DE19930607A1 - Verfahren und Apparatur zum Gewinnen von Daten für die Bestimmung der Reaktionskinetik - Google Patents

Abstract

Zur Gewinnung von Daten über die Reaktionskinematik wird der Ablauf von Reaktionen in einer oder mehreren Proben von Zusammensetzungen an einer Vielzahl diskreter Meßorte optisch überwacht. Erfindungsgemäß werden zur Registrierung der Lichtsignale aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils der Gesamtheit der Meßorte während der zu erwartenden Dauer der ablaufenden Reaktionen aufgenommen. Die Auswertung der Lichtsignale erfolgt durch Analyse der die Meßorte wiedergebenden Bildausschnitte der aufgenommenen Einzelbilder.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zum Gewinnen von Daten, die Aufschluß über die Reaktionskinetik in Zusammensetzungen geben, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. des Anspruchs 15.

Die Kinetik chemischer Reaktionen wird üblicherweise anhand meßbarer physikalischer Eigenschaften verfolgt, die sich abhängig von der Konzentration bestimmter Reaktanten oder des Endproduktes der Reaktion in der jeweils beobachteten Zusam­ mensetzung ändern. Gebräuchlich sind insbesondere photometri­ sche Messungen im Bereich sichtbaren oder ultravioletten Lichtes zur Erfassung von Fluoreszenz, Lumineszenz und opti­ scher Eigenschaften wie z. B. des Lichtabsorptionsvermögens in ausgewählten Spektralbereichen, häufig unter Verwendung von Indikatorfarbstoffen. Um das jeweils zu messende Licht hervorzurufen, kann die beobachtete Probe der Zusammensetzung mit anregender Strahlung (z. B. UV-Licht zur Anregung von Fluoreszenz oder Lumineszenz) oder mit dem erforderlichen Einfallslicht (zur Messung der Absorption) bestrahlt werden. Das zu messende Licht kann aber auch Licht sein, das in der Zusammensetzung originär erzeugt wird und dessen Intensität sich in charakteristischer Weise während des Reaktionsablaufs ändert, wie dies als Chemolumineszenz bekannt ist.

Wird die Reaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß untersucht, kann das der Reaktion entsprechende physikalische Signal in einfacher Weise unter ununterbrochener Beobachtung durch ein Photometer unmittelbar registriert werden. Soll die Reaktion im Sinne eines großen Durchsatzes, wie es im Rahmen von Suchtests (Screening) notwendig ist, mehrfach mit unterschied­ licher Zusammensetzung untersucht werden, bedient man sich üblicherweise sequentieller Verfahren unter Verwendung mehre­ rer Reaktionsgefäße. Als Reaktionsgefäße werden üblicherweise handelsübliche Küvetten, Mikrotiterplatten aber auch verschie­ dene Trägermaterialien genutzt, die sowohl einer kinetischen Signalregistrierung zugänglich als auch zur Durchführung der chemischen Reaktion geeignet sind.

Bei einer ersten Variante sequentieller Verfahren läßt man die chemische Reaktion nacheinander in den verschiedenen Reak­ tionsgefäßen ablaufen, und das zur Lichtmessung verwendete Photometer wird nacheinander an den einzelnen Gefäßen einge­ setzt. Die zur Bewertung einer chemischen Reaktion in einem Reaktionsgefäß notwendige Registrierdauer wird also vollstän­ dig für die Registrierung nur dieser Reaktion aufgewendet. Nach Beendigung dieser Registrierung wird der Vorgang separat mit dem nächsten Reaktionsgefäß durchlaufen. Dies wird wieder­ holt, bis die Reaktion in allen Reaktionsgefäßen registriert wurde. Die Gesamtmeßzeit dieser Verfahren setzt sich hier hauptsächlich zusammen aus der Summe aller einzelnen Regi­ strierdauern. Die Anzahl der Meßpunkte je Zeiteinheit, die zur Auswertung der kinetischen Reaktion zur Verfügung stehen, wird ausschließlich durch das Meßgerät bestimmt und liegt bei gebräuchlichen Photometern im Bereich von 10 bis 100 Meßpunk­ ten je Sekunde. Nachteil dieses Verfahrens ist die notwendige lange Meßzeit für eine große Anzahl von Proben.

Bei anderen sequentiellen Verfahren wird, zur Verkürzung der Gesamtmeßzeit, die zu beobachtende Reaktion in allen Reak­ tionsgefäßen so zeitversetzt gestartet, daß während Reaktions­ ablaufes in einem Reaktionsgefäß bereits die Reaktion im jeweils nächsten Reaktionsgefäß beginnt. Die Reaktionsabläufe werden hierbei beobachtet, indem die jeweiligen Meßorte, also die einzelnen Reaktionsgefäße, nacheinander, entsprechend dem Maß der Startzeitversetzung, vom Photometer zur Meßwertnahme anvisiert werden und diese Folge zyklisch wiederholt wird, bis zum Ende der zuletzt gestarteten Reaktion. Die Gesamtmeßzeit dieser Verfahren setzt sich hauptsächlich zusammen aus der Zeitdifferenz zwischen dem Meßbeginn am ersten Meßort und dem Meßbeginn am letzten Meßort (Summe der Startzeitversetzungen) und der Meßdauer für eine einzelne Reaktion.

Während das zuletzt beschriebene Verfahren die Gesamtmeßzeit also deutlich verkürzen kann, ist die zeitliche Auflösung der Messungen begrenzt durch die Geschwindigkeit, mit welcher von Meßort zu Meßort gegangen werden kann. Gebräuchliche Photome­ ter erreichen bei der Registratur von Kinetiken in Titerplat­ ten mit 96 Kavitäten Geschwindigkeiten von bis zu 2 Meßpunkten je Sekunde. Hinzu kommt, daß der zeitliche Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Meßwertnahmen am jeweils selben Meßort von der Anzahl der Meßorte (also der Anzahl der Reaktions­ gefäße) abhängt. Die Anzahl der Meßwertnahmen je Zeiteinheit bestimmt aber bei vorgegebenem Meßsignal im wesentlichen die Qualität der Beurteilung der registrierten chemischen Reaktion.

Allen vorstehend genannten Verfahren ist gemeinsam, daß für die räumliche Anordnung der Reaktionsgefäße bzw. Meßorte ein bestimmtes Format vorgegeben werden muß. Dies kann von Nach­ teil sein, wenn die Anordnung von Reaktionsgefäßen verändert werden soll oder wenn sich die räumlichen Anordnungen der Proben in nicht vorhersehbarer Weise ändern. Dies kann z. B. bei Verwendung von Trägermaterialien wie Zellulosematrizen, bei denen einzelne Spots als Reaktionsgefäße bzw. Meßorte benutzt werden, durch die Einwirkung wäßriger Medien auf diese Trägermaterialien in unerwünschter Weise vorkommen.

Ein weiterer Nachteil kommerziell üblicher Methoden zur Kinetikbestimmung sind die verwendeten Bewertungsverfahren. Obwohl bei nichtlinearen Reaktionskinetiken der Signal/Zeit- Quotient nicht konstant ist, läßt die begrenzte zeitliche Auflösung der Meßwertnahme keine entsprechende Selektion der Meßzeitpunkte zu, so daß die Auswertung stets anhand zeitlich äquidistanter Meßpunkte erfolgen muß.

Die bisher bekannten Geräte zur maschinellen optischen Beob­ achtung von Reaktionsabläufen haben zudem den Nachteil, daß jedes Photometer nur einen globalen Lichtmeßwert liefert, der charakteristisch für die Gesamtintensität des von der Probe abgestrahlten Lichtes ist. Häufig ist es jedoch auch die räum­ liche Verteilung der Lichtintensität innerhalb einer Probe, die sich zeitlich mit dem Reaktionsablauf ändert und zur Bestimmung der Reaktionskinetik aufschlußreich sein kann. So gibt es Reaktionen, zu deren Eigenart es gehört, daß sich charakteristische Muster durch sichtbare Konzentrations­ inhomogenitäten im betreffenden Reaktionsgefäß ausbilden.

Bei Agglutinationen, z. B. bei der Hämagglutination von Erythrozyten, wie sie zur Prüfung der Verträglichkeit von Bluttransfusionen benutzt wird, können diese Konzentrations­ inhomogenitäten z. B. zur Ausbildung charakteristischer konzen­ trischer Ringe führen. Beim Wachstum von Zellkolonien auf ge­ eigneten Kulturmedien können sich durch die Wirkung lytischer Enzyme an der Oberfläche dieser Kolonien auf das Kulturmedium oft schon mit bloßem Auge sichtbare Ringe, sogenannte "Höfe", ausbilden.

Zur Sichtbarmachung solcher Zellkolonien sind zahlreiche Indikatorreaktionen bekannt, z. B. unter Verwendung von pH- Indikatoren, die das sich um die Zellkolonien ändernde pH- Milieu sichtbar machen. Andere Verfahren wiederum nutzen immunologische Methoden oder aber auch ganz spezielle Nach­ weisverfahren, um Unterschiede zwischen verschiedenen Zell­ kolonien sichtbar zu machen. Diese Unterschiede können in der Verschiedenartigkeit der Kulturen selbst begründet sein; sie können aber auch durch die Verwendung unterschiedlicher Ein­ flußfaktoren auf die Zellkulturen hervorgerufen werden, z. B. durch unterschiedliche Zusätze zum Kulturmedium.

All diesen Methoden ist gemeinsam, daß sich visuell unter­ scheidbare Muster zeitabhängig ausbilden können. Mit spek­ troskopischen Verfahren, die nur global die Änderung des Gesamtlichtsignals an einem Raktionsgefäß erfassen, sind die genannten Musteränderungen nicht mit befriedigender Orts- und Zeitauflösung zu erfassen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Technik vorzuse­ hen, die es erlaubt, Daten über die Reaktionskinetik durch photometrische Beobachtung einer Vielzahl von Meßorten mit hoher zeitlicher Auflösung zu gewinnen, wobei weder die Auflö­ sung noch die Gesamtmeßzeit nennenswert von der Anzahl der Meßorte abhängt. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 beschriebene Verfahren und durch die im Anspruch 15 beschriebene Apparatur gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Gewin­ nung von Daten, die Aufschluß über die Reaktionskinetik in einer oder mehreren Zusammensetzungen geben, wobei der Ablauf von Reaktionen in einer oder mehreren Proben von Zusammenset­ zungen an einer Vielzahl diskreter Meßorte optisch überwacht wird und die dabei detektierten Lichtsignale registriert und ausgewertet werden. Erfindungsgemäß werden zur Registrierung der Lichtsignale aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils der Gesamtheit der Meßorte während der zu erwartenden Dauer der ablaufenden Reaktionen aufgenommen, und die Auswertung der Lichtsignale erfolgt durch Analyse der die Meßorte wiederge­ benden Bildausschnitte der Einzelbilder.

Eine erfindungsgemäße Apparatur zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß über die Reaktionskinetik in Zusammensetzungen geben, enthält eine Gefäßeinrichtung zur Aufnahme einer oder mehrerer Proben von Zusammensetzungen und eine Sensoreinrich­ tung zum selektiven Registrieren des von verschiedenen Meß­ orten am Inhalt der Gefäßeinrichtung abgestrahlten Lichtes. Erfindungsgemäß enthält die Sensoreinrichtung eine Bildaufnah­ meeinrichtung, deren Gesichtsfeld zum gleichzeitigen über­ blicken der verschiedenen Meßorte angeordnet ist, um die Meßorte an unterschiedlichen Stellen der Bildaufnahmefläche abzubilden, und die zur Aufnahme aufeinanderfolgender Einzel­ bilder steuerbar ist. Des weiteren sind Verarbeitungsmittel vorgesehen, um aus denjenigen Bestandteilen von Bildsignalen, welche während Rasterabtastungen aufeinanderfolgend aufgenom­ mener Einzelbilder jeweils bei Abtastung der die einzelnen Meßortabbildungen enthaltenen Rasterbereiche erzeugt werden, für jeden Meßort zeitlich aufeinanderfolgende Lichtmeßwerte zu bilden.

Vorteilhafte Ausführungsformen und Ausgestaltungen der Erfin­ dung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Durch die erfindungsgemäße Bildaufnahme können Lichtsignale von einer Vielzahl verschiedener Meßorte nahezu gleichzeitig und in schneller Folge registriert werden. Die Lichtsignale lassen sich als Bildsignale mittels üblicher Aufzeichnung auf üblichen Datenträgern sichern.

Als Bildaufnahmeeinrichtung kann im Grunde jede Einrichtung verwendet werden, die in der Lage ist, aufeinanderfolgende Einzelbilder der Gefäßeinrichtung so aufzunehmen, daß sich hieraus verarbeitbare Bildsignale ableiten lassen. Vorzugs­ weise wird eine Videokamera verwendet, die während der zu erwartenden Reaktionsdauer in der üblichen Weise zur periodi­ schen Abtastung ihres Bildrasters betrieben wird, um die auszuwertenden Bildsignale direkt als Videosignale zu erzeu­ gen. Brauchbar ist aber auch eine elektronische Kamera, die aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils als Standbild nach jeweiliger Einzel-Auslösung aufnimmt und entsprechende elek­ trische Bildsignale liefert. Die zur Auswertung heranzuziehen­ den Meßwerte können in diesen beiden Fällen in Realzeit "live" aus Bildsignalen schon während des Betriebs der Kamera abge­ leitet werden; die Meßwerte können aber auch, was in vielen Fällen vorzuziehen ist, aus einer Aufzeichnung der elektri­ schen Bildsignale abgeleitet werden. Im Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, die Einzelbilder mittels einer Laufbild- oder Einzelbildkamera auf ein photoempfindliches Medium wie z. B. einen Film aufzuzeichnen, das dann (nach Entwicklung und Fixierung) zur Erzeugung verarbeitbarer elektrischer Signale mittels eines Scanners abgetastet wird.

Die Anzahl der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beobacht­ baren Meßorte wird durch das Auflösungsvermögen der verwende­ ten Bildaufnahme- bzw. Abtasteinrichtung bestimmt. Bereits das Auflösungsvermögen relativ billiger Videokameras von einigen hunderttausend Pixeln pro Vollbild kann gut ausreichen, die Reaktionen an mehr als hundert verschiedenen Meßorten gleich­ zeitig photometrisch zu registrieren. Die Vielzahl der Meßorte können Proben von Zusammensetzungen in einer entsprechenden Vielzahl von Reaktionsgefäßen sein, es können aber auch ver­ schiedene Orte in einer Probe sein, z. B. um die zeitliche Änderung der räumlichen Verteilung der Lichtintensität inner­ halb der Probe zu messen.

Es wurde überraschend gefunden, daß die Signale etwa einer Videoaufnahme, wie sie vorzugsweise genutzt wird, eine weitge­ hend lineare Abhängigkeit zwischen Konzentration eines Indika­ torfarbstoffes in einer Probe und dem Farbwert des Video­ signals der betreffenden Probenabbildung besitzen. In den meisten Fällen können also Pixelwerte des Videosignals in linearem Maßstab die Farbstoffkonzentration anzeigen, was die Auswertung sehr vereinfacht. In davon abweichenden Fällen kann man eine nichtlineare Abhängigkeit durch Mitführen geeigneter Konzentrationsreihen berücksichtigen: Durch Anpassen nicht- linearer Kurven mittels geeigneter Verfahren, wie z. B. mittels einer Spline-Funktion, kann diese Abhängigkeit mathematisch definiert werden. Diese Funktion kann dann weiterhin genutzt werden um die unmittelbar durch das Bildsignal registrierten Farbwerte in entsprechender Weise zu korrigieren, d. h. auf die tatsächliche Konzentration zu eichen.

Um die zu registrierenden Lichtsignale von störenden Signalen zu trennen, kann es von Vorteil sein, Filter einzusetzen. Im Falle einer Anregung der Lichtsignale durch UV-Bestrahlung kann z. B. ein Schwerpunktfilter mit einer Durchlässigkeit zwischen 280 und 360 nm verwendet werden, um das UV-Anregungs­ signal der Lichtquelle zu filtern, und des weiteren ein Schwerpunktfilter unmittelbar vor der Kameralinse, um das Signallicht zu filtern. Letzeres ist von Vorteil, wenn eine monochromatische Bildaufnahmeeinrichtung verwendet wird; im Falle einer farbtauglichen Bildaufnahmeeinrichtung können auzuwertende Farbanteile des Signallichtes gewünschtenfalls durch "elektronische Filterung" selektiert werden, d. h. durch Einstellung des Anteilsverhältnisses der Primärfarbkomponenten des Farbbildsignals.

Änderungen oder Unterschiede in der räumlichen Anordnung der Meßorte, z. B. unterschiedliche Formate der Anordnung der Reak­ tionsgefäße oder unterschiedliche Formen bzw. Größen in der Ausdehnung eines zu beobachteten Probenbereiches, können leicht verkraftet werden. Für die Registrierung der Signale, also die Bildaufnahme, muß lediglich sichergestellt sein, daß alle gewünschten Meßorte gleichzeitig von der Bildaufnahme­ einrichtung "sichtbar" sind. Nur für die Auswertung der aufge­ nommenen Signale bedarf es einer besonderen Berücksichtigung des Formates, um die Bildbestandteile bzw. Pixel jeder einzel­ nen Meßortabbildung gegenüber den anderen Meßortabbildungen und gegenüber den übrigen Bildbereichen abzugrenzen.

Diese Abgrenzung kann mittels vorprogrammierter Bildverarbei­ tungs-Software erfolgen, vorzugsweise mittels Überlagerung eines virtuellen Netzes als Maske, deren Gestalt dem jeweili­ gen Format der Gefäßanordnung angepaßt ist. Eine solche Maske kann aus einem Vorrat vorgespeicherter Masken abgerufen wer­ den; sie kann aber auch von Fall zu Fall neu definiert werden, unter Beobachtung des aufgenommenen Gesamtbildes der Gefäßein­ richtung. Bei Realzeit-Auswertung muß die Maske natürlich vor dem Start der Reaktionen definiert werden.

In vielen Fällen ist es jedoch vorteilhafter, die Maske erst nach erfolgter Aufzeichnung der Bildsignale zu definieren, unter Beobachtung eines Standbildes aus der Aufzeichnung, um die Maske optimal auf die Gegebenheiten des tatsächlich stattgefundenen Reaktionsablaufes abzustimmen. Die Ableitung der Meßwerte mittels der Maske und die Auswertung geschieht dann anschließend anhand der wiederabgespielten Aufzeichnung. Hierbei kann die Abspielung mit verlangsamter Geschwindigkeit erfolgen, zur Anpassung an die Leistungsfähigkeit der verwen­ deten Verarbeitungsmittel.

Die Auswertung anhand einer Aufzeichnung ist auch dann beson­ ders günstig, wenn man die weiter oben erwähnten Muster aus­ werten will, die sich bei kinetischen Reaktionen bilden. Hier­ bei kann es nämlich von Vorteil sein, nur bestimmte Einzelmu­ ster oder Teile eines Musters auszuwerten. So kann z. B. ein aus der Aufzeichnung gewonnenes Standbild des Endergebnisses des durch die Reaktion entstandenen Musters genutzt werden, um die virtuelle Maske, welche die kinetisch zu bewertenden Teil­ bereiche als diskrete Meßorte festlegt, zu definieren. Nach dieser Festlegung können während eines erneuten Vorlaufs der Aufzeichnung selektiv diese Teilbereiche kinetisch ausgewertet werden.

Die nachträgliche Definition der virtuellen Maske ist auch dann von besonderem Vorteil, wenn sich etwa beim Ausplattieren einer Zellkultur auf ein festes Kulturmedium die Lage der anwachsenden Kulturen in zufälliger, nicht vorhersagbarer Weise ausbildet.

Allgemein gilt, daß die Abgrenzung der auszuwertenden Bildbe­ reiche mittels einer virtuellen Maske zu einer wesentlichen Verminderung der zu verarbeitenden Datenmenge führt. Die Datengewinnung kann jeweils auf das Wesentliche konzentriert werden, so daß trotz möglicher hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung die Datenflut in vertretbaren Grenzen gehalten werden kann.

Eine Verringerung der Datenmenge kann man ohne Nachteil in allen Fällen auch erreichen, indem man die zur Auswertung herangezogenen Meßwerte für jeden Meßort zeitlich nicht äquidistant sondern derart ableitet, derart daß der Abstand aufeinanderfolgender Meßwerte in zeitlich hochaufzulösenden Abschnitten des Reaktionsverlaufes größer ist als in Abschnit­ ten, wo eine geringere zeitliche Auflösung tolerierbar ist. So kann man den zeitlichen Abstand der zur Auswertung herangezo­ genen aufeinanderfolgenden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignaländerungen kleiner wählen als in Abschnitten lang­ samerer Lichtsignaländerungen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeich­ nungen und anhand einiger Ausführungsbeispiele erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch, teilweise in Blockform, ein Bei­ spiel für den Aufbau einer Apparatur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 zeigt schematisch die Draufsicht auf die Kavitäten einer Titerplatte als Beispiel für eine typische Anordnung einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen;

Fig. 3 zeigt die Gestalt einer virtuellen Maske für die Abbildung der Gefäßanordnung nach Fig. 2;

Fig. 4 zeigt ein Beispiel für eine nicht-äquidistante Meßwertnahme;

Fig. 5 zeigt in vergrößerter Darstellung ein Muster, wie es sich im Verlauf einer Reaktion in einem einzelnen Reaktionsgefäß bilden kann.

Fig. 6 und 7 zeigen ein Beispiel für die Ausbildung von Zellkulturen in einem Reaktionsgefäß und die Anordnung geeigneter Maskenöffnungen zu deren Beobachtung.

Die in der Fig. 1 gezeigte Apparatur enthält eine insgesamt mit 10 bezeichnete Gefäßeinrichtung, im dargestellten Fall mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 (in Schnittansicht ge­ zeigt). Die Reaktionsgefäße 11 enthalten Proben 12 von Zusam­ mensetzungen, in denen Reaktionen ablaufen, die photometrisch überwacht werden sollen, um Lichtsignale zu registrieren, die charakteristisch für die Reaktionsabläufe sind. Die Gefäßein­ richtung 10 kann, wie als Beispiel schematisch gezeigt, eine Titerplatte sein, deren Kavitäten die Reaktionsgefäße 11 bil­ den. Es kann auch eine beliebige Anordnung anderer Reaktions­ gefäße verwendet werden, z. B. eine Anordnung einzelner Küvet­ ten oder ein Trägermaterial wie etwa eine Zellulosematrix, in der einzelne Spots die Reaktionsgefäße bilden. Jedes der Ge­ fäße bzw. jeder Spot bildet einen gesonderten diskreten Meßort für eine durchzuführende photometrische Messung. Jedes Gefäß kann aber selbst wiederum einer Summe diskreter Meßorte beein­ halten, die sich selektiv mit einer virtuellen Maske in einem aufgenommenen Bild abgrenzen und bewerten lassen. Die Gefäß­ einrichtung 10 kann aber auch ein einziges Gefäß zur Aufnahme einer Probe sein, in welcher an unterschiedlichen Stellen Reaktionen mit unterschiedlicher Kinetik ablaufen können. In diesem Fall bilden die jeweils zu überwachenden Stellen der Probe diskrete Meßorte.

Oberhalb der Gefäßeinrichtung 10 ist eine Bildaufnahmeeinrich­ tung 20, die mononochromatisch oder farbtauglich sein kann, so angeordnet, daß sie von oben alle Meßorte gleichzeitig über­ blickt. Das heißt, das Objektiv 21 der Bildaufnahmeeinrichtung 20 bildet die Draufsicht der Gefäßeinrichtung 10 auf einer lichtempfindlichen Bildaufnahmefläche (z. B. einem CCD-Bildsen­ sor im Falle einer elektronischen Kamera) ab. Jeder Meßort ist also anhand der Bildkoordinaten seiner Abbildung eindeutig identifizierbar. Die Bildaufnahmeeinrichtung 20 sei im darge­ stellten Beispielsfall eine Videokamera und kann gewünschten­ falls so ausgelegt sein, daß die Bildwiederholfrequenz (Rasterabtastrate bzw. Vollbildfrequenz) veränderbar ist. Die in der Zeichnung dargestellte Apparatur enthält ferner eine Beleuchtungseinrichtung 31, 32, um die Meßorte in der Gefäßeinrichtung 10 derart zu bestrahlen, daß die Reaktions­ abläufe anhand von Lichtsignalen beobachtet werden können. Die Art der Beleuchtung wird abhängig davon gewählt, welche Art von Lichterscheinung oder optischer Eigenschaft als Indikation für das Fortschreiten der ablaufenden Reaktionen genutzt wer­ den soll. Beim dargestellten Beispiel sind seitlich der Kamera 20 vier um 90° winkelversetzte Lampen 31 vorgesehen (von denen nur die beiden vorderen zu sehen sind), welche die Proben 12 von oben bestrahlen, und eine unter der (transparenten) Gefäß­ einrichtung 10 angeordnete Lampe 32, welche die Proben 12 von unten bestrahlt. Für die Anordnung der Beleuchtungsquelle(n) kann aber auch eine andere, für die Lichtmessung geeignete Geometrie gewählt werden.

Soll z. B. Fluoreszenz oder Lumineszenz als reaktionsindizie­ rende Größe beobachtet werden, wird für die Beleuchtung eine entsprechende anregende Strahlung verwendet, z. B. UV-Licht, vorzugsweise aus allen Lampen 31 und 32. Um Nutzlicht von Störlicht zu trennen, können Filter benutzt werden, vorzugs­ weise Schwerpunktfilter (z. B. Durchlässigkeitsbereich zwischen 280 und 360 nm) an den UV-Lampen (nicht dargestellt) und ein Schwerpunktfilter 22 (z. B. 430 ± 10 nm) zum Durchlassen des Luminenzlichtes vor dem Kameraobjektiv 21.

Werden Indikatorfarbstoffe in den Proben verwendet, können die Proben durch sichtbares Licht beleuchtet werden. Hierbei kann mit Auflicht unter Verwendung der Lampen 31 und/oder mit Durchlicht unter Verwendung der Lampe 32 gearbeitet werden. Zur Beobachtung von Lichtabsorption verwendet man vorzugsweise nur die Lampe 32 als Durchlicht-Beleuchtungsquelle. Um Nutz­ licht von Störlicht zu trennen oder bestimmte Farbeffekte in den Proben selektiv zu registrieren, können auch hier Filter, gegebenenfalls dem jeweiligen Farbstoff angepaßt, an den Lampen bzw. vor dem Kameraobjektiv benutzt werden. Im Falle einer Farbkamera kann eine eventuell erwünschte Farbselektion auch elektronisch bei der Signalverarbeitung erfolgen, durch entsprechende relative Gewichtung der Primärfarbkomponenten des Farbbildsignals (z. B. der Rot-, Grün- und Blau-Komponente bei einem RGB-Videosignal).

Soll Chemolumineszenz als reaktionsindizierende Größe beobach­ tet werden, bleibt die Beleuchtungseinrichtung 31, 32 vorzugs­ weise ausgeschaltet.

Die in der Zeichnung gezeigte Apparatur enthält ferner einen Computer 40, einen Monitor 50 und ein Aufzeichnungs- und Abspielgerät 60 für Videosignale. Der Videosignalausgang der Kamera 20 führt zum Gerät 60 und von dort zu Videosignal­ eingängen des Monitors 50 und des Computers 40. Es sind (nicht dargestellte) Schaltmittel vorgesehen, um die Videosignale von der Kamera 20 wahlweise mit oder ohne gleichzeitige Aufzeich­ nung im Gerät 60 auf den Monitor 50 und/oder den Computer 40 zu koppeln zu können und um aufgezeichnete Videosignale aus dem Gerät 60 zum Monitor 50 und/oder zum Computer 40 koppeln zu können.

Der Computer 40 enthält Prozessoren 41 und Speichereinrichtun­ gen 42 zur programmgesteuerten Verarbeitung und Auswertung der Videosignale. Eine allgemein als Block 70 dargestellte Einga­ bevorrichtung enthält Mittel für Nutzereingaben (Tastatur, Maus) am Computer 40. Weitere Peripheriegeräte, stellvertre­ tend durch den Block 80 dargestellt, können Ausgabeeinrichtun­ gen wie z. B. einen Drucker oder zusätzliche Datenträger enthal­ ten. Zwischen Computer 40 und Monitor 50 ist die übliche Datenkommunikationsverbindung vorgesehen, um vom Computer verarbeitete Bildsignale, Graphiken als Ergebnisse der Auswer­ tung von Videosignalen und vom Computer generierte Ikons, Befehls- und Anzeigefelder, Masken, Fenster, Mitteilungen, Menüs u. dergl. wiederzugeben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gefäßeinrichtung 10 mit der oder den zu beobachtenden Probe(n) gefüllt und in das Gesichtsfeld der Videokamera 20 gebracht, und gewünschtenfalls wird die Beleuchtung 31 und/oder 32 und die Videokamera 20 eingeschaltet. Das von der Kamera 20 nach deren Einschaltung gesehene Bild wird auf dem Bildschirm des Monitors 50 wiedergegeben. Mit Hilfe des Computers 40 kann als Schablone oder Maske ein frei definiertes virtuelles Netz erzeugt und so auf dem Bildschirm positioniert werden, daß die Innenseiten der Netzöffnungen bzw. die "Maschen" des Netzes Bildausschnitte einrahmen, welche jeweils einen Meßort als Fläche auf dem Bildschirm definieren. Die Art der Geometrie dieser Flächen kann beliebig sein, z. B. kreisförmig oder rechteckig.

Die Fig. 2 zeigt als Beispiel eine Gefäßeinrichtung 10 mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 in einer Ansicht, wie sie von der Kamera 20 gesehen wird und auf dem Bildschirm 50 abgebildet werden kann. Diese Gefäßeinrichtung 10 kann eine Titerplatte sein, deren Kavitäten die Gefäße 11 bilden. Der Einfachheit halber sind nur 24 Kavitäten dargestellt, angeord­ net in einer Matrix aus vier Reihen und sechs Spalten; in der Praxis kann die Titerplatte weit mehr Kavitäten aufweisen, in handelsüblichen Ausführungsformen z. B. 8 × 12 = 96 oder 16 × 24 = 384 Kavitäten. Die Reaktionsgefäße können auch einzelne Küvetten sein, oder Spots einer Spotmatrix von Proben (z. B. 20 × 20 Spots) auf einem geeigneten Trägermaterial.

Die Fig. 3 zeigt als Beispiel ein virtuelles Netz 90 in Form einer Maske mit 24 quadratischen Teilflächen 91, welche ein­ zelne Maskenöffnungen darstellen. Dieses Netz 90 ist dazu konzipiert, der Abbildung der Gefäßeinrichtung 10 nach Fig. 2 überlagert zu werden. Jede Netzfläche 91 entspricht einem "Meßort", d. h. sie definiert einen Bildbereich, der einem auszuwertenden Bereich der in den Gefäßen 11 enthaltenen Proben entspricht.

Nach Festlegen der Datensammelrate (d. h. Meßwertnahme je Zeit­ einheit) und nach dem Start der Reaktionen in den Reaktions­ gefäßen können die Werte jeweils mehrerer oder aller Pixel der einzelnen Netzflächen 91 jeweils mittels üblicher Algorithmen integriert werden. Da jede Netzfläche einem Meßort entspricht, repräsentieren die integrierten Daten aus jeder einzelnen Flä­ che pro Rasterabtastperiode (Videovollbild) einen Lichtmeßwert vom betreffenden Meßort. Es können auch Daten über jeweils mehrere Vollbildperioden integriert werden, um jeweils einen Lichtmeßwert zu bilden. Durch schrittweises Auswerten der Videobilder können also zeitlich geordnete Meßwertreihen erhalten werden, mit denen die Kinetik der chemischen Reaktion, die in allen Reaktionsgefäßen abläuft, beschrieben werden kann.

Mittels bekannter Rechenverfahren können aus diesen Meßdaten kinetische Konstanten berechnet werden, die für weitere Bewertungen zugänglich abgespeichert oder graphisch darge­ stellt werden. Eine solche graphische Darstellung kann auch auf den Bildschirm des Monitors 50 wiedergegeben werden. Beispielsweise können die berechneten Meßwertkurven in jeweils einem eigenen kleinen Feld des Schirmbildes wiedergegeben werden, wobei dieser Graphikbildchen vorzugsweise in gleicher räumlicher Anordnung zueinander angelegt werden, wie es der Anordnung der Meßorte entspricht. Die Menge der Graphikbild­ chen kann entweder bildschirmfüllend oder in einem gesonderten Abschnitt des Schirms neben der Meßortabbildung wiedergegeben werden.

Bei Kenntnis der Gesetzmäßigkeit der Reaktion (Reaktionsordnung) und Größe der Reaktionskonstanten kann die Gewinnung der einzelnen Meßwerte (Datenpunkte) gewünschten­ falls nichtäquidistant erfolgen, angepaßt an die Nichtlineari­ tät entsprechend der Reaktionsordnung und der Größe der Reaktionskonstanten.

Ein Beispiel für eine nicht-äquidistante Meßwertnahme ist qualitativ in der Fig. 4 veranschaulicht. Diese Figur zeigt den zeitlichen Verlauf der an einer Probe beobachtbaren Lichtintensität L im Falle einer Reaktion erster Ordnung. Die Meßgröße steigt nach dem Start der Reaktion steil an und wird dann zunehmend flacher. Zur genauen Auswertung genügt eine hohe zeitliche Auflösung der Meßwertnahme nur in den Bereichen steilen Anstiegs, während man sich in anderen Bereichen mit geringerer Auflösung begnügen kann, um die Datenmenge zu reduzieren. Diesem Prinzip folgt das in der Fig. 4 gezeigte Schema, indem die zeitlichen Abstände der Meßwertnahme zu Beginn der Reaktion sehr klein und dann zunehmend größer gewählt werden, wie es die diskreten Punkte in der Fig. 4 rein qualitativ veranschaulichen. Als praktisches Beispiel für eine Reaktion erster Ordnung mit einer Reaktionsdauer von 900 Sekunden kann zu Beginn ein Zeitabstand von 0,4 Sekunden gewählt werden, der bis zum Ende der Reaktion allmählich auf etwa 80 Sekunden vergrößert wird, um insgesamt nur etwa 500 Meßwerte zu erhalten (statt 2250 Meßwerte im Falle einer durchgehenden unveränderten Zeitauflösung von 0,4 Sekunden).

Im folgenden werden vier spezielle Beispiele für die Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.

Beispiel 1

Bei diesem Beispiel wird zur Bildung der Reaktionsgefäße ein 96 mal 140 mm großes Trägermaterial (Zellulose, Whatman 540) verwendet, auf welches eine Peptidbibliothek der Sequenz QUE- XaaXaaF-FLU-Z, in der QUE als Fluoreszenzquencher, Xaa als eine mögliche natürliche Aminosäure und FLU als ein Fluorogen dienen, in einer Spotmatrix von 400 (20 × 20 Spots) aufsyntheti­ siert wird. Unter dem Trägermaterial befindet sich eine Wanne, und darüber sind im Abstand von 30 cm eine handelsübliche Farb-Videokamera 20 und seitlich davon vier UV-Lampen 31 (wie in der Zeichnung gezeigt) angebracht sind. Unmittelbar vor dem Kameraobjektiv 21 ist ein Schwerpunktfilter 22 (430 ± 15 nm) angebracht. Die Wanne ist gefüllt mit 10 ml einer gepufferten Chymotrypsinlösung (0,1 mg/ml Chymotrypsin; 0,1 M Phosphatpuf­ fer pH 7.8).

Durch Eintauchen der Spotmatrix in die Chymotrypsinlösung wird die Reaktion gestartet. Die Zunahme der Fluoreszenz durch chymotryptische Hydrolyse wird mittels der Videokamera 20 bei einer Bildwiederholfrequenz von 20 Vollbildern je Sekunde für eine Dauer von 15 min nach Start der Reaktion vom Gerät 60 aufgezeichnet.

Zur Auswertung wird, während des Abspielens der aufgezeichne­ ten Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein virtuelles Netz von 20 mal 20 Einzelflächen so angeordnet, daß repräsentative kreisrunde Flächen der 400 Spots abgegrenzt werden. Durch Integration von 16 Pixeln je Einzelfläche über jeweils 10 Vollbilder, was einer Meßwertrate von jeweils einem Meßwert je 10 Vollbilder bzw. von 2 Meßwerten pro Sekunde für jeden Spot entspricht, werden alle 400 Spots kinetisch ausge­ wertet, und mittels linearer Regression werden die Anfang­ sanstiege berechnet. Der Vergleich der synthetisierten Peptid­ sequenzen mit den berechneten kinetischen Konstanten läßt Rückschlüsse über die Substratspezifität der verwendeten Protease zu.

Beispiel 2

Als Anordnung von Reaktionsgefäßen wird hier eine Titerplatte mit 96 Kavitäten verwendet. In die Kavitäten werden je 137 µl einer Lösung aus 7 µl Serum, 50 µl Substratlösung (123 mg/L Succinyl-Phe-Pro-Phe-4-nitroanilid in 35 mmol/L HEPES Puffer, pH 7,8) und 80 µl Chymotrypsin-Lösung (1 g/L Chymotrypsin in 35 mmol/L HEPES Puffer, pH 7,8) pipettiert.

Die Reaktion wird jeweils durch die Zugabe der 50 µl Substrat­ lösung gleichzeitig zu allen Kavitäten mittels eines handels­ üblichen Pipettiersystems gestartet. Während der Reaktion wird die Titerplatte von unten mittels weißem Licht (z. B. durch die Lampe 32 bei der in der Zeichnung dargestellten Apparatur) gleichmäßig angestrahlt. Die Änderung der Lichtabsorption wird mittels der Videokamera 20 bei einer Bildwiederholfrequenz von 20 Vollbildern je Sekunde für 20 min nach Start der Reaktion aufgezeichnet. Das geeignete Lichtsignal wird durch Vorschal­ ten eines Schwerpunktfilters 22 (390 ± 5 nm) vor die Optik 21 der Videokamera 20 erhalten.

Zur Auswertung wird, vor dem Abspielen der aufgezeichneten Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein stehen­ des Bild der 96 Kavitäten erzeugt, und ein virtuelles Netz von 8 mal 12 Einzelflächen wird so auf dem Bildschirm angeordnet, daß repräsentative Flächen der 96 Spots einzeln abgegrenzt werden. Während des Vorlaufs der Videosequenzen mit einer Bildwiederholfrequenz von 10 Vollbildern je Sekunde wird durch Integration von 3 mal 3 Pixeln je Einzelfläche die Änderung der Lichtabsorption aller 96 Kavitäten erfaßt.

Die Reaktion kann gemäß einem Konzentrations-Zeitgesetz "ers­ ter Ordnung" ausgewertet werden. Die Reaktionsgeschwindig­ keits-Konstanten befinden sich im Bereich zwischen 4.10^-3 und 3.10^-2 je Sekunde. Zur Berechnung der Reaktionskonstanten werden Datensammelraten verwendet, die folgendem Zeitgesetz entsprechen:

Dsz = ln(1 - A)/k, mit A = [1 - exp(-k.gZ)]/Dp.

Es bedeuten:
Dsz = Zeit, zu der ein Meßpunkt zur Berechnung herangezogen wird;
k = kinetische Konstante einer Reaktion erster Ordnung;
gZ = gesamte Reaktionszeit, über die die Reaktion beobach­ tet wird;
Dp = Anzahl aller Datenpunkte, mit der die Reaktion be­ schrieben wird.

Mittels dieser Datenpunkte können nun die genauen kinetischen Konstanten mittels üblicher Algorithmen berechnet werden. Der Vergleich dieser Konstanten einzelner Kavitäten erlaubt die Charakterisierung der Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerase- Aktivitäten in humanem Serum.

Beispiel 3

In eine Titerplatte mit 16 mal 24 Kavitäten werden je 70 µl Substratlösung, 10 µl Enzymlösung und 1 µl einer DMSO-Lösung pipettiert. Die DMSO-Lösung enthält jeweils unterschiedliche Naturstoffe einer Naturstoffbank, in einer Konzentration von 1 mg je ml DMSO. Einige der Lösungen enthalten als Kontrolle keine solche Zusätze. Das Substrat besitzt die Sequenz A1-A2- A3-P-A4-A5-A6. Dabei steht P für die Aminosäure Prolin. A1, A2, A3, A4, A5, A6 stehen für Peptide, vorzugsweise aber Aminosäuren, aber auch Verbindungen, die sich innerhalb von Peptidketten einbauen lassen und bei Anregung mit einer geeig­ neten Wellenlänge fluoreszieren, bzw. auch Verbindungen, die bei entsprechender Geometrie und geeignetem Abstand von der fluoreszierenden Verbindung diese Fluoreszenz löschen (quen­ chen) können. Die verwendeten Aminosäuren bzw. Peptide können mit dem Fachmann bekannten chemischen Modifizierungen weit­ gehend verändert sein.

Ein besonderes Kennzeichen dieser Substrate ist, daß es unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer zeitweilig bestän­ digen Verbindung zwischen chemischen Funktionalitäten kommen kann, die zu einem Ringschluß führen können, die die Amino­ säure Prolin einschließen. Dieser Ringschluß führt zu der besonderen Eigenschaft dieser Substrate, daß sich die Konzen­ tration der Konformation der Peptidyl-Prolyl-Bindung dieses Ringes von der Konzentration unterscheidet, die dieses Sub­ strat ohne einen solchen Ring in wäßrigen Lösungen, mit phy­ siologischen Eigenschaften, ausbilden. Eine weitere Beson­ derheit dieser Substrate ist die Eigenschaft, daß dieser molekulare Geometrieunterschied zwischen offenkettiger und ringförmiger Struktur zu einem Unterschied in der Fluoreszenz führt. Die Öffnung des Ringes kann durch physikalische Metho­ den erfolgen, so z. B. durch einen Lichtblitz, wenn der Ring­ schluß lichtempfindlich ist, sie kann aber auch durch chemi­ sche Reagenzien (Starter) ausgelöst werden, wenn der Ring­ schluß chemisch empfindliche Gruppierungen wie z. B. protease­ sensible Schnittstellen aufweist. Erfolgt die Ringöffnung durch geeignete Versuchsanordnung so schnell, daß die Einstel­ lung des Konformerengleichgewichtes geschwindigkeitsbestimmend wird, kann dessen Katalyse anhand der Fluoreszenzänderung beobachtet werden.

Beim hier beschriebenen Verfahrensbeispiel erfolgt die enzyma­ tische Katalyse durch Zugabe von 10 µl einer Lösung von Cyclo­ phylin als Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerase. Die Ringöffnung je Kavität gelingt nach Zugabe von 40 µl Starter innerhalb von 7 sec. Eine notwendige schnelle Mischung wird durch eine berührungsfreie Methode innerhalb dieser Zeit erreicht. Die Zugabe des Starters erfolgt hierbei mittels einer 16-fach- Dosiereinrichtung sequentiell in aufeinerderfolgende 16er- Reihen der Kavitäten, innerhalb einer Zeit von 4 Sekunden für alle 16 mal 24 Kavitäten. Dabei gelangt jeweils innerhalb von 3 Sekunden nach Start der Reaktion die jeweilige 16er-Reihe zur Auswertung. Danach werden alle Kavitäten über eine Zeit von 20 Minuten gemäß den spektroskopischen Gegebenheiten wie Beispiel 1 und mit einer Datensammelrate vermessen, die ähnlich variiert, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, entsprechend einem Zeitgesetz erster Ordnung unter Zugrundelegung einer Geschwindigkeitskonstante von 4.10^-3 s^-1 und einer Gesamt­ anzahl von 999 Meßwerten je Kavität.

Die Draufsicht auf die Titerplatte wird von der Videokamera 20 aufgenommen und als Gesamtbild auf dem Monitor 50 wiedergege­ ben. Über dieses Bild wird ein virtuelles Netzes von 16 mal 24 rechteckigen Einzelflächen so auf dem Bildschirm angeordnet, daß diese jeweils einen Ausschnitt der Probenabbildungen in den Kavitäten 11 der Titerplatte abgrenzen. Nach dem Start der Reaktion und Vermischen der 40 µl Starterlösung in den jeweils 90 µl Vorlagelösung (10 µl Enzym- und 80 µl Substratlösung) werden, durch Integration von jeweils 4 Pixeln innerhalb jeder Einzelfläche bei oben beschriebener Registrierhäufigkeit von insgesamt 999 Meßpunkten je Kavität, alle 384 Flächen zeitbe­ zogen ausgewertet, und nach Anpassen einer Reaktion gemäß einem Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung werden die Geschwin­ digkeitskonstanten berechnet. Der Vergleich der Geschwindig­ keitskonstanten aller Kavitäten miteinander, beispielsweise als Balkendiagramm, läßt Wirkstoffe erkennen, die die Aktivi­ tät des zugesetzten Enzyms inhibieren.

Beispiel 4

Dieses Beispiel entspricht im wesentlichem dem Beispiel 3. Es demonstriert aber in besonderer Weise den Einsatz des Meßver­ fahrens innerhalb eines Massenscreenings ("Highthroughput").

Nach Zuführung einer vorbereiteten Titerplatte (16 mal 24 Kavitäten) auf einen Titerplatten-Trägerschlitten des Meßplat­ zes beginnt jeweils einer neuer Meßzyklus. Die Vorbereitung der Titerplatte beinhaltet das Zupipettieren aller notwendigen Reagenzien in den geeigneten Mengen, so daß durch Zugabe eines Startreagenz die zu beurteilende Reaktion gestartet werden kann. Folgende Schritte laufen dann ohne manuelles Eingreifen automatisch ab:

• 1. Die Titerplatte wird sequentiell mit Startreagenz verse­ hen.
• 2. Die einzelnen Kavitäten der Titerplatte werden berührungs­ frei durch Zugabe eines gepulsten Luftstromes homogen gemischt.
• 3. Die Titerplatte fährt unmittelbar weiter in die Zone der Beobachtung, d. h. in das Gesichtsfeld der Kamera 20.
• 4. Beim automatischen Bewegen der Titerplatte erfolgt die Lesung der Titerplattenkennung mittels Balkencode- Lesegerät.
• 5. über 20 Minuten erfolgt die Registrierung der Meßsignale, wie dies in Beispiel 3 beschrieben wurde.
• 6. Die 383616 Originalmeßdaten (16 mal 24 mal 999) werden automatisch vom Computer 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkennbar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
• 7. Alle Meßdaten werden kavitätsbezogen verrechnet, wie dies im Beispiel 3 beschrieben wurde.
• 8. Die kavitätsbezogenen Ergebnisse, wie Geschwindigkeitskon­ stante, Amplitude, extrapolierte Endfluoreszenz werden ebenfalls automatisch vom Computer 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkenn­ bar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
• 9. Entsprechend einem vorher eingegebenen Bewertungsmaßstab, werden nichtplausible Messungen (dies sind insbesondere solche mit unerwartet extremen Meßwerten) aber auch solche, bei denen ein Bewertungskriterium im Sinne eines sogenannten "Hits" erfüllt wurde, auf einem angeschlosse­ nen Drucker ausgegeben.
• 10. Die Titerplatte wird aus der Beobachtungszone herausgefah­ ren und mittels geeigneter Hilfsmittel vom Meßschlitten entfernt.
• 11. Durch Zuführen einer weiteren Titerplatte wird ein näch­ ster Zyklus gestartet.

Weitere Ausführungsformen

Bei den vorstehend beschriebenen Beispielen werden die Pixel jeder Einzelfläche des virtuellen Netzes jeweils über diese Fläche integriert, so daß globale Meßwerte erhalten werden, welche die Gesamtlichtintensität an den betreffenden Meßorten widerspiegeln. Die Pixel jeder Einzelfläche (oder ausgewählter Einzelflächen) des virtuellen Netzes können aber auch einzeln oder in diskreten Teilmengen ausgewertet werden, als Sätze von verschiedenen lokalen Meßwerten innerhalb des betreffenden Meßortes, um die zeitliche Änderung der räumlichen Verteilung der Lichtintensität innerhalb des betreffenden Meßortes und somit die Ausbildung charakteristischer Muster in einer Probe analysieren zu können.

Ein Anwendungsbeispiel hierfür ist die Beobachtung der weiter oben erwähnten Hämagglutination, bei der sich verschieden große Agglutinationhöfe oder konzentrische Ringe in den Proben ausbilden. Eine entsprechende Ringstruktur kann ähnlich ausse­ hen, wie es im linken unteren Reaktionsgefäß in Fig. 2 darge­ stellt ist. Die zeitlich aufgelöste Auswertung der Agglutina­ tionsstrukturen kann vorgenommen werden anhand der Einzelwerte von Pixeln (oder Teilmengen der Pixel), welche die lokalen Meßwerte innerhalb einer Probe darstellen. In der vergrößerten Darstellung nach Fig. 5 bedeutet jedes Karo des karierten Linienmusters ein z. B. ein Pixel (oder eine definierte Pixel­ gruppe) der in Fig. 3 dargestellten Maskenöffnung 91 (aus Fig. 3), die den die Agglutinationsstruktur zeigenden Meßort abgrenzt.

Für die maschinelle Auswertung der Musterstrukturen können an sich bekannte Bewertungsverfahren angewandt werden. Beispiels­ weise kann, in einem ersten Schritt, durch Vergleich der Dichte dunkler (oder heller) Pixel in verschiedenen Zonen der Meßortabbildung (Maskenöffnung) mittels mathematischer Algo­ rithmen das Agglutinationszentrum Z gefunden werden, welches den Dichtemittelpunkt darstellt. In einem zweiten Schritt kann die Dichteverteilung in Abhängigkeit vom Radius (also als Funktion der Entfernung vom Dichtemittelpunkt) bestimmt wer­ den. Aus den zeitlich versetzten Berechnungen dieser Dichte­ verteilung kann somit ein Maß für die Agglutinationsgeschwin­ digkeit ermittelt werden, auch bezogen auf die Größe des Agglutinationshofes.

Wie bereits erwähnt, können die verschiedenen diskreten Meßorte auch verschiedene Bereiche einer Probe in einem einzelnen Reaktionsgefäß sein, wobei die virtuelle Maske von Fall zu Fall so angepaßt werden kann, daß Meßwerte nur für diejenigen Bereiche der Probe abgeleitet werden, die eine auszuwertende Reaktion zeigen. Ein Beispiel hierfür ist in den Fig. 6 und 7 dargestellt. Die Fig. 6 zeigt das Bild eines Reaktionsgefäßes 11 nach Ablauf einer Reaktionszeit, in welcher sich eine Vielzahl diskreter, optisch als Flecken erkennbarer Zellkulturen entwickelt hat. Anhand dieses "letzten" Bildes einer zuvor aufgezeichneten Bilderfolge wird auf dem Bildschirm eine Maske definiert, deren Öffnungen 91 die einzelnen Kulturen umgrenzen. Die Aufzeichnung der Bilder­ folge wird dann Wieder abgespielt, und die entsprechend den Maskenöffnungen selektierten Bildsignale werden ausgewertet. Das Erkennen der Flecken und die Plazierung der Maskenöffnun­ gen kann auch durch geeignete Bildverarbeitungs-Software automatisch erfolgen. Für die Auswertung kann mit Globalmeß­ werten für jeden Meßort durch räumliche Integration der Meß­ ortpixel gearbeitet werden, oder aber mit Sätzen räumlich aufgelöster lokaler Meßwerte zur Musteranalyse, wie weiter oben beschrieben.

Wie weiter oben angesprochen, läßt sich die vorliegende Erfin­ dung auch mit Bildaufnahmeeinrichtungen realisieren, die Bild­ information nicht selbst in elektrische Signale umwandeln, sondern z. B. auf photographische Bildträger aufzeichnen. In diesem Fall werden die zu verarbeitenden Bildsignale durch Abtastung dieser Bildträger mittels eines geeigneten Scanners gewonnen (z. B. mittels eines Filmabtasters, wenn der Bildträ­ ger ein photographischer Kinofilm ist).

Claims (21)

1. Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß über die Reaktionskinetik in einer oder mehreren Zusammensetzungen geben,
wobei der Ablauf von Reaktionen in einer oder mehreren Proben (12) von Zusammensetzungen an einer Vielzahl diskreter Meßorte (11) optisch überwacht wird und die dabei detektierten Lichtsignale registriert und ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Registrierung der Lichtsignale aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils der Gesamtheit der Meßorte (11) während der zu erwartenden Dauer der ablaufenden Reaktionen aufgenom­ men werden und
daß die Auswertung der Lichtsignale durch Analyse der die Meßorte wiedergebenden Bildausschnitte der Einzelbilder erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl diskreter Meßorte (11) Proben von Zusam­ mensetzungen in einer entsprechenden Vielzahl von Reaktions­ gefäßen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl diskreter Meßorte verschiedene Orte in einer Probe einer Zusammensetzung sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Registrierung der Lichtsignale die Gesamtheit der Meßorte (11) im Gesichtsfeld einer Bildaufnahmeeinrichtung (20) angeordnet wird, um die verschiedenen Meßorte an unter­ schiedlichen Stellen der Bildaufnahmefläche dieser Einrichtung abzubilden, worauf die Bildaufnahmeeinrichtung während der zu erwartenden Dauer der an den Meßorten ablaufenden Reaktionen zur Aufnahme aufeinanderfolgender Einzelbilder betrieben wird, und
daß die Auswertung der Lichtsignale anhand von Meßwerten erfolgt, die abgeleitet werden aus Bestandteilen von Bild­ signalen, welche während Rasterabtastungen der Einzelbilder jeweils bei Abtastung der die einzelnen Meßortabbildungen enthaltenden Rasterbereiche erzeugt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Bildaufnahmeeinrichtung (20) eine Einrichtung zur Aufnahme von Farbbildern verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Bildaufnahmeeinrichtung (20) eine elektronische Kamera verwendet wird, deren Bildaufnahmefläche zur Gewinnung der Bildsignale abgetastet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als elektronische Kamera (20) eine periodisch abtastende Videokamera verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Auswahl der für die Auswertung herangezogenen Bestandteile der Bildsignale den aufgenommenen Bildern eine virtuelle Maske (90) überlagert wird, deren Öffnungen (91) jeweils eine Menge von Pixeln jeder Meßortabbildung abgrenzen, und
daß die auszuwertenden Meßwerte aus diesen Pixelmengen abgeleitet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Pixelwerte in mindestens einer der abgegrenzten Pixelmengen wiederholt und über jeweils eine vorgewählte Anzahl n ≧ 1 von Einzelbildern integriert werden, um für die betreffende Meßortabbildung öffne Reihe aufeinanderfolgender Globalmeßwerte zu erhalten, anhand derer die Auswertung erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß für mindestens eine der Meßortabbildungen aufeinanderfolgende Sätze von jeweils mehreren lokalen Meßwer­ ten erzeugt werden, wobei jeder lokale Meßwert abgeleitet wird aus jeweils einer zugeordneten lokal definierten Teilmenge der abgegrenzten Pixelmenge aus der betreffende Meßortabbildung.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die lokalen Meßwerte in den aufeinanderfolgenden Meßwertsätzen zur Bestimmung der zeitlichen Entwicklung der Intensitätsverteilung der Lichtsignale über den räumlichen Bereich des betreffenden Meßortes ausgewertet werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die aufeinanderfolgenden Einzelbilder aufgezeichnet werden und
daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte aus der wiederabgespielten Aufzeichnung abgeleitet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte für jeden Meßort (11) als eine nicht-äquidistante Folge aus dem Bildsignal abgeleitet werden, derart daß der Abstand aufeinanderfolgender Meßwerte in zeitlich hochaufzulö­ senden Abschnitten des Reaktionsverlaufes größer ist als in Abschnitten, wo eine geringere zeitliche Auflösung tolerierbar ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand der zur Auswertung herangezogenen aufeinanderfolgenden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignaländerungen kleiner gewählt wird als in Abschnitten langsamerer Lichtsignaländerungen.

15. Apparatur zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß über die Reaktionskinetik in Zusammensetzungen geben,
mit einer Gefäßeinrichtung (10) zur Aufnahme einer oder mehrerer Proben (12) von Zusammensetzungen,
und mit einer Sensoreinrichtung (20) zum selektiven Registrieren des von verschiedenen Meßorten (11) am Inhalt der Gefäßeinrichtung (10) abgestrahlten Lichtes, dadurch gekennzeichnet,
daß die Sensoreinrichtung eine Bildaufnahmeeinrichtung (20) enthält, deren Gesichtsfeld zum gleichzeitigen Überblicken der verschiedenen Meßorte angeordnet ist, um die Meßorte (11) an unterschiedlichen Stellen der Bildaufnahme­ fläche abzubilden, und die zur Aufnahme aufeinanderfolgender Einzelbilder steuerbar ist, und
daß Verarbeitungsmittel (40) vorgesehen sind, um aus denjenigen Bestandteilen von Bildsignalen, welche während Rasterabtastungen aufeinanderfolgend aufgenommener Einzelbil­ der erzeugt werden jeweils bei Abtastung der die einzelnen Meßortabbildungen enthaltenen Rasterbereiche, für jeden Meßort zeitlich aufeinanderfolgende Lichtmeßwerte zu bilden.

16. Apparatur nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) zur Aufnahme von Farb­ bildern ausgelegt ist.

17. Apparatur nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) eine Videokamera ist.

18. Apparatur nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildwiederholfrequenz der Videokamera (20) veränderbar ist.

19. Apparatur nach einem der Ansprüche 15 bis 18, gekenn­ zeichnet durch einen Einrichtung (31, 32) zur Beleuchtung des Inhaltes der Gefäßeinrichtung (10).

20. Apparatur nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (60) vorgesehen ist zum Aufzeichnen der von der Bildaufnahmeeinrichtung (20) aufgenom­ menen Einzelbilder und zum Abspielen von aus der Aufzeichnung gewonnenen Bildsignalen an die Verarbeitungsmittel (40).

21. Apparatur nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäßeinrichtung (10) und die Verar­ beitungsmittel (40) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ausgebildet sind.