DE2938056C2

DE2938056C2 - Vorrichtung zur fluorometrischen Untersuchung von Proben

Info

Publication number: DE2938056C2
Application number: DE2938056A
Authority: DE
Inventors: Dieter 3000 Hannover Ernst; Eckehard 3222 Freden Schulze
Original assignee: GESELLSCHAFT fur STRAHLEN- und UMWELTFORSCHUNG MBH 8000 MUENCHEN DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur STRAHLEN- und UMWELTFORSCHUNG MBH 8000 MUENCHEN DE
Priority date: 1979-09-20
Filing date: 1979-09-20
Publication date: 1986-12-11
Also published as: FR2466015A1; GB2062889A; GB2062889B; FR2466015B1; DE2938056A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur fluorometrischen Auswertung von Proben mit einer Strahlenquelle fuer die die Fluoreszenzstrahlung erregende Primaerstrahlung, optischen Elementen zur Ausrichtung der Primaerstrahlung auf die Probe, einem Behaelter fuer die Probe und Aufnahme- und Auswerteelemente fuer die Fluoreszenzstrahlung, wobei die optischen Elemente fest angeordnete Filter, Linsen und Spiegel sind. Die besonderen Vorteile der Erfindung bestehen darin, dass das Erregerlicht durch das Messvolumen dringt und durch den selektiven Spiegelbelag der Probe reflektiert wird. Dadurch wird die Probe, nachdem sie von einer Seite durchstrahlt wurde, von der anderen Seite nochmals, wenn auch mit etwas geringerer Intensitaet, beleuchtet. Entsprechendes gilt auch fuer das Fluoreszenzlicht. Das in Erregerstrahlrichtung entweichende Licht wird direkt zum Empfaenger geleitet und das uebrige Dank des selektiv reflektierenden Belages zum Empfaenger geleitet. Dadurch werden: 1. Die absorptionsbedingten Ungleichmaessigkeiten in der Erfassung des Messvolumens weitgehend ausgeglichen, 2. Erreger- und Fluoreszenzlicht weit besser ausgenuetzt und 3. Bei gleichzeitiger Empfindlichkeitssteigerung wird der Anteil der Erregerstrahlung am Emissionssignal stark reduziert. Die Gesamtfluoreszenzausbeute nimmt dadurch Zu. die Einrichtung ermoeglicht es, den Chlorophyllgehalt, die photosynthetische Aktivitaet und/oder den Verlauf der Phtotsynthesereaktion zu ermitteln. ...U.S.W

Description

3 4

nen ermittelbar ist Fluoreszenzstrahlung bewirken eine verbesserte Be- \: Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die rücksichtigung von sedimentierten Partikeln gegenüber kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 gelöst dem normalen senkrechten Strahlengang. Die optischen Die Merkmale der Ansprüche 2—4 geben vorteilhaf- Elemente sind in einer kompakten erschütterungsfesten - te Weiterbildungen der Erfindung an. 5 und leicht auswechselbaren Form montiert Alle trans-Die besonderen Vorteile der Erfindung bestehen dar- mittierenden und reflektierenden Bauteile (Filter und ■' in, daß das Erregerlicht durch das Meßvolumen dringt, Spiegel), sowie die Probenhalterung werden in einen r'- und durch den selektiven Spiegelbelag durch die Probe gemeinsamen Block gebaut, der — falls Wellenlängenreflektiert wird. Dadurch wird die Probe, nachdem sie wechsel nötig ist — als Ganzes ausgetauscht werden _s von einer Seite durchstrahlt wurde, von der anderen io kann. Statt selektiv bedampfter gewölbter Oberflächen ,^L5 Seite nochmals, wenn auch mit etwas geringerer Intensi- können auch ebene Flächen benutzt werden.

tat beleuchtet Entsprechendes gilt auch für das Fluor- Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausfüh-

eszenzlicht Das in Erregerstrahlrichtung entweichende ruagsbeispielen mittels der Fig. 1—3 näher erläutert

Licht wird direkt zum Empfänger geleitet und das übri- Die F i g. 1 zeigt schematisch den Aufbau eines kompak-

ge dank des selektiv reflektierenden Belages zum Emp- 15 ten Strahlenganges. Die von einer gepulsten Lichtquelle

fänger geleitet Dadurch werden: 8 (Xe-Hochdruckblitz) ausgesandte Anregungsstrahlung 3 (Strahlengang 2 bzw. optische Achse) wird von

1. die absorptionsbedingten Ungleichmäßigkeiten in dem selektiv für die Anregungsfrequenz bedampften der Erfassung des Meßvolumens weitgehend aus- zusätzlichen Filter 9 (Glasspiegel mit Bedampfung aus geglichen, 20 Thoriumoxid, derart, daß für A = 682 nm bzw.

2. Erreger- und Fluoreszenzlicht weit besser ausge- A = 435 nm Transmission- bzw. Reflexionsmaxima entnützt und stehen) reflektiert und gelangt durch das Filter 10 (Inter-

3. bei gleichzeitiger Empfindlichkeitssteigerung wird ferenzfilter) auf einen Spiegel 14. Dieser Spiegel 14 aus der Anteil der Erregerstrahlung am Emissionssi- Glas mit Thoriumoxidbedampfung reflektiert die unter gnal stark reduziert 25 45° auf treffende Anregungsstrahlung (A=435 nm) selektiv. Das im Strahlengang 2 folgende, vor dem Pro-Die Gesamtfluoreszenzausbeute nimmt dadurch zu. bengefäß 1 angeordnete Filter 6 ist derart mit Thorium-Weitere Filter im Erreger- und Fluoreszenzstrahlen- oxid bedampft daß es für die Anregungs- bzw. Primärgang drücken das Restlicht, das bei herkömmlichen An- strahlung 3 transparent ist, die in der Probe entstehende Ordnungen stört, auf ein unmeßbares Niveau herab. 30 Fluoreszenzstrahlung 5 (A = 682 nm) jedoch reflektiert. Diese Filter können auch durch selektive Spiegel ersetzt Der Probenbehälter 1 enthält die Substanzen homogen

: sein. oder inhomogen, gleichgültig ob Sedimentation stattfin-

Die Erzeugung des Erregerlichtes erfolgt durch einen det oder nicht Sein Durchmesser beträgt 25 mm, seine

Lichtblitz ähnlich wie bei elektronischen Blitzgeräten Höhe 30 mm.

für die Photographic. Die Blitztechnik wurde bisher je- 35 Im Strahlengang 2, dem Probenbehälter 1 nachgeorddoch nicht zur Energieersparnis oder zum Einhalten ei- net, befindet sich ein zweites Filter 7 mit der Eigenner bestimmten Beleuchtungsdauer nach vorhergehen- schaft, nunmehr die Anregungsstrahlung 3, welche den Dunkelpausen benutzt Die Energieersparnis ist we- durch den Probenbehälter 1 gelangte, zu reflektieren, sentlich bei Feldgeräten (Gewicht der Akkumulatoren). die Fluoreszenzstrahlung 5 jedoch zu transmittieren. h Das Einhalten einer definierten Dunkelpause und das 40 Die Thoriumbedampfung ist entsprechend ausgelegt. Erzeugen definierter Lichtblitze sind wesentlich bei Über einen weiteren Spiegel 15 (er entspricht dem Spiezahlreichen Fluoreszenzfarbstoffen, die sich unter dem gel 14) wird zur räumlichen Verkleinerung der Vorrich-Einfluß des Erregerlichtes zersetzen können, insbeson- tung nunmehr das Fluoreszenzlicht 5 unter einem Windere bei der nachfolgend beschriebenen Chlorophyll- kel von 45° reflektiert. Die Konkavlinse 12 mit fluoreszenz. 45 jf ·= 25 cm bildet den Boden des Probenbehälters 1 auf Ein geringes Gewicht und geringer Energieverbrauch die Detektoreinrichtung 4 (Photodiode) ab. Zur weite-(Feldgerät) werden auch durch Verwendung eines ren Unterdrückung von nicht zur Registrierung er-Halbleiterphotoelements als Lichtempfänger begün- wünschter Strahlung ist vor der Detektoreinrichtung 4 stigt Dadurch entfällt die stabilisierte Hochspannungs- ein weiteres Filter 11 angebracht, das nur für die Fluorversorgung für den sonst in solchen Fällen aufgrund von 50 eszenzstrahlung transparent ist. Der zweimal geknickte mangelnder Fluoreszenzlichtausbeute benutzten Se- Strahlengang 2 erlaubt einen kompakten mechanischen kundärelektronenvervielfacher. Die spezielle Auswahl Aufbau.

eines Elementes mit kleiner Zeitkonstante erlaubt dabei In der F i g. 2 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel eine Verbindung mit der Blitzanregung. dargestellt Der Strahlengang 2 ist nicht geknickt. Die Erfindungsgemäß wird also eine höhere Linearität bei 55 Bezugszeichen für sich entsprechende Teile sind aus der sonst gleichem Aufwand bzw. Benutzung größerer Pro- Vorrichtung nach F i g. 1 übertragen,
benvolumina und damit höherer Empfindlichkeit bei Beim geraden Strahlengang 2 kann auf die Spiegel 14 gleicher Linearität erreicht. Die gute Ausnutzung des und 15 verzichtet werden (selbstverständlich könnten Erreger- und Fluoreszenzlichtes ermöglicht kleinere solche selektiven Filter 14' u. 15' entsprechend den Spie-Lichtquellen. geringeren Energiebedarf, geringere fin gel 14 und 15 mit senkrechter Transparenz für Anre-Schädigung der Probe. Der Impulsbetrieb senkt den gungslicht 3 bzw. Fluoreszenzlicht 5 im Strahlengang Energieverbrauch der Lichtquelle und damit das Akku- enthalten sein). Im Gegensatz zur Anordnung nach mulatorengewicht Er ermöglicht definierte Dunkel- Fig.; ist das zusätzliche Filter 9 als Kondensorspiegel und Beleuchtungsphasen bei kleinem technischen Auf- ausgebildet, wodurch die Lichtausbeute aus der Lichtwand. Dies ist insbesondere wichtig für zersetzliche 65 quelle 8 für die Anregungsstrahlung 3 erhöht wird. Eine Fluoreszenzfarbstoffe. Der Halbleiterdetektor spart Kondensorlinse 13 bildet ausschließend einen parallelen Kosten und Gewicht. Die Anregung der Probe von Strahlengang 2 aus, der durch das Filter 10 und das oben und unten sowie die beidseitige Erfassung der Filter 6 auf den Probenbehälter 1 auftrifft. Zur Verstär-

5 6 ■>

kung der Reflexionswirkungen der Filter 7 und 6 für ,-;;

Anregungs- bzw. Fluoreszenzstrahlung 3 bzw. 5 sind

diese als sphärische Spiegel ausgebildet, die auf die Pro- %

benküvette 6 fokussiert sind. Die Fluoreszenzstrahlung f?

5 trifft wiederum auf die Detektoreinrichtung 4 und 5 i|

wird ausgewertet L^

Die F i g. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluores- ff

zenz nach einer längeren Dunkelpause, sowie nach Ver- i

giftung mit CMU oder DCMU. Die unterschiedliche
Fluoreszenzausbeute mit ohne ohne diese Vergiftung ist 10

ein Maß für die photosynthetische Aktivität vor der ;

Vergiftung. Durch Zusatz von CMU soll diese Vergif- >;'

tung (Blockierung der Elektronentransportkette des ΐ

Photosystems II) erreicht werden. _; 1

Der Fluoreszenzwert vor Vergiftung nach einer Dun- 15 '.f_t

kelpause zwischen zwei Lichtblitzen mit Anregungs- i

strahlung 3 steht in gut reproduzierbarer Beziehung
zum Maximum der Kurve in F i g. 3 (A). Die Differenz
der Fluoreszenzwerte vor und- nach der Vergiftung
zeigt eine gute Korrelation zum Wert (B). Durch Mes- 20
sung des zeitlichen Verlaufes und Entnahme der Daten

A und B können im Prinzip die gleichen Zahlen gewon- ^!

nen werden wie durch Messen der Fluoreszenz vor und
nach der Vergiftung.

Die Ermittlung der photosynthetischen Aktivität er- 25
folgt, wie bereits beschrieben, aus der Differenz der
Fluoreszenzwerte vor und nach der Vergiftung oder aus
der Ermittlung der Fluoreszenzwerte A und B. Wesentlich ist die Ausnutzung der Dunkelpause, die Verwendung von CMU statt DCMU oder die Entnahme der 30
Fluoreszenzwerte aus der Kurve. <'

Zahlreiche Herbizide enthalten CMU, DCMU oder '

andere Substanzen, die die Elektronentransportkette
des Photosystems II blockieren und die erwähnte Wirkung auf die Fluoreszenz zeigen. Wird einer intakten 35
Algensuspension verdächtiges Wasser zugesetzt, so
zeigt der zeitliche Fluoreszenzeffekt ein evtl. vorhandenes Herbizid an, das den gleichen Wirkungsmechanismus hat

Eine Chlorophyllbestimmung ist somit ohne Extrak- 40

tionsschritt und ohne die Fehler einer einfachen Fluor- ^;

eszenzmessung möglich unter definierten Bedingungen ί

(Lichtblitze mit dazwischenliegender Dunkelpause), ei- · fine Messung der photosynthetischen Aktivität unter den

gleichen Vorteilen gelingt und eine Reihe von Herbizi- 45 <

den können praktisch momentan ohne Extraktionsschritte und chromatographische Bestimmungen und
ähnliche chemische Manipulationen nachgewiesen werden.

50

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2 Erregerlichtes, die auch das Sperrfilter durchdringen, Patentansprüche: eine erhebliche Störbelichtung des Empfängers erzeugen.

1. Vorrichtung zur fluorometrischen Untersu- Die Fluorometer werden insbesondere zur reproduchung von Proben, bei der die Fluoreszenzstrahlung 5 zierbaren Ermittlung des Chlorophyllgehaltes von in Richtung der Anregungsstrahlung meßbar ist, mit Pflanzen (z. B. Algen) verwendet Durch Auswertung einer Lichtquelle für die Anregungsstrahlung, einem des Fluoreszenzsignals kann zusätzlich eine Aussage Probenbehälter, einem ersten Filter im Strahlengang zur photosynthetischen Aktivität und der Wirkung von vor dem Probenbehälter, das für die Anregungs- Stoffen (z. B. Herbiziden) auf den zeitlichen Verlauf der strahlung durchlässig ist, einem zweiten Filter im 10 Photosynthesereaktion getroffen werden, wenn es mög-Strahlengang nach dem Probenbehälter, das für die lieh ist, die Anregung des Fluoreszenzvorganges mit Fluoreszenzstrahlung durchlässig ist und einer De- ausreichender Intensität impulsmäßig durchzuführen tektor- und Auswerteeinrichtung für die Fluores- und die Einzelimpulse getrennt auszuwerten,
zenzstrahlung, dadurch gekennzeichnet, Chlorophyll wurde mit chemischen Hilfsmitteln exdaß das erste Filter (6) zusätzlich so ausgebildet ist, 15 trahiert und photometrisch gemessen. Dies erfordert daß es die Fluoreszenzstrahlung (5) in den Proben- zahlreiche Arbeitsgänge^ die nur im Labor vorgenombehälter (1) reflektiert, und daß das zweite Filter (7) men werden können. Feldmessungen sind nicht möglich, zusätzlich so ausgebildet ist, daß es die Anregungs- Oder es wurde aus der Fluoreszenz lebender Pflanzen strahlung (3) in den Probenbehälter (1) reflektiert auf den Chlorophyllgehalt geschlossen, dann aber mit

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 20 dem Nachteil, daß die Quantenausbeute der Fluoreszeichnet, daß hinter der Lichtquelle (8) ein zusätzli- zenz in unübersehbarer Weise vom physiologischen Zuches Filter (9) angeordnet ist, welches die Anre- stand abhängt (Govindjee, The Absorption of Light in gungsstrahlung (3) aus der Lichtquelle (8) als auch Photosynthesis, Scientific American, Dez. 1974, Seiten die vom zweiten Filter (7) reflektierte Anregungs- 68—e^Samuelsson.G.etal.Thevariablechlorophyll-astrahlung (3) in Ausbreitungsrichtung (2) der Anre- 25 fluorescense as a measure of photosynthetic capacity in gungsstrahlung reflektiert algae, Mitt Internat Verein Limnol 21, 1978, Seiten

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch 207—209). Diese Abhängigkeit begründet sich im Kongekennzeichnet, daß die Filter (6, 7, 9) plan oder kurenzverhalten von Photosynthese und Fluoreszenz,
sphärisch ausgebildet sind. Die photosynthetische Aktivität wurde bisher durch

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 30 eine chemische Bestimmung der Sauerstoffproduktion dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Licht- oder des Kohlendioxydverbrauches (i. a. durch Markiequelle (8) und dem ersten Filter (6) ein nur für Anre- rung mit radioaktivem ¹⁴C) bestimmt Diese Methoden gungsstrahlung (3) durchlässiges Filter (10) und zwi- erfordern lange Expositionszeiten (einige Stunden) und sehen dem zweiten Filter (7) und der Detektorein- zahlreiche Manipulationen, die nicht im Feld durchgerichtung (4) ein nur für Fluoreszenzstrahlung (5) 35 führt werden können. In »Samuelsson, G. et al, The vadurchlässiges Filter (11) angeordnet ist. nable Chlorophyll-a-fluorescence as a measure of photosynthetic in algae, Mitt Internat. Verein Limnol. 21,

1978, Seiten 207—209« wird aus dem Unterschied der

Fluoreszenz vor und nach der Vergiftung mit DCMU 40 auf die photosynthetische Aktivität geschlossen. Unbe-

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur fluorome- rücksichtigt bleibt, daß der Meßwert vor der Vergiftung

frischen Untersuchung von Proben, bei der die Fluores- noch von der Vorbelichtung und anderen physiologi-

zenzstrahlung in Richtung der Anregungsstrahlung sehen Faktoren abhängig ist, was diese Messung unsi-

meßbar ist, mit einer Lichtquelle für die Anregungs- eher macht.

strahlung, einem Probenbehälter, einem ersten Filter im 45 Herbizidanalysen werden nach einer Vielzahl völlig

Strahlengang vor dem Probenbehälter, das für die An- anderer chemischer Methoden durchgeführt, vornehm-

regungsstrahlung durchlässig ist einem zweiten Filter Hch Extraktion mit nachfolgender gas- oder flüssigchro-

im Strahlengang nach dem Probenbehälter, das für die matrographischer Trennung. Eine andere Methode ist in

Fluoreszenzstrahlung durchlässig ist und einer Detek- der DE-PS 26 26 915 beschrieben,

tor- und Auswerteeinrichtung für die Fluoreszenzstrah- 50 Mit der z. B. in der DE-OS 26 56 417 beschriebenen

lung. Eine derartige Vorrichtung ist aus der DE-OS Vorrichtung sind solche Analysen auch nicht zufrieden-

56 417 oder aus Spectrochemical Methods of Analy- stellend durchführbar. Anregungs- und Meßstrahlung

sis, Wiley-Interscience, 1971, S. 404—405, bekannt stehen im rechten Winkel zueinander, wodurch eine

In einem Fluorometer wird die Probe vom Erreger- gleiche Bewertung aller Teilvolumina der Proben (Unlicht durchstrahlt und gibt dabei Fluoreszenzlicht ab. 55 abhängig von Sedimentation und Homogenität) nicht zu Beides unterliegt innerhalb der Probe einer Absorption erreichen ist.

nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz, was eine un- Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe begleichmäßige Erfassung des Meßvolumens zur Folge steht darin, eine Einrichtung zu bieten, bei der eine möghat. Diese ungleichmäßige Erfassung wurde bisher liehst gleichmäßige Durchstrahlung mit Erregerlicht HiirnK ctapL·« Vep/4iinnan Aai· Drnka auf "ΓΐβΓι>^α'Μΐ'^ΛΗ^Α ^£Λ uri^ ^leiche Bewertu··** »!!sr TsuvolujniTiii bsi «er Erfss-Werte abgeschwächt. Darunter leidet die Nachweis- sung des Fluoreszenzlichtes sich ergibt (Unabhängig grenze (Christoffers, D., Fluorometrische Lysinbestim- von Sedimentation und Homogenität), wobei Erregermung in Getreidemehlen Diss. Hannover 1976, S. 12 ff). und Fluoreszenzlicht nahezu verlustfrei ausgenutzt Eine fast vollständige Ausnützung von Erreger- und werden und mit geringer Erregerlichtenergie ausge-Fluoreszenzlicht war bisher unmöglich, da, um den Hin- 65 kommen werden kann, so daß keine Ausbleicheffekte tergrund dunkel zu halten, Erreger- und Meßstrahlen- entstehen und der Chlorophyllgehalt, die photosynthetigang im rechten Winkel zueinander standen. Durch- sehe Aktivität und/oder der Verlauf der Photosyntheselichtstrahlengänge haben den Nachteil, daß Reste des reaktion auch in natürlichen, unaufbereiteten Populatio-