutzphotoverschluss 1b sowie eine Mehrzahl an Anregungslasern, welche wie dargestellt als grüner, blauer und roter ps-Anregungslaser 24, 25, 26 ausgestaltet sind. Die von den Anregungslasern 24, 25, 26 emittierten Strahlen werden mittels einer Anzahl von dichroitischen Strahlteilern 5b kolinear vereinigt und in das optische System, bestehend aus einem Makro-, Mikro-, oder Nanoskop, eingekoppelt. Daneben können noch ein oder mehrerer Manipulationslaser 22 sowie ein oder mehrerer Aktivierungslaser 23 eingekoppelt werden. Weiterhin kann das System auch einen Anregungsmanipulator 20 umfassen, welcher das Licht der Anregungslaser 24, 25, 26 strukturiert (strukturierte Beleuchtung zur Erhöhung der Auflösung). Alle Laser und zugeordnete Dichroiten, die auf Klappspiegel 5b montiert sind, werden vom Synchronisator 7 synchronisiert. Dadurch können die synchronisierten Parameter der Laser 22, 23, 24, 25, 26 den jeweiligen durch das TSCSPC 1 detektieren Daten zugeordnet werden. Der synchronisierte Schutz-Photoverschluß 1b des Detektorkopfes ist während der Manipulations- und Aktivierungsphase geschlossen, um den empfindlichen TSCSPC-Kopf von Schaden zu bewahren. Der Spiegel 5 kann zur Justierung verwendet werden. Durch die verschiedenen Anregungswellenlängen der Lasern 24, 25, 26 kann simultan bzw. pseudo-simultan Mehrkanalakquisition betrieben werden, wenn die Peripherie, d.h. der Dichroit des Mikroskops (im Dichroiten-Karousel) und die entsprechenden Emissionsfilter eines Filterrad entsprechend synchronisiert sind.
Manipulations- und Aktivierungslaser 22, 23 können in Reihe, wie hier dargestellt, angeordnet werden oder aber unterschiedliche Mikroskopeingänge verwenden. Eine externe Reihenanordnung gewährt große Variabilität bei sequentieller und simultaner Anregung. Bei Verwendung von unterschiedlichen Mikroskopeingängen kann es zu Behinderungen kommen, weshalb man zusätzlich einen synchronisierten Mikroskop-Verteilerwürfel 34 braucht, der die einzelnen Ausgänge kontrolliert.
In der 4 ist ein Abwandlung des in 3 beschriebenen Multikanal-, Multi-Methoden-Akquisitionssystems dargestellt, welches neben dem Makro-, Mikro- oder Nanoskop 21 mit dem TSCSPC-System 1 auch einen Synchronisator 7 umfasst. Die Multikanal-Akquisition wird über einen synchronisierten weißen ps-Anregungslaser 28, welcher mit einem synchronisierten Wellenlängenselektor 27 verbunden ist, betrieben. Mithilfe des Wellenlängenselektors 27 kann ein beliebiger Wellenlängenbereich ausgewählt werden und die Probe mit dem ausgewählten Wellenlängenbereich bestrahlt werden. Der durch den Anregungslaser 28 emittierte Strahl wird mit den optionalen Manipulations- und Aktivierungslasern 22, 23 unter Verwendung von dichroitischen Spiegeln 5b kolinear vereinigt. Dabei sind sämtliche vorbenannten Laser 28, 22, 23, der Wellenlängenselektor 28, und der Schutzphotoverschluß des Detektorkopfes 1b über den Synchronisator 7 synchronisiert, sodass die über das TSCSPC-System 1 erhaltenen Daten nachfolgend im Replay Modus 10 den jeweiligen Parametern der Laser 22, 23, 28 und des Wellenlängenselektors 28 zugeordnet werden können. Der Photoverschluß 1b ist während der Manipulations- und Anregungsphasen geschlossen, um Schaden am lichtempfindlichen Detektor zu vermeiden.
Die 5 zeigt eine beispielhafte Darstellung eines Ausschnitts aus einer Liste mit „schnellen“ und „langsamen“ Kanälen 14a, 14b. Die TSCSPC-Koordinaten (x, y, t) ändern sich sehr schnell (ps-Zeitauflösung) und sind für jedes Einzelereignis unterschiedlich. Die Peripherie- und Extern-Daten (PSN und ESN) verändern sich im Vergleich dazu langsam und treten gewöhnlich als Gruppen auf. Das Beispiel beschreibt ein 8-Kanalsystem mit Kombinationen aus 2-Laseranregungen, 2-Emmisionsfiltern und 2-ROI (region-of-interest) eines externen Geräts 2. Im Listmodus können nunmehr die gewünschten Daten in beliebiger Kombination dargestellt werden. So würden beispielsweise für die folgenden Replay-Sortierungskriterien Filter = 4, Dichroit = 3, Laser = 3 und ROI (region-of-interest) = 7, die Ereignisse i = 5–7 ausgewählt werden.
In der 6 ist eine Kombination von Freistrahl- und Faser-Mikroskopeinkopplung des Anregungslasers 3, der durch den Teilerspiegel 5 geteilt wird, dargestellt. Dabei wird ein Teil des Laserstrahls auf die Probe 31 im Makro-, Mikro- oder Nanoskop 21 geleitet und der andere Teilstrahl wird mittels eines Lichtleiters zum externen Gerät des externen Systems 2 geleitet, wobei die Einkopplung mittels einer Fasereinkopplung 39 erfolgt. Dieses Beispiel zeigt eine kombinierte TSCSPC-Anwendung, wobei das Extern-Gerät 2 als ein Nikon-Konfokalspektrometer Ci mit ROI-Selektor ausgeführt ist, das am TSCSPC-System 1, welches ein Fluoreszenzmikroskop 21 umfasst, angeflanscht ist. Es können, wie vorliegend dargestellt, zwei synchronisierte TSCSPC-Systeme 1 zum Einsatz kommen, wobei beide synchronisiert sind mit dem Externgerät des externen Systems 2. Alternativ kann lediglich ein TSCSPC System 1 sequentiell verwendet werden, was durch einen Schellverschluss, wie etwa einer Ringklemmung am Detektorkopf erleichtert wird. Zudem sind das externe Gerät des externen Systems 2 und ein Polychromator 29 mittels eines Lichtwelleiters 30 verbunden. Die Einkopplung des mittels eines Laserteleskops aufgeweiteten Freistrahllasers erfolgt mittels einer Tubuslinse.
Die 7 wiederum zeigt eine beispielhafte typische Multi- Peripherie-, Multi-Externgerät-Anordnung des erfindungsgemäßen Akquisitionssystems. Dabei fällt ein durch den Wellenlängenselektor 28 ausgewähltes Band des Weißlicht-Kontinuumlasers 27 auf das synchronisierte Dichroitenkarousel 32 des Makro-, Mikro- oder Nanoskops 21, welches vorliegend als Epi-Fluoreszenzmikroskop ausgeführt ist und wird auf die Probe 31 reflektiert, von wo die emittierte rotverschobene Fluoreszenz durch den Dichroiten 32 hindurchtritt und auf den synchronisierten Verteilerwürfel 34 trifft, der die Fluoreszenz wahlweise in das Okular 37, eine ccd Kamera 33 oder auf ein Filterrad 35 lenkt. Hinter dem Filterrad 35 befindet sich ein Photoverschluss 1b, der den TSCSPC-Detektor 1b, 36 schützt. Der Detektor 36 ist mit der TSCSPC-Elektronik 11a verbunden, die vom PC 9 kontrolliert wird. Alle Peripheriekomponenten, wie 32, 34, 35 sowie die Externgeräte 1b, 27, 28, 33, 36, 38 sind mit dem Synchronisator 7 verbunden, der wiederum vom PC 9 kontrolliert wird.
Eine typische Anwendung für ein System gemäß 7 wäre die synchronisierte periodische Änderung des Wellenlängenselektors 28, des synchronisierten Dichroiten-Karousels 32 und des synchronisierten Filterrads 35 bei einer TSCSPC-Akquisition bei verschiedenen Anregungs- und Emissionswellenlängen, welche durch den dazu passenden Dichroitspiegel optimiert wird, unterbrochen von periodischen CCD-Aufnahmen 33, und periodischen Aktivierungsphasen durch den Flipspiegel 38, wobei der Photoverschluss 1b geschlossen ist.
Die 8 zeigt eine beispielhafte typische Multi-Peripherie-, Multi-Externgerät-Anordnung des erfindungsgemäßen Akquisitionssystems. Dabei wird von einem Makro-, Mikro- oder Nanoskop 21 ein Fluoreszenzbild auf einen Spiegel 5, welcher als Intentsitätsteiler ausgeführt ist, geleitet, wodurch der Strahl in zwei Teilstrahlen aufgespalten wird. Der eine Teilstrahl wird an einem vollreflektierenen Spiegel 40 auf einen TSCSPC-Detektor 36 mit Photoschutzverschluß 1b gelenkt. Der andere Teilstrahl wird auf einen CCD-Detektor 33 des externen Systems 2 gelenkt. Sowohl das Makro-, Mikro- oder Nanoskop 21, der Spiegel, der TSCSCPC-Detektor als auch der CCD-Detektor 33 sind über den Synchronisator 7 miteinander synchronisiert.
Die 9 zeigt eine schematische Darstellung einer möglichen Makroskopie-Anwendung des erfindungsgemäßen Multikanal-Multiparameter Akquisitionssystems, wobei das System einen ps-Anregungslaser 3 mit Wellenlängenselektor 28 und Weitfeldbeleuchtung. Der Laser 3 emittiert einen Strahl auf einen dichroitischen Spiegel eines Dichroiten-Karousels 10, von welchem der Strahl auf die Probe 31 gelenkt wird. Die Probe 31 ist vorliegend als eine Multi-well-Platte ausgeführt, welche beispielswiese 4 × 5 wells umfasst und auf einem xy-verstellbaren Probentisch angeordnet ist. Es sind jedoch auch größere Wellzahlen möglich. Die durch Wechselwirkung mit der Probe 31 entstandene Emission wird auf ein lichtstarkes Kameraobjektiv 41 gelenkt und dann auf ein synchronisiertes Filterrad 35, wobei alternativ zum Filterrad 35 auch ein AOMF (akusto-optisch modulierter Filter) Bandpassfilter eingesetzt werden kann.
Die Emission wird schließlich auf einen TSCSPC-Detektor 36 mit Photoschutzverschluss 1b gelenkt. Dabei sind sowohl TSCSPC-Detektor 36 als auch Photschutzverschluss 1b, Anregungslaser 3 sowie Wellenlängenselektor 28 und Dichroiten-Karousel 10 sowie der xy-verstellbare Probentisch der Probe 31 über einen Synchronisator 7 miteinander synchronisiert.
Bezugszeichenliste

1: TSCSPC-System mit optischem System (Mikro-, Makro-, Nanoskop) und optoelektronischer Peripherie
1b: Detektorkopf mit Schutz-Photoverschluß
2: Externes Gerät einer unabhängigen Methode
3: ps-Anregungslaser 1
4: ps-Anregungslaser 2
5: Spiegel
5b: dichroitischer Strahlteiler
6: Laserlichtmanipulator
7: Synchronisator
8: Datenformat des Listmodus
9: Datenverarbeitungsgerät
10: kombinierte Parameterausgabe
11a: TSCSPC-Elektronik
11b: Peripherie-Elektronik
11c: Extern-Elektronik
12: Kontrolle der TSCSPC-Elektronik
13: Synchronisator
14a: Fast-Channel-Elektronik
14b: Slow-Channel-Elekronik
15: ESN-Generator
15a: ES-Informationen
16: Daten des TSCSPC-Systems
17: “langsame” diskrete und/oder kontinuierliche Daten
18: Datenverarbeitungsvorrichtung des TSCSPC-Systems
19: Datenverarbeitungsvorrichtung des Externen Geräts
20: Anregungsmanipulator
21: Makro-, Mikro-, Nanoskop
22: Manipulationslaser
23: Aktivierungslaser
24: ps Anregungslaser blau
25: ps Anregungslaser grün
26: ps Anregungslaser rot
27: ps Anregungslaser weiss
28: Wellenlängenselektor
29: Polychromator
30: Lichtleiter
31: Probe
32: synchronisiertes Dichroiten-Karousel
33: CCD-Kamera
34: synchronisierter Verteilerwürfel
35: synchronisiertes Filterrad
36: TSCSPC-Detektor
37: Okular
38: Flipspiegel
39: Fasereinkopplung
40: reflektierender Spiegel
41: lichtstarkes Kameraobjektiv

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5148031 [0020]
US 686721 [0020]
DE 9421717 U [0022]
EP 1291627 A1 [0023]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

K. Kemnitz et. al, J. Fluorescence, 7(1997)93) [0004]
Spectral Diagnostics Ltd., P.O. Box 147, Migdal Haemek, 10551 Israel [0007]
K.Kemnitz et.al: Time- and Space-Correlated Single Photon Counting Spectroscopy, SPIE Proc., 2628 (1995)2. [0013]
K. König et al., Cell damage in twophoton microscopes, Proc. SPIE, 2926(1996)172 [0016]
K. Kemnitz et al., EC Demonstration Projekt BIO4-CT97-2177 [0016]
M. Lampton and R.F. Malina, Quadrant anode image sensor, Rev.Sci.Instr., 47(1976)1360 [0018]
C.Martin, P.Jelinsky, M.Lampton, R.F.Malina, Wedge-and-strip anodes for centroid-finding position-sensitive photon and particle detectors, Rev.Sci.Instr., 52(1981)1067 [0018]
Eldy Ltd.: Simultaneous spectral and temporal resolution in single photon counting technique, M.R.Ainbund et al., Rev.Sci.Intr., 63(1992)3274 [0020]
RoentDek GmbH, Im Vogelshaag 8, 65779 Kelkheim, O. Jagutzki et al., Fast Position and Time Sensitive Readout of Image Intensifiers for Single Photon Detection, Proc. SPIE, 3764(1999)61. [0020]
Eldy Ltd.; EuroPhoton GmbH im Projekt INTAS-94-4461 [0021]
M. Lampton and R.F. Malina, Quadrant anode image sensor, Rev.Sci.Instr., 47(1976)1360 [0021]
C. Martin, P. Jelinsky, M. Lampton, R.F. Malina, Wedge-and-strip anodes for centroid-finding position-sensitive photon and particle detectors, Rev.Sci.Instr., 52(1981)1067 [0021]
Stepanov et al., Widefield TSCSPC-Systems with Large-Area-Detectors: Application in simultaneous Multi-Channel-FLIM, Proc. SPIE 7376, 73760Z (2010) [0024]

Claims

Vorrichtung zur simultanen Multikanal-, Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in Fluoreszenz-Lebensdaueranwendungen umfassend – ein Fluoreszenz-Makroskop, -Mikroskop oder -Nanoskop (21), – zumindest eine gepulste Laserquelle (3, 4, 24, 25, 26, 27), – zumindest einen Strahlteiler (5, 5a), – zumindest ein synchronisiertes peripheres Gerät, – zumindest einen TSCSPC-Detektor (1b, 36), – sowie ein externes System (2) zur Bestimmung weiterer Parameter der Probe (31), wobei das externe System (2) die Parameter synchronisiert zur TSCSPC-Detektion erfassend ausgebildet oder modifiziert ist und zumindest einen gepulsten oder ungepulsten Laser (22, 23, 24, 25, 26, 27) als externes Gerät umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend zumindest zwei TSCSPC-Detektoren (1b, 36).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das externe System (2) weiterhin ein Rastersondenmikroskop, ein Laser-Scanning Zytometer, ein konfokales Ein- oder Zweiphotonen Laser-Scanning Mikroskop, eine Farb-CCD Kamera, gated CCD-Kamera, eine S/W-CCD Kamera, in Verbindung von RGB Filtern in einem synchronisierten Filterrad, die Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters (z.B. AOTF, acusto-optical tunable filter), ein Laser in einer multiplen Laseranregung, Fiber Switchers, die Eigenschaften eines oder mehrerer zusätzlichen Manipulationslaser, xyz-Position und zugehöriger Meßwert eines Scanning-Probe Mikroskops, rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen, Laserstrahlmodifikatoren, Rotatoren zur Kontrolle von zirkularen Neutralfiltern zur Einstellung der Laserintensität, Prismen zur Verdrehung der Polarisationsrichtungausgeführt umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (5, 5a) als ein Intensitäts-, Farb-, oder Polarisationsteiler ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Photoverschluss (1b) am Detektorkopf des TSCSPC-Detektors (36) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Farbteiler und ein Polarisationsteiler hintereinander geschaltet werden, sodass zumindest vier Teilbilder in einer quadratischen Anordnung erhalten werden.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Gerät des externen Systems (2) über eine Fasereinkopplung mit einem Anregungslaser (29), welcher am TSCSPC-System (1) angeordnet ist, verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das ein externe Gerät des externen Systems (2) am TSCSPC-System (1) angeflanscht ist.
Verfahren zur simultanen Multikanals, Multimethoden-Akquisition synchronisierter Parameter in Fluoreszenzlebensdaueranwendungen umfassend die Schritte: – Bestrahlung einer Probe (31) mit mindestens einem gepulsten, hochfrequenten, polarisierten oder unpolarisierten ps- oder ns-Laserstrahl (3, 4, 24, 25, 26, 27), – Emission der Fluoreszenzstrahlung von der Probe (31), wobei die Fluoreszenzstrahlung auf zumindest einen Strahlteiler (5, 5b) geleitet wird, sodass zumindest zwei Strahlteile ausgebildet werden, – die beiden Strahlteile mindestens auf mindestens einen auf orts- und zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählung basierenden Listmode-Detektor (36) gelenkt werden, wobei der zumindest eine Listmode-Detektor (36) simultan alle physikalischen Parameter eines jeden Einzelphotons erfasst und in einer Kontroll-Elektronik (11a) speichert, – simultan eine Bestimmung weiterer Parameter durch zumindest ein peripheres Gerät und ein externes Gerät eines externen Systems (2) erfolgt, wobei die Parameter-Akquisition durch die peripheren und externen Geräte des externen Systems (2) synchronisiert erfolgt und die durch das externe Gerät des externen Systems (2) ermittelten Parameter der Probe (31) gespeichert werden und – die gespeicherten Parameter der Listmode-Detektoren (16) und des peripheren und externen Geräts (17) zu einem Multiparameter-, Multimethoden-Aquisitionssystem in einer 1-File-Methode kombiniert werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als externes Gerät einer unabhängigen Methode des externen Systems (2) ein Rastersondenmikroskop, Laser Scanning Zytometer, ein konfokales Ein- oder Zweiphotonen Laser Scanning Mikroskop, eine Farb-CCD Kamera (33), eine S/W-CCD Kamera, eine gated CCD-Kamera, synchronisierten Filterrad (35), elektronisch geregelte Farbfilters, ein Laser in einer multiplen Laseranregung, Fiber Switchers, Manipulationslaser (22), rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen, Laserstrahlmodifikatoren, ein konfokaler Scanningspektrograph oder ein Prisma zur Verdrehung der Polarisationsrichtung verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin synchronisierte Koordinaten und/oder Parameter der externen Geräte des externen Systems (2) erfasst und mit den gespeicherten Parametern der Listmode-Detektoren zu einem Multiparameter-Aquisitionssystem kombiniert werden, wobei die externen Geräte des externen Systems (2) ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus CCD Kamera (33), gated CCD-Kamera, Position eines Filterrads (35) und/oder eines Dichroiten-Karousels (32), Farbe eines elektronisch geregelten Farbfilters, Laser in einer multiplen Laseranregung, Eigenschaften eines oder mehrerer zusätzlichen Manipulationslaser (22), xy-Position und Z-Parameter eines Scanning-Probe Mikroskops, Position eines Nano-, Mikrooder Makroskop-xy-Verschiebetisches, Laserstrahlmodifikatoren, rotierende Nipkowscheibe mit Mikrolinsen, z-Position der Nipkow-Scheibe, 3D-SIM-Mikroskop.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Multiparameter-, Multimethoden-Akquisitionssystem in einem Replay-Modus für funktionelle und/oder strukturelle Analysen verwendet werden, wobei diese ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus: TSCSPC-Nanotracking, TSCSPC-Palmira-FLIN, TSCSPC-STICS, TSCSPC-OLID, TSCSPC-PALM/FPALM, TSCSPC-STORM, TSCSPC-STED, TSCSPC-PAM, Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie, TSCSPC-FRAP, TSCSPC-FRET sowie TSCSPC-SPM.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserstrahl von einem Spiegel in zumindest zwei Teile geteilt wird, wobei der eine Teilstrahl auf die Probe (31) im Makro-, Mikro oder Nanoskop (21) gelenkt wird und der andere Teilstrahl an das externe Gerät des externen Systems (2) gelenkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Akquisition der Zeit- und Ortsinformationen eines jeden Photons durch das TSCSPC-System (1) in der Peripherie weitere Daten und Parameter des Peripheriestatus erhoben werden, welche im Datenformat (8) an Datenverarbeitungsvorrichtung des TSCSPC-Systems (18) zur Abspeicherung weitergeleitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Daten und Parametersätze des TSCSPC-Systems (1) sowie der externen Geräte des externen Systems (2) auf verschiedenen Datenverarbeitungsanlagen (18, 19) als getrennte Daten- und Parametersätze hinterlegt werden und diese Daten- und Parametersätze im Replay-Modus (10) miteinander in einer 2-File-Methode kombiniert werden, wobei die Zuordnung über die ESN erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Farbteiler und ein Polarisationsteiler so hintereinander geschaltet werden, dass vier Teilbilder in einer quadratischen Anordnung erhalten werden, wobei echt-simultane Dual-Anisotropie-Abbildung ermöglicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine zwei- bzw. vier-Kanal-Koinzidenz-Abbildung mit lediglich einem Detektorkopf erfolgt, wobei zwei oder vier Sets von crossed-DL oder anderen ortsabbildenen Anoden neben- und übereinander einander eingesetzt werden, wobei jedes Teilbild von einem eigenen DL-Set ausgelesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung eines Laserstrahls in das externe Gerät des externen Systems (2) mittels einer Fasereinkopplung (39) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig eine Änderung der Anregungswellenlänge, der Emissionswellenlänge sowie des dichroitischen Mikroskopspiegels (5b) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mittels 2-File-Methode synchronisierte Datenmengen auf dem Datenverarbeitungsgerät 19 hinterlegt werden oder auch auf einem Peripherie-Datenverarbeitungsgerät abgespeichert werden können.
Verfahren nach Anspruch 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass bei hohem Datendurchsatz > 0,25 × 10⁶ cps des TSCSPC-Zweigs kann ps/ns-zeitaufgelöstes Time-Lapse Imaging im Bereich der Videoqualität mit 25 Bilder/s oder höher erzielt wird, um schnelle Änderungen der Fluoreszenzdynamiken während oder nach der Messung festzustellen.
Verfahren nach Anspruch 9 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die absolute Ankunftszeit aus dem TSCSPC Parametersatz zur Synchronisation mit Peripherie- und Externen Systemen (2) verwendet wird, wobei die Ankunftszeit durch eine Quarzuhr oder mittels der gezählten Anzahl von periodischen Anregungslaserpulsen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Weitfeld 2-Photonanregung in einem externen TIRF-Prisma mit > 100 mW IR-Laserpower erfolgt, wobei zwischen 1-Photonen und 2-Photonenanregung durch synchronisiertes Umschalten eines Frequenzverdopplers des Anregungslasers (22) gewechselt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fokuslinse vor dem TIRF-Prisma die gewünschte Beleuchtungsfläche und damit die Anregungsintensität einstellt.