CH658912A5 - Einrichtung zum quantitativen nachweis biochemischer reaktionen. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 genannten Art.

Es ist eine Messanordnung zur Bestimmung des Umsatzes fluorogener Substrate in Zellen mittels der Durchflussim-pulsfluorometrie bekannt (Biotechnische Umschau 3, Heft 7, 1979, S. 214 ff), wobei die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung vereinzelt hintereinander durch den Strahl eines Dauerstrich-Lasers geführt werden. Hierbei werden Fluorophore in den Zellen zur Fluoroszenz angeregt und geben Fluoreszenzstrahlung ab, die beim Durchlaufen der Messstrecke den auszuwertenden Fluoreszenzlichtimpuls bildet, der der Masse des Fluorophors proportional ist. Diese Methode erlaubt nur Einmal-Ausmessungen der Zellen und somit sind Reaktionsabläufe in der Einzelzelle nicht erfassbar.

Eine fluorometrische Bestimmung ruhender Proben mittels der Mikrofluorometrie ist ebenfalls bekannt (Mikrochi-mica Acta, Wien, 1977 II, 379-388). Diese Bestimmung besitzt eine untere Nachweisgrenze von 5 x 1014 mol NADPH und ist nicht zeitauflösend. Sie ist für die Bestimmung kleinster Reaktionsumsätze auf zellulärer Basis und für die Aufnahme schneller Reaktionskinetiken nicht geeignet.

Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht nunmehr darin, eine Einrichtung zu bieten, mit der der fluorometrische Nachweis unter erhöhter Empfindlichkeit bzw. Reduktion der minimal erfassbaren Zahl von Enzymmolekülen mit Messzeiten im Sekundenbereich möglich ist, damit einerseits schnelle Reaktionskinetiken erfassbar sind und andererseits routinemässige Untersuchungen mit einem grossen Probendurchsatz pro Zeit durchgeführt werden können.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden

Merkmalen des Patentanspruchs 1 beschrieben.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen wiedergegeben.

Einerseits erlaubt somit erfindungsgemäss die Anwendung des zeitauflösenden Photonenzählverfahrens sowohl die Rauschunterdrückung als auch eine Trennung des Messsignals von Streulicht und Störlumineszenzen aufgrund des zeitlichen Abklingverhaltens. Andererseits werden für den Einsatz des Photonenzählverfahrens zum Nachweis biochemischer Reaktionen die folgenden Vorteile erreicht:

- optimale Fokussierbarkeit der Anregungs-Lichtquelle im Bereich weniger /im.

- Lichtquelle mit grosser Zahl von Anregungsimpulsen 105 innerhalb der Messzeit von wenigen Sekunden; nur so können genügend Fluoreszenz-Photonen mit guter Einzel-photonen-Statistik (nach der Poisson -Verteilung) aufsummiert werden.

- Verwertbarer UV-Anteil der Anregungslichtquelle.

Zwar ist die zeitauflösende Einzelphotonenzählung für die Messung der Radiophotolumineszenz in Metaphosphatglas-Dosismetern bekannt (Appl.Phys. A 26,23-26,1981), jedoch kann bei dieser Messung eine geringe Anregungsimpulsrate des verwendeten Impulslasers und damit eine lange Messzeit in Kauf genommen werden, da sich die fluoreszenzspektros-kopischen Eigenschaften innerhalb der Messzeit nicht ändern ; d.h. es gibt bei dem vorliegenden Verwendungszweck keine Reaktionsabläufe, die verfolgt werden sollen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:

Fig. 1 ein Blockschaltbild der erfindungsgemässen Einrichtung und

Fig. 2 und 3 graphische Darstellung eines mit der Einrichtung erhaltenen Zählerergebnisses in Funktion der Zeit bzw. der Substanzmenge.

Die Fig. 1 zeigt ein Blockschaltbild der Einrichtung. Die Probe 1 mit einem Messvolumen im sub- /il- bis sub-nl-Bereich zur Vermeidung hoher Substratkosten für hochspezifische Proteine sowie zur Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses wird mittels eines gepulsten Laserstrahles 2 bestrahlt. Dieser Laserstrahl 2 ist über einen Umlenkspiegel 3 sowie ein Anregungsfilter 4 auf die Probe 1 gerichtet. Die Fluoreszenzphotonen 5 gelangen über einen Emissionsfiltersatz 6 auf einen Photodetektor 7 mit zugehöriger, bekannter Messelektronik 8 für Einzelphotonenfluoreszenz, Zeitkorre-lator 9, Vielkanalanalysator 10 und Computer 11 zur Steuerung und Auswertung.

Ein Teil 2' des Anregungslichtes 2 wird mittels des Strahlteilers 12 ausgeblendet und mit der Photodiode 13 aufgenommen. Deren Ausgangssignal 14 mit einer Frequenz, die der Impulsfolge des Laserlichtes 2 entspricht, wird benutzt zur Erzeugung eines Referenzsignals in der Messelektronik 15, welches wiederum zur sogenannten Synchronisation von Anregungsimpuls (Licht 2) und Einzelphotonenfluoreszenz-signal 5 im Zeitkorrelator 9 verwendet wird.

Die optische Anregung der Probe 1 kann neben dem sichtbaren Spektralbereich auch im nahen UV-Bereich (330 -370 nm) erfolgen, so dass u.a. auch die Absorptionsbanden von Methyl-Umbelliferon, Naphthol und NADPH erfassbar sind. Diese Fluorophore werden u.a. zum Nachweis der häufig benutzten Enzyme ß-Galaktosidase und alkalische Phosphatase verwendet.

Für die Erfüllung der oben genannten unterschiedlichen Bedingungen bezüglich einer hohen Anregungsrate wird ein

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s

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15

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30

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CW-Laser (z.B. Argon-Ionenlaser) mit ausreichender UV-Spezifikation und aktiver Modenkopplung verwendet. Die Impulsfolgefrequenz solcher Systeme (z.B. 82 MHz) ist jedoch für die Nachweiselektronik (Zeitkorrelator 9) zu hoch und führt

- zu einem verfälschten Abklingverhalten der Fluoreszenz,

- zu einem unnötigen Aufheizen der Probe 1 und damit möglicherweise zu einer Störung der extrem empfindlichen Enzym-Kinetiken.

Eine Reduktion der Impulsfolgefrequenz mit Hilfe eines sogenannten Cavity Dumpers (W. Demtröder, «Grundlagen und Techniken der Laserspektroskopie», Springer Verlag, 1977) ist bei den zur Zeit verfügbaren UV-Lasern nur unter sehr grossem technischen und finanziellen Aufwand möglich. Statt dessen wurde eine besonders kostengünstige und in der Praxis leichter verwendbare Methode entwickelt. Die Impulsselektion erfolgt mit Hilfe eines elektrooptischen Verschlusses 16 (z.B. Hochfrequenz-Pockelszelle), der eine beliebig einstellbare Impuls-Folgefrequenz (z.B. 250 kHz) erlaubt. Sein praktischer Einsatz erfordert eine spezielle Synchronisation. Die Modelocker-Frequenz (=halbe Impuls-Folgefrequenz) des Modelockers 17 des Lasers 18 wird elektronisch abgegriffen und in beliebigem Teilungsverhältnis im Untersetzer 19 unterteilt. Dessen Signal 20 dient dann zur Ansteuerung des schnellen Impulsgenerators 21, dessen Ausgangssignal 22 wiederum aus TTL-Impulsen mit variabler Länge (^ 4ns) und variabler Verzögerung besteht. Diese Anregungsimpulse 22 dienen zur Triggerung des Hochleistungsgenerators 23, der kurzfristig Spannungsänderungen an der Pockelszelle 16 von bis zu 100 V bewirkt und eine kurzzeitige Transmission des einfallenden Laserlichts 24 aus dem Laser 18 ermöglicht. Die Optimierung von Länge und Verzögerung des Trigger-Impulses 22 erlaubt ein vollständiges Ein- und Ausschalten der Pockelszellen-Spannung innerhalb eines Zeitintervals, das kürzer als der doppelte Impulsabstand (z.B. 24 ns) ist. Dadurch wird die Selektion der einzelnen Laserimpulse 2 aus einem Impulszug hoher s Folgefrequenz (z.B. 82 MHz) möglich. Ein Nachschwingen der Pockelszellen-Spannung wurde durch Dämpfung mittels Ferrit-Perlen und geeigneten kapazitiven Abschluss verhindert.

