DE19602145C2 - Optisches Meßverfahren zur Bestimmung der Bio- oder Chemolumineszenz einer Probe, insbesondere im Rahmen des Leuchtbakterientests und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Meßverfahren zur Bestimmung der Bio- oder Chemolumineszenz einer Probe, insbesondere im Rahmen des Leuchtbakterientests und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Die Vermessung des Leuchtverhaltens von selbstleuchtenden Proben kommt in der Praxis in verschiedensten Bereichen vor. So gibt es fluoreszierende oder chemolumineszente Proben, bei denen chemische Stoffe aufgrund von Fluoreszenz selbst leuchten bzw. durch eine chemische Reaktion zur Lichtemission angeregt werden. Beispiele für chemolumineszente Stoffe sind Luminol und Lucigenin, die mit Chlor und Stickstoff unter Lichtemission reagieren.

Von besonderer Bedeutung sind jedoch auch biolumineszente Meßverfahren. Hierbei wird ausgenutzt, daß es Leuchtbakterien gibt, die bei ihrer Atmung bzw. allgemeinen Stoffwechselvorgängen Licht emittieren. Solche biologischen Organismen bilden häufig einen sehr empfindlichen Indikator für selbst geringe Mengen von toxischen Substanzen. So beschreibt beispielsweise die DE 28 41 896 A1 den Einsatz des Photobacteriums wie beispielsweise P. Splendidum, P. Mandapamencis, P. Phosphorio. Weitere Leuchtbakterienstämme sind beispielsweise Bakterien der Gattung Vibrio, Lucibakterium, oder andere Mikroorganismen wie z. B. Meeres-Dinoflagellaten oder Pilze (Basidiomyceten). Toxizitätsmessungen mit derartigen Leuchtbakterien sind bereits als Routineverfahren normiert (vgl. DEV L34). Die natürliche Leuchtaktivität der Leuchtbakterien wird in diesen Toxizitätstests in der Regel durch die Zugabe der toxischen Substanz gehemmt. Die daraufhin einsetzende Abnahme der Lichtemission wird mit Hilfe eine Lichtdetektors gemessen und aufgezeichnet. Dabei ergibt sich in der Praxis das Problem, daß stark verfälschende Störeinflüsse durch das Suspensionsmedium der Bakterien auftreten. Dieses Medium kann nämlich je nach Herkunft eine eigene Färbung oder Trübung haben, welche das Meßergebnis erheblich beeinflußt. Aus diesem Grunde sind Verfahren entwickelt worden, wie durch Vergleichsmessung mit dem Suspensionsmedium ohne die Leuchtbakterien eine Korrektur der Störeinflüsse durchgeführt werden kann. So beschreibt z. B. der Artikel "Möglichkeiten und Grenzen der Farbkorrektur im Leuchtbakterientest mit Hilfe von Absorptions-Korrektur-Küvetten" (Berthold Klein, Z. Wasser-Abwasser-Forsch., 23, Seiten 70-74 (1990)) drei derartige Verfahren. Zwei von diesen Verfahren verwenden eine spezielle Absorptions-Korrektur-Küvette (ACC), die einen zweiteiligen Aufbau mit einer inneren und einer äußeren Kammer für die Probe hat. Während die die Leuchtbakterien enthaltende Flüssigkeit nur in die innere Kammer gefüllt wird, wird die äußere Kammer wechselweise mit einer klaren Vergleichsflüssigkeit oder dem reinen Suspensionsmedium (ohne Leuchtbakterien) gefüllt. Nach einem derartigen Befüllen ist über einen Zeitraum von ca. 20-30 Minuten das Leuchtverhalten zu beobachten, da sich aufgrund von Temperaturangleichungsprozessen das Leuchtverhalten der Bakterien zunächst stark ändert. Nach dem genannten Zeitraum nimmt es sodann eine konstante Drift an, so daß mit Hilfe von grafischen Verfahren anhand der ermittelten Meßkurven die Lichtintensität I₀ hinter optisch leerem Medium und die Lichtintensität I_f hinter gefärbtem Medium in der äußeren Kammer der ACC ermittelt werden kann. Der genannte Artikel beschreibt ferner ein Ver­ fahren, bei dem mit vier ACC-Küvetten, die unterschiedlich befüllt sind, gleichzeitig eine kompensierende Messung durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren vermeidet, daß durch einen Austausch der Flüssigkeit in der äußeren Kammer der ACC zeitaufwendige Temperatureffekte auftreten. Dafür erfordert es jedoch den relativ aufwendigen Vorgang einer Messung mit vier Küvetten, der zudem mit weiteren Fehlerquellen behaftet ist (z. B. unterschiedliche Gefäßeigenschaften). Die geschilderten Methoden zur Korrektur von Farb- und Trübungseinflüssen bei Leuchtbakterientests sind alle sehr aufwendig. Ihre Durchführung erfordert geschultes Personal und ist auch dann noch aufgrund zahlreicher Fehlerquellen sehr fehlerbehaftet.

