DE69936099T2

DE69936099T2 - Nachweis sehr geringer Mengen von Analyt, der an eine Festphase gebunden ist

Info

Publication number: DE69936099T2
Application number: DE69936099T
Authority: DE
Inventors: Robert J. Yorba Linda OBREMSKI; John W. Yorba Linda SILZEL; Tsong-Tseh Orange TSAY; Bibijana Yorba Linda CERCEK; Charles L. Orange DODSON; Tung Rung Fullerton WANG; Yagang Irvine LIU; Shaomin Yorba Linda ZHOU
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: WO1999054736A1; US20020001853A1; EP1073903A1; US7157234B2; DE69936099D1; EP1073903B1; JP2002512371A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der Erfindung betrifft Ligandenbindungsassays, in denen der Analyt direkt oder indirekt auf der Grundlage seiner spezifischen Affinität für ein chemisch modifiziertes festes Material nachgewiesen und quantifiziert wird.
HINTERGRUND
Die Fähigkeit, chemische Messungen in mikroskopischen Volumina durchzuführen, findet in der analytischen Chemie viele Anwendungen. Dies ist insbesondere für die breite Gruppe heterogener "Ligandenbindungsassays" wahr. Diese breite Klasse schließt Hybridisierungsassays für spezifische DNA Sequenzen, Immunassays, die immobilisiertes Antigen oder Antikörper einsetzen, und die Rezeptorassays, die im Hochdurchsatz Screenen von Pharmazeutika verwendet werden, ein.
Wenn solche Assays auf das mikroskopische Niveau „maßstäblich reduziert" werden, gibt es eine klare Reduktion in den Kosten pro Test entsprechend der Verwendung geringerer Mengen der "Sorptions"materialien – der eingesetzten spezifischen Antikörper, Nukleinsäuresonden oder Rezeptor Moleküle. Da diese Reagenzien häufig ausgezeichnete Selektivität für den Analyt aufweisen müssen, während sie anderen Probenbestandteilen gegenüber inert bleiben, stellen sie häufig einen großen Anteil der gesamten Reagenskosten in herkömmlichen Assayverfahren dar. Zusätzlich zu der maßstäblich entsprechenden Reduktion von Kosten können Mikromaßstabsverfahren paralleles Testen auf mehrere Analyte in einer einzigen Probe erleichtern. Maßstäbliches Reduzieren ermöglicht, dass mehrere Tests innerhalb der Grenzen herkömmlicher optischer Systeme optisch untersucht werden.
Die Theorie mikroskopischer Assays ist durch die Arbeit von Ekins et al. {"Multianalyte Microspot Immunoassay – Microanalytical "Compact Disc" of the Future," Clin. Chem. 37(11), 1955–1967 (1991); "Development of Microspot Multi-Analyte Ratiometric Immunoassay using Dual Fluorescent-Labelled Antibodies," Anal. Chim. Act. 227, 73–96, (1989)} erweitert worden, die auf das Konzept eines „Umgebungsanalyt" Assays gerichtet ist. Unter Umgebungsanalyt Bedingungen ist die Gleichgewichtsanzahl von Analytmolekülen, die durch die feste Phase gebunden sind, minimal relativ zu der Anzahl von Analytmolekülen, die in der Lösung vorliegen. Ein solches System stört die Analytkonzentration in der Lösung über der Festphase während des Verlaufs eines Assays minimal. Dieser Ansatz hat den theoretischen Vorteil, jegliche Gleichgewichte zwischen dem Analyt und anderen Probenbestandteilen minimal zu stören. Zum Beispiel kann es in einem diagnostischen Assay erwünscht sein, die Konzentration eines "freien" Arzneimittelmoleküls in der Anwesenheit einer Albumin gebundenen Form zu bestimmen, ohne das physiologische Gleichgewicht der Probe zu stören. Der „Umgebungsanalyt" Assay weist auch den Vorteil auf, minimalen Massentransport von einer Lösung zur Oberfläche zu benötigen und stellt so minimale Anforderungen an die Kinetiken des Transports von der Menge der Lösung zu einem mikroskopischen Bereich, der ein Einfangreagens trägt.
Umgebungsanalyt Assays sind durch Ekins et al. unter Verwendung des Massenwirkungsgesetzes und chemischer Aktivitäten modelliert worden, die durch Teilen der Menge von Analytbindungsstellen, die auf dem festen Träger bereitgestellt werden, in das gesamte flüssige Reagensvolumen berechnet wurden. Mit diesen Annahmen gelten "Umgebungsanalyt Assay" Bedingungen als bestehend, wenn die Bindungsstellen "Aktivität" < 0,01 K^–1 beträgt, wobei K die Ligandenbindungsaffinität in Liter Mol^–1 ist. Ekins et al. weisen darauf hin, dass ein Reduzieren des Bereichs der Festphase, die in einem Assay angewendet wird, auch die Hintergrundsignale reduziert, die oft die Sensitivität von Ligandenbindungsassays beschränken. Obwohl der "Umgebungsanalyt" Ansatz dazu neigt, ein Signal durch Reduzieren der Menge eines gebundenen Analyten zu reduzieren, ermöglicht die Hinter grundreduktion, die durch die Verwendung mikroskopischer Festphasen Bereiche geboten wird, dass das gesamte Signal zu Hintergrund Verhältnis für hohe Sensitivität günstig bleibt.
Das Umgebungsanalyt System stellt aufgrund seiner geringen prozentualen Rückgewinnung von Analyt strenge Anforderungen an Lasermonochromatizität, optische Filter, zulässiges Streulicht und, vielleicht am wichtigsten, an den zulässigen Hintergrund von der Festphase selbst. Darüber hinaus beschränken die praktischen Belange von Analytkonzentration und Probenvolumen die gesamte Anzahl von Analytmolekülen, die zum Nachweis verfügbar sind. In der Tat kann für einige Mikromaßstabsanwendungen die vollständige Menge von Analyt, die in der Probe verfügbar ist, zur praktischen Bestimmung über dem Hintergrund kaum ausreichen.
Wegen der vorangegangenen Gründe besteht ein Bedarf an Mikromaßstabsassayverfahren mit erhöhter Sensitivität für sehr geringe Mengen von Analyt. Vorzugsweise werden die miniaturisierten Bindungsassays die Menge von Analyt, der an ein Substrat gebunden ist, zur Bestimmung und Quantifizierung maximieren. Darüber hinaus sollten solche maßstäblich reduzierten Bindungsassays die Verwendung von "Sorptionsmaterialien" minimieren und ermöglichen, dass mehr als ein Assay mit demselben Probenvolumen durchgeführt wird.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Assayverfahren gerichtet, das den Bedarf an Mikromaßstabsbindungsassays mit erhöhter Sensitivität für sehr geringe Mengen von Analyt abdeckt.
Der Bindungsassay weist eher Analytmasse als Analytkonzentration in einer flüssigen Probe nach. Eine Anordnung von Sorptionsbereichen wird auf einem Substrat immobilisiert. Die Sorptionsbereiche schließen einen Analytbindungspartner ein, der eine Oligonukleotidsonde, ein Antikörper oder ein Rezeptor Molekül sein kann. Wenn ein definiertes Volumen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie einen Analyt enthält, auf einem Sorptionsbereich abgelegt ist, wird der Analyt von der Probe wesentlich abgereichert, um einen Analyteinfangkomplex mit dem Analytbindungspartner zu bilden. Interessierende Analyte können Polynukleotidmoleküle, Antigene, Haptene, Arzneimittel und Hormone einschließen. Im Allgemeinen liegt der Analytbindungspartner relativ zu dem Analyt im molaren Überschuss vor.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der Sorptionsbereich auch einen ersten an das Substrat gebundenen Bindungspartner, wobei der erste Bindungspartner einen ersten Bindungskomplex mit einer konjugierten Verbindung bildet. Die konjugierte Verbindung umfasst einen ersten Liganden und den Analytbindungspartner. Der erste Ligand bindet spezifisch an den ersten Bindungspartner, und der Analytbindungspartner kann spezifisch an den Analyt binden. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Avidin oder Streptavidin als den ersten Bindungspartner, wobei der erste Ligand Biotin ist. Eine am meisten bevorzugte Ausführung verwendet einen biotinylierten Antikörper als konjugierte Verbindung.
Der Immobilisierungsschritt kann durch das Verteilen von Tropfen unter Verwendung eines Druckerstrahls durchgeführt werden, um die Anordnung von Sorptionsbereichen zu bilden, wobei das Volumen der Tropfen etwa 80 pl bis etwa 1 nl beträgt. Vorzugsweise schließt der Immobilisierungsschritt eine kovalente Bindung von einem Bindungspartner an das Substrat ein.
Der Analyteinfangkomplex wird mit einer fluoreszierenden Markierung markiert, und der Sorptionsbereich wird mit einem Laser in der Abwesenheit von Flüssigkeit beleuchtet. Die fluoreszierenden Markierungen sind vorzugsweise Carbocyaninfarbstoffe, wie Cy5, BCy5, DBCy5, Cy7, BCy7 und DBCy7. Darüber hinaus wird der Markierungsschritt vorzugsweise durch Inkubieren des Analyteinfangkomplexes mit einem markierten Bindungspartner durchgeführt. Der markierte Bindungspartner weist eine fluoreszierende Markierung auf, vorzugsweise einen Carbocya ninfarbstoff, und kann auch an den Analyteinfangkomplex binden. Am meisten bevorzugt ist der markierte Bindungspartner ein Antikörper.
Der Beleuchtungsschritt wird vorzugsweise durch das Richten von nahen Infrarot-Ausstrahlungen von einer Laserquelle durch einen Prismakoppler in das Substrat durchgeführt, wodurch eine Evaneszenzwellenanregung von Fluoreszenz erzeugt wird. Fluoreszenzausstrahlungen werden von jeglichem Sorptionsbereich, der einen mit einer fluoreszierenden Markierung markierten Analyteinfangkomplex aufweist, nachgewiesen, wodurch die aus dem definierten Volumen der Probe gesammelte Analytmasse bestimmt wird.
Bevorzugte Substrate sind aus der Gruppe, bestehend aus Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen und Polymethylmethacrylat ausgewählt. Darüber hinaus kann das Substrat in der Form eines Films, Bogens, Streifens oder einer Mikrotiterplatte vorliegen.
Der Assay kann unter Verwendung eines definierten Volumens einer Probe von etwa 50 μl bis etwa 500 μl optimiert werden. Vorzugsweise beträgt die Menge des in einem Sorptionsbereich immobilisierten Analytbindungspartners von 10⁵ bis etwa 10¹² Moleküle Analytbindungspartner, und der Durchmesser der Sorptionsbereiche beträgt etwa 60 µm bis etwa 500 µm. Unter diesen Bedingungen können etwa 10⁵ bis etwa 10¹⁰ Moleküle Analyt pro Sorptionsbereich nachgewiesen werden.
Eine am weitesten bevorzugte Ausführung des Assays ist ein Multianalytassay, wobei die Anordnung von Sorptionsbereichen eine Mehrzahl verschiedener Analytbindungspartnern umfasst. Die Sorptionsbereiche können auch in mindestens zwei Untermengen unterteilt werden, wobei eine erste Untermenge von Sorptionsbereichen einen ersten Analytbindungspartner enthält und eine zweite Untermenge von Sorptionsbereichen einen zweiten Analytpartner enthält.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, angehängten Ansprüche und beiliegenden Zeichnungen, in denen:
1 das berechnete TSH Assaygleichgewicht für "Massenassay" und "Umgebungsanalyt Assay" Systeme zeigt (es werden eine Antikörperaffinität von 10⁺¹⁰ Liter Mol^–1 und ein Volumen von 100 μl angenommen; für den Massenassay werden 10¹⁰ Bindungsstellen pro 100 μl angenommen);
2 eine schematische Darstellung der Vorrichtung zeigt, die für Evaneszenzwellenanregung und Bild gebenden Fluoreszenz Nachweis verwendet wird;
3 einen Bild gebenden Nachweis von DBCY5 Farbstoff, gedruckt unter Verwendung von Lösungen bekannter Konzentration, der Präzisions- und Nachweisgrenzen bestimmt, zeigt; der Einsatz zeigt ein typisches CCD Bild einer Mikroanordnung;
4 Dosis-Antwort-Daten für DBCY5 Biotin, das mit Avidin Mikroanordnungen inkubiert wurde, zeigt; die Daten zeigen Abhängigkeit vom Volumen der Probe während der Inkubation; nicht kovalente Adsorption von Avidin an einen Polystyrolfilm ergibt geringe Signale;
5A die Daten von 4 zeigt, die gegen die vorliegende DBCY5 Biotinmasse aufgetragen wurden, die erneut aufgetragenen Dosis-Antwort-Daten geben an, dass die Mikroanordnung eher Analytmasse als -konzentration auffindet, d.h. Analyt "Sammeln" findet statt;
5B eine Dosis-Antwort-Kurve für ein 200 Mikroliter Volumen von DBCY5 Biotin zeigt, wobei eine Massennachweisgrenze für das Avidin-Biotin System von ungefähr 10⁶ Molekülen pro Spot angegeben wird (die Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung über der durchschnittlichen Dichte einer 9-Spot Anordnung an);
6 zeigt, dass ein Reduzieren der Anzahl von Stellen ein Erhöhen des Signals ergibt – ferner Evidenz des Sammelns; die Berechnung unter Verwendung eines Gleichgewichtsmodells gibt an, dass jegliche kinetische Beschränkung gering ist;
7 Dosis-Antwort-Kurven für einen IgG3 Mikroanordnungsassay zeigt; die Spezifität wird für die IgG3 Unterklasse relativ zu einem Kontrollexperiment mit IgG4 Klasse Myelom beobachtet (Daten einer 3-stündigen Inkubation würden innerhalb des angegebenen internen Anordnungsstandardfehlers für die über Nacht Inkubationen liegen);
8 Dosis-Antwort-Kurven des IgG3 Assays und des Avidin-Biotin Systems zeigt, die gegen Masseeinheiten aufgetragen wurden; es gibt eine Begrenzung aufgrund unspezifischer Bindung auf den IgG3 Assay, aber ungefähre Übereinstimmung entlang linearer Anteile beider Kurven beim Annähern der maximalen Signalniveaus;
9 Rohbilddaten von dem vier-Analyt Assay humaner Unterklasse zeigt; Zahlen über jeder Mikroanordnungssäule geben die Anzahl von Serienverdünnungen, die für jede Unterklasse während der Präparation der getesteten Vier-Bestandteilsmischung durchgeführt wurden, in einem gegebenen Bild an ("B" gibt eine Blindprobe an); und
10 Dosis-Antworten für die vier humanen Unterklassen zeigt, die gleichzeitig für jede der acht "Zufalls"mischungen von humanen Myelomproteine getestet wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
I. Einleitung
Reduktion von Größe bietet für analytische Verfahren viele erwartete Vorteile, wie reduzierte Kosten, schnellere Chemie und äquivalente oder verbesserte Sensitivität. Die vorliegende Erfindung ist auf Ligandenbindungsassays gerichtet, in denen der Analyt direkt oder indirekt auf der Grundlage seiner spezifischen Affinität für ein chemisch modifiziertes festes Material quantifiziert wird. Diese breite Klasse schließt Hybridisierungsassays für spezifische DNA Sequenzen, Immunassays, die immobilisiertes Antigen oder Antikörper einsetzen, und die Rezeptorassays ein, die im Hochdurchsatz Screenen von Pharmazeutika verwendet werden. Zusätzlich zu den oben angemerkten Vorteilen stellt die vorliegende Erfindung eine Multianalytfähigkeit bereit, wobei alle Analyte der Festphase gleichzeitig exponiert und gleichzeitig gemessen werden.
Unsere Bestrebungen Assaytechnologien "maßstäblich zu reduzieren", entstanden aus einem Wunsch, das nützliche analytische Signal von jeglichem gegebenen Assaysystem zu maximieren. Insbesondere zeigen unsere Experimente an, dass direkter Laser induzierter Fluoreszenz (LIF) Nachweis größeren dynamischen Bereich und Einfachheit bot als viele Assaynachweisverfahren, die Enzymamplifikation einschließen. Hintergrundfluoreszenz von biologischen Stoffen, die häufig die Sensitivität von direkter Fluoreszenz im sichtbaren Bereich beschränkt, wurde in unserem Labor größtenteils durch die Verwendung von Fluorophoren umgangen, die im kurzwelligen nahen Infrarot (NIR) Bereich ausstrahlen, wo biologische Stoffe optisch inerter sind {Obremski, R.J., et al., "Near IR fluorescence: instrumentation, application, and pitfalls." In: Burgess, C., Jones, D.G., Hrsg., Spectrophotometry, Luminescence and Colour; Science and Compliance. Amsterdam: Elsevier, 1995: 235–246}. Die Sensitivität unter Verwendung von LIF im NIR Bereich wurde dann prinzipiell durch Raman Streuung vom Lösungsmittel (im Allgemeinen Wasser) und durch die optischen Gesichtspunkte beschränkt, effiziente Anregung eines Lösungsvolumens oder einer Festphase mit Dimensionen in der Größenordnung von 0,5 bis 1 cm zu erreichen.
Eine Lösung dieser Probleme wurde im Einbringen des gesamten Festphasen "Sorptions"mittels für einen Assay in ein mikroskopisches Volumen gesehen, das durch einfache Laseroptik untersucht werden könnte. Ein Entfernen der Festphase von der flüssigen Umgebung und ein Durchführen unserer Messungen in der Abwesenheit von Flüssigkeit würden dann Lösungsmittel Hintergründe eliminieren. Wir erwarteten, wie Ekins und Chu {"Multianalyte Testing [Letter]. Clin Chem 39: 369–370 (1993)}, dass die Hintergrund Fluoreszenz oder Streuung in Bezug auf die Festphase selbst abnehmen würde, da der betrachtete "Sorptions"bereich reduziert wurde. Jedoch reduziert unsere Verwendung des NIR diesen Hintergrund weitgehend auf die unvermeidbare Raman Streuung, und unser vorrangiges Anliegen war die Maximierung des Signals. Um diese Maximierung zu erreichen, haben wir Verfahren zum Präparieren mikroskopischer Sorptionsbereiche entwickelt in einem Bestreben, die Probenkonzentration durch Sammeln der gesamten Analytmasse, bis zum möglichen Ausmaß, auf dem mikroskopischen Messbereich maximal zu stören. In unserem Assaysystem wirkt deshalb der mikroskopische "Sorptions"bereich als ein Probenkonzentrationsgerät. Im Unterschied zu dem "Umgebungsanalyt" System von Ekins et al., das Analytkonzentrationen misst, bestimmt unser Verfahren stattdessen die Analytmasse, die in dem angewandten Flüssigkeitsvolumen vorliegt. In der Theorie würde dieses Massenassaysystem eine äquivalente Antwort auf eine 100 μl Probe, die 10^–3 M Analyt enthält, oder auf ein 10 μl Aliquot ergeben, das denselben Analyt von 10^–12 M enthält. Dies setzt ein Gleichgewicht des Einfangsreagens mit der Flüssigkeitsmenge voraus, was im experimentellen Abschnitt behandelt wird.
II. Massenassaytheorie
Es wird ein TSH Assay betrachtet, der unter Verwendung des vorgeschlagenen "Massenassay" Verfahrens durchgeführt wird. Es wird im experimentellen Abschnitt gezeigt, dass unsere typische Bindungskapazität in einem einzigen 150 Mikron Sorptionsbereich in der Größenordnung von 10¹⁰ Analytmolekülen liegt. Wenn dieser Bereich mit einem 100 μl Probenvolumen in Kontakt gebracht wird, würde die effektive "Konzentration" eines Sorptionsmittels 1,7 × 10^–10 M betragen. Es wird angemerkt, dass dies 1 – 2 Zehnerstellen höher ist als die 0,01 K^–1, die durch die "Umgebungsanalyt" Theorie diktiert werden, da die meisten optimierten Antikörper K nahe 10⁹ oder 10¹⁰ aufweisen.
Es wird Gleichung (1) betrachtet, in der N die Avogadro'sche Zahl ist und x die Anzahl von Molekülen des Antigen-Antikörper Komplexes darstellt, der in einem System eines Volumens V im Gleichgewicht vorliegt unter Annahme einer Affinitätskonstanten K mit Ab_o und Ag_o– Mol Antikörper bzw. Antigen, die anfänglich vorliegen. Unter "Umgebungsanalyt" Bedingungen würde der Komplex wenig Wirkung auf die Konzentration in Lösung haben, und die Variable x kann bezüglich des Nenners fallen gelassen werden. Unter Annahme von K = 10¹⁰ Liter Mol^–1, eines Volumens von 100 Mikrolitern und 60.000 Molekülen TSH, die für einen Assay verfügbar sind (10^–15 Mol Liter^–1), würden 600 Moleküle gebunden werden und ein Signal bereitstellen. In dem "Massenassay" Verfahren muss Gleichung 1 in quadratischer Form gelöst werden, und es wird festgestellt, dass bei einem Gleichgewicht annähernd 38.000 Moleküle des Analyten gebunden werden, über 60 % der verfügbaren gesamten Analytmasse. Das absolute Fluoreszenzsignal, das von dem "Massenassay" erwartet wird, beträgt 60 Mal dessen, was aus den Richtlinien berechnet wird, die für "Umgebungsanalyt" Bedingungen vorgeschlagen werden. Der theoretische Vorteil prozentualer Rückgewinnung wird bei höheren Analytkonzentrationen erhalten, wie in 1 angegeben ist.
Natürlich werden diese Modelle und Diskussion unter der Annahme aufgestellt, dass ein chemisches Gleichgewicht in Ligandenbindungsassays mikroskopischen Maßstabs unter angemessenen Bedingungen erreicht werden kann. Die Formulierung thermodynamischer chemischer Aktivitäten in Gleichung (1) unter Verwen dung des gesamten Flüssigkeitsvolumens ignoriert klar die kinetische Diffusionsgrenze zwischen der Mengen der Lösung und einem mikroskopischen Sorptionsbereich, die in jedem realen System funktionieren muss. Natürlich fordert das Massenassayverfahren die Minimierung des Assayvolumens (durch die Vermeidung von Probenverdünnung), um maximales Sammeln von Analyt zu erleichtern.
III. Proben und Analyte
Der erfindungsgemäße Bindungsassay kann zur Verwendung mit einer Vielfalt flüssiger Proben angepasst werden. Klinische Proben, wie Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit oder Urin werden bevorzugt. Ein interessierender Analyt, der in der Probe nachgewiesen werden kann, ist vorzugsweise ein klinisch relevantes Biomolekül, das fähig ist, spezifisch an einen Bindungspartner zu binden, wie ein Oligonukleotid, Antikörper oder Rezeptor Molekül. Solche Analyte können Polynukleotide mit einer spezifischen Nukleotidsequenz einschließen, die komplementär zu einer Oligonukleotidsonde, Antigenen, Haptenen, Arzneimitteln und Hormonen ist. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung ist der Analyt eine antigene Substanz, die fähig ist, spezifisch an einen Einfangantikörper zu binden.
IV. Substrat
Das erfindungsgemäße Assaysystem wird durch erstes Immobilisieren von "Sorptionsmaterial" an einem Substrat oder festen Träger durchgeführt. Der feste Träger ist vorzugsweise ein unlösliches nicht poröses Plastikmaterial oder Glas. Polystyrol ist aufgrund seiner optischen Transparenz, seines hohen Brechungsindexes und seiner Zugänglichkeit für chemisches Koppeln ein bevorzugtes Plastikmaterial, aber andere Polyolefine oder Acryl- oder Vinylpolymere können gleichermaßen verwendet werden. Zum Beispiel sind Polycarbonat, Polymethylmethacrylat, Polyethylen und Polypropylen alle geeignet. Das Substrat kann in der Form eines Films, Bogens oder Streifens vorliegen, die mit einer Anordnung von Tropfen gespottet werden können. Alternativ kann das Substrat Teilchen sein oder in einer Multikammerkonfiguration, wie einer Mikrotiterplatte, vorliegen, worin flüssige Proben definierter Volumina leicht in regelmäßigen Abständen an voneinander getrennten Orten aufbewahrt werden können. Wenn der Beleuchtungsschritt des Assays unter Verwendung von Evanesenzwellenanregung der Fluoreszenz (unten detaillierter erklärt) durchgeführt wird, ist das Substrat vorzugsweise ein transparentes Material mit einem hohen Brechungsindex, am meisten bevorzugt mit einem Brechungsindex, der höher ist als der von Wasser.
V. Sorptionsbereiche
Die erfindungsgemäßen Sorptionsbereiche sind diskrete Bereiche auf dem Substrat, wo Sorptionsmaterialien lokalisiert sind. Die Sorptionsmaterialien können Liganden einschließen, die spezifisch an einen Bindungspartner binden können. Zum Beispiel können Liganden Oligonukleotide, Haptene, Antigene, Arzneimittel, Hormone oder Biotin einschließen. Darüber hinaus können Sorptionsmaterialien auch die entsprechenden Bindungspartner einschließen, die spezifisch an Liganden und/oder Analyte binden. Entsprechend würde der Bindungspartner eines Oligonukleotids eine Nukleinsäure mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz sein. Der Bindungspartner eines Arzneimittels oder Hormons könnte ein Rezeptor Molekül sein. Ein Bindungspartner von Biotin ist Avidin oder Streptavidin. Darüber hinaus weisen die meisten Liganden entsprechende Antikörper Moleküle auf, die spezifische Bindungspartner sind.
Entsprechend werden die Analytbindungspartner vorzugsweise Antikörper sein, weiter bevorzugt monoklonale Antikörper. Monoklonale Antikörper sind für eine breite Vielfalt von Analyten kommerziell verfügbar oder können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Die verwendeten Antikörper werden im Allgemeinen herkömmliche Affinitätskonstanten in der Größenordnung von etwa 10⁸ bis etwa 10¹¹ Liter/Mol aufweisen, jedoch können auch Hochaffinitätsantikörper mit Affinitätskonstanten von etwa 10² bis etwa 10³ verwendet werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung schließt der Sorptionsbereich einen ersten Bindungspartner und eine konjugierte Verbindung ein. Die erste Bindung kann jeglicher der Bindungspartner sein, die oben angeführten sind, aber am meisten bevorzugt ist Avidin oder Streptavidin aufgrund der Hochaffinitätsbindung (etwa 10¹⁵ Liter/Mol) dieser Sorptionsmaterialien mit Biotin. Die konjugierte Verbindung ist aus einem ersten Liganden und einem Analytbindungspartner zusammengesetzt. Der erste Ligand kann jeglicher der oben angeführten Liganden sein, in Abhängigkeit vom ersten Bindungspartner, aber am meisten bevorzugt ist Biotin. Entsprechend ist eine am meisten bevorzugte konjugierte Verbindung ein biotinylierter Antikörper.
Die Dimensionen der Sorptionsbereiche sind durch die Präzision und Genauigkeit des Verfahrens beschränkt, das Bereiche in einer Anordnung verteilt. Jedoch gibt die ökonomische Verwendung kostspieliger Sorptionsmaterialen vor, die Größe von Sorptionsbereichen auf einem Minimum zu halten. Darüber hinaus erhöht ein Minimieren der Größe eines Sorptionsbereichs, der eine fluoreszierende Markierung enthält, unerwartet das Signal zu Rausch Verhältnis während eines Bildnachweises. Aus einem praktischen Grund kann ein Tropfenvolumen von ungefähr 80 Picolitern Sorptionsmaterial mit einer Präzision von etwa 6 % CV unter Verwendung von Thermo-/Piezostrahldruckverfahren verteilt werden. Der Durchmesser der Sorptionsbereiche, die unter Verwendung dieser Verfahren erhalten werden können, beträgt etwa 60 µm bis etwa 500 µm. Für bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungen beträgt der Durchmesser des Sorptionsbereichs etwa 75 µm bis 250 µm, und die am meisten bevorzugten Durchmesser betragen etwa 100 µm bis 200 µm.
Hinsichtlich der Mikromaßstabsdimensionen von Sorptionsbereichen ist es erwünscht, die Menge des Analytbindungspartners, der innerhalb dieser Bereiche immobilisiert ist, zu maximieren. Darüber hinaus geben die Bedingungen, um die Probenkonzentration durch Sammeln der gesamten Analytmasse maximal zu stören, eine Konzentration des Analytbindungspartners vor, die beträchtlich höher ist als der 0,01 K^–1 Wert, der durch die "Umgebungsanalyt" Theorie vorgeschlagen wird. Im Allgemeinen ist ein molarer Überschuss von Analytbindungspartner zu Analyt bevorzugt. Da die Masse eines Analyten, der in einer klinischen Probe vorliegt, typischerweise im Bereich von etwa 10⁵ bis etwa 10¹⁰ Molekülen pro 100 μl Probe beträgt, werden mindestens etwa 10⁵ Moleküle und vorzugsweise bis zu 10¹² Moleküle eines Analytbindungspartners innerhalb eines Sorptionsbereichs immobilisiert werden. Theoretisch würde eine maximale Anzahl von Analytbindungsmolekülen erreicht werden, wenn sterische Effekte zu dominieren beginnen. Die am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung weist etwa 10¹⁰ bis etwa 10¹¹ Moleküle des Analytbindungspartners auf, die innerhalb eines Sorptionsbereichs mit einem Durchmesser von etwa 100 µm bis etwa 200 µm immobilisiert sind.
VI. Anordnungen
Anordnungen davon können aus Sorptionsbereichen jeglicher Anzahl, jeglichen Musters, jeglicher Ausgestaltung oder Geometrie bestehen, z.B. aus Kreisen, Linien oder einer n × n Anzahl von Spots. Vorzugsweise sind Anordnungen eine n × m Matrix von Sorptionsbereichen, wobei n die Anzahl der Säulen ist und m die Anzahl der Reihen ist. Die gesamte Anzahl von Säulen und Reihen kann, falls erforderlich, auf eine besondere Anwendung angepasst werden. Ein adäquater Abstand zwischen den Sorptionsbereichen ist erwünscht, um Kreuzkontamination durch Assayreagenzien zu vermeiden und einen genauen Bildnachweis zu erleichtern. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung werden die Sorptionsbereiche in einer Matrix ausgerichtet, wobei der vertikale und/oder horizontale Abstand zwischen Sorptionsbereichen etwa 500 µm beträgt.
Multianalytbindungsassays können durch Konstruieren einer Anordnung mit einer Mehrzahl von Sorptionsbereichen durchgeführt werden, wobei die Sorptionsbereiche in Untermengen von Sorptionsbereichen geteilt werden. Jede Untermenge von Sorptionsbereichen kann verschiedene, innerhalb der Sorptionsbereiche der Untermenge immobilisierte Analytbindungspartner aufweisen. Die Untermengen können für den Zweck, Mittelwerte und Probenfehler zu bestimmen, identische Sorptionsbereiche enthalten. Alternativ können Untermengen mit identischen Sorptionsbereichen verwendet werden, um eine Dosis-Antwort-Kurve für einen besonderen Analyt bereitzustellen. Verschiedene Untermengen von Sorptionsbereichen mit verschiedenen Analytbindungspartnern können verwendet werden, um verschiedene Analyte aus derselben Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Eine bevorzugte Ausführung eines Multianalytbindungsassay, der eine Anordnung mit Untermengen von Sorptionsbereichen verwendet, ist in Beispiel III der vorliegenden Anmeldung beschrieben. In dem Beispiel gibt es vier Untermengen von Sorptionsbereichen. Jede Untermenge hat fünf identische Sorptionsbereiche, die denselben monoklonalen Antikörper zu einem einzigen IgG Untertyp tragen. Darüber hinaus verwendet jede Untermenge der fünf identischen Sorptionsbereiche einen anderen monoklonalen Antikörper, wobei jeder monklonale Antikörper einen von vier verschiedenen IgG Untertypen erkennt.
Wie es für den Fachmann offensichtlich sein wird, kann eine Vielfalt von verschiedenen Multianalytbindungsanordnungen konstruiert werden, um für den besonderen vorliegenden Zweck geeignet zu sein. Zum Beispiel kann eine Blutprobe auf die Anwesenheit von Antikörper oder Antigenen gescreent werden, die eine Vielfalt von infektiösen Erregern, wie Hepatitis und humane Immundefizienz Viren, anzeigen.
VII. Fluoreszierende Markierungen
Die Analytmasse, die durch den Bindungsassay gesammelt wird, ist mit einer fluoreszierenden Markierung zum Nachweis markiert. Obwohl jeglicher fluoreszierende Farbstoff geeignet sein kann, werden Farbstoffe, die innerhalb des nahen Infrarot (NIR) Bereichs des elektromagnetischen Spektrums Strahlung absorbieren und ausstrahlen, bevorzugt. Die Vorteile der Verwendung NIR fluoreszierender Farbstoffe als Markierungen schließen ein: (1) Es gibt bei der NIR Wellenlänge von etwa 650 bis 1000 nm, wo nur einige Klassen von Verbindungen signifikante Absorption oder Fluoreszenz zeigen, sehr geringe Interferenz; (2) NIR fluoreszierende Farbstoffe sind mit der Verwendung kostengünstiger Gallium-Aluminium- Arsenid (Ga-Al-As) Halbleiter Laserdioden kompatibel, um Fluoreszenz zu induzieren; und (3) NIR Nachweis ermöglicht Flexibilität im Auswählen von Silikonfotodetektoren.
Verbindungen, die eine Absorption im unteren NIR (650–750 nm) besitzen, schließen Phthalocyanin- und Naphthalocyaninfarbstoffe, Metallkomplexfarbstoffe, Triphenyl- oder Diphenylmethane, Azofarbstoffe, Chinone und Carbocyaninfarbstoffe ein. Unseres Wissens nach ist nur eine leicht verfügbare Gruppe von Molekülen, Tricarbocyaninfarbstoffe, im oberen NIR (750 nm und darüber) fluoreszierend. Die großen molaren Extinktionskoeffizienten und hohen Quanteneffizienzen der Cyaninfarbstoffe machen sie zu guten Kandidaten für Anwendungen unter Verwendung Laser induzierter Fluoreszenz.
Die am meisten bevorzugten Cyaninfarbstoffe sind die Phthalocyanin-, Dicarbocyanin- und Tricarbocyaninfarbstoffe, die La Jolla Blau, Cy5, BCy5, DBCy5, Cy7, BCy7 und DBCy7 einschließen. Die Farbstoffe sind kommerziell von Molecular Probes (Eugene, OR) und Amersham (Buckinghamshire, UK) verfügbar.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung ist der gesammelte Analyt durch Bindung eines markierten Bindungspartners markiert, wie in den gut bekannten "Sandwichassays" des Standes der Technik. Verfahren zur Bindung fluoreszierender Farbstoffe an Bindungspartner, wie Oligonukleotide, Rezeptoren oder Antikörper, sind im Stand der Technik auch gut bekannt. In einem solchen "Sandwichassay" bindet der markierte Bindungspartner vorzugsweise an einen Anteil des Analyten, der nicht an einen immobilisierten Analytbindungspartner gebunden ist. Eine am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung verwendet einen Antikörper, der mit DBCy5 markiert ist, als den markierten Bindungspartner.
VIII. Kits
Kits können in geeigneter Weise zur Verwendung zusammen mit dem erfindungsgemäßen Bindungsassay zusammengesetzt werden. Das Kit wird ein Substrat mit einer Anordnung von Sorptionsbereichen, vorzugsweise eine Multianalytbindungsanordnung, zum Sammeln von Analyten aus einer Probe enthalten. Zusätzlich können Kits mindestens ein Gefäß mit einem markierten Bindungspartner zum Markieren der eingefangenen Analyte enthalten. Darüber hinaus können Kits Standardreagenzien, wie Positiv- und Negativkontrollen, oder vorgemessene Analyte für Dosis-Antwort-Kurven einschließen. Solche Kits können auch Puffer und Blockierlösungen einschließen, die häufig für dazwischen liegende Assayschritte verwendet werden, die unspezifische Bindung von Sorptionsmaterialien reduzieren.
IX. Immobilisierung
Die Anordnung von erfindungsgemäßen Sorptionsbereichen kann durch einfaches Pipettieren, durch Strahldrucken oder Fotolithographie gebildet werden. Obwohl Fotoverbinden der Sorptionsmaterialien durch eine Maske sich als ein ausgezeichnetes Verfahren zum Herstellen einer Anordnung innerhalb enger Toleranzen erweisen kann, ist derzeit Thermo-/Piezostrahldrucken das Verfahren der Wahl zum Lokalisieren von Sorptionsbereichen. Die erfindungsgemäßen Sorptionsmaterialien, wie der erste Bindungspartner, die konjugierte Verbindung oder der Analytbindungspartner sind in Tropfen von etwa 60 pl bis etwa 1 nl verteilt und trocknen schnell, im Allgemeinen innerhalb von 30 Sekunden.
Vorzugsweise wird die erste Menge von Sorptionsmaterialien, die auf dem Substrat verteilt werden, kovalent gebunden. Verfahren zur kovalenten Bindung von Bindungspartnern, wie Oligonukleotiden, Rezeptoren und Antikörpern, an Plastikmaterialien sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren, den ersten Bindungspartner oder Analytbindungspartner kovalent an das Substrat zu binden, verwendet ein fotoaktives Verbindungsmolekül, wie die PhotoLink^® Technologie, die kommerziell von SurModics, Inc. (Eden Prairie, Minnesota) verfügbar ist. Der Bindungspartner wird mit einem fotoaktiven Linker derivatisiert, der auf dem Substrat abgelegt ist, und die trockenen Spots werden durch UV Strahlung immobilisiert. Die kovalente Verbindung von Bindungspartnern mit dem Sub strat eliminiert eine Abreicherung der Sorptionsmaterialien während anschließender Waschschritte und maximiert das Signal, das vom eingefangenen Analyt erzeugt wird.
X. Analyteinfangen & Markieren
Die Bedingungen zum Sammeln des größten Teils des Analyten aus einem Probenvolumen können durch die folgenden Faktoren optimiert werden: (1) Verwenden von Sorptionsmaterialien mit hohen Affinitätskonstanten, z.B. K_A > 10¹⁰ Liter Mol^–1, um eine stärkere Bindung zu ergeben; (2) Minimieren des Probenvolumens; und (3) Verwenden einer großen anfänglichen Masse von Analytbindungspartner als ein Einfangreagens. Jedoch unterliegen solche Optimierungsbemühungen Beschränkungen der "realen Welt". Zum Beispiel können die Affinitätskonstanten von kommerziell verfügbaren Bindungspartnern, die sich auf einen interessierenden Analyt richten, weniger als optimal sein. Darüber hinaus kann das Probenvolumen nicht unendlich erniedrigt werden, ohne die Anzahl von Analytmolekülen unter ein nachweisbares Niveau zu reduzieren. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungen haben wir festgestellt, dass Probenvolumina von etwa 20 μl bis etwa 500 μl zum Analyteinfangen und -nachweis geeignet sind. Schließlich kann die anfängliche Masse eines Einfangreagens nicht endlos erhöht werden, da sterische Effekte schließlich dominieren.
Unter den idealen Assay Bedingungen zum Sammeln des Analyten, wie oben diskutiert, geben unsere theoretischen Schätzungen an, dass mindestens etwa 60 des Analyten durch einen Hochaffinitätsbindungspartner mit einer K_A > 10¹⁰ Liter Mol^–1 eingefangen werden. Diese Zahl liegt gut über der < 10 % Reduktion der Analytkonzentration, die durch Ekins et al. empfohlen wird. In dem erfindungsgemäßen Massenauffindungsassay wird der Analyt wesentlich von der Probe abgereichert, um einen Analyteinfangkomplex mit einem Hochaffinitätsbindungspartner zu bilden.
In einer ähnlichen Weise kann das Signal, das vom markierten Analyteinfangkomplex erhalten wird, durch die Verwendung eines markierten Bindungspartners mit einer relativ hohen Affinitätskonstante optimiert werden. Darüber hinaus kann das Signal weiter verstärkt werden, wenn eine Mehrzahl von fluoreszierenden Farbstoffmolekülen an den spezifischen Bindungspartner gebunden werden. Zum Beispiel weist der DBCy5 markierte Antikörper, der in den folgenden Beispielen verwendet wird, etwa 2,8 Moleküle DBCy5 pro Antikörper Molekül auf.
In der Praxis können jedoch Probleme entstehen, wenn eine unspezifische Bindung zu einem höheren Rauschniveau beiträgt, wodurch die Sensitivität des Systems erniedrigt wird. In Beispiel III erniedrigten solche Probleme mit hohen Hintergrundniveaus die Sensitivität des Assays auf etwa 10⁸ Moleküle eines Analyten. Glücklicherweise liegt dies innerhalb von Grenzen, die für viele klinische Anwendungen geeignet sind. Weitere Optimierungsbemühungen, um eine unspezifische Bindung zu reduzieren, werden voraussichtlich die Sensitivität des Assays enger an eine geringere Grenze von etwa 10⁵ Molekülen erhöhen, wie in dem Avidin-Biotin Modellsystem.
XI. Beleuchtung
Typischerweise werden die Anordnungen unter Verwendung einer Laserquelle beleuchtet, um Laser induzierte Fluoreszenz (LIF) des markierten Analyteinfangkomplexes zu erzeugen. Die Verwendung der bevorzugten Carbocyaninfarbstoffe, die im kurzwelligen NIR Bereich zwischen 670 und 900 nm fluoreszieren, ermöglicht zur Anregung die Verwendung kostengünstiger Festkörper Ga-Al-As Diodenlaser. Darüber hinaus ergeben die Cyaninfarbstoffe Ausstrahlungswellenlängen nahe der optimalen Strahlungssensitivität von Silikondetektoren.
XII. Bildnachweis
Der Bildnachweis wird vorzugsweise unter Verwendung eines Peltier gekühlten CCD Detektors durchgeführt, der Hochdurchsatz Vorteile gegenüber Serienscann techniken bei geringeren Kosten als konfokale Optik bietet. Evaneszenzwellennachweis wird eingesetzt, um die Quelle und den Detektor für weitere Hintergrundverringerung physikalisch zu trennen. Eine detailliertere Beschreibung des Bild gebenden Systems kann im Material und Methoden Abschnitt der folgenden Beispiele gefunden werden. Quantitative Analyse der sich ergebenden Bilddaten wird durchgeführt, wie zuvor in der gleichzeitig anhängigen vorläufigen Anmeldung mit der Seriennummer 60/065,937 beschrieben ist, die durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele zeigen die praktische Durchführbarkeit der Massenassayverfahren unter Verwendung eines vereinfachten Ligandenbindungssystems (Avidin & Biotin) und die Ausweitung des Massenauffindungs-Mikroanordnungsformats auf einen einzigen Analytimmunassay von humanem IgG. Schließlich wird ein Multianalytanordnungsassay der vier humanen IgG Unterklassen gezeigt.
Material und Methoden
Die hochspezifische Bindung von Biotin durch das Protein Avidin wurde als ein optimales Ligandenbindungsassaymodell mit einer Bindungsaffinität von etwa 10⁵ Liter Mol^–1 ausgewählt. Für diese Arbeit wurde ein deglykosyliertes kommerzielles Avidinpräparat (NeutrAvidin, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) eingesetzt, obwohl keine statistisch signifikanten Unterschiede in Bindungskapazität, Hintergrund oder Sensitivität beobachtet wurden, wenn Streptavidin oder Avidin ersetzt wurden.
Der fluoreszierende NIR Farbstoff, der für diese Arbeit ausgewählt wurde, DBCY5, ist das Dicarbocyanin Analog von Indocyaningrün. Der Farbstoff wurde durch Umsetzung seines N-Hydroxysuccinimidylester Derivats im Überschuss mit Biotinhydrazid biotinyliert. Das sich ergebende Biotin Derivat weist ein Absorptionsma ximum nahe 670 nm mit einer Fluoreszenzausstrahlung auf, die bei 710 nm auftritt. Die molare Absorptionsfähigkeit in wässrigen Lösungen beträgt 200.000 und die Quanteneffizienz ungefähr 20 %. Diese spektralen Eigenschaften sind im Wesentlichen zu dem nicht konjugierten Farbstoff unverändert. Die Bewertung des Grads der Biotinylierung wurde durch zwei Verfahren durchgeführt. Das erste schließt ein Inkubieren eines einzigen Aliquots des Produkts aufeinander folgend in mehreren Kammern einer kommerziell präparierten Avidin beschichteten Mikrotiterplatte (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) und Aufnehmen der Restfluoreszenz der Lösung nach Entfernung des ganzen biotinylierten Materials ein. Auf diese Weise wurde bestimmt, dass 70 % der NIR Farbstoffmoleküle in dem Produkt biotinyliert wurden. Ein zweites Verfahren schließt den herkömmlichen Assay von Biotin unter Verwendung von HABA (4-Hydroxyazobenzen-2-carbonsäure, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ein, um die Abwesenheit von unmarkierten Biotinresten zu bestätigen, welche die Sensitivität durch Blockieren von Avidinstellen reduzieren würden.
Mikroskopische Reagensbereiche wurden durch Laden der gewünschten Reagenslösung in eine zuvor auseinander gebaute und Ultraschall gereinigte Druckkopfeinheit eines Desktop Strahldruckers (Hewlett Packard ThinkJet, Palo Alto, CA) präpariert. Ein 3'' × 3'' Bogen aus vorgereinigtem Polystyrolfilm mit 1 mil Dicke (Whatman Inc., Rockland, MA) wurde dann auf Transportpapier geklebt und in den Drucker geladen. Ein Film wurde durch Spülen in absolutem Methanol und Trocknen unter Verwendung eines inerten Gasstrahls vorgereinigt. Das verteilte Volumen wurde nach jeder Aktivierung eines Druckerstrahls durch Drucken einer vorbestimmten Anzahl von Tropfen der DBCY5 Farbstofflösung mit bekannter Konzentration auf einen Film, dann Spülen des Farbstoffs vom Film mit einem bekannten Volumen Methanol bestimmt. Die Fluoreszenz der Waschlösung wurde dann mit Standardlösungen von DBCY5 in Methanol verglichen. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde bestimmt, dass das durchschnittliche Tropfenvolumen 80 Picoliter beträgt.
Die experimentelle Vorrichtung, die verwendet wurde, um Fluoreszenz von den gedruckten Bereichen zu messen, ist in 2 gezeigt. Kurz gesagt wird der Bildnachweis von Fluoreszenz von den mikroskopischen Bereichen unter Verwendung einer Peltier gekühlten CCD Kamera (Princeton Instruments, Inc., Trenton, NJ), die an ein 6,5 × Mikroskopobjektiv (Melles Griot, Irvine, CA) gekoppelt ist, und passender Anregungs- und Ausstrahlungsfilter (Omega Optical Filterset XF-48, Omega Optical, Brattleboro, VT) durchgeführt, um isotrope Ausstrahlungen von dem Films nachzuweisen. Evaneszenzwellenanregung von Fluoreszenz von den gedruckten Bereichen wurde durch Einführen gefilterter Ausstrahlungen bei 670 nm von einem Ga-Al-As Diodenlaser (Lasiris, Inc., Quebec, Kanada) in den Film unter Verwendung eines Prismakopplers unserer eigenen Ausgestaltung erkannt. Quantitative Analyse der sich ergebenden 16-Bit Bilddaten wurden unter Verwendung eines automatisierten Makros durchgeführt, das die intrinsischen Funktionen ansteuert, die in einem kommerziellen Softwarepaket (ImagePro 3.0, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD) verfügbar sind.
Eine Beurteilung der Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Druck- und Messvorgänge wurde durch Drucken von Standardlösungen von nicht derivatisiertem DBCY5 Farbstoff, dann Konstruieren von Dosis-Antwort-Kurven aus den reduzierten Bilddaten durchgeführt. Wie in 3 gezeigt, hat das Bildsystem eine Massennachweisgrenze von ungefähr 10⁵ DBCY5 Molekülen pro gedrucktem Bereich. Die volumetrische Präzision des Tintenstrahldruckers ist derart, dass eine Standardabweichung über dem Mittelwert der Spotintensitäten in einer 9-Spot Anordnung ungefähr 6 % beträgt. Die Nachweisgrenze wird durch einen Hintergrund auferlegt, der eine Kombination restlicher störender langwelliger Ausstrahlung des Diodenlasers und Raman Streuung des Polystyrolfilms ist.
Anordnungen von immobilisierten Avidinspots wurden durch Drucken einer Lösung von 1 mg/ml NeutrAvidin in gepufferter Lösung präpariert. Diese Konzentration ist höher als die, welche typischerweise für das Beschichten von Mikrotiterplattenkammern verwendet wird, ist aber auf der Grundlage der sehr verschiedenen Volumen-zu-Oberfläche-Bereichseigenschaften verständlich, die durch den mikroskopischen experimentellen Maßstab dargestellt werden. Die gedruckten Spots trocknen innerhalb von 30 Sekunden nach Ablage, wobei ein sichtbarer fester Rest hinterlassen wird, der eine sichtbare Untersuchung der Anordnung und eine grobe Verifikation der Druckerfunktion ermöglicht. Für nicht kovalente Immobilisierung wurde ein 50 mM Carbonatpuffer bei pH 8,2 zum Drucken verwendet. Für kovalente Immobilisierung war der Puffer 50 mM Phosphat gepufferte Salzlösung bei pH 7,4. Eine kovalente Immobilisierung wurde durch Derivatisierung von NeutrAvidin mit einem kommerziellen fotolabilen Linkerrest erreicht. Nach dem Drucken dieser NeutrAvidin Linker konjugierten Verbindung wurde eine kovalente Immobilisierung durch Exponieren der trockenen gedruckten Anordnungen gegenüber dem Licht einer UV Quelle (Dymax 2000EC, Torrington, CT) für drei Minuten erhalten. Die anschließende Erfahrung mit trockenen Avidin Anordnungen hat gezeigt, dass diese Materialien unter gekühlter Vakuumtrocknung für mindestens sechs Monate stabil sind.
Unmittelbar vor der Verwendung werden gedruckte Anordnungen gewaschen, um jegliches lose gebundenes Avidin zu entfernen. Dieses Waschen wurde mit "PBS/T", einer 0,2 % Lösung aus Tween-20 in Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,4, durchgeführt. Ein Assay mit Biotin DBCY5 wurde dann durch Inkubieren gedruckter Anordnungen mit verschiedenen Volumina und Konzentrationen einer DBCY5 Biotin konjugierten Verbindung durchgeführt, die in PBS/T verdünnt wurde. Die Inkubationszeiten wurden von 15 Minuten bis über Nacht unter Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers (Lab Line, Inc., Melrose Park, IL) oder eines rotierenden Rads (Glas-Col, Terre Haute, IN) in Abhängigkeit des untersuchten Probenvolumens variiert. Nach der Inkubation wurde der PBS/T Waschschritt wiederholt, um freies DBCY5 und/oder lose gebundenes DBCY5 Biotin zu entfernen. Ein letztes Spülen in deionisiertem Wasser wurde durchgeführt, um Puffersalze vor dem Trocknen vom Film zu entfernen. Die Anordnungen wurden dann unter Verwendung eines inerten Gaszerstäubers getrocknet und innerhalb einer Stunde zur quantitativen Analyse Bild gebend dargestellt.
Ein Immunassay der humanen IgG Unterklassen wurde unter Verwendung biotinylierter monoklonaler Antikörper (Klone HP-6091, HP-6014, HP-6050 und HP6025, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mittels eines Protokolls durchgeführt, das von dem von Hamilton, et al. {"Monoclonal antibody-based immunoenzymetric assays for quantification of human IgG and its four subclasses." J. Immunoassay 9: 275–296 (1988)} abgeleitet wurde. Antikörper Anordnungen wurden entweder durch Inkubation Avidin gedruckter Anordnungen mit einem Überschuss eines biotinylierten Einfangantikörpers oder durch direktes Strahldrucken eines Antikörpers erzeugt, um Multianalytanordnungen zu bilden. Die Anordnungen wurden dann gewaschen und mit einer 5 mg/ml BSA Lösung in PBS blockiert und für drei Stunden mit 50 Mikrolitern einer Lösung inkubiert, die humane Myelomproteine enthielt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), die in 1 mg/ml BSA verdünnt wurden. Die Anordnungen wurden dann gewaschen und für eine Stunde mit polyklonalem Maus anti-humanem IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) inkubiert, das mit ungefähr 2,8 DBCY5 Molekülen pro Antikörper markiert war. Schließlich wurden die Anordnungen gewaschen, getrocknet und Bild gebend dargestellt, wie es im Avidin/Biotin System durchgeführt wird.
BEISPIEL I
Biotin/Avidin Bindungssystem
4 zeigt typische Ergebnisse aus Dosis-Antwort-Kurven, die durch Titration von 9-Spot Avidin Anordnungen mit vier verschieden fixierten Volumina von DBCY5 Biotinlösung erhalten wurden, die durch Serienverdünnung präpariert wurden. Die durchschnittliche CCD Pixelintensität, die aus den Bild gebend dargestellten fluoreszierenden Spots berechnet wurde, weist eine Farbstoff Biotinkonzentration in der quantitativen Weise nach, die von herkömmlichen Bindungsassays erwartet wird. Die Daten in 4 geben eine Stunde Inkubationszeit wieder: Obwohl beobachtet wurde, dass das Signal mit Inkubationszeiten von 30 Minuten bis 3 Stunden zunahm, wurde festgestellt, dass die Signale nach 15 Stunden Inkubation nur leicht höher waren als nach drei Stunden. Eine Standard Inkubationszeit von drei Stunden wurde deshalb als maximale Sensitivität angenommen (5b).
In dem Massenauffindungs-Mikroassayformat wird eine Maximierung des Signals durch Maximieren der funktionellen Analytbindungskapazität pro Einheitsbereich erreicht. Die Dosis-Antwort-Kurven von nicht kovalent immobilisierten Avidin Anordnungen zeigen eine relativ geringe Dichte von Bindungsstellen relativ zu kovalenter Bindung (4). Es wurde festgestellt, dass nicht kovalente Immobilisierung gegenüber Desorption und Verlust von Einfangreagens während der Waschschritte mit vorliegendem grenzflächenaktivem Mittel (0,2 % Tween-20, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) anfällig ist. Diese Ergebnisse haben zur Aufgabe nicht kovalenter Bindungs- zugunsten kovalenter Immobilisierungsverfahren geführt. Es wurde festgestellt, dass unter Verwendung kovalenter Immobilisierung Signalverluste in Waschschritten nicht signifikant sind, und wir glauben, dass ein Spannungsausgleich von gebundenem Analyt auf den gedruckten Anordnungen durch die hohe lokale Konzentration von Bindungsstellen erleichtert wird, die bei gebundenen Arten vorkommt.
Die Rasterkraftmikroskopie eines immobilisierten Avidinspots nach dem Waschen zeigt, dass die kovalent gedruckten Anordnungsspots eine ungleichmäßige Topologie aufweisen, die sich bis zu 200 nm vertikal von der Oberfläche des Films ausdehnt. Die Integration der RKM Topologiedaten zeigt, dass der trockene Rest, der sich aus einem "Spot" zusammensetzt, ein Volumen in der Größenordnung von 6 × 10^–11 cm³ aufweist, was eine obere Grenze der Masse von Avidin von annähernd 190 Picogramm pro Spot vorgibt, unter der Annahme, dass jedes Avidinmolekül 6 nm³ in der getrockneten Matrix besetzt. Da ungefähr 100 Picogramm Avidin pro Spot in der RKM Studie abgelegt wurden (100 Picoliter einer 1 mg/ml Lösung), zeigen die RKM Experimente, dass ein Großteil der eigentlich gedruckten Avidinmasse kovalent in die Spot "Struktur" eingeführt ist. Die gedruckten Avidinspots in der RKM Studie wurden mit DBCY5 Biotinlösungen einer bekannter Konzentration titriert, und es wurde festgestellt, dass sie eine Bindungskapazität in der Größenordnung von 10⁹ Farbstoff Biotinmolekülen pro Spot aufweisen, äquivalent zu annähernd 100 Picogramm Avidin pro Spot unter Annahme einer Bindungsstelle pro Avidinmolekül. Dieses Ergebnis bedeutet zusammen mit den RKM Daten, dass zwischen einer und zwei aktiven Stellen pro Avidinmolekül nach Drucken und Immobilisierung vorliegen. Es wird angemerkt, dass sich die Signalniveaus in 3 durch höhere Laserkraft ergeben, und sie können nicht verwendet werden, um die Bindungskapazität durch Vergleich mit 5A und 5B zu quantifizieren.
Wenn das gedruckte Volumen von 100 Picoliter auf 1 Nanoliter erhöht wird, verdoppelt sich der Spotdurchmesser annähernd auf 200 Mikron. Eine Titration dieser großen Spots mit DBCY5 Biotin gibt dann eine funktionelle Bindungskapazität in der Größenordnung von 10¹⁰ Farbstoff Biotinmolekülen an, die pro gedrucktem Spot gebunden werden, oder annähernd 3500 ng/cm² unter Annahme einer aktiven Bindungsstelle pro Avidinmolekül. Diese Bindungsstellendichte ist annähernd 20 mal höher als die 130 bis 150 ng/cm², die typischerweise für kommerzielle Avidin beschichtete Polystyrolmikrotiterplatten spezifiziert sind, wahrscheinlich aufgrund der komplexen Topologie der gedruckten Spots.
Die Wendepunkte der Titrationskurven, die von diesen 200 Mikron Spots erhalten wurden, zeigen eine Abhängigkeit vom Volumen der Farbstoff Biotinlösung, die während der dreistündigen Inkubation vorliegt (4). Da das Volumen der Farbstofflösung in Kontakt mit den Anordnungen von 150 Mikrolitern auf 5 Milliliter erhöht wird, verschiebt sich die Titrationskurve entlang der Farbstoff Biotinkonzentrationsachse hin zu geringeren Konzentrationen. Wenn die Daten eher als eine Funktion der vorliegenden gesamte Analytmasse als der -konzentration dargestellt werden, wird festgestellt, dass die Daten innerhalb der Standardabweichung über der durchschnittlichen Pixelbildintensität der neun Spots in jeder Anordnung übereinstimmen (5). Die gedruckten Avidin Anordnungen antworten auf Analytmasse, nicht auf -konzentration, da sie über genügend Affinität und Bindungskapazität verfügen, um die Lösung des Farbstoff Biotins signifikant abzureichern, da das Lösungsvolumen reduziert ist. Die funktionelle Nachweisgrenze für DBCY5 Biotin kann beliebig als die Farbstoff Biotinkonzentration definiert werden, die eine durchschnittliche Spot Fluoreszenzintensität in einer 9-Spot Anordnung bei mindestens drei Standardabweichungen über dem Mittelwert einer "Blindproben" Anordnung ergibt, die für drei Stunden mit Standard PBS/0,2 % Tween Lö sung inkubiert wurde. Dieser funktionellen Nachweisgrenze wird begegnet, wenn die anfängliche Farbstoff Biotinlösung eine Masse in der Größenordnung von 10⁵ Molekülen Biotin Farbstoff pro Spot bereitstellt. Diese Beschränkung wird durch die spektroskopische Hintergrundeigenschaft der verwendeten Geräteausstattung auferlegt, wie in 3 angegeben ist.
Wenn die Anzahl der Avidinspots pro Anordnung in einer solchen Massenauffindungsanordnung variiert wird, würde das Massenwirkungsgesetz bedeuten, dass die Dichte von gebundenem Analyt pro Spot invers mit der Anzahl der vorliegenden Spots variieren sollte. Wenn weniger Spots pro Anordnung gedruckt werden, wird die gesamte Analytmasse, die während der Inkubation vorliegt, auf weniger Spots gesammelt, was zu einem erhöhten Signal von jedem Spot führt. 6 zeigt experimentelle Ergebnisse von dreistündigen Inkubationen, bei denen 100 Mikroliter Aliquote von 5 × 10^–10 M DBCY Biotinlösung in Kontakt mit Anordnungen mit 1, 9, 25, 49 oder 70 Spots gebracht wurden. Auch wird in dem Diagramm das durch quadratische Lösung des Massenwirkungsgesetzes vorausgesagte Signal gezeigt unter Annahme einer Affinitätskonstante für Avidin von 10¹⁵ M^–1, einer Bindungskapazität von 10¹⁰ Biotin Farbstoffmolekülen pro Spot und einer durchschnittlichen Fluoreszenzbildintensität von 10⁴ bei Bindungsstellensättigung (vergleiche 5). Das Experiment bestätigt die massensensitive Natur der Avidin Anordnungen und gibt auch an, dass die dreistündige Inkubation Ergebnisse ergibt, die vergleichbar mit jenen sind, die allein auf thermodynamischen Gesichtspunkten beruhend erwartet werden. Der mikroskopische Diffusionstransport von Biotin DBCY5 von der Menge der Lösung zu den gedruckten Spots ist offensichtlich für praktische Mikroanordnungsassays schnell genug, um in einem Massenauffindungssystem zu funktionieren, während herkömmliche Inkubationszeiten in der Größenordnung von einer bis mehreren Stunden verwendet werden.
BEISPIEL II
Assay mit humanem IgG3
Das beschriebene Avidin-Biotin System wurde auf den Assay mit humanem IgG3 durch Inkubation von standardmäßig gedruckten Avidin Anordnungen mit einem Überschuss von biotinyliertem HP-6050 monoklonalem Antikörper ausgeweitet, der spezifisch für die IgG3 Unterklasse ist, unter Verwendung des Assayprotokolls, das im experimentellen Abschnitt beschrieben ist. 7 zeigt eine Dosis-Antwort-Kurve, die sich aus einem Assay von 50 Mikroliter Aliquoten von humanen Myelomproteinen (Kappa Kette) ergibt. Eine Unterklassen-spezifische Antwort auf IgG3 wird beobachtet, die auf negativen Kontrollexperimenten unter Verwendung von Lösungen von humanen Myelomproteinen verschiedener Unterklassen beruht. Für eine über Nacht Probeninkubation wurde festgestellt, dass sie eine signifikante Signalsteigerung über eine dreistündige Inkubation ergibt, und eine Inkubation für eine Stunde ergibt eine dreifache Reduktion der gesamten Signalniveaus, aber keinen Verlust an Sensitivität. Die Nachweisgrenze für IgG3 (willkürlich definiert als die interpolierte IgG Konzentration, bei der die Bilddichte der Spots in der Anordnung drei Standardabweichungen größer ist als ein "Blindproben" Experiment) betrug ungefähr 15 ng/ml, eine Konzentration, die etwa 3 × 10⁸ Moleküle IgG3 pro Anordnungsspot bereitstellt. Über einen herkömmlichen ELISA Plattenassay ist von Hamilton et al. berichtet worden, dass er eine Sensitivität von 2 ng/ml aufweist, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer 8-fach höheren Affinität für IgG3 (HP-6047). Beruhend auf Gleichgewichtsgesichtspunkten sollte ein Mikroanordnungs IgG3 Assay, der den Hochaffinitätsantikörper einsetzt, zum ELISA vergleichbare Sensitivität zeigen, trotz der Verwendung direkter Fluoreszenz. Wir schreiben dieses Niveau von Sensitivität dem Sammeln von Analytmasse aus der Menge der Lösung zu, wobei der Analyt auf den gedruckten Spots bis zu einem Grad konzentriert wird, der den Bedarf nach einem Enzym/Substrat Amplifikationssystem entfernt und die Verwendung der einfacheren direkten Fluoreszenzmarkierung ermöglicht. Die Nachweisgrenze in dem IgG3 Assay wird durch immunchemische unspezifische Bindung auferlegt, von der beobachtet wird, dass sie nur bei den gedruckten Spots, nicht aber bei den geblockten, unbehandelten Polystyrolbereichen zwischen den Anordnungen vorkommt. Das unspezifische Bindungshintergrundsignal beträgt ungefähr 1000 mal die instrumentelle Nachweisgrenze, die für das Avidin-Biotin System (8) beobachtet wird, was bedeutet, dass die Mikroanordnungstechnik zu größerer Sensitivität fähig ist, wenn die unspezifische Bindung unter das Niveau reduziert ist, das im IgG3 Assay angetroffen wird.
Die maximalen Signalniveaus, die in den IgG3 Dosis-Antwort-Daten beobachtet werden, sind vergleichbar zu jenen, die im Farbstoff Biotinsystem (8) gemessen werden. Offensichtlich werden jegliche sterische Beschränkungen, die den Zugang von Antikörperreagenzien zu den Avidinbindungsstellen beschränken, durch die Verwendung mehrerer fluoreszierender Markierungen auf dem polyklonalen Sondenantikörper ausgeglichen. Die IgG3 und Avidin/Biotin Dosis-Antwort-Daten haben auch eine ähnliche Form, wenn sie gegen die gesamte Anzahl von Analytmolekülen pro Kammer unter Vernachlässigung des unspezifischen Bindungsniveaus des Assays aufgetragen werden. Diese Übereinstimmung ist mit der Funktion des Immunassays in dem Massenauffindungssystem konsistent, trotz der reduzierten Affinität (10⁸ M^–1) im Vergleich zu dem Avidin/Biotin System.
BEISPIEL III
Multianalytimmunassay der vier humanen IgG Unterklassen
Eine Ausweitung des IgG3 Assays auf einen Multianalytanordnungsassay aller vier humanen IgG Unterklassen wurde durch Strahldrucken einer 1 mg/ml biotinylierten monoklonalen Antikörperlösung durchgeführt, um Anordnungen zu bilden, in denen jede Säule von 200 Mikron Spots eine unterschiedliche IgG Unterklasse erkennt. Jeder Spot wurde unter Verwendung von 1 Nanoliter Lösung erzeugt. Acht verschiedene Mischungen von humanen Myelomproteinen aus jeder Unterklasse wurden in PBS Lösung mit 5 mg/ml BSA präpariert und unter Verwendung desselben Protokolls getestet, das für den Assay von IgG3 entwickelt wurde. Die getesteten Mischungen schließen Pseudozufallskombinationen von Myelomkonzentrationen zwischen 10 Mikrogramm ml^–1 und 10 ng ml^–1 sowie Mischungen ein, in denen eine Unterklasse nicht vorliegt. Nach der Probeninkubation und dem Waschen wurde das DBCY5 markierte polyklonale Maus anti-humane IgG Reagens dann verwendet, um Signale von allen vier Assays gleichzeitig zu entwickeln. Die Bilddaten für die vier Analytanordnungen (9) zeigen qualitative Abhängigkeit zwischen der Spotintensität entlang jeder Säule und der erwarteten Konzentration der passenden Myelom Unterklasse in den getesteten 50 Mikroliter IgG Mischungsaliquoten. Die quantitative Bildverarbeitung ergibt Dosis-Antwort-Kurven (10) für jede IgG Unterklasse, wenn die Fluoreszenz von der passenden Säule der Mikroanordnung gegen die Myelomproteinkonzentrationen in den Mischungen aufgetragen wird. Nachweisgrenzen können grob aus den Dosis-Antwort-Daten abgeschätzt werden und scheinen ähnlich den 10–20 ng/ml zu sein, die in dem Einzelbestandteils IgG3 Assay beobachtet wurden.
Ein Beweis für Unterklassenspezifität wird in den mangelhaften Korrelationen gesehen, die beobachtet werden, wenn Daten von einer Mikroanordnungssäule gegen Myelomkonzentrationen der nicht korrekten Unterklasse aufgetragen werden. Die multilineare Regression der Multianalytanordnungsdaten zeigt, dass jegliche Kreuzreaktivität zwischen den Assays ausreichend gering ist, um durch die Spot-zu-Spot Variabilität innerhalb der Spaltenüberdeckt zu werden. Dieser Fehler beträgt derzeit 10 bis 15 % der durchschnittlichen Intensität in einer Säule (eine Standardabweichung) aufgrund mechanischer Schwierigkeiten, auf die im Strahldrucken mehrerer Analyte gestoßen wird. Das geringe Niveau von Kreuzreaktivität gibt an, dass die Antikörperspezifität trotz der Härte des Strahldruckens und Trocknens bewahrt werden kann. Für die Stabilität trocken gedruckter Multianalytanordnungen ist gezeigt worden, dass sie von dem besonderen immobilisierten Antikörper abhängen, aber es ist dargestellt worden, dass sie einen Monat überschreiten, wenn die Anordnungen in einem gekühlten Vakuumtrockengefäß aufbewahrt werden und mit einem kommerziellen Immunassaystabilisationspräparat (StableCoat, SurModics Inc., Eden Prairie, MN) beschichtet werden.
Dass dieser Multianalytanordnungsassay eher die Masse jedes Analyten als seine Konzentration auffindet, kann durch Präparation von Mikroanordnungen gezeigt werden, die Säulen von Spots enthalten, die für IgG3, IgG4 spezifisch sind, mit einigen Anordnungen, die auch einen dritten monoklonalen Antikörper enthalten, der sowohl IgG3 als auch IgG4 (Klon HP6017, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) erkennt. Diese Experimente stellen eine interne Anordnungskonkurrenz dar, bei der die IgG3 und IgG4 Signale relativ zu den Kontrollen in der Anwesenheit der Spots, die "gesamtes" IgG erkennen, reduziert werden. Diese Wirkung würde nicht ersichtlich sein, wenn die Probenlösung in Kontakt mit der Anordnung nicht von Analyt abgereichert würde, und bestätigt, dass Signalniveaus im Multianalytanordnungsassay durch "Sammeln" und Konzentration des Analyten auf den gedruckten Spots verstärkt werden. Eine interne Anordnungskonkurrenz muss in Massenauffindungsmultianalytanordnungen, die ausgestaltet sind, gesamtes IgG zusätzlich zu den Unterklassen aufzufinden, in Betracht gezogen werden.
Obwohl das Massenauffindungs-Mikroanordnungsassayformat von einer hohen Dichte der Bindungsstellen abhängt, führen die extrem kleinen Maßstäbe, die eingeschlossen werden, zu einer gesamten Abnahme in der Masse von Antikörper, die pro Test benötigt wird. Ungefähr 1 ng Antikörper ist pro Spot in den gedruckten Anordnungen abgelegt, verglichen mit den 100 ng, die typischerweise in einer Kammer einer 96-kammerigen Mikrotiterplatte immobilisiert sind. Die eigentlichen Einsparungen an Reagens können sogar größer als diese sein, da häufig bis zu mehrere Mikrogramm Antikörper pro Kammer während (nicht kovalentem) Plattenbeschichten zugegeben werden, um eine "sicher" gebundene Antikörpermasse von 100 ng pro Kammer zu erhalten. Diese potenziellen Kosteneinsparungen können in vielen Anwendungen wichtig sein.
Schlussfolgerungen
Es wurde gezeigt, dass Strahl gedruckte Spots eines Reagens mit Durchmessern von 100 bis 200 Mikron unter Verwendung von Lösungen von Avidin oder Antikörpern präpariert werden können, welche die Spezifität und Affinität für ihre Ziele bewahren. Wenn die Bindungsstellendichte maximiert wird und Bindungsstellen im Überschuss vorliegen, können die Spots wirksam Analyt von der Menge der Lösung abreichern, um hohe lokale Analytkonzentrationen auf dem gedruckten Spot zu ergeben. Dieses "Sammeln" von Analyten maximiert die Signal zu Hintergrund Verhältnisse und ermöglicht den Nachweis von 10⁵ oder weniger Analytmolekülen durch direkten Fluoreszenznachweis ohne auf Enzymamplifikation zurückzugreifen. In diesem System hängt das nachgewiesene Signal eher von der gesamten Analytmasse in einer Probe als von seiner Konzentration ab. Wenn Analytmoleküle einmal durch die Mikroanordnung gebunden sind, sind sie ziemlich resistent gegenüber Verlust während der Waschschritte, weil sie offensichtlich eine hohe lokale Konzentration von Bindungsstellen erfahren. Ein einfacher Immunassay mit IgG3 unter Verwendung des Massenauffindungs-Mikroanordnungsansatzes hat eine Sensitivität gleich der eines herkömmlichen ELISA Plattenassays dargestellt und ist zu einem gleichzeitigen Multianalytassay der vier humanen IgG Unterklassen in einem einzigen 50 Mikroliter Probenaliquot ausgeweitet worden. Die Nachweisgrenzen des Mikroanordnungsassays sind konsistent mit der veröffentlichten Sensitivität herkömmlicher Plattenassays unter Verwendung ähnlicher Immunreagenzien und Protokollen trotz der Tatsache, dass der Mikroanordnungsansatz bis zu 1/1000 der Antikörpermasse herkömmlicher Mikrotiterplattenassays benötigt, die beschichtete Kammern verwenden.
Obwohl die vorliegende Erfindung in beträchtlichem Detail unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungen davon beschrieben worden ist, sind andere Ausführungen möglich. Deshalb sollte der Schutzbereich der angehängten Ansprüche nicht auf die bevorzugten Ausführungen, die hier enthalten sind, beschränkt werden.

Claims

Bindungsassay zum Auffinden von Analytmasse in einer flüssigen Probe, umfassend: a) das Immobilisieren einer Anordnung auf einem Substrat, wobei die Anordnung eine Mehrzahl von Sorptionsbereichen umfasst, wobei ein Sorptionsbereich einen Analytbindungspartner umfasst; b) das Inkontaktbringen eines definierten Volumens einer Probe, von der angenommen wird, dass sie einen Analyt enthält, mit mindestens einem Sorptionsbereich, wobei der Analytbindungspartner in dem Sorptionsbereich relativ zu dem Analyt im Überschuß derart vorliegt, dass jeglicher in dem definierten Volumen vorliegender Analyt aus der Probe abgereichert wird, um einen Analyteinfangkomplex mit dem Analytbindungspartner zu bilden; c) das Markieren des Analyteinfangkomplexes mit einer fluoreszierenden Markierung; d) das Beleuchten des Sorptionsbereichs mit einem Laser in der Abwesenheit von Flüssigkeit; e) das Nachweisen von Fluoreszenzausstrahlungen von jeglichem Sorptionsbereich, der einen mit einer fluoreszierenden Markierung markierten Analyteinfangkomplex aufweist, wodurch die aus dem definierten Volumen der Probe gesammelte Analytmasse bestimmt wird.
Assay nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen und Polymethylmethacrylat, ausgewählt ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein Film, ein Bogen, ein Streifen, ein Teilchen oder eine Mikrotiterplatte ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Analytbindungspartner durch kovalente Bindung an das Substrat immobilisiert ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei die Sorptionsbereiche weiter einen ersten an das Substrat gebundenen Bindungspartner umfassen, wobei der erste Bindungspartner einen ersten Bindungskomplex mit einer konjugierten Verbindung bildet, wobei die konjugierte Verbindung einen ersten Liganden und den Analytbindungspartner umfasst, wobei der erste Ligand spezifisch an den ersten Bindungspartner bindet, und der Analytbindungspartner spezifisch an den Analyt binden kann.
Assay nach Anspruch 5, wobei der erste Bindungspartner Avidin oder Streptavidin ist und der erste Ligand Biotin ist.
Assay nach Anspruch 6, wobei die konjugierte Verbindung ein biotinylierter Antikörper ist.
Assay nach Anspruch 5, wobei der erste Bindungspartner durch kovalente Bindung an das Substrat immobilisiert ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Markierungsschritt weiter das Inkubieren des Analyteinfangkomplexes mit einem markierten Bindungspartner umfasst, wobei der markierte Bindungspartner eine fluoreszierende Markierung aufweist und dazu fähig ist, an den Analyteinfangkomplex zu binden.
Assay nach Anspruch 9, wobei der markierte Bindungspartner einen Antikörper umfasst.
Assay nach Anspruch 1, wobei die fluoreszierende Markierung ein Cyanin farbstoff ist.
Assay nach Anspruch 11, wobei der Cyaninfarbstoff aus der Gruppe, bestehend aus La Jolla Blau, Cy5, BCy5, DBCy5, Cy7, BCy7 und DBCy7, ausgewählt ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei das definierte Volumen der Probe von etwa 20 μl bis etwa 500 μl beträgt.
Assay nach Anspruch 1, wobei die Menge des in einem Sorptionsbereich immobilisierten Analytbindungspartners von 10⁵ bis etwa 10² Moleküle Analytbindungspartner beträgt.
Assay nach Anspruch 1, wobei etwa 10⁵ bis etwa 10¹⁰ Moleküle Analyt pro Sorptionsbereich nachgewiesen werden.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Durchmesser der Sorptionsbereiche etwa 60 µm bis etwa 500 µm beträgt.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Analytbindungspartner ein Antigen, ein Antikörper, ein Oligonukleotid oder ein Rezeptor ist.
Assay nach Anspruch 1, wobei die Anordnung von Sorptionsbereichen eine Mehrzahl verschiedener Analytbindungspartner umfasst.
Assay nach Anspruch 18, wobei die Sorptionsbereiche weiter mindestens zwei Untermengen umfassen, wobei eine erste Untermenge von Sorptionsbereichen einen ersten Analytbindungspartner enthält und eine zweite Untermenge von Sorptionsbereichen einen zweiten Analytpartner enthält.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Immobilisierungsschritt weiter das Verteilen von Tropfen unter Verwendung eines Druckerstrahls umfasst, um eine Anordnung von Sorptionsbereichen zu bilden.
Assay nach Anspruch 20, wobei das Volumen der Tropfen etwa 80 pl bis etwa 1 nl beträgt.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Beleuchtungsschritt durch das Richten von nahes Infrarot-Ausstrahlungen durch einen Prismakoppler in das Substrat durchgeführt wird, wodurch eine Evaneszenzwellenanregung von Fluoreszenz erzeugt wird.