DE102015111282A1

DE102015111282A1 - Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs

Info

Publication number: DE102015111282A1
Application number: DE102015111282.5A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Benjamin Kaupp; René Pascal; Luis Alvarez; Christoph Brenker
Original assignee: Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Current assignee: Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-01-19

Abstract

Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs anhand eines lumineszierenden Stoffes (8), der durch eine erste, insbesondere zeitmodulierte, Lichtstrahlung (21) angeregt wird, wobei der luminszierende Stoff (8) bei Anregung durch Licht der ersten Lichtstrahlung (21) dritte Lichtstrahlung (23) durch Lumineszenz erzeugt, wobei der chemische bzw. biologische Vorgang durch eine zweite Lichtstrahlung (22) beeinflusst wird, wobei die zweite Lichtstrahlung (22) ebenfalls geeignet ist, den lumineszierenden Stoff (8) zur Erzeugung der dritten Lichtstrahlung (23) durch Lumineszenz anzuregen, wobei die dritte Lichtstrahlung (23) durch einen Lichtsensor (13) erfasst wird und in ein elektrisches Signal (25) zur weiteren Verarbeitung umgewandelt wird, wobei die erste Lichtstrahlung (2) in Pulsen (24) ausgesendet wird und dass aus dem elektronischen Signale der Einfluss der zweiten Lichtstrahlung (22) anhand einer Synchronisierung mit den Pulsen (24) herausgefiltert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs anhand eines lumineszierenden Stoffes, wobei der Vorgang selbst durch eine Lichtstrahlung angeregt wird.
Bewegliche Zellen und Organismen nutzen den zeitlichen Verlauf von sensorischen Signalen zur Navigation, dieser Mechanismus wird Klinotaxis genannt. Samenzellen verfügen dabei über eine Art Kompass, um die zu befruchtende Eizelle zu lokalisieren. Die Samenzellen folgen Gradienten der Konzentration eines von der Eizelle ausgesendeten Lockstoffs. Der Mechanismus, welcher der dreidimensionalen Navigation zugrunde liegt, ist jedoch nicht bekannt.
Samenzellen bewegen sich zumeist auf helixförmigen Bewegungsbahnen und nähern sich dabei der Eizelle immer weiter an. Dabei werden regelmäßig Bahnkorrekturen vorgenommen, durch welche die Samenzellen auf Kurs gehalten werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen Zusammenhänge zwischen der Änderung der Konzentration des Lockstoffs und der biochemischen Vorgänge in der Samenzelle untersucht werden.
Grundsätzlich ist es dabei bekannt, biochemische Vorgänge in einer Zelle durch fluoreszierende Indikatoren sichtbar zu machen, die durch eine Lichtquelle gezielt angeregt werden. Die Konzentration des Lockstoffs kann über caged-Verbindungen und einer gezielten Lichteinstrahlung gesteuert werden. Im vorliegenden Fall liegt nun die Schwierigkeit vor, dass sowohl die fluoreszierenden Indikatoren als auch die Lockstoffkonzentration durch Lichtstrahlen angeregt werden, die sich teilweise in ihren Wellenlängenbereichen überlagern. Hierbei kommt es bislang zu signifikanten Verfälschungen, die es auszuräumen gilt.
Dies wird erfindungsgemäß nun gelöst durch ein Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs anhand eines lumineszierenden Stoffes, der durch eine erste Lichtstrahlung angeregt wird. Der chemische bzw. biologische Vorgang wird durch eine zweite Lichtstrahlung beeinflusst. Der lumineszierende Stoff erzeugt bei Anregung durch Licht der ersten Lichtstrahlung dritte Lichtstrahlung durch Lumineszenz. Auch die zweite Lichtstrahlung ist geeignet, den lumineszierenden Stoff zur Erzeugung der dritten Lichtstrahlung durch Lumineszenz anzuregen. Die dritte Lichtstrahlung wird durch einen Lichtsensor erfasst und in ein elektrisches Signal zur weiteren Verarbeitung umgewandelt.
Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtstrahlung in Pulsen ausgesendet wird und dass aus dem elektronischen Signal der Einfluss der zweiten Lichtstrahlung auf die Vorgänge anhand einer Synchronisierung mit den Pulsen herausgefiltert wird.
