DE60309317T2 - Biomolekulares kinetik-messverfahren mit hilfe von einem durchfluss-mikroarray - Google Patents

Biomolekulares kinetik-messverfahren mit hilfe von einem durchfluss-mikroarray Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekülbindungsinteraktionsstudien. Die vorliegende Erfindung betrifft die multidimensionale Hochgeschwindigkeitsanalyse einer großen Anzahl von gemischten Molekülarten oder Biomolekülen, die im Allgemeinen "Bibliotheken" genannt werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren für das Überwachen von Bindungsinteraktionen zwischen in Reihe vorliegenden Biomolekülen und Zielmolekülen einer Probe. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren, um Interaktionsereignisse zwischen Biomolekülen unter variierenden Reaktionsbedingungen zu untersuchen.
  • Modellsysteme, die Rezeptorbindung und andere auf Zellen beruhende Assays nachahmen, sind von zunehmender Wichtigkeit in der molekularbiologischen und pharmakologischen Industrie. Phänomene wie Transporteraktivität, prä- und postsynaptische Zellinteