DE19736641A1 - Verfahren und Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen Mischungen - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen MischungenInfo
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Description
Bisher konnten Chemo- und Biosensoren nur sehr bescheidene Anwendungsbereiche erschlie
ßen. Dies ist u. a. darauf zurückzuführen, daß die Meßinformation zu wenig umfangreich ist und
zu stark von äußeren Faktoren beeinflußt wird. Dies macht das Meßergebnis zu unsicher, um in
vielen Anwendungen akzeptabel zu sein. Bei z. B. Immunsensoren/Immunoassays führen die
sog. Kreuzreaktionen dazu, daß in einer unbekannten Probe keine Einzelstoffinformation erlangt
wird, sondern nur schwer und nur von hochqualifizierten Fachleuten interpretierbare
"Äquivalente" erhalten werden. Dies ist für die meisten Meßaufgaben nicht ausreichend, so daß
eine zusätzliche konventionelle Analytik notwendig wird. Hierdurch ist häufig die Sensortechnik
nicht konkurrenzfähig gegenüber anderen Verfahren. Das andere Problem ist die Multianalytfä
higkeit. Kaum ein Anwender möchte nur einen einzigen Analyten in konstanter Matrix bestim
men. Häufig ist sogar unbekannt, was genau gesucht wird. Bei Einzelstoff-Verfahren, so preis
günstig und schnell sie auch sein mögen, verkehren sich die Vorteile bald in Nachteile, sobald
mehrere Analyten gesucht werden, denn der Aufwand ist additiv. Mehrstoff-Verfahren, wie die
Chromatographie, sind in diesen Fällen fast immer überlegen. Auch die Kosten sind hier ent
scheidend. Die Mehrstoff-Verfahren sind umso kostengünstiger, je mehr Analyten gleichzeitig
bestimmt werden können. Leider sind konventionelle Mehrstoff-Verfahren (wie Gaschromato
graphie-Massenspektrometrie-Kopplung) sehr teuer und können in vielen Fällen aus Kosten
gründen nicht angewendet werden. Zudem sind diese Verfahren langsam und benötigen sehr gut
ausgebildetes Personal. Verfahren, wie das in der Anmeldung vorgestellte, eröffnen hier Mög
lichkeiten für zahllose neue Anwendungen, die auch am Markt in hohem Maße wettbewerbsfä
hig sein dürften. Die Kosten einer derartigen Analyse sollten um mindestens den Faktor 10
unter denen einer üblichen Multianalytbestimmung liegen.
Die Chemo-/Biosensorik an sich ist in einer schwierigen Situation. Die vor vielen Jahren noch
sehr optimistischen Prognosen haben sich allesamt als falsch erwiesen. Der kommerzielle
Durchbruch von chemischen/biochemischen Sensoren ist bis heute fast vollständig
ausgeblieben. Dies zeigt, daß die entscheidenden Probleme bisher nicht gelöst werden konnten.
Die meisten Ansätze, wie piezoelektrische Sensoren (Quarzmikrowaagen, Surface-Acoustic
Wave-Sensoren, Lamb-Wave-Sensoren u.ä.), elektrochemische Sensoren (Amperometrie u. a.),
optische Sensoren ohne Label (Surface-Plasmon-Resonance (SPR), Interferometrie etc.),
optische Sensoren mit Label (Evanescent-Wave-Sensoren, Flow-Immunanalyse-Systeme u.v.a.)
konzentrierten sich zuerst auf die Realisierung eines "Einkanal"-Sensors für einen Analyten
(bzw. eine Analytgruppe). Diese Ansätze waren praktisch alle mit den o.g. Nachteilen behaftet.
Auch wenn sich langsam die Notwendigkeit einer Multianalytmessung durchsetzt, enden die
meisten Ansätze hier in einer Sackgasse: Es muß fast immer der komplette Meßaufbau mit n
multipliziert werden, wenn n Analyten gemessen werden sollen. Auch mit einer optimistischen
Berechnung der Massenfertigungskosten ist einleuchtend, daß hier meistens bei ca. 10 Sensoren
die technische und kommerziell sinnvolle Obergrenze liegt. Alles andere wird inakzeptabel
kompliziert und teuer. Hieraus folgt zwangsläufig, daß die bisher vorgestellten und bekannten
Sensoren weder für eine richtige Multianalytfähigkeit geeignet sind, noch die Probleme der
Kreuzreaktionen konsequent angegangen werden können.
Das BIACore-System (z. B. US 5313264) ist wohl das kommerziell erfolgreichste Konzept bis
dato. Das Verfahren benützt eine labelfreie Detektion, die auf Brechungsindexveränderungen
basiert. Das System ist besonders sinnvoll für Forschungszwecke, um z. B. kinetische
Konstanten von biochemischen Bindungsmolekülen zu untersuchen bzw. zu vermessen. Zwar
wurden auch Geräte mit mehreren Kanälen vorgesehen, um z. B. Referenzproteine vermessen zu
können, eine Parallelisierung im Sinne der vorliegenden Anmeldung scheint aber aufgrund des
komplizierten technischen Aufbaus unmöglich. Da auch alle Patente auf diesem Gebiet auf das
Surface-Plasmon-Resonance (SPR) System beschränkt sind, ist davon die vorliegende
Anmeldung nicht betroffen. Vergleichbar in der Anwendung ist das System, das in Bioforum
3/1996, S. 92 beschrieben wird.
Murex (in US 5096807) hat ein System beschrieben, das auf einer simultanen Detektion von
mehreren lichterzeugenden Probenvolumina beruht. Das Patent bezieht sich vorwiegend auf die
Detektion von Signalen und spart die Biochemie weitgehend aus. So ist auch aus Fig. 3 und Fig.
4 erkennbar, daß erstens nur sehr wenige parallele Systeme ausgelesen werden sollen und zudem
von einem dem Standard-Mikrotiterplattenformat sehr ähnlichen Aufbau ausgegangen werden
soll. So werden in US 5599720 getrennte Reaktionsgefäße mit separaten chemischen Systemen
vorausgesetzt. Es wird nicht, wie in der vorliegenden Anmeldung, ein System verwendet, das
primär aus einer einzigen Reaktionskammer besteht. Zudem fehlen auch sämtliche
Charakteristika, die für eine Multianalytfähigkeit auf der Basis von Kreuzreaktionen notwendig
sind. Sehr ähnlich ist DE 36 12 873 A1 zu bewerten.
In US 5413939 ist eine "Immuno-CD", also eine Scheibe mit immobilisierten Reagenz-Punkten,
beschrieben, die auf einer interferrometrischen Messung beruht. Das Patent bezieht sich
vollständig auf meßtechnische Aspekte. Chemische Probleme einer derartigen Immuno-CD
bleiben ausgeklammert. Auch von der Detektionsseite betrifft dieses Patent die vorliegende
Anmeldung nicht, da es sich hier um ein typisches sequentielles System und nicht um ein
paralleles handelt. Hiermit werden z. B. die Auslesezeiten mit der Skalierung der Analytanzahl
proportional höher, was zu einer oberen Grenze der sinnvollen Punktanzahl führt. Zudem ist
bekannt, daß interferrometrische Verfahren zur Analytik von Substanzen bisher zu unempfindlich
und oft auch zu unselektiv sind, um breit anwendbar zu sein.
Boehringer Mannheim hat ein Patent angemeldet (DE 44 35 727), in welchem ein Array von
Bindemolekülen beschrieben wird. Die Ansprüche sind jedoch nur auf sich nicht berührende
Metallschichtspots beschränkt. Die vorliegende Anmeldung benötigt keine Metallspots und ist
daher von DE 44 35 727 nicht betroffen. Zudem werden für die vorliegende Anmeldung
deutlich kleinere und dichtere Spot-Arrays bevorzugt.
Affymax hat ein paralleles Oligonucleotid-System z. B. zur Sequenzierung von DNA bzw. zum
Screening von kombinatorischen Peptidbibliotheken realisiert. Da das System weder zur
hochempfindlichen Spurenanalytik unbekannter Substanzen, noch zur echten Parallelanalytik
(das System wird sequentiell gelesen) verwendet wurde, betrifft nur das Einzelmerkmal
Parallelisierung an sich die Anmeldung. Die Lesung des Kreuzreaktionsproblems und die
Analyse beliebiger Substanzen auf einem Chip wurde von Affymax nicht beschrieben. In
US 5545531 wird eine Mikrotiterplatte vorgestellt, bei der die einzelnen Kavitäten mit je einem
DNA-Chip ausgerüstet sind. Die vorliegende Anmeldung zielt gerade nicht auf ein
Mikrotiterplattensystem ab. Zudem wird in US 5545531 die Auslesung sequentiell durchgeführt,
was gleichfalls dem Sinn der vorliegenden Anmeldung widerspricht. Letztlich ist US 5545531
weder für Nicht-Nukleinsäure-Derivate vorgesehen, noch zur quantitativen Analytik von
komplexen Analytmischungen geeignet. US 5324633 hingegen ist ganz auf die Bestimmung
von Affinitätskonstanten bezogen und zielt nicht auf die Analytik von Proben.
Multilyte Ltd. bzw. R. Ekins halten zwei Patente (US 5171695, US 5432099), die
Parallelsensoren zum Thema haben. US 5171695 beschreibt die Verwendung eines Systems, das
räumlich getrennte, immobilisierte Reagenzpunkte aufweist. Das System erfordert jedoch die
Verwendung von Doppelmarkern, sowie die Bedingung, daß nur ein insignifikanter Anteil der
Probe gebunden werden darf. Auch erfordert US 5171695 explizit die Verwendung
hochselektiver Reagenzien, da für das Auftreten unerwünschter Kreuzreaktionen keine Lösung
vorgestellt wird. Diesen Einschränkungen unterliegen die in dieser Anmeldung vorliegenden
Systeme nicht. In US 5432099 wird die unter US 5171695 beschriebene Methodik weiter
ausgebaut, wobei insbesondere Ansprüche für spezielle Beschichtungsdichten, Spot-Größen,
Affinitätskonstanten und Volumina aufgeführt sind. Da wie bei US 5171695 schon erwähnt, das
in der Anmeldung vorliegende System nicht auf den in den US-Patenten genannten restriktiven
Randbedingungen beruht und damit wesentlich vielseitiger einsetzbar ist, sind die auch in
US 5432099 aufgeführten Ansprüche hier nicht relevant. Auch fehlt es in US 5432099 an einer
konkreten Umsetzung, z. B. beruht die Zeichnung vollständig auf theoretischen Grundlagen.
Auch das erwähnte "Ambient-Analyte-Verfahren" bezieht sich auf einen speziellen Grenzfall
von Immunoassays, der jedoch für die vorliegende Anmeldung von geringer Bedeutung ist.
Basierend auf Forschungsarbeiten an der GBF in Braunschweig wurde kürzlich die erste
Kommerzialisierung eines für die On-line-Analytik vorgesehenen Immunsensors eingeleitet (U.
Bilitewsky et al., und DE 196 06 267 A1). Da jedoch wie schon beschrieben, in diesem Ein- oder
Wenig-Kanal-System die echte Multianalytfähigkeit und das Handling mit
Kreuzreaktionen fehlt, ist von diesem Patent die vorliegende Anmeldung nicht betroffen.
Vergleichbar ist DE 196 20 636 A1, das ein System mit einer Kapillare vorstellt. Die Bewertung
ist ähnlich wie DE 196 06 267 A1.
Die Erfindung umfaßt ein System, bestehend aus einer chemischen oder biochemischen
Meßvorrichtung, die eine räumliche (bevorzugt zweidimensionale) Anordnung von
Teilmeßsystemen (Arraystruktur) zur Messung der Zusammensetzung eines Fluids einschließt.
Diese Meßsysteme sind räumlich getrennt angeordnet, werden aber normalerweise nicht
physikalisch voneinander abgeschottet, wobei jedoch partielle Abschottungen durchaus dem
Sinn der Erfindung entsprechen. Die Erfindung wird zudem dadurch gekennzeichnet, daß eine
quasi-gleichzeitige (parallele) Messung und quasi-gleichzeitige Datenverarbeitung ermöglicht
wird. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß die Arraystruktur sehr einfach erweitert
werden kann, ohne explizit zusätzliche Einzelmeßsysteme zu benötigen. Die Erfindung ist auch
dadurch gekennzeichnet, daß die Arraygröße sehr hoch sein kann, und charakteristischerweise
über 10 Einzelsysteme (bevorzugt 1000 oder mehr) umfaßt.
Die Meßvorrichtung besteht bevorzugt aus einer mit Affinitätsmolekülen beschichteten Platte,
die in eine Flußkammer integriert ist. Die Affinitätsmoleküle werden in einer räumlich
nachvollziehbaren Weise mit üblichen Immobilisierungsmethoden aufgebracht. Die Messung
erfolgt nun z. B. in einer sog. kompetitiven Weise mittels markierter Substanzen, die gezielt mit
einer Untergruppe (wobei die Untergruppe auch die Gesamtheit erfassen kann) der
Affinitätsmoleküle in Wechselwirkung gebracht werden. Unter Affinitätsmolekülen versteht
man im Sinne der Erfindung alle Moleküle, die mehr oder weniger selektive Wechselwirkungen
mit anderen Molekülen eingehen können (z. B. Antikörper, Antigene, Protein A, Avidin,
Streptavidin, Biotin (sowie -derivate), Lectine, Nucleinsäuren, Enzyme, Proteinfragmente,
rekombinant veränderte Varianten der genannten Proteine, Haptene, auch Mischungen
derselben, Kavitanden, Komplexliganden, Indikatoren, farbstoffgekoppelte Moleküle,
Fluorezenzliganden u.ä.). Als Markierung kommen Fluoreszenzfarbstoffe, Radioisotope, stabile
Isotope, chemilumineszenzfähige Moleküle (z. B. Luminol-Derivate, Acridiniumester,
Adamantyldioxetane u.ä.), Biolumineszenzmarkierungen (Aequorin, Luciferine u.ä.), und
bevorzugt Enzyme (Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase,
Penicillinase, Glucose Oxidase, Luciferase u.ä.) in Frage. Enzyme lassen sich wiederum mit
verschiedenen Methoden detektieren (z. B. colorimetrisch mit ABTS(R), Tetramethylbenzidin,
Guajacol, 4-Nitrophenylphosphat etc., oder fluorimetrisch mit p-Hydroxyphenylessigsäure etc.,
oder bevorzugt durch Chemilumineszenz (Luminol, verstärkte Luminolreaktion, AMPPD etc.).
Die Reaktion der Affinitätsmoleküle (immobilisiert) mit den markierten Molekülen wird durch
ein geeignetes, quasi-paralleles Meßsystem detektiert, bevorzugt einer CCD-Kamera mit Inten
sifier oder ohne Intensifier mit back-illuminated-Anordnung. Die Meßkammer und das Detekti
onssystem sind mit einer geeigneten optischen Einrichtung verbunden, die Fasern, Linsen und
Spiegel beinhalten können, bevorzugt wird ein Linsensystem hoher Lichtstärke. Die CCD-
Kamera muß mindestens so viele Pixel besitzen, wie unabhängige Meßkanäle erforderlich sind.
Die Optik sollte eine Abbildung der Meßspots ungefähr in einem Abbildungsmaßstab 1 : 1 er
möglichen, welcher einen guten Kompromiß zwischen Systemgröße und Empfindlichkeit dar
stellt. Kleinere Abbildungsmaßstäbe führen z. B. zu Empfindlichkeitsgewinnen in der Detektion,
jedoch zu einer relativen Vergrößerung der Meßspots. Ein Abbildungsmaßstab von ca. 1 : 1 ist für
Linsensysteme relativ aufwendig, dagegen für faseroptische Systeme sehr günstig und platzspa
rend. Das System kann in eine lichtdichte Dunkelkammer plaziert werden, um Störlicht aus der
Umgebung weitgehend auszuschließen. Bei bestimmten Systemen kann auch ein Shutter
(Verschluß) sinnvoll oder sogar notwendig sein. Es können daher mechanische und/oder opti
sche und/oder akusto-optische Verschlüsse und/oder Blenden und/oder andere optische Ele
mente (z. B. Schalter) in das optische System eingefügt sein. Im Sinne der Anmeldung sind
jedoch auch andere optische Detektionsverfahren, ob mit (z. B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz)
oder ohne Markierung (z. B. Surface-plasmon resonance, Interferometrie) geeignet. Auch
nicht-optische Detektionsverfahren (siehe Anspruch 13) sind einsetzbar. Die Reaktanden wer
den bevorzugt mit einer oder mehreren Pumpen (z. B. Schlauch-, Zahnrad- oder bevorzugt Kol
benpumpen) in die Meßkammer gepumpt. Es kann aber auch die Schwerkraft, Kapillarkraft oder
Über- bzw. Unterdruck genutzt werden.
In der einfachsten Ausführung besitzt die Meßvorrichtung nur eine einzige Meßkammer (z. B.
Abb. 3). Für einige Anwendungen kann es jedoch günstig sein, die Meßkammer zu unterteilen
oder mehrere Meßkammern zu verwenden. Die Abschottungen können u. a. folgende Zwecke
haben: Verhinderung/Verminderung von gegenseitigen Reagenzienstörungen, simultane Ver
dünnungsreihe zur Meßbereichserweiterung, verbesserte Nutzung von Kreuzreaktionen, cy
clische Regenerierung (Erhöhung der Meßfrequenz), Abgrenzung von Substanzgruppen-
Reagenzien, Parallelmessung von mehreren Proben, Vermessung von Referenzproben
(Negativprobe, Standard-Lösungen), es werden zusätzliche Freiheitsgrade zur Analyse ge
wonnen (z. B. Substanzidentifikation, Verifikation, Quantifizierung), durch z. B. Variation der
Meßparameter, Zusatz von Additiven (wie Tensiden, Lösungsmitteln, pH-verschiebenden
Puffern, Inhibitoren, Komplexbildnern, Bindungsmolekülen zur Unterdrückung von Störun
gen (auch Antikörpern, Haptenen) und zur Messung von kinetischen oder thermodynamischen
Konstanten oder deren Äquivalenten. Die Kammer kann aus verschiedensten Materialien
bestehen, wie Glas, Quarzglas, Metall (bevorzugt sind Edelmetalle, Edelstahl oder Titan),
Kunststoffe (bevorzugt sind Fluorpolymere, wie Polytetrafluorethen, PTFE) oder beschichte
ten Materialien. Die austauschbare Wand kann gleichfalls aus ähnlichen Materialien bestehen,
wobei ggf. lichtdurchlässige Materialien notwendig sind (z. B. bei optischer Detektion). Es
können auch zusätzliche Unterteilungen der Meßkammer (bzw. mehrere Meßkammern) vor
handen sein. Die Unterteilungen können in einer Ebene liegen (Chip in parallele Flußkanäle
aufgeteilt und/oder wie ein Fensterkreuz aufgeteilt und/oder wie (ggf. verzerrte) Bienenwaben
aufgeteilt) und/oder gestaffelt untereinander angeordnet sein (Kammerstapel mit transparenten
und/oder lichtundurchlässigen Wänden). Die Meßkammer und andere Teile des Systems kön
nen optional in einer Dunkelkammer aus lichtundurchlässigem Material untergebracht wer
den. Das Verfahren ist auch dadurch gekennzeichnet, daß bevorzugt ein Fließsystem mittels
Pumpe(n) und/oder Ventil(en) verwendet wird. Optional können Filter, Entgaser, Blasenfal
len, Pulsationsdämpfer, Restriktoren, Verteiler, Autosampler und Probenahmehilfen einge
setzt werden. Für die Immobilisierung von Reagenzien werden bevorzugt Mikropumpen
(besonders bevorzugt Piezopumpen nach dem ink-jet-Prinzip mit Tröpfchen-Ausstoß), photo
lithographische Verfahren, Druckverfahren, Sprühverfahren, und/oder eine Kombination
dieser Techniken verwendet. Für die Immobilisierung von Reagenzien werden bevorzugt
hydrophobe Oberflächen (silanisiertes Glas, Kunststoff u.ä.), photochemisch aktivierbare
Oberflächen, chemisch aktivierte Oberflächen, chemisch aktivierte Reagenzien, selbstorgani
sierende Schichten (wie Alkylthiol-Derivate auf Goldoberflächen), Strept(avidin)/Biotin-
Systeme, Protein A, Protein G, Sekundärantikörper, Polymere, Sol-Gel-Gläser, Gele oder
membranähnliche Strukturen verwendet.
Für eine Regenerierung werden bevorzugt wäßrige Lösungen verwendet, deren pH-Wert
mehr als 2 Einheiten nach unten oder oben von pH 7 abweicht, ganz besonders bevorzugt
Lösungen mit einem pH von 1 bis 3. Bevorzugt werden auch Lösungen mit Harnstoff
und/oder Guanidiniumhydrochlorid und/oder Zusätzen von organischen Lösungsmitteln,
und/oder Tensiden, die eine konformationsändernde und/oder partiell oder vollständig denatu
rierende bzw. struktur- oder eigenschaftsverändernde Wirkung auf Bindungsmoleküle aufwei
sen. Bevorzugt werden auch Lösungen mit Enzymen, die Reagenzien abspalten oder in klei
nere Teile zerlegen können, ganz besonders bevorzugt werden hier Proteasen (z. B. Pepsin)
und Peptidasen (bzw. Nucleasen). Neben der Regenerierung im engeren Sinn, kann auch die
Unschädlichmachung der Markierung angewendet werden (bei Peroxidase-Markierung wird
die Verwendung von Wasserstoffperoxid in einer Konzentration von 0.1-5% bevorzugt). Zur
Anwendung kommen mathematische Verfahren, die den Aktivitätsverlust bei jedem Meß
schritt berechnen und alle Meßwerte entsprechend korrigieren.
Der Detektor, ggf. notwendige Ventile, Autosampler oder ähnliche Peripheriegeräte werden über
ein Rechnersystem programmiert gesteuert. Die Auswertung der Meßdaten soll bevorzugt über
ein leistungsfähiges Rechnersystem erfolgen, um die Ergebnisse möglichst ohne Verzögerung
zur Verfügung zu haben. Die Auswertung ist ein wichtiger Teil der Erfindung, da damit die
ursprünglich unabhängigen Teilmeßwerte zusammengeführt werden. Die Auswertung geschieht
mit sog. chemometrischen Methoden, die in ihrer Kombination die weitgehende Eliminierung
des Kreuzreaktionsproblems ermöglichen und zudem die Multianalytfähigkeit unterstützen. Es
hat sich herausgestellt, daß übliche chemometrische Verfahren, die schon zur Multianalyt-
Bestimmung eingesetzt wurden (wie neuronale Netze, multivariate Regression) bei den
vorgestellten Systemen nur von begrenztem Nutzen sind. Limitierend wirkt sich die
Akkumulation von Fehlern aus, da viele Kanäle nicht zur einzelnen Information beitragen und
nur den Gesamtfehler erhöhen. Dies kann verhindert werden, wenn möglichst viele
Vorinformationen in die Auswertung einfließen und implizit vorausgesetzt werden. So werden
für die Auswertung eines einzelnen Analyten nur wenige Kanäle hohen Informationsgehalts
verwendet, die restlichen Informationen werden für diesen Analyten nicht verwertet. Für den
nächsten Analyten werden wiederum andere Kanäle herangezogen (eine Überlappung ist jedoch
möglich). Auch sollten die Responsefunktionen stark beschränkt werden, da ansonsten der
Kalibrieraufwand extrem stark ansteigt. Es ist offensichtlich, daß bei fast allen Proben die
überwiegende Anzahl der Spots kein positives (ggf. Inhibitions-)Signal liefert und daher die zu
verarbeitenden Daten sehr stark reduziert werden können. In vielen Fällen kann sogar eine
Mischkalibrierung durchgeführt werden. Die chemometrische Auswertung erlaubt zusätzlich,
die Meßwerte zu bewerten und Fehler zu entdecken.
In Abb. 1 und 2 ist eine Vorrichtung dargestellt, die ein Ausführungsbeispiel für die praktische
Umsetzung des in der Anmeldung beschriebenen Verfahrens ist. Die experimentellen Daten
wurden an diesem oder an sehr ähnlichen Vorrichtungen gewonnen.
Glasträger (z. B. Objektträger für die Mikroskopie) werden gereinigt und silanisiert. Dazu
werden die Glasträger etwa eine Stunde bei Raumtemperatur in eine etwa 5%ige Lösung von
Trimethylchlorsilan in Isopropanol eingetaucht und anschließend mit Isopropanol und Metha
nol gewaschen. Die silanisierten Glasträger werden vor Gebrauch bei Raumtemperatur für 24
Stunden getrocknet. Monoklonale oder polyklonale Antikörper werden in basischem Carbo
nat-Puffer (pH 9,6) gelöst. Um das Eintrocknen der Antikörper auf dem Glasträger zu verhin
dern, werden 25% Glycerin zugemischt. Dann werden kleine Spots (etwa 1 µL) dieser ver
dünnten Antiköperlösungen auf den silanisierten Glasträger pipettiert. Man läßt bei Raum
temperatur etwa zwei Stunden inkubieren und wäscht dann die Glasträger gründlich mit ei
nem auf Phosphat basierenden Puffer (Waschpuffer, pH ca. 7,5). Der Puffer enthält Tween 20,
um eventuell anhaftende Mehrfachschichten von Antikörpern abzuwaschen.
Nach dem Spülen mit Waschpuffer werden die Chips in eine Lösung aus 0,5% BSA, 0,5%
Casein und 4% Tween 20 in Phosphatpuffer (pH 7,5) getaucht. Vor Gebrauch läßt man die
Chips mindestens eine Stunde lang in dieser Lösung stehen und spült sie vor dem Einbau in
die Küvette gründlich mit Waschpuffer, um lose anhaftende Blockingreagenzien abzuwa
schen. Die Chips können ohne signifikanten Verlust der Aktivität bis zu 24 Stunden in dieser
Blocking-Mischung stehen gelassen werden.
Der mit immobilisierten Antikörpern beschichtete Glasträger (Chip) wird in die Durchflußkü
vette eingebaut. Soll der Blindwert gemessen werden, wird der Tracer nur mit Wasser ge
mischt. Werden dagegen Proben vermessen oder Kalibrierungen durchgeführt, wird der
Tracer vor der Messung mit Probe oder Kalibrierungslösung vorgemischt. Die Tracerlösung
wird in die Küvette gepumpt. Nach einer Inkubationsdauer von fünf Minuten wird genügend
Waschlösung durch die Küvette gepumpt, um Tracer und, falls vorhanden, die Analyten voll
ständig zu entfernen. Dann wird Chemilumineszenz-Substrat in die Küvette gepumpt und mit
einer CCD-Kamera ein räumlich aufgelöstes Bild des Glasträgers aufgezeichnet. Dadurch
kann jeder einzelne Antikörper-Spot getrennt ausgewertet werden.
Zur Kalibrierung des Systems werden verschieden konzentrierte Lösungen des Analyten her
gestellt, wobei diese Kalibrierungslösungen möglichst den gesamten Meßbereich umfassen
sollten. Die einzelnen Analytlösungen werden mit dem Peroxidase-Tracer vorgemischt. Zur
Messung des Blindwerte wird nur Peroxidase-Tracer ohne Analyt verwendet. Als interne
Referenz jedes einzelnen Chips wird ein gegen Peroxidase gerichteter Antikörper (Anti-POD)
verwendet. Dazu bildet man nach der Messung des Blindwerte das Verhältnis zwischen dem
Signal jedes auszuwertenden Antikörper-Spots und dem Anti-POD-Signal. Die Höhe des
Anti-POD-Signals ist von der Zugabemenge des Analyten weitgehend unabhängig. Bildet
man daher nach der Messung eines Kalibrierungspunktes das Verhältnis aus Meßsignal und
Anti-POD-Signal und vergleicht dieses Verhältnis mit dem Verhältnis der Blindwerte, dann
kann der Grad der Inhibition des einzelnen Antikörper-Spots berechnet werden. Abb. 6 zeigt
das Meßsignal einer Blindwert-Messung für einen mit verschiedenen Antikörpern beschich
teten Chip. Werden nun auf verschiedenen Chips unterschiedlich konzentrierte Kalibrie
rungslösungen vermessen, erhält man Kalibrierkurven des Chips bei allen Antikörpern, die
mit dem betreffenden Analyten eine ausreichend hohe Kreuzreaktivität aufweisen. Bei dieser
Berechnung wird vorausgesetzt, daß jeder das Verhältnis der Blindwerte aller Signale eines
Chips von Chip zu Chip konstant ist. Dies gilt jedoch nur, wenn alle Chips einer Meßreihe
identisch präpariert und für alle Chips gleiche Antikörperinkubationszeiten verwendet wur
den. Abb. 10 zeigt eine auf diese Weise ermittelte Kalibrierungskurve für Terbuthylazin, die
für einen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität zu dieser Substanz erhalten wurde.
Zur Messung von Wasserproben wird ein Teil Probe mit einem Teil Tracer verdünnt, wobei
die Endkonzentration des Tracers nach dem Verdünnen identisch zu der Konzentration ist, mit
der der Blindwert bestimmt wurde. Dann wird die Messung durchgeführt wie unter 1.3.1
beschrieben. Mit dem ermittelten Signal wird aus der Kalibrierungskurve (siehe 1.3.1) des
jeweiligen Antikörpers die Konzentration des Analyten bzw. seiner Äquivalente abgelesen.
Zur Regenerierung im direkten Assayformat wird eine 0,1 M Glycin-Lösung verwendet, deren
pH mit konzentrierter Salzsäure auf den Wert 2,3 eingestellt und mit 10 vol-% 1-Propanol
gemischt wurde. Im Anschluß an einen Assayzyklus im direkten Assayformat kann der Chip
mit Hilfe dieser Lösung regeneriert werden. Bei der Regenerierung wird die Bindung zwi
schen immobilisiertem Antikörper und Tracer, sowie - falls vorhanden - zwischen Antikörper
und Analyt gespalten und der Chip somit in seinen Ausgangszustand zurückgeführt. Um zu
zeigen, daß diese Art der Regenerierung erfolgreich ist, wurden mit einem mit Antikörper
spots beschichteten Chip nacheinander mehrere Assayzyklen durchgeführt und Blindwerte
(d. h. keine Zugabe von Analyten) gemessen. Zwischen jeder neuen Blindwert-Messung wurde
die den Chip enthaltende Küvette mit der oben beschriebenen Lösung mehrmals durchspült
und somit regeneriert. Zum Test des Erfolgs der Regeneration wurde nach jeder Regeneration
eine Kontrollmessung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abb. 11 zu sehen. Die Grafik zeigt,
daß mit der oben beschriebenen Regenerationslösung tatsächlich der Tracer entfernt bzw.
zumindest inaktiviert wird, und daß der Chip nach der Regeneration für eine neue Messung
benutzt werden kann. Nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen nimmt das Blindwert-Signal
soweit ab, daß keine aussagekräftigen Messungen mehr durchgeführt werden können und der
Chip gewechselt werden muß. Die genaue Anzahl der mit einem einzigen Chip möglichen
Zyklen hängt von den verwendeten Antikörpern, Tracern sowie den individuellen Reaktions
bedingungen ab.
Um den Einfluß die Pixelgröße des Detektors (hier ein CCD-Chip mit 1100×330 Pixel, jeder
Einzelpixel hat eine Fläche von 24 µm×24 µm) auf die Detektion des Signals der einzelnen
Spots zu untersuchen, wurde der in Abschnitt 1.3.3 beschriebene Versuch mit zwei verschie
denen Binning-Formaten ausgewertet. Dabei wurde bei der ersten Auswertung ein Binning
von 5×5 = 25 gewählt, entsprechend einer resultierenden Gesamtzahl der Superpixel von
220×66. Die Kantenlänge jedes entstehenden Pixels beträgt somit 5×24 µm = 120 µm. Die
zweite Auswertung dagegen wurde mit einem Binning von 25×25 = 625 durchgeführt entspre
chend einer Gesamtzahl der resultierenden Superpixel von 44×13. Die Kantenlänge der hier
bei entstehenden Pixels beträgt somit 24×25 µm = 600 µm. Der Vergleich der Ergebnisse für
beide Bildformate ist in Abb. 11 dargestellt. Aus der Grafik geht hervor, daß beide Formate zu
absolut vergleichbaren Ergebnissen führen. Dieser Befund ist von entscheidender Bedeutung
für die minimale Spotgröße der verwendeten selektiven Bindungsreagenzien und damit für die
in diesem Patent beschriebene Skalierbarkeit der Analytik. Wenn man von kreisförmigen
Spots der selektiven Bindungsreagenzien ausgeht und voraussetzt, daß zwischen jedem Spot
ein Abstand bestehen soll, der gleich dem Durchmesser der Spots ist, so ergibt sich im oben
beschriebenen Fall für das Binning von 5×5 Einzelpixeln eine mögliche Spotzahl von
110×33 = 3630. Beträgt das Binning jedoch 25×25 Einzelpixel, so beträgt unter den gleichen
Annahmen die maximal mögliche Spotzahl 22×6 = 132. Wichtig in diesem Zusammenhang ist
auch der Abbildungsmaßstab. Je stärker das Licht fokussiert wird, umso höher ist die Intensi
tät auf dem CCD-Chip. Diese Option ist aber insofern limitiert, da das Objekt (der Reagenz
spot) entsprechend größer sein muß und bei gleicher Spotanzahl zu einer erheblichen Vergrö
ßerung der Flußkammer führt.
Glasträger (Glasplättchen) werden vor der Verwendung 2 h mit frisch bereiteter Piranha-
Lösung (1 Teil Wasserstoffperoxid (30%) + 2 Teile konz. Schwefelsäure) gereinigt. An
schließend wird mit Wasser gewaschen und bei 40°C an Luft getrocknet. Vor der Kopplung
der Haptene wird mit den Glasträgern eine Aminosilanisierung durchgeführt, um leicht modi
fizierbare Gruppen an der Oberfläche zu erhalten. Dazu werden 0,5 ml 2-(Aminoethyl)-3-
aminopropylmethyl-dimethoxysilan in 50 ml mit Wasser gesättigtem Toluol gelöst. In diese
Lösung werden die Glasträger für 12 h eingetaucht. Anschließend wird mit Toluol, Wasser,
0,1 M HCl, Wasser und Methanol gewaschen und für 15 min bei 80°C getrocknet. Man läßt
abkühlen. Für die Kopplung der Haptene werden gleiche Mengen von je 0,1 M Lösungen des
Haptens (z. B. 2,4-Dichlorphenoxybuttersäure) N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcar
bodiimid gemischt und in kleinen Spots (z. B. mit einer Mikropipette) auf die Glasträger auf
getragen. Um niedrige Kopplungsdichten des Haptens zu erreichen, kann dieses mit einem
"Blockinghapten" (z. B. Bernsteinsäure) in beliebigen Verhältnissen gemischt werden. Die
Raumtemperatur sollte dabei nicht über 20°C liegen. Am besten wird die Reaktion in einem
auf 8°C temperierten Kühlraum durchgeführt. Nach 2 h wird mit Glyme, Wasser und Metha
nol gewaschen und bei 40°C getrocknet. Um freie Aminogruppen auf dem Chip zu blockie
ren, wird der Chip über Nacht in eine Mischung aus 50 ml trockenem Tetrahydrofuran, 2 g
Bernsteinsäureanhydrid und 1 ml Pyridin getaucht. Nach Waschen mit Dimethoxyethan
(Glyme) und Wasser sind die Chips einsatzbereit und können in die Sensorzelle eingebaut
werden. Getrocknet sind die beschichteten Chips über Wochen haltbar. Für die Messung wird
die in Abb. 1 abgebildete Anordnung verwendet. Über jeweils separate Pumpen werden Re
generationslösung (1 mg/ml Pepsin in Glycin/HCl-Puffer; pH 1,7), Sekundärantikörper (z. B.
Anti-Maus; POD-markiert), Substratlösung (Pierce; CL-Substrat); Waschpuffer (Phosphate
Buffered Saline (PBS) mit Tween-20-Zusatz) und Wasser dosiert. Im Autosampler wird vor
der Messung der Antikörper zur Probe dosiert und das Gemisch injiziert. Der Ablauf des
indirekten Immunoassays auf dem Chip ist in Tabelle 1 zu sehen. Zur Regeneration liegen
zwar nur begrenzte Daten vor, es konnte aber gezeigt werden (Abb. 9), daß Regenerationen im
indirekten Format relativ einfach zu realisieren sind.
Das Ergebnis sei an der Messung des Analyten Trinitrotoluol (TNT) exemplarisch für einen
Analyten veranschaulicht. Abb. 8 zeigt die Kalibrierungskurve, die mit der oben beschriebe
nen Methode aufgenommen wurde.
Bedingungen: Antikörper: mAb-TNT; 1 : 10.000 verdünnt; im Verhältnis 1 : 3 mit der Probe (in
Wasser) vermischt; PBS-Puffer; 500 µl der Mischung injiziert; Sekundärantikörper: Anti-
Maus aus Ziege; 1 : 10 000 verdünnt in PBS-Puffer. Der Chip ist mit Haptenen gegen gegen
verschiedene Stoffgruppen beschichtet (z. B. Nitroaromaten, Triazine, Fluorescein). Für die
Auswertung wird das Signal der zu analysierenden Soffgruppe (TNT) mit dem Signal einer
nicht in der Probe vorhandenen Stoffgruppe (Triazin, Fluorescein) verglichen. Aus der Ände
rung dieses Verhältnisses ergibt sich die Kalibrierungskurve.
Die Glasträger werden wie in Beispiel 1 (direkter Assay) beschrieben silanisiert. Auf die vor
behandelten Träger werden Spots von 0,5 µl einer Lösung von Protein A (1 : 20 000) in basi
schem Carbonatpuffer (pH 9,6) aufgebracht und für 3 h inkubiert. Anschließend wird mit
tensidhaltigem Waschpuffer gewaschen. Für das Blocking werden die Glasträger über Nacht
in eine Lösung von je 0,1% Albumin aus Rinderserum (BSA) und Casein getaucht. Nach
einem weiteren Waschschritt werden die Glasträger in das Sensorsystem (Abb. 3) eingebaut.
Der Ablauf des Assays ist Tabelle 2 zu entnehmen.
Das Ergebnis einer Kalibrierungsreihe für Trinitrotoluol (TNT) zeigt Abb. 7.
Bedingungen: Antikörper: polyklonaler TNT-Antikörper (Serva); 1 : 5000; Boraxpuffer;
pH 8,5; Tracer: TNT-POD-Konjugat; 1 : 5000; PBS-Puffer; gemischt im Verhältnis 1 : 1 mit
Probe; die Mischung erfolgt automatisch; Regeneration: Glycin/HCl-Puffer; pH 2,3.
Um die Abnahme der Intensität von Zyklus zu Zyklus auszugleichen, wurde jeweils nach
zwei Proben ein Nullwert bestimmt. Mit den Nullwerten wurde eine Regression durchgeführt
und der gemessene Wert einer jeden Probe mit dem entsprechenden berechneten Nullwert
verrechnet.
Probleme treten bei allen Beispielen auf, wenn stark matrixbelastete Proben (Oberflächenwasser,
Abwässer, Blut, Urin, etc.) vermessen werden sollen. Hier werden die Proben je nach Belastung
um den Faktor 1 : 1 bis 1 : 100 mit PBS-Puffer verdünnt, der je 1% Tween 20 und Polyacrylsäure,
sowie 0,1% BSA enthält. Diese Zusätze haben keine signifikanten Einfluß auf die Empfindlich
keit des Assays, der Einfluß von Störstoffen wird dagegen stark reduziert. Die Messung erfolgt
dann wie unter Beispiel 1-3 beschrieben. Eine Verdünnung ist auch bei stark konzentrierten
Proben sinnvoll. Einerseits gelangt man auf diese Weise in den quasi-linearen Bereich der je
weiligen Methode, zudem werden aber auch Memoryeffekte im System reduziert bzw. sogar
vermieden.
Das Verfahren der vorliegenden Anmeldung eignet sich besonders gut zur Miniaturisierung, da
für weitgehend alle Komponenten miniaturisierte Varianten verfügbar sind. So sind Pumpen,
Ventile, faseroptische Bauteile, CCD-Systeme in entsprechend kleinen Bauformen erhältlich.
Abb. 5 zeigt ein System, das eine erste Stufe der Miniaturisierung darstellt. Der Bau höher inte
grierter Systeme hängt vorwiegend von der Verfügbarkeit entsprechender Bauteile ab. Ein be
vorzugtes System wird wie folgt gekennzeichnet: Die Integration eines flächenhaften Detek
tors (wie CCD-Chip) erfolgt mit einem kompakten faseroptischen System und einer Meßflä
che in einer Kammer, die an miniaturisierte Pumpen und/oder Ventile angeschlossen ist. Eine
besonders hohe Integration kann erzielt werden, wenn zudem sämtliche Steuerungselemente
und für die Auswertung und Darstellung des Ergebnisses benötigten Rechenchips auf einem
Silizium-Chip (oder einem Chip-Ensemble) vereinigt werden. Die ggf. benötigten Reagenzlö
sungen können in einem Kartuschensystem, einem Konzentratsystem oder in Form von ge
friergetrockneten Pulvern/Tabletten/Filmen zur Verfügung gestellt werden.
Claims (16)
1. Verfahren zur Multikomponenten-Analyse von Fluiden, dadurch gekennzeichnet, daß
- - die Analyse eines Analyten oder die parallele Analyse mehrerer Analyten ermöglicht wird,
- - dessen Multikanaldetektion durch Ortsauflösung der immobilisierten Reagenzien erreicht wird,
- - eine hohe Skalierbarkeit des Systems vorhanden ist,
- - Bindungsmoleküle verschiedener Spezifität verwendet werden,
- - die Reaktionen in einem oder wenigen (max. 10) Kompartiment(en) ablaufen,
- - nur eine oder wenige (maximale Probenanzahl=Anzahl der Kompartimente) Proben parallel abgearbeitet werden,
- - die Kreuzreaktionen der Bindungsmoleküle mittels chemometrischer Verfahren für die Analyse genutzt werden können,
- - mindestens 10 unabhängige Meßkanäle und/oder mindestens 10 diskrete, räumliche Meßbereiche vorhanden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Referenzwert (Nullwert)
bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Meß- und Reak
tionskammer verwendet wird, die eine leicht austauschbare Wand besitzen kann, auf deren
Oberfläche Reagenzien immobilisiert sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß eine physikalisch
unstrukturierte Oberfläche zur Immobilisierung von Reagenzien verwendet wird. Die Struktu
rierung wird durch Beschichtungen oder die lokale Immobilisierung selbst erzielt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß optische Detek
tionsverfahren verwendet werden. Insbesondere solche Systeme sind günstig, die aus einem
hoch-lichtstarken Linsensystem, und/oder einem oder mehreren hoch-lichtstarken Spiegel(n),
und/oder einer oder mehreren faseroptischen Platte(n), und/oder einer oder mehreren Tapern
(faseroptisches Bauteil), und/oder einer oder mehreren faseroptischen Bündeln, und/oder einer
oder mehreren Grin(Gradientenindex)-Linsen, und/oder einer oder mehreren
Grin(Gradientenindex)-Linsen-Zeile(n), und/oder einer oder mehreren Grin(Gradientenindex)-
Linsen-Platte(n) bestehen, und in Kombination mit Meßsystemen mit mehreren Kanälen ver
wendet werden, wie Photodiodenzeilen, CCD-Chips (charge-coupled-device), CID-Chips
(charge-injection-device), PDA-Chips (photo-diode-array), Mehrkanal-Photomultipliern,
Mikrokanalverstärkerplatten, optische Verstärker sonstiger Bauweise oder chemische De
tektoren (wie photographische Emulsionen). Bevorzugt werden luft- oder flüssigkeitsgekühlte
CCD-Chips in back-illuminated-Bauweise.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß durch eine
vollautomatische Auswertung eine Meßwertkorrektur und eine Selbstkalibrierung stattfinden
kann und automatische Verfahren zur Fehlerkontrolle, Anzeige von Matrix-Störungen
und/oder Qualitätskontrolle des Meßsystems zur Anwendung gelangen, die auf der Paralleli
sierung des Verfahrens beruhen.
7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mes
sung von thermodynamischen Konstanten und/oder kinetischen Konstanten oder deren empi
risches Äquivalent zur Charakterisierung von Substanzen und/oder zur Identifizierung
und/oder Quantifizierung von Analyten herangezogen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der/die
in Flüssigphase zugesetzte(n) Reaktand(en) (Bindungsmolekül, z. B. Antikörper; Marker-
Hapten-Konjugat oder ähnliche Reagenzien) sich nicht im Gleichgewicht mit den oberflä
chen-immobilisierten Reagenzien befindet/befinden.
9. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Va
riationen der Meßparameter zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Analyten her
angezogen werden, z. B. durch Zusatz von Additiven (wie Tensiden, Lösungsmitteln, pH-
verschiebenden Puffern, Inhibitoren, Komplexbildnern, Bindungsmolekülen zur Unterdrückung
von Störungen (auch Antikörpern, Haptenen, chemischen Reagenzien) oder auch durch
Temperaturänderungen und photochemische Prozesse.
10. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß
Verdünnungen der Probe zur Erweiterung des Meßbereichs und zur Detektion/Behebung von
Störungen verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß
das System oder Teile des Systems einer Miniaturisierung unterworfen wird/werden, die zu
einem integrierten Meßsystem hoher Leistung führt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die Regenerierung durch Dissoziation, Spaltung oder Zerstörung von Reagenzkomplexen
durch geeignete Reagenzlösungen oder Änderung der Reaktionsbedingungen (z. B. Tempera
tur) möglich ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet,
daß nicht-optische Meßsysteme mit mehreren Kanälen verwendet werden, wie Arrays oder
andere Anordnungen von Elektroden, Piezowaagen, akustischen Oberflächenwellenleitern
oder analogen Systemen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13, dadurch gekenn
zeichnet, daß getrennt oder in Kombination polyklonale, durch Affinitätsreinigung fraktio
nierte polyklonale (pseudo-monoklonale), monoklonale, rekombinante und andere Antikör
per(derivate), die u. a. monovalent und/oder bivalent sein können, Nucleinsäuren und deren
auch synthetische Derivate (z. B. PNA), Lectine, Protein A, Protein G, Cyclodextrine, Enzy
me, Apoenzyme, Rezeptoren, "Molecular Imprints", synthetische Antikörper, synthetische
Kavitanden, Komplexliganden, synthetische oder semisynthetische Polymere oder andere,
auch selbstindizierende, Wirts-Gast-Systeme als Bindungsmoleküle verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 14, dadurch gekenn
zeichnet, daß optisch detektierbare Markierungen verwendet werden, wie Chemilumineszenz-
Marker, bevorzugt Peroxidase mit Luminol-Reagenzien(gemischen), Alkalische Phosphatase
mit Dioxetan-Reagenzien(gemischen), beta-Galactosidase mit Dioxetan-Reagenzien-
(gemischen), Luminol-Derivate, Dioxetan-Derivate, sowie Acridinium-Ester; Biolumines
zenz-Marker, bevorzugt Leuchtkäfer-Luciferase/Luciferin, bakterielle Luciferase/Luciferin
und Aequorin; Fluoreszenz-Marker in Kombination mit einer zusätzlichen Anregungslicht
quelle (z. B. mit schnellen Verschlüssen, optischen oder akustooptischen Modulatoren verse
hene Lampen, Leuchtdioden, Laserdioden, sonstige Laser, Blitzlampen oder Deuteriumlam
pen) verwendet werden, bevorzugt Fluorescein-Derivate, Rhodamin-Derivate, Hydroxy
pyrentrisulfonsäure-Derivate, Perylen-Derivate, fluoreszierende bzw. Phosphoreszenz zeigen
de Lanthaniden-Chelate, Phycoerythrine, Cyaninfarbstoffe und andere NIR-Fluoreszenz-
Farbstoffe; fluorogene Substrate und chromogene Substrate in Kombination mit den passen
den Enzymen, wie 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, ABTS, 4-Nitrophenylphosphat, sowie an
dere Farbstoffe (UV, VIS, NIR), die z. B. durch ihre Absorption empfindlich nachgewiesen
werden können.
16. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß das System eingesetzt wird
- - für die Analyse von Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum, Speichel, Urin
- - zur Diagnostik von Infektionskrankheiten
- - zur Immundiagnostik
- - zur Status-Diagnostik bzw. Vorsorge-Diagnostik
- - zur Analyse von Lebensmitteln (z. B. Zusatzstoffe, Verfälschungen, Pestizidrück stände, Verderb, Toxine)
- - zur Analyse von Umweltproben (Wasser, Boden, Luft, Lebewesen)
- - zum Naturstoffscreening
- - zum Screening von Wirkstoffen (z. B. pharmazeutisch, agrarisch, tiermedizinisch)
- - zum High-Throughput-Screening (HTS)
- - zum Rezeptor-Screening (das z. B. Substanzen auf die Wirkung auf eine Vielzahl von Rezeptoren untersuchen soll)
- - zur Analyse von kombinatorischen Syntheseansätzen
- - zur Analyse von Strukturelementen (Strukturanalyse)
- - zur Abschätzung bzw. Vorhersage von Toxizitäten
- - zur Messung bzw. Abschätzung von Toxizitätsäquivalenten
- - zur Notfallanalytik von vergifteten Personen oder Tieren
- - zur Analyse von rekombinanten, modifizierten und natürlichen Proteinen und Protein mischungen
- - zur Analyse Nukleinsäuren und deren Derivaten
- - zur Prozeßanalytik z. B. in der Biotechnologie und in der chemischen Industrie
- - zur Analyse von Rohwasser, Trinkwasser, Abwasser, zum Flußwasser-Monitoring, als Wasserkontaminationsalarm-Sensor, zur Kontrolle und Steuerung von Wasseraufbereitungsanlagen.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE1997136641 DE19736641A1 (de) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Verfahren und Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen Mischungen |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE1997136641 DE19736641A1 (de) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Verfahren und Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen Mischungen |
Publications (1)
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DE19736641A1 true DE19736641A1 (de) | 1999-03-11 |
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DE1997136641 Ceased DE19736641A1 (de) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Verfahren und Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen Mischungen |
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