DE69426965T2

DE69426965T2 - Test zum Nachweis von Toxizität

Info

Publication number: DE69426965T2
Application number: DE69426965T
Authority: DE
Inventors: James T. Blankemeyer
Original assignee: Oklahoma State University
Current assignee: Oklahoma State University
Priority date: 1993-11-15
Filing date: 1994-11-14
Publication date: 2001-07-05
Anticipated expiration: 2014-11-15
Also published as: EP1035412A2; US5416005A; DK0653633T3; US5459070A; ATE200149T1; ES2155084T3; DE69426965D1; EP0653633A3; EP0653633B1; EP0653633A2; CA2134636A1; CA2134636C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich insgesamt auf eine wäßrige Toxizitätsprüfung und genauer, jedoch nicht in einschränkender Weise, bezieht sie sich auf Verbesserungen sowohl eines Verfahrens als auch einer Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung flüssiger Proben durch Quantifizierung der Wirkungen der jeweiligen Probe auf Daphnia sp. oder andere in Wasser lebende Gattungen.
Zum Stand der Technik gehören mehrere Arten bzw. Typen von Prüfverfahren zum Bestimmen wäßriger Toxizität und in den meisten Fällen versuchen die bekannten Verfahren, ein quantifizierbares Ergebnis herzuleiten, beispielsweise WO-A-90112886. Ein unter dem Namen chronischer oder dauerhafter Gesamtabwassertoxizitätstest (Whole Effluent Toxicity (WET) Test) bekanntes System ist ein relativ wirtschaftliches Toxizitätsprüfsystem, das vom EPA zugelassene Verfahren und Testorganismen verwendet; ein solches System ist jedoch nur sehr begrenzt transportierbar und erfordert zur Durchführung eines einzelnen Tests 7 Tage. Dieses biologische Testverfahren verwendet repräsentative Organismen, um die Wirkungen von abgegebenen Abwässern oder aufgenommenen Wässern auf das Ökosystem abzuschätzen.
Ein anderes Prüfsystem, das unter dem Namen MICROTOX® Toxizitätstest bekannt ist, verwendet die Luminiszenz-Meeresmikroorganismen, die durch Änderungen in ihren metabolischen Prozessen hinsichtlich ihrer Lichtemission verändert werden. Die Verminderung des Lichts ist proportional zur Toxizität der Probe. Ein Testreagenz, das die Mikroorganismen enthält, wird zur Aufbewahrung gefriergetrocknet und wird dann zur Prüfung in einer sehr kurzen Zeit in einfacher Weise wieder hergestellt. Schließlich macht ein Toxizitätstest, der unter dem Namen IQ Test KitTM bekannt ist, ein niederpreisiges Testsystem verfügbar, jedoch ein System, das keine quantifizierbaren Ergebnisse erzeugt.
Dieser Test erfordert einen anfänglichen Ansatz der Testprobe mit Organismen für eine nachfolgende Bestrahlung mit ultraviolettem Licht (langweilig). Die verfügbaren Testdaten werden dann mittels anderer herkömmlicher Versuchsverfahren interpretiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte Art eines Toxizitätstestsystems, das in der Lage ist, rasch quantitative/qualitative Ergebnisse zu erzeugen. Das vorliegende System wird im Handel "DAPHNIAQUANTTM" genannt und das System ist so aufgebaut, daß schädliche Wirkungen auf einen ausgewählten Organismus (Organismen) ausgewertet werden, die toxischen Substanzen, wie verunreinigtem Wasser, Schlamm und ähnlichem ausgesetzt werden. Der Zustand des Organismus drückt sich in den kurzfristigen bzw. kurzzeitigen Veränderungen der Gesundheit der Zellen aus, die den Organismus enthalten. Das Versuchssystem funktioniert derart, daß das Membranpotenial von Zellen der betroffenen bzw. beeinflußten Organismen mittels eines spannungsempfindlichen Farbstoffs, das heißt eines elektrochromen Farbstoffs, ausgewertet wird, um das Membranpotential optisch in Fluoreszenzemissionen umzuwandeln. Die Fluoreszenzemissionen werden dann photoelektrisch detektiert und für eine Eingabe in einen zugehörigen Computer verarbeitet, der derart programmiert ist, daß die Ausgabe der erforderlichen Antwort in Form von quantitativen/qualitativen Daten erfolgt.
Die der Testprobe ausgesetzten Organismen sind in einer Küvette enthalten, woraufhin ein Lichtstrahl aus einer Quarzhalogenlampe zeitweilig in einzelne Farbblinke bzw. -blitze von abwechselnd gelben und blauen Lichtstrahlen zur Bestrahlung der Küvette getrennt wird. Die Küvette enthält weiter einen ausgewählten elektrochromen Farbstoff, der bei Beleuchtung mit der alternierend gelben und blauen Beleuchtung fluoresziert, um mit einer ausgewählten Frequenz zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz ist ein Indikator des Zellmembranpotentials (für Fluoreszenz mit blauem Licht) und die Menge des Farbstoffs, der fluoresziert (für Fluoreszenz mit gelbem Licht). Die Analyse und das Auftragen einer erfaßten Änderung eines Fluoreszenzemissionsverhältnisses aus den beiden Anregungsfarben schafft dann eine Ausgabe von quantifizierten Daten, die die Toxizität der Testprobe darstellen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher darin, ein Toxizitätstestsystem zu schaffen, das tragbar, von geringem Gewicht und in der Lage ist, Tests innerhalb minimaler Zeit durchzuführen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Toxizitätsprüfung geschaffen, das enthält:
Einbringen einer flüssigen Testprobe in eine transparente Küvette;
Zugeben einer Menge des elektrochromen Farbstoffes Di-4-ANEPPS oder Di-8- ANEPPS, der ein Dialkylaminostyrl-pyridinium-sulfonat-Farbstoff ist, zu der flüssigen Testprobe;
Zugeben einer Mehrzahl von lebenden Organismen mit einem Membranpotential und von der Spezies Daphnia umfassend Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia affinis und Daphnia pulex zu der Testprobe;
Beleuchten der Küvette mit blauem Licht mit einem auf 470 Nanometer Wellenlänge zentrierten Durchlaßbereich;
periodisches und alternierendes Befeuchten der Küvette mit gelbem Licht mit einem auf 580 Nanometer Wellenlänge zentrierten Durchlaßbereich:
Erfassen einer ersten Fluoreszenz, die auf das blaue Licht hin bei einer Wellenlänge von 620 Nanometern emittiert wird, als ein Maß des Membranpotentials der lebenden Organismen;
Erfassen einer zweiten Fluoreszenz, die auf gelbes Licht hin bei einer Weitenlänge von 620 Nanometern emittiert wird, als ein Maß der gesamten Farbstofffluoreszenz;
Bestimmen der jeweiligen ersten und zweiten emittierten Fluoreszenz und Zuordnen von Werten dazu; und
Anzeigen der erfaßten ersten und zweiten Fluoreszenzwerte als ein Verhältnis über ein vorbestimmtes Zeitintervall und Beobachten einer Änderung des Verhältnisses als ein Maß der Toxizität der Flüssigkeitsprobe.
Die Zeichnung ist ein funktionales Blockdiagramm des Versuchssystems.
Das Versuchssystem der vorliegenden Erfindung verwendet einen speziellen Testorganismus bzw. spezielle Testorganismen in Verbindung mit ausgewähltem Fluoreszenzfarbstoffmaterialien, um die erforderlichen Anzeigen zu liefern. Die Testorganismen können lebende Daphnia magna oder verwandte Organismen sein, wie Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia affinis, und Daphnia pulex, und es gibt eine Anzahl von Amphibienembryos und im Wasser lebender Insekten, die verwendet werden können. Diese Indikatortestorganismen werden dann in Wasser mit geeignetem Salzgehalt eingebracht und ein elektrochromer Farbstoff, Di-4-ANEPPS oder Di-8-ANEPPS wird in das vorbereitete Wasser eingebracht. Die Farbstoffe können kommerziell in geeigneter Reinheit und Konsistenz erhalten werden und jeder ist aktuell ein elektrochromer fluoreszierender Farbstoff. Die Chemistry Abstracts Registriernummern und die Namen der Farbstoffe sind: Di-4-ANEPPS-90134-00-2 Pyridinium, 4-[2-(6-dibutyl- amino)-2-naphtalenyl]ethenyl-1 (3-sulfopropyl)-, Hydroxid, inneres Salz; und Di- 8-ANEPPS ist ein neues Analog von Di-4-ANEPPS, dem noch kein Chemical Abstracts-Registriername zugeteilt ist. Die Farbstoffe haben positive und negative Ladungen, so daß der Farbstoff in der Membranschicht des Organismus verteilt wird, und Fluoreszenzänderungen direkt in Abhängigkeit von Änderungen des Membranpotentials erfolgen.
Fig. 1 zeigt das Versuchssystem 10, das eine Beleuchungssektion 12 und eine Bearbeitungssektion 14 enthält. Die Beleuchtungssektion 10 enthält ein drehendes Filterrad 16, das aufeinanderfolgende, zeitweilig getrennte Farbblitze bzw. -blinke erzeugt, die dann zur Untersuchung der Probe innerhalb einer Küvette 18 verwendet werden, und Ausgangsdaten werden in der Bearbeitungssektion 14 erfaßt und bearbeitet, wie im folgenden beschrieben wird.
Eine Quarzhalogenlampe 20, beispielsweise eine 75-Watt-Lampe handelsüblicher Bauart, erzeugt einen nichtkollimierten bzw. nicht parallel gerichteten Lichtstrahl 22, der durch eine asphärische Linse 46 gerichtet wird, die den Lichtstrahl sammelt und auf eine äußere radiale Stelle des Filterrades 16 kollimiert bzw. richtet. Das Filterrad 16 ist eine idealisierte Darstellung mit einer quadratischen Anordnung von filternden und opaken bzw. undurchsichtigen Bereichen, d. h. undurchsichtige Bereiche 24 und 26 sind an sich gegenüberliegenden Stellen angeordnet und ein blauer Filterbereich 28 ist gegenüberliegend einem gelben Filterbereich 30 angeordnet. Das Filterrad 16 wird mittels einer zentral angeschlossenen Antriebswelle 32 von einem Antriebsmotor 34 angetrieben, der seine Antriebsstromversorgung von einer Motorsteuerschaltung 36 erhält.
Der Antriebsmotor 34 kann ein Gleichstrommotor sein, wie er handelsüblich als Escap Type N28 von der Portescap Corp. New York, erhältlich ist. Der spezielle Motor, Series 213E ist erhältlich und liegt in einem 9 Volt-System. Der Antriebsmotor 34 wird von der Motorsteuerschaltung 36 angesteuert, die eine integrierte Schaltung von Motorola ist, die als Leistungsschaltregler der Bauart MC34166 bezeichnet wird, und eine freischwingende Schaltung erzeugt das Motorantriebsausgangssignal auf der Leitung 38.
Das Filterrad 16 wird auf diese Weise angetrieben, um über einen insgesamt kollimierten Lichtstrahl 44 alternierende Perioden von blauem und gelbem Licht zu erzeugen, zwischen denen dunkle Perioden liegen. Die hellen Perioden werden in zwei spezifische Wellenlängen von Filtern unterteilt, die integral mit dem Filterrad ausgebildet sind; der blaue Filterbereich 28 läßt ein blaues Lichtband durch, das auf 470 Nanometer zentriert ist, während der gelbe Filterbereich 30 ein Band durchläßt, das auf 580 Nanometer zentriert ist.
Die Küvette 18 ist ein aus klarem Glas bestehender, quadratischer Behälter, der auf geeignete Weise innerhalb eines Probenhalters 50 an einer Stelle derart gehalten ist, daß sie von dem Strahl 44 maximal beleuchtet wird. Die Küvette 18 enthält eine Probe mit einer Mehrzahl ausgewählter Daphnia-Gattungen oder anderen Organismen, die lebend darin schwimmen, d. h. in der Größenordnung von 6 bis 15 Daphnia magnia, Ceriodaphnia, Daphinia pulex oder andere ausgewählten Organismen, für die ein Standard vorhanden ist. Weiter wird elektrochromer Farbstoff in die Probe in eine Menge eingebracht, so daß eine Konzentration von 1 mg/l vorliegt. Fluoreszenzemissionen werden längs einer Linie erfaßt, die einen Winkel 90 Grad mit dem einfallenden Lichtstrahl 44 bildet. Fluoreszenzemissionen erscheinen somit längs eines Strahls 52 durch einen Interferenzfilter 58 hindurch auf einem Photomultiplier 60. Das Interferenzfilter 58 wird im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt, Fluoreszenzemissionen einer spezifischen Wellenlänge durchzulassen, beispielsweise ein um 620 Nanometer zentriertes Durchlaßband.
Die erfaßten Emissionsereignisse werden von dem Photomultiplier 60 als Impulse ausgegeben, die in einen Verstärker 62 gelangen und weiter einem Ana- Iog/Digitalwandler 64 zugeführt werden. Digitale Impulsanzeigen werden dann über die Leitung 66 dem Computer 42 eingegeben, der derart programmiert ist, daß er die erforderliche Verarbeitung durchführt, um sowohl erstens das Membranpotential der beeinflußten Organismenzellen und zweitens die Menge an Farbstoff zu bestimmen, die insgesamt fluoresziert. Weiter schafft die photoelektrische Zählung der Dunkelperioden, d. h. während der undurchsichtigen Filterbereiche 24 und 26 des Filterrades 16, eine Dunkelstromanzeige des Photomultipliers 60, die eine Herleitung einer Hintergrundzählung ermöglicht, die ständig von den auftretenden Fluoreszenzzähldaten abgezogen werden können. Der Computer 42 kann weiter geeignete Periphergeräte, wie eine Anzeige 68 und einen Drucker 70 enthalten, die zur Anzeige der Testergebnisse dienen.
Das Protokoll für das Test- bzw. Versuchssystem 10 ist in der Software in dem Computer 42 enthalten. Um eine Analyse zu beginnen, wird die Küvette 18 mit der Probe gefüllt, der weiter 6 bis 16 lebende Daphniaorganismen zugesetzt werden, woraufhin der Probe der elektrochrome Farbstoff in handelsüblicher Qualität zugefügt wird, bis die Konzentration 1 mg/l beträgt. Der Farbstoff tritt in die Plasmamembran der meisten Zellen jedes der Organismen ein und die Probe ist fertig für die Prüfung.
Die Lampe 20 wird in Betrieb gesetzt und der Anschlußmotor 24 wird auf geeignete Drehzahl gebracht, um das Filterrad zu drehen, das einen alternierenden Beleuchtungslichtstrahl 44 mit der Charakteristik dunkel/gelb/dunkel/blau Beleuchtung mit einer vorgewählten Wiederholrate hat. Wenn die alternierenden gelben und blauen Blinke von Licht im Strahl 44 in die Küvette 18 eintreten, regen sie Fluoreszenz an, die in einem Winkel 90 Grad längs der Strahllinie 52 durch ein Interferenzfilter 58 hindurch auf dem Photomultiplier 60 aufscheint. Die in die Küvette 18 eintretende Blauchlichtphotonen mit einem auf 470 Nanometer zentriertem Lichtband bewirken, daß die Zellen der Organismen innerhalb der Küvette 18 eine Fluoreszenz aussenden, die proportional zum Membranpotential derjenigen Zellen ist, die den Farbstoff enthalten, Die Fluoreszenz nimmt mit einer Hypopolarisation des Membranpotentials zu. Ein nächst nachfolgender Blink von gelbem Licht in einem Band, das auf 580 Nanometer zentriert ist, beleuchtet die Organismen ebenfalls, und die einzelnen, den Farbstoff enthaltenen Zellmembranen fluoreszieren proportional zur Gesamtmenge von Farbstoff, der fluoresziert, entsprechend wie er in der Plasmamembran verteilt ist. Das heißt, der Farbstoff fluoresziert proportional zur Farbstoffkonzentration und unabhängig vom Membranpotential.
Die Dunkelperiode zwischen aufeinanderfolgenden Farbblinken dient dazu, einen Dunkelstrom des Photomultipliers 60 zur Verfügung zu stellen, und dies ermöglicht, daß eine Hintergrundzählung für eine kontinuierliche Subtraktion von dem blauen und gelben Datenzählungen vorhanden ist. Diese Subtraktion kann innerhalb des Computers 42 stattfinden, wodurch für jede Zeitperiode aus dem Analog/Digitalwandler 64 digitale Werte hergeleitet werden. Der Computer 42 subtrahiert den Dunkelstrom und korrigiert die Impulszählungen sowohl für die blauen als auch für die gelben Filterperioden. Bei der Verarbeitung kann eine vollständige Photonenzählperiode in der Größenordnung von 20 Sekunden mit Erfassung und Speicherung der blauen und gelben Zählimpulse betragen, woraufhin die akkumulierten Impulse analysiert werden, um die Größe der Fluoreszenz der Organismen innerhalb der Küvette 18 zu bestimmen, und diese Zähldaten werden weiter in einem Speicher innerhalb des Computers 42 gespeichert.
Nach der Inkubationszeitdauer von 5-15 Minuten kann das Membranpotential oder die Blaulichtantwort der Zellen innerhalb der Organismen gemessen werden, aufsummiert werden, gemittelt werden und an der Anzeige 68 bzw. dem Drucker 70 angezeigt bzw. ausgedruckt werden. Insgesamt bestehen die Ergebnisse eines Probetests in einem Datenstrom von Fluoreszenz über die Zeit und der Datenstrom enthält eine Anzeige der Kontrolle ohne toxische Substanzen und des Effektes der toxischen Substanz auf die Organismen.
Ein schädlicher bzw. schädigender Effekt der Testprobe auf dem Testorganismus innerhalb der Küvette 18 wird durch eine Änderung der Fluoreszenzemission festgestellt, d. h. eine Änderung im Verhältnis zwischen den beiden Erregerfarben, blau und gelb. Die meisten Verbindungen bewirken eine Vergrößerung der Fluoreszenz, als Hypopolarisation bezeichnet; jedoch bewirken einige Verbindungen, wie wäßrige Organika eine Hyperpolarisation. Diese Änderung im Membranpotential tritt rasch auf, innerhalb von 5 Minuten für viele Verbindungen. Jede Änderung des Membranpotenials aufgrund der Toxizität in der Probe, gemessen durch die Fluoreszenz des Farbstoffs, folgt einer Konzentrationsantwortbeziehung. Das heißt, größere Konzentrationen von toxischen Stoffen in der Probe erzeugen größere Antworten in direkter Proportionalität und diese Eigenschaft ermöglicht einen Vergleich der relativen Toxizität zwischen verschiedenen Probenmengen.
Vorstehend wurde eine neue Form eines Versuchsprobentestsystems für eine quantitative/qualitative Toxizitätsprüfung unter Verwendung von Testorganismen aus der Spezies Daphnia und anderen Organismen beschrieben. Das System leitet zelluläre Anzeigen der Gesundheit des Testorganismus her und dadurch kann es rasch das Versuchsergebnis vorhersagen. Das Probensystem ist in der Lage, optische Messungen von zellulären Eigenschaften der Organismen zu verwenden und die Messungen werden während einer vorbestimmten zeitlichen Beaufschlagung durchgeführt, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, um die Antwort auf Gifte bzw. toxische Gifte zu quantifizieren. Das erfindungsgemäße Probensystem ist verläßlich und benutzerfreundlich und das Gerät ist ausreichend kompakt und leichtgewichtig, so das tragbare, batteriebetriebene Einheiten und mit kompakten, Laptop-Computern an jedwelcher Stelle verwendet und benutzt werden können. Das Proben- bzw. Versuchssystem ist sehr vielseitig verwendbar, da es für die Identifikation von Toxizitätsquellen, zum Überwachen von Sturmwassertoxizität, für Toxizitätsmessungen des Grundwassers, für eine rasche Prüfung der Toxizität reiner Verbindungen oder in Anpassung an jedwelche einer Vielzahl von Toxizitätsprüfarten und Umgebungen benutzt werden kann.

Claims

1. Verfahren zur raschen Toxizitätsprüfung einer Flüssigkeitsprobe, enthaltend:

Einbringen einer flüssigen Testprobe in eine transparente Küvette;

Zugeben einer Menge des elektrochromen Farbstoffes Di-4-ANEPPS oder Di-8- ANEPPS, der ein Dialkylaminostyrl-pyridinium-sulfonat-Farbstoff ist, zu der flüssigen Testprobe;

Zugeben einer Mehrzahl von lebenden Organismen mit einem Membranpotential und von der Spezies Daphnia umfassend Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia affinis und Daphnia pulex zu der Testprobe;

Beleuchten der Küvette mit blauem Licht mit einem auf 470 Nanometer Wellenlänge zentrierten Durchlaßbereich;

periodisches und alternierendes Beleuchten der Küvette mit gelbem Licht mit einem auf 580 Nanometer Wellenlänge zentrierten Durchlaßbereich:

Erfassen einer ersten Fluoreszenz, die auf das blaue Licht hin bei einer Wellenlänge von 620 Nanometern emittiert wird, als ein Maß des Membranpotentials der lebenden Organismen;

Erfassen einer zweiten Fluoreszenz, die auf gelbes Licht hin bei einer Wellenlänge von 620 Nanometern emittiert wird, als ein Maß der gesamten Farbstofffluoreszenz;

Bestimmen der jeweiligen ersten und zweiten emittierten Fluoreszenz und Zuordnen von Werten dazu; und

Anzeigen der erfaßten ersten und zweiten Fluoreszenzwerte als ein Verhältnis über ein vorbestimmtes Zeitintervall und Beobachten einer Änderung des Verhältnisses als ein Maß der Toxizität der Flüssigkeitsprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Beleuchtung der Küvette während Perioden zwischen der Beleuchtung mit blauem Licht und mit gelbem Licht unterbrochen wird, um das Erfassen einer Dunkelstromanzeige zu ermöglichen für eine Verwendung der Hintergrundkorrektur der jeweiligen ersten und zweiten Fluoreszenzwerte.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, wobei das Di-4-ANEPPS oder das Di- 8-ANEPPS der flüssigen Testprobe in einer Konzentration von etwa 1 mg/l zugefügt wird.