CH658912A5

CH658912A5 - QUANTITATIVE DETECTION OF BIOCHEMICAL REACTIONS.

Info

Publication number: CH658912A5
Application number: CH5524/82A
Authority: CH
Inventors: Peter Prof Dr Hoesli; Herbert Dr Schneckenburger; Eberhard Dr Unsoeld; Winfried Luehrs
Original assignee: Strahlen Umweltforsch Gmbh
Priority date: 1982-02-23
Filing date: 1982-09-20
Publication date: 1986-12-15
Also published as: FR2522150A1; DE3206407A1; FR2522150B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 genannten Art. The invention relates to a device of the type mentioned in the preamble of claim 1.

Es ist eine Messanordnung zur Bestimmung des Umsatzes fluorogener Substrate in Zellen mittels der Durchflussim-pulsfluorometrie bekannt (Biotechnische Umschau 3, Heft 7, 1979, S. 214 ff), wobei die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung vereinzelt hintereinander durch den Strahl eines Dauerstrich-Lasers geführt werden. Hierbei werden Fluorophore in den Zellen zur Fluoroszenz angeregt und geben Fluoreszenzstrahlung ab, die beim Durchlaufen der Messstrecke den auszuwertenden Fluoreszenzlichtimpuls bildet, der der Masse des Fluorophors proportional ist. Diese Methode erlaubt nur Einmal-Ausmessungen der Zellen und somit sind Reaktionsabläufe in der Einzelzelle nicht erfassbar. A measuring arrangement for determining the conversion of fluorogenic substrates in cells by means of flow pulse fluorometry is known (Biotechnische Umschau 3, number 7, 1979, p. 214 ff), the cells being guided through the beam of a continuous wave laser in a row by hydrodynamic focusing will. Here, fluorophores in the cells are excited to fluoresce and emit fluorescent radiation, which forms the fluorescent light pulse to be evaluated when passing through the measuring section, which is proportional to the mass of the fluorophore. This method only allows one-time measurements of the cells and thus reaction sequences in the single cell cannot be recorded.

Eine fluorometrische Bestimmung ruhender Proben mittels der Mikrofluorometrie ist ebenfalls bekannt (Mikrochi-mica Acta, Wien, 1977 II, 379-388). Diese Bestimmung besitzt eine untere Nachweisgrenze von 5 x 1014 mol NADPH und ist nicht zeitauflösend. Sie ist für die Bestimmung kleinster Reaktionsumsätze auf zellulärer Basis und für die Aufnahme schneller Reaktionskinetiken nicht geeignet. A fluorometric determination of still samples using microfluorometry is also known (Mikrochi-mica Acta, Vienna, 1977 II, 379-388). This determination has a lower detection limit of 5 x 1014 mol NADPH and is not time-resolving. It is not suitable for the determination of the smallest reaction conversions on a cellular basis and for the absorption of fast reaction kinetics.

Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht nunmehr darin, eine Einrichtung zu bieten, mit der der fluorometrische Nachweis unter erhöhter Empfindlichkeit bzw. Reduktion der minimal erfassbaren Zahl von Enzymmolekülen mit Messzeiten im Sekundenbereich möglich ist, damit einerseits schnelle Reaktionskinetiken erfassbar sind und andererseits routinemässige Untersuchungen mit einem grossen Probendurchsatz pro Zeit durchgeführt werden können. The object of the invention is now to provide a device with which the fluorometric detection with increased sensitivity or reduction of the minimally detectable number of enzyme molecules with measuring times in the range of seconds is possible, so that rapid reaction kinetics can be detected on the one hand and routine tests with a on the other large sample throughput can be carried out per time.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden The solution to this problem is in the characteristic

Merkmalen des Patentanspruchs 1 beschrieben. Features of claim 1 described.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen wiedergegeben. Advantageous developments of the invention are given in the dependent claims.

Einerseits erlaubt somit erfindungsgemäss die Anwendung des zeitauflösenden Photonenzählverfahrens sowohl die Rauschunterdrückung als auch eine Trennung des Messsignals von Streulicht und Störlumineszenzen aufgrund des zeitlichen Abklingverhaltens. Andererseits werden für den Einsatz des Photonenzählverfahrens zum Nachweis biochemischer Reaktionen die folgenden Vorteile erreicht: On the one hand, according to the invention, the use of the time-resolving photon counting method allows both noise suppression and a separation of the measurement signal from scattered light and interference luminescence due to the time decay behavior. On the other hand, the following advantages are achieved when using the photon counting method for the detection of biochemical reactions:

- optimale Fokussierbarkeit der Anregungs-Lichtquelle im Bereich weniger /im. - Optimal focusability of the excitation light source in the range less / in.

- Lichtquelle mit grosser Zahl von Anregungsimpulsen 105 innerhalb der Messzeit von wenigen Sekunden; nur so können genügend Fluoreszenz-Photonen mit guter Einzel-photonen-Statistik (nach der Poisson -Verteilung) aufsummiert werden. Light source with a large number of excitation pulses 105 within the measuring time of a few seconds; this is the only way to add up enough fluorescence photons with good single photon statistics (after the Poisson distribution).

- Verwertbarer UV-Anteil der Anregungslichtquelle. - Usable UV component of the excitation light source.

Zwar ist die zeitauflösende Einzelphotonenzählung für die Messung der Radiophotolumineszenz in Metaphosphatglas-Dosismetern bekannt (Appl.Phys. A 26,23-26,1981), jedoch kann bei dieser Messung eine geringe Anregungsimpulsrate des verwendeten Impulslasers und damit eine lange Messzeit in Kauf genommen werden, da sich die fluoreszenzspektros-kopischen Eigenschaften innerhalb der Messzeit nicht ändern ; d.h. es gibt bei dem vorliegenden Verwendungszweck keine Reaktionsabläufe, die verfolgt werden sollen. Although the time-resolving single-photon counting for measuring the radio photoluminescence in metaphosphate glass dosemeters is known (Appl.Phys. A 26,23-26,1981), a low excitation pulse rate of the pulse laser used and thus a long measuring time can be accepted with this measurement , since the fluorescence spectroscopic properties do not change within the measurement time; i.e. there are no reaction sequences to be followed for the present purpose.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen: The invention is explained below with reference to an embodiment using the drawing. In it show:

Fig. 1 ein Blockschaltbild der erfindungsgemässen Einrichtung und Fig. 1 is a block diagram of the inventive device and

Fig. 2 und 3 graphische Darstellung eines mit der Einrichtung erhaltenen Zählerergebnisses in Funktion der Zeit bzw. der Substanzmenge. 2 and 3 graphical representation of a counter result obtained with the device as a function of time or the amount of substance.

Die Fig. 1 zeigt ein Blockschaltbild der Einrichtung. Die Probe 1 mit einem Messvolumen im sub- /il- bis sub-nl-Bereich zur Vermeidung hoher Substratkosten für hochspezifische Proteine sowie zur Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses wird mittels eines gepulsten Laserstrahles 2 bestrahlt. Dieser Laserstrahl 2 ist über einen Umlenkspiegel 3 sowie ein Anregungsfilter 4 auf die Probe 1 gerichtet. Die Fluoreszenzphotonen 5 gelangen über einen Emissionsfiltersatz 6 auf einen Photodetektor 7 mit zugehöriger, bekannter Messelektronik 8 für Einzelphotonenfluoreszenz, Zeitkorre-lator 9, Vielkanalanalysator 10 und Computer 11 zur Steuerung und Auswertung. Fig. 1 shows a block diagram of the device. The sample 1 with a measurement volume in the sub / il to sub-nl range to avoid high substrate costs for highly specific proteins and to improve the signal / noise ratio is irradiated by means of a pulsed laser beam 2. This laser beam 2 is directed onto the sample 1 via a deflection mirror 3 and an excitation filter 4. The fluorescence photons 5 pass via an emission filter set 6 to a photodetector 7 with associated, known measuring electronics 8 for single photon fluorescence, time corrector 9, multi-channel analyzer 10 and computer 11 for control and evaluation.

Ein Teil 2' des Anregungslichtes 2 wird mittels des Strahlteilers 12 ausgeblendet und mit der Photodiode 13 aufgenommen. Deren Ausgangssignal 14 mit einer Frequenz, die der Impulsfolge des Laserlichtes 2 entspricht, wird benutzt zur Erzeugung eines Referenzsignals in der Messelektronik 15, welches wiederum zur sogenannten Synchronisation von Anregungsimpuls (Licht 2) und Einzelphotonenfluoreszenz-signal 5 im Zeitkorrelator 9 verwendet wird. A part 2 'of the excitation light 2 is masked out by means of the beam splitter 12 and recorded with the photodiode 13. Their output signal 14 with a frequency that corresponds to the pulse sequence of the laser light 2 is used to generate a reference signal in the measuring electronics 15, which in turn is used for the so-called synchronization of the excitation pulse (light 2) and single photon fluorescence signal 5 in the time correlator 9.

Die optische Anregung der Probe 1 kann neben dem sichtbaren Spektralbereich auch im nahen UV-Bereich (330 -370 nm) erfolgen, so dass u.a. auch die Absorptionsbanden von Methyl-Umbelliferon, Naphthol und NADPH erfassbar sind. Diese Fluorophore werden u.a. zum Nachweis der häufig benutzten Enzyme ß-Galaktosidase und alkalische Phosphatase verwendet. In addition to the visible spectral range, the optical excitation of sample 1 can also take place in the near UV range (330 -370 nm), so that i.a. the absorption bands of methyl umbelliferone, naphthol and NADPH are also detectable. These fluorophores are used used to detect the commonly used enzymes ß-galactosidase and alkaline phosphatase.

Für die Erfüllung der oben genannten unterschiedlichen Bedingungen bezüglich einer hohen Anregungsrate wird ein For the fulfillment of the above-mentioned different conditions regarding a high excitation rate, a

2 2nd

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3rd

658 912 658 912

CW-Laser (z.B. Argon-Ionenlaser) mit ausreichender UV-Spezifikation und aktiver Modenkopplung verwendet. Die Impulsfolgefrequenz solcher Systeme (z.B. 82 MHz) ist jedoch für die Nachweiselektronik (Zeitkorrelator 9) zu hoch und führt CW laser (e.g. argon ion laser) with sufficient UV specification and active mode coupling used. However, the pulse repetition frequency of such systems (e.g. 82 MHz) is too high for the detection electronics (time correlator 9) and leads

- zu einem verfälschten Abklingverhalten der Fluoreszenz, - a falsified decay behavior of the fluorescence,

- zu einem unnötigen Aufheizen der Probe 1 und damit möglicherweise zu einer Störung der extrem empfindlichen Enzym-Kinetiken. - to an unnecessary heating of sample 1 and thus possibly to a disturbance of the extremely sensitive enzyme kinetics.

Eine Reduktion der Impulsfolgefrequenz mit Hilfe eines sogenannten Cavity Dumpers (W. Demtröder, «Grundlagen und Techniken der Laserspektroskopie», Springer Verlag, 1977) ist bei den zur Zeit verfügbaren UV-Lasern nur unter sehr grossem technischen und finanziellen Aufwand möglich. Statt dessen wurde eine besonders kostengünstige und in der Praxis leichter verwendbare Methode entwickelt. Die Impulsselektion erfolgt mit Hilfe eines elektrooptischen Verschlusses 16 (z.B. Hochfrequenz-Pockelszelle), der eine beliebig einstellbare Impuls-Folgefrequenz (z.B. 250 kHz) erlaubt. Sein praktischer Einsatz erfordert eine spezielle Synchronisation. Die Modelocker-Frequenz (=halbe Impuls-Folgefrequenz) des Modelockers 17 des Lasers 18 wird elektronisch abgegriffen und in beliebigem Teilungsverhältnis im Untersetzer 19 unterteilt. Dessen Signal 20 dient dann zur Ansteuerung des schnellen Impulsgenerators 21, dessen Ausgangssignal 22 wiederum aus TTL-Impulsen mit variabler Länge (^ 4ns) und variabler Verzögerung besteht. Diese Anregungsimpulse 22 dienen zur Triggerung des Hochleistungsgenerators 23, der kurzfristig Spannungsänderungen an der Pockelszelle 16 von bis zu 100 V bewirkt und eine kurzzeitige Transmission des einfallenden Laserlichts 24 aus dem Laser 18 ermöglicht. Die Optimierung von Länge und Verzögerung des Trigger-Impulses 22 erlaubt ein vollständiges Ein- und Ausschalten der Pockelszellen-Spannung innerhalb eines Zeitintervals, das kürzer als der doppelte Impulsabstand (z.B. 24 ns) ist. Dadurch wird die Selektion der einzelnen Laserimpulse 2 aus einem Impulszug hoher s Folgefrequenz (z.B. 82 MHz) möglich. Ein Nachschwingen der Pockelszellen-Spannung wurde durch Dämpfung mittels Ferrit-Perlen und geeigneten kapazitiven Abschluss verhindert. A reduction of the pulse repetition frequency with the help of a so-called cavity dumper (W. Demtröder, “Fundamentals and Techniques of Laser Spectroscopy”, Springer Verlag, 1977) is only possible with the currently available UV lasers with very great technical and financial effort. Instead, a particularly inexpensive method that was easier to use in practice was developed. The pulse selection takes place with the aid of an electro-optical shutter 16 (e.g. high-frequency Pockels cell), which allows an arbitrarily adjustable pulse repetition frequency (e.g. 250 kHz). Its practical use requires special synchronization. The model locker frequency (= half pulse repetition frequency) of the model locker 17 of the laser 18 is picked up electronically and divided into any ratio in the coaster 19. Whose signal 20 is then used to control the fast pulse generator 21, the output signal 22 in turn consists of TTL pulses with variable length (^ 4ns) and variable delay. These excitation pulses 22 are used to trigger the high-power generator 23, which briefly causes voltage changes at the Pockels cell 16 of up to 100 V and enables the incident laser light 24 to be transmitted briefly from the laser 18. The optimization of the length and delay of the trigger pulse 22 allows the Pockels cell voltage to be switched on and off completely within a time interval which is shorter than twice the pulse interval (e.g. 24 ns). This makes it possible to select the individual laser pulses 2 from a pulse train with a high repetition frequency (e.g. 82 MHz). A swinging of the Pockels cell voltage was prevented by damping with ferrite beads and a suitable capacitive termination.

Die Vorteile des zeitauflösenden Photonen-Zählverfahrens io können auch innerhalb der in der Biochemie erforderlichen kurzen Messzeiten ausgenützt werden. Die nach Fig. 1 erhaltenen Fluoreszenz-Abklingkurven (Fig. 2, nur eine dargestellt) werden mit Subnanosekunden-Zeitauflösung innerhalb weniger Sekunden aufgenommen. Die Auswertung des 15 Messignals erfolgt integral innerhalb eines bestimmten Zeitbereiches der Abklingkurve (z.B. in Fig. 2, obere Kurve, zwischen 4,3 ns und 8,8 ns nach dem Maximum), innerhalb dessen der Untergrund aufgrund des Anregungslichtes 2 (untere Kurve), sowie längerlebiger Störlumineszenzen stark 20 reduziert ist. Damit kann die minimal nachweisbare Substanzmenge der Probe 1 von ca. 10-'3 mol auf 10"15 mol (bei jxl-bis sub-jil-Volumina) verringert werden (siehe Fig. 3 ; Photonenzahl als Funktion der Substanzmenge am Beispiel von Methyl-U mbellif eron). The advantages of the time-resolving photon counting method can also be used within the short measuring times required in biochemistry. The fluorescence decay curves obtained according to FIG. 1 (FIG. 2, only one shown) are recorded with subnanosecond time resolution within a few seconds. The evaluation of the 15 measurement signal takes place integrally within a certain time range of the decay curve (for example in FIG. 2, upper curve, between 4.3 ns and 8.8 ns after the maximum), within which the background due to the excitation light 2 (lower curve) , as well as longer-lived interference luminescence is greatly reduced. In this way, the minimally detectable amount of substance in sample 1 can be reduced from approximately 10 -3 mol to 10 15 mol (with jxl to sub-jil volumes) (see FIG. 3; number of photons as a function of the amount of substance using the example of methyl -U mbellif eron).

25 Eine Fokussierung des Anregungslichts 2 auf kleinere Messvolumina lässt eine Reduktion der Nachweisgrenze auf weniger als 1016 mol in nl-Bereich und weniger als 10-18 mol im pl-Bereich zu. Damit ist sowohl ein Nachweis einzelner Enzymmoleküle als auch die Beobachtung schneller Enzym-30 kinetiken mit einem Umsatz von ca. 3x10" fluorogenen Molekülen pro Enzymmolekül und pro Minute möglich. Das bereits computergesteuerte Messystem (Fig. 1) ist weiter automatisierbar und kann daher für Routineuntersuchungen innerhalb eines weiten Anwendungsbereichs (neben der 35 medizinischen Diagnose u.a. auch in der Lebensmittelchemie, Agrikultur, Umweltschutz) eingesetzt werden. 25 Focusing the excitation light 2 on smaller measurement volumes allows the detection limit to be reduced to less than 1016 mol in the nl range and less than 10-18 mol in the pl range. This enables both the detection of individual enzyme molecules and the observation of fast enzyme kinetics with a turnover of approx. 3x10 "fluorogenic molecules per enzyme molecule and per minute. The already computer-controlled measuring system (Fig. 1) can be further automated and can therefore be used for routine examinations can be used within a wide range of applications (in addition to 35 medical diagnosis, including in food chemistry, agriculture, environmental protection).

B B

3 Blatt Zeichnungen 3 sheets of drawings

Claims

658912 PATENT CLAIMS

1. Device for the quantitative detection of biochemical, in particular enzymatic reactions with a short measuring time with a determination of natural and / or artificial fluorophores as reaction products, the reaction products being irradiated with light and the fluorescence radiation emitted by them being recorded and evaluated, characterized by:

a) Components (2.16 to 24) for optical excitation of the reaction products by means of light pulses and b) Components (5.7 to 11.13.15) for time-resolving photon counting with noise suppression and a separation of the measurement signal from stray light and interference luminescence due to the temporal decay behavior, the components for excitation and those for photon counting being operated synchronously.

2. Device according to claim 1, characterized in that the components for optical excitation (2) in the visible and / or UV range work with a laser (17, 18), the high pulse train (24) by pulse selection with the aid of an adjustable electro-optical Closure (16) is reducible.

3. Device according to one of claims 1 and 2, characterized in that a single photon count is carried out in the corresponding components.

4. Use of the device according to claim 1 in medical diagnosis.

5. Use according to claim 4 in the prenatal diagnosis of metabolic diseases and / or in immuno-enzymatic reactions for the detection of antibodies or antigens.