Der Kern der Erfindung liegt nun darin, dass die Pulse eine Differenzierung von Teilen der dritten Lichtstrahlung dahingehend ermöglichen, ob diese nun bestimmungsgemäß durch die erste Lichtstrahlung erzeugt wird oder durch die zweite Lichtstrahlung verfälscht wird. Zur Ermittlung der Abhängigkeit der Vorgänge durch die zweite Lichtstrahlung werden nur noch diejenigen Signalanteile ausgewertet, die synchron sind zu den Pulsen. Hieraus lässt sich der gewünschte zeitliche Verlauf der Vorgänge weiter durch Interpolation ermitteln.
Die Filterung erfolgt bevorzugt mithilfe eines phasensensitiven Verstärkers, insbesondere eines Lock-In Verstärkers oder eines Boxcar Verstärkers, der mit der ersten Lichtquelle gekoppelt ist. Über die Kopplung können Informationen über den zeitlichen Verlauf der Pulse an den Verstärker übermittelt werden.
Bei der Anregung des chemischen und/oder biologischen Vorgangs durch die zweite Lichtstrahlung kommen insbesondere sogenannte Caged-Verbindungen (engl. caged-compound) zum Einsatz. Dies sind chemische Verbindungen, die bei Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen eine bestimmte Substanz freisetzen. Diese freigesetzte Substanz erzeugt dann eine gewünschte Reaktion. Durch Steuerung der an einen Ort eingebrachten Lichtmenge kann somit die gewünschte Reaktion gezielt an diesem Ort veranlasst werden.
Das Hauptanwendungsgebiet der caged-Verbindungen ist die biochemische und zellbiologische Forschung. Biologisch aktive Verbindungen werden mit einer photolabilen Schutzgruppe, nämlich dem "cage" ausgestattet und verlieren somit temporär ihre biologische Funktion. Mittels Lichteinstrahlung wird die photolabile Schutzgruppe irreversibel von der biologisch aktiven Verbindung abgespalten und die zuvor inaktive Verbindung weist wieder eine biologische Aktivität auf.
Als Lichtmenge wird die Strahlungsenergie bezeichnet, berechnet als Integral des Lichtstromes über eine bestimmte Zeit. Durch die an einem Ort auftreffende Lichtmenge in einer bestimmten Lichtfrequenz wird an diesem Ort eine entsprechende Konzentration von Lockstoff erzeugt. Durch den gezielten Einsatz von Linsen kann die Lichtmenge an einem gewünschten Ort erhöht bzw. verringert werden. Je näher ein Ort am Brennpunkt der Linse angeordnet ist, desto größer ist die an diesem Ort anfallende Lichtmenge pro Zeiteinheit. Werden unterschiedliche Orte während für dieselbe Zeit mit einem fokussierten Lichtstrahl beaufschlagt, so werden die Bereiche, die näher an dem Brennpunkt angeordnet sind, stärker belichtet als andere Orte. Folglich bildet sich dort eine größere Konzentration von Lockstoffen aus.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Vorgang insbesondere mit einer homogenen örtlichen Lichtverteilung beeinflusst, das heißt, die eingebrachte Lichtmenge ist im Wesentlichen an allen Orten des Vorgangs identisch.
Die Erfindung wird anhand der Figuren nachfolgend näher erläutert. Hierin zeigt
1 schematisch den Versuchsaufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
2 schematisch eine verwendete Auswerteanordnung.
1 zeigt eine Beobachtungskammer 3, in der eine Flüssigkeit mit einer Vielzahl von zu beobachtenden Zellen 1 aufgenommen ist. Beispielhaft ist eine Zelle 1 schematisch dargestellt. Es soll im Rahmen der Beobachtung ein Zusammenhang ermittelt werden zwischen dem Auftreten eines Wirkstoffs 5 innerhalb der Flüssigkeit der Beobachtungskammer und dem Auftreten eines Zielstoffes 2 innerhalb der Zelle 1. In Abhängigkeit der Konzentration des Wirkstoffs 5 oder dessen Gradienten ändert sich die Menge des Zielstoffes 2 in der Zelle 1. Der Zielstoff 2 selbst lässt sich isoliert nicht in der Zelle 1 nachweisen. Dafür wird die Zelle mit einem Indikatorstoff 7 geimpft, der eine Verbindung 8 mit dem Zielstoff 2 einnehmen kann. Die Verbindung 8 wirkt im Gegensatz zu den Stoffen 2 und 7 lumineszierend. Bei Anregung über eine erste Lichtstrahlung 21 gibt die lumineszierende Verbindung 8 eine dritte Lichtstrahlung 23 ab, die von einem Lichtsensor 13 erfasst wird und in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. Bei dieser Verbindung kann es sich um ein fluoreszierendes Protein oder einen fluoreszierenden Indikator, beispielsweise Fluo4, welches seine Fluoreszenz bei Bindung von Ca²⁺ ändert.
Zur gezielten Erzeugung des Wirkstoffs 5 ist eine zweite Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen, die eine zweite Lichtstrahlung 22 definiert einstellbar mit einer vorgegebenen Wellenlänge in die Beobachtungskammer 3 einstrahlen kann. Die von der zweiten Beleuchtungseinrichtung 12 ausgesendete Lichtstrahlung 22 kann auf unterschiedlichste Weise moduliert sein. Im vorliegenden Beispiel weist die Lichtstrahlung zwar eine konstante Lichtleistung P₁₂ auf; die Lichtleistung P₁₂ kann aber jegliche andere Form aufweisen, beispielsweise eine sinusförmige oder gepulste Form.
In der Beobachtungskammer 3 ist der Wirkstoff 5 zunächst in einer Caged-Verbindung 4 aufgenommen. Die Caged-Verbindung 4 umfasst dabei einen Schutzstoff 6, der den Wirkstoff 5 zunächst bindet. Bei Auftreffen der zweiten Lichtstrahlung 22 von bestimmter Wellenlänge auf die Caged-Verbindung 4 wird die Verbindung 4 zwischen Schutzstoff 6 und Wirkstoff 5 gelöst; der Wirkstoff 5 kann frei in die Beobachtungskammer 3 entweichen.
Wenn der Wirkstoff 5 frei in der Flüssigkeit ist, kann er im Gegensatz zum gebundenen Zustand an der Zellwand der Zelle 1 andocken. Ist der Werkstoff 5 an der Zellwand angedockt, öffnet er eine Durchgangsmöglichkeit für den Zielstoff 2 in die Zelle 1 hinein. Der Zielstoff 2 kann nun im Zellinneren, wie bereits beschrieben, die Verbindung mit dem Indikatorstoff 7 eingehen und die lumineszierende Verbindung 8 bilden.
Nachteiligerweise ist jedoch auch die zweite Lichtstrahlung 22 dazu geeignet, die lumineszierende Verbindung 8 anzuregen, wodurch ebenfalls dritte Lichtstrahlung 23 erzeugt wird. Diese durch die zweite Lichtstrahlung 22 generierte Lichtstrahlung 23 fälscht das Untersuchungsergebnis ab. Zu diesem Zweck wird die erste Lichtstrahlung 11 gepulst ausgesendet. Dabei werden einzelne kurze Pulse 24 mit jeweils der Leistung P₁₁ von der ersten Lichtquelle 11 ausgesendet. Dies wird verdeutlicht durch die gestrichelte Linie, welche die erste Lichtstrahlung 21 darstellt. Die dritte Lichtstrahlung 23 ist zeichnerisch ebenfalls aufgeteilt in unterschiedliche Komponenten, nämlich einmal die durch die durchgezogene Linie dargestellte kontinuierliche Lichtstrahlung und die durch die gestrichelte dargestellte Linie gepulste dritte Lichtstrahlung 23. Es ergibt sich eine Lichtleistung nach dem Diagramm mit der Leistung P₁₃, wie rechts unten in 1 dargestellt.
Anhand 2 wird nun erläutert, wie die Signalverarbeitung des von dem Lichtsensor 13 erfassten Lichts beziehungsweise generierten elektrischen Signals durchgeführt wird. Zu erkennen ist das elektrische Signal 25‘, welches die Lichtleistung P₁₃ in elektronischer Form darstellt. Das elektrische Signal 25‘ umfasst auch die verfälschten Werte, die durch die zweite Lichtstrahlung erzeugt wurden. Das Signal 25‘ wird nun einem Lock-in-Verstärker 9 zugeführt, der gekoppelt ist zu der ersten Lichtquelle 11. Der Lock-in-Verstärker 9 ist ein Bandpassfilter, der lediglich die Signalabschnitte durchlässt, die zeitlich synchronisiert sind mit den Pulsen 24 der ersten Lichtquelle 11. Als Ergebnis verbleibt ein Signal 25‘‘ welches lediglich einzelne Punktwerte umfasst, die synchron zu den Pulsen 24 auftreten. Durch Interpolation 27 der Punktwerte kann nun eine Näherungskurve 26 erzeugt werden. Diese Näherungskurve 26 stellt den zeitlichen Zusammenhang zwischen der Änderung der Konzentration des Wirkstoffs 5 in der Beobachtungskammer 3 und dem Auftreten des Zielstoffs 2 in der Zelle 1 dar.

Beispielhaft kann es sich um folgende Stoffe handeln:

Zielstoff 2:	Ca²⁺
caged-Verbindung 4:	DMNB-caged resact
Wirkstoff 5:	chemoattractant resact
Schutzstoff 6:	caging group
Indikatorstoff 7	Fluo4-AM
lumineszierende Verbindung 8	Fluorescent Fluo4 bound to Ca²⁺

Bei der untersuchten Zelle 1 handelt es sich die Zelle eines Seeigelspermiums.

Das Lichtspektrum der ersten Lichtstrahlung umfasst vorzugsweise folgenden Wellenlängenbereich: 350–1100 nm. Das Lichtspektrum der zweiten Lichtstrahlung umfasst vorzugsweise folgenden Wellenlängenbereich: 350–1100 nm. Das Lichtspektrum der dritten Lichtstrahlung umfasst vorzugsweise folgenden Wellenlängenbereich: 350–1100 nm.
Bezugszeichenliste

1: Zelle
2: Zielstoffes
3: Beobachtungkammer
4: caged-Verbindung
5: Wirkstoff
6: Schutzstoff
7: Indikatorstoff
8: lumineszierende Verbindung
9: Lock-In Verstärker
11: erste Beleuchtungseinrichtung
12: zweite Beleuchtungseinrichtung
13: Lichtsensor
21: erste Lichtstrahlung
22: zweite Lichtstrahlung
23: dritte Lichtstrahlung
24: Pulse
25: elektrisches Signal
26: Näherungskurve
27: Interpolation

Claims

Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs anhand eines lumineszierenden Stoffes (8), der durch eine erste, insbesondere zeitmodulierte, Lichtstrahlung (21) angeregt wird, wobei der luminszierende Stoff (8) bei Anregung durch Licht der ersten Lichtstrahlung (21) dritte Lichtstrahlung (23) durch Lumineszenz erzeugt, wobei der chemische bzw. biologische Vorgang durch eine zweite Lichtstrahlung (22) beeinflusst wird, wobei die zweite Lichtstrahlung (22) ebenfalls geeignet ist, den lumineszierenden Stoff (8) zur Erzeugung der dritten Lichtstrahlung (23) durch Lumineszenz anzuregen, wobei die dritte Lichtstrahlung (23) durch einen Lichtsensor (13) erfasst wird und in ein elektrisches Signal (25) zur weiteren Verarbeitung umgewandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtstrahlung (2) in Pulsen (24) ausgesendet wird und dass aus dem elektronischen Signale der Einfluss der zweiten Lichtstrahlung (22) anhand einer Synchronisierung mit den Pulsen (24) herausgefiltert wird.
Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterung mittels eines phasensensitiven Verstärkers (9) erfolgt, der mit der ersten Lichtquelle (11) gekoppelt ist.
Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass über die Kopplung Informationen über den zeitlichen Verlauf der Pulse (24) von der Lichtquelle (11) an den Verstärker (9) übermittelt werden.