Die Durchführung einer Kompensationsmessung an der Probe vor Zugabe der Testbakterien beschreibt auch die DE 26 26 915 B1. Mit Hilfe dieser Messung sollen die Absorptionseigenschaften der Probenflüssigkeit festgestellt werden, um eventuelle Verfälschungen der späteren Hauptmessung (mit Bakterien) kompensieren zu können. Für die Kompensationsmessung ist eine eigene Meßzelle mit Lichtquelle und -de­ tektor vorgesehen. In der Hauptmeßzelle befindet sich bei der DE 26 26 915 B1 neben dem Detektor ebenfalls eine Lichtquelle, da fluoreszierende Bakterien verwendet werden, die eine Lichtanregung benötigen. Das genannte Verfahren ist daher nicht für Bio- oder Chemolumineszenz gedacht. Auch finden die Haupt- und die Kompensationsmessung zeitlich versetzt statt, so daß kurzfristige Änderungen nicht erkennbar sind.

Die DE 36 23 601 A1 betrifft die Messung von Bio- und Chemolumineszenz in einer maschinellen, automatisierten Vermessung von zahlreichen Probenröhrchen in einer Halterung. Letztere werden automatisch an einem Lichtdetektor vorbeigeführt, wobei das Lumineszenzlicht durch ein Fenster aus der Halterung austreten kann. Die Halterung enthält ferner ein zweites Fenster, welches dem ersten Fenster gegenüber angeordnet ist und eine Transmissionsmessung erlauben soll. Eine derartige Transmissionsmessung ist in der DE 36 23 601 A1 allerdings nur als Alternative zur Lumineszenzmessung vorgesehen, d. h. entweder wird die Lumineszenz oder die Transmission gemessen. Eine Korrektur von Lumineszenzmeßwerten findet nicht statt.

Die vorliegende Erfindung hat sich demgegenüber die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das einfach durchzuführen und daher auch von ungeschulten Personen anwendbar ist, und mit dem Störeinflüsse wie z. B. Färbungen oder Trübungen innerhalb einer bio- oder chemolumineszierenden Probe erkannt und kompensiert werden können.

Diese Aufgabe wird durch ein optisches Meßverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 3 gelöst. Zusätzlich zur bekannten Messung der Lichtemission der Probe wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren (mindestens) eine Vergleichsmessung durchgeführt, bei der mit Hilfe einer Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise durchstrahlt und die resultierende Transmission des Lichtes gemessen wird. Durch das Durchstrahlen der Probe mit einer Lichtquelle bekannter Stärke und bekannter Anordnung ist es möglich, durch Messung der Transmission festzustellen, wieviel des Lichtes innerhalb der Probe absorbiert und damit durch die Störeinflüsse verändert wurde. Auf diese Weise erhält man Kenntnis über die Größe der Störeinflüsse und kann diese aus dem Meßsignal der Lumineszenz herauskompensieren.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Lichtquelle innerhalb der Probe oder außerhalb angeordnet sein. Wichtig ist nur, daß ihre geometrische Anordnung in bezug auf den Lichtdetektor bekannt und konstant ist.

Zur Ermittlung der Vergleichsmessung ist es möglich, die Lichtquelle mindestens einmal ein- bzw. auszuschalten und die Differenz in der gemessenen Lichtintensität festzustellen. Bei diesem Vorgehen wird in der Regel die Probe sowohl im ein- als auch im ausgeschalteten Zustand der Lichtquelle aktiv bio- oder chemolumineszieren.

Bei einem anderen Meßvorgehen wird die Probe zunächst im nicht-bio- oder chemolumineszenten Zustand mit eingeschalteter Lichtquelle vermessen; anschließend wird im bio- oder chemolumineszenten Zustand mit ausgeschalteter Lichtquelle gemessen, und die beiden somit ermittelten Meßwerte können miteinander korreliert werden.

Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Meßverfahren das Spektrum der Lichtquelle auf das Spektrum der vorliegenden bzw. erwarteten Bio- oder Chemolumineszenz abgestimmt. Dies geschieht insbesondere so, daß die Spektren so weit wie technisch möglich einander angenähert werden.

Mit Hilfe der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Vergleichsmessungen können die durch Färbungen oder Trübungen verursachten Störeinflüsse meßtechnisch kompensiert werden. In der Regel wird dazu in einer Serie von Kalibrierungsmessungen der Zusammenhang ermittelt, mit dem sich die Bio- oder Chemolumineszenz zum einen und das durchstrahlende Licht der Lichtquelle zum anderen bei Zugabe von definierten Trübungen ändern. Über eine derartige Kalibrierungsmessung kann sodann in einer späteren realen Messung aus dem Lichtintensitätswert der Lichtquelle der korrigierte Lichtintensitätswert der bio- oder chemolumineszierenden Probe ermittelt werden.

Während das obige Verfahren vorwiegend am Beispiel der Biolumineszenz mit Hilfe von Leuchtbakterien erläutert wurde, ist es jedoch keineswegs auf diese Lumineszenzerscheinung eingeschränkt. Es ist vielmehr mit allen bekannten bio- oder chemolumineszenten (selbstleuchtenden) Vorgängen einsetzbar.

Die Vorrichtung zur optischen Messung von bio- oder chemolumineszierenden Proben nach dem oben dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren, weist einen transparenten Probenbehälter und einen Lichtdetektor auf; ferner enthält eine derartige Vorrichtung eine ein-/ausschaltbare Lichtquelle, welche innerhalb des Probenbehälters oder außerhalb des Probenbehälters angeordnet ist, und zwar in einer Weise, daß der von der Lichtquelle ausgehende Strahlengang nach Durchtritt durch den Probenbehälter den Lichtdetektor erreicht. Mit einer derartigen Vorrichtung ist es möglich, das oben geschilderte erfin­ dungsgemäße Verfahren durchzuführen. Durch Ein- bzw. Ausschalten der Lichtquelle kann dabei die Transmission des Lichtes durch die Probe gemessen werden, und dieser Wert kann zur Korrektur von Störeinflüssen herangezogen werden.

Bei der in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzten Lichtquelle handelt es sich vorzugsweise um Leuchtdioden (LED), Gasentladungslampen, Glühlampen, Laser, Halogen- oder Wolfram-Lampen. Bei dem Lichtdetektor handelt es sich vorzugsweise um eine Fotodiode, eine Fotozelle, einen Fotowiderstand oder eine Fotomultiplierröhre.

Um eine Anpassung des Spektrums der Lichtquelle in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu erzielen, können im Strahlengang geeignete Filter angeordnet sein. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um Bandpaßfilter oder Monochromatoren, insbesondere um Transmissionsfilter (die nur ein schmales Band des Spektrums durchlassen) oder optische Gitter. Diese Filter können sowohl vor der Lichtquelle angeordnet sein und damit das von ihr ausgehende Licht filtern, als auch vor dem Detektor und damit das Licht der Lichtquelle und der lumineszierenden Probe gleichermaßen filtern.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren haben gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil, daß sie durch einen relativ einfachen apparativen Aufbau erzielbar sind, und daß bei ihrer Anwendung kaum Fehler durch eine falsche oder unsaubere Ausführung auftreten können. Das geschilderte Verfahren ist vielmehr routinemäßig durchführbar und führt zu robusten Ergebnissen.

In dem folgenden Beispiel werden Meßergebnisse wiedergegeben, die mit dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren zur Farbkompensation bei einem Leuchtbakterientest nach DIN 38412 L34, L341 gewonnen wurden. Tabelle 1 gibt die Ergebnisse dieses Tests wieder, bei dem ein nicht hemmender (d. h. nicht toxischer) Farbstoff dem Leuchtbakterientest in zunehmenden Konzentrationen zugesetzt wurde. Der Vergleich der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren farbkompensierten Meßwerte mit den wahren Werten zeigt, daß eine erhebliche Verbesserung der normalerweise gemessenen verfälschten Werte erzielt wird. Während durch den Farbstoff bei einem unkorrigierten Meßverfahren eine Hemmung der Aktivität der Leuchtbakterien von bis zu 37% vorgetäuscht wird, können derartige Fehler bei der erfindungsgemäßen Meßwertkompensation in der Regel beseitigt werden. Tabelle 2 zeigt die Durchführung desselben Tests, wobei jedoch ein (toxischer) Hemmstoff zugegeben wurde. Auch hier führt die erfindungsgemäß durchgeführte Meßwertkompensation zu erheblich verbesserten, d. h. dichter am wahren Wert liegenden Ergebnissen.

Tabelle 1

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38412 L34, L341 ohne zusätzlichen Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Tabelle 2

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38412 L34, L341 mit zugesetztem Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Die Vorrichtung ist in der beigefügten Figur dargestellt.

Die zu vermessende Probe 1 mit angedeuteten Leuchtbakterien 1a befindet sich in einem durchsichtigen Probenbehälter 5. Hierbei handelt es sich in der Regel um eine standardisierte Küvette. Der Probenbehälter 5 befindet sich vor dem Lichtdetektor 2. Bei dem Lichtdetektor 2 handelt es sich in der Regel um eine Fotozelle. Mit ihr wird die von den Leuchtbakterien 1a (bzw. von chemolumineszenten Stoffen innerhalb der Probe 1) ausgehende Lichtemission registriert und quantitativ erfaßt. Je nach Trübungsgrad der Probe 1 wird nun das von den Leuchtbakterien 1a ausgehende Licht innerhalb der Probe verschieden stark gestreut oder absorbiert. Ein und derselbe Leuchtwert eines Bakteriums 1a führt daher je nach Zusammensetzung des umgebenden Mediums zu einer unterschiedlich starken Lichtmenge, die den Lichtdetektor 2 erreicht. Als Kenngröße des Verfahrens interessiert jedoch die ursprüngliche, unverfälschte Leuchtstärke der Leuchtbakterien 1a. Mit der Vorrichtung wird daher eine Zusatzeinrichtung eingeführt, welche im Prinzip eine Messung der reinen Störeinflüsse ermöglicht, so daß diese, nachdem sie derart ermittelt wurden, vom verfälschten Meßergebnis der Leuchtbakteri­ en-Lumineszenz abgezogen werden können.

Die Vorrichtung hat zu diesem Zweck eine Lichtquelle 3 vor dem Probenbehälter 5 angeordnet. Das von der Lichtquelle 3 ausgesandte Licht tritt durch den transparenten Probenbehälter 5 und damit durch die Probe 1 hindurch und erreicht auf der anderen Seite der Probe den Lichtdetektor 2. Je nach Zusammensetzung der Probe, d. h. insbesondere nach Trübung oder Färbung, wird das Licht dabei unterschiedlich stark absorbiert bzw. gestreut. Das den Lichtdetektor 2 noch erreichende Licht ist dabei ein Maß für die Transmission des Probenbehälters 5 und der Probe 1, aus der rückgeschlossen werden kann, wie stark das Medium um die Leuchtbakterien 1a Licht absorbiert. Als weitere optionale Ausstattung der Vorrichtung ist ein Monochromator 4 vorgesehen. Dieser befindet sich (in Richtung auf den Lichtdetektor 2) vor der Lichtquelle 3 und läßt nur einen bestimmten Spektralbereich der Lichtquelle 3, vorzugsweise ein schmales Wellenband, durchtreten. Dieses Wellenband ist soweit möglich auf die Wellenlänge der Bio- oder Chemolumineszenz abgestimmt. Ein weiteres Filter 6 kann vor dem Lichtdetektor 2 angeordnet werden. Durch dieses Filter tritt sowohl das Licht der Lichtquelle 3 als auch der bio- oder chemolumineszierenden Probe 1.

Claims (7)

1. Optisches Meßverfahren zur Bestimmung der Bio- oder Chemolumineszenz einer Probe, insbesondere im Rahmen des Leuchtbakterientests, bei dem mit einem Lichtdetektor die Lichtemission der Probe gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Vergleichsmessung mit Hilfe einer Lichtquelle (3) die Probe (1) ganz oder teilweise durchstrahlt und die resultierende Transmission gemessen wird, wobei die Transmission im Spektralbereich der Bio- oder Chemolumineszenz gemessen wird, und daß Störeinflüsse wie Färbungen oder Trübungen der Probe (1) auf die mit dem Lichtdetektor (2) gemessene Lichtemission der Bio- oder Chemolumineszenz mit Hilfe der Vergleichsmessung kompensiert werden.

2. Optisches Meßverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (1) mindestens einmal im Wechsel zwischen ein- und ausgeschalteter Lichtquelle (3) gemessen wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 mit

• - einem transparenten Probenbehälter (5),
• - einem Lichtdetektor (2) und
• - einer ein-/ausschaltbaren Lichtquelle (3), welche in dem Probenbehälter (5) oder außerhalb desselben derart angeordnet ist, daß ihr Strahlengang nach Durchtritt durch den Probenbehälter (5) den Lichtdetektor (2) erreicht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (3) eine Leuchtdiode (LED), eine Gasentladungslampe, eine Glühlampe oder ein Laser ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Spektrum der Lichtquelle (3) auf das Spektrum der Bio- oder Chemolumineszenz abgestimmt ist, vorzugsweise, indem es hiermit ganz oder annähernd identisch ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtdetektor (2) eine Fotodiode, ein Fotowiderstand oder eine Fotomultiplierröhre ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Lichtquelle (3) und/oder vor dem Lichtdetektor (2) ein oder mehrere Filter (6), vorzugsweise Bandpaßfilter, oder Monochromatoren (4), Transmissionsfilter oder optische Gitter angeordnet sind.