Die Vorteile des zeitauflösenden Photonen-Zählverfahrens io können auch innerhalb der in der Biochemie erforderlichen kurzen Messzeiten ausgenützt werden. Die nach Fig. 1 erhaltenen Fluoreszenz-Abklingkurven (Fig. 2, nur eine dargestellt) werden mit Subnanosekunden-Zeitauflösung innerhalb weniger Sekunden aufgenommen. Die Auswertung des 15 Messignals erfolgt integral innerhalb eines bestimmten Zeitbereiches der Abklingkurve (z.B. in Fig. 2, obere Kurve, zwischen 4,3 ns und 8,8 ns nach dem Maximum), innerhalb dessen der Untergrund aufgrund des Anregungslichtes 2 (untere Kurve), sowie längerlebiger Störlumineszenzen stark 20 reduziert ist. Damit kann die minimal nachweisbare Substanzmenge der Probe 1 von ca. 10-'3 mol auf 10"15 mol (bei jxl-bis sub-jil-Volumina) verringert werden (siehe Fig. 3 ; Photonenzahl als Funktion der Substanzmenge am Beispiel von Methyl-U mbellif eron).

25 Eine Fokussierung des Anregungslichts 2 auf kleinere Messvolumina lässt eine Reduktion der Nachweisgrenze auf weniger als 1016 mol in nl-Bereich und weniger als 10-18 mol im pl-Bereich zu. Damit ist sowohl ein Nachweis einzelner Enzymmoleküle als auch die Beobachtung schneller Enzym-30 kinetiken mit einem Umsatz von ca. 3x10" fluorogenen Molekülen pro Enzymmolekül und pro Minute möglich. Das bereits computergesteuerte Messystem (Fig. 1) ist weiter automatisierbar und kann daher für Routineuntersuchungen innerhalb eines weiten Anwendungsbereichs (neben der 35 medizinischen Diagnose u.a. auch in der Lebensmittelchemie, Agrikultur, Umweltschutz) eingesetzt werden.

B

3 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

658912 PATENTANSPRÜCHE

1. Einrichtung zum quantitativen Nachweis biochemischer, insbesondere enzymatischer Reaktionen bei geringer Messzeit mit einer Bestimmung natürlicher und/oder künstlicher Fluorophore als Reaktionsprodukte, wobei die Reaktionsprodukte mit Licht bestrahlt und die von ihnen abgegebene Fluoreszenzstrahlung erfasst und ausgewertet wird, gekennzeichnet durch:

a) Komponenten (2,16 bis 24) zur optischen Anregung der Reaktionsprodukte mittels Lichtimpulsen und b) Komponenten (5,7 bis 11,13,15) zur zeitauflösenden Photonenzählung mit Rauschunterdrückung und einer Trennung des Mess-Signals von Streulicht und Störlumineszenz aufgrund des zeitlichen Abklingverhaltens, wobei die Komponenten zur Anregung und diejenigen für die Photonenzählung synchron betrieben werden.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten zur optischen Anregung (2) im sichtbaren und/oder UV-Bereich mit einem Laser (17,18) arbeiten, dessen hohe Impulsfolge (24) durch Impulsselektion mit Hilfe eines einstellbaren elektrooptischen Verschlusses (16) reduzierbar ist.

3. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass in den entsprechenden Komponenten eine Einzelphotonenzählung erfolgt.

4. Verwendung der Einrichtung nach Anspruch 1 in der medizinischen Diagnose.

5. Verwendung nach Anspruch 4 in der pränatalen Diagnose von Stoffwechselkrankheiten und/oder bei immun-enzymatischen Reaktionen zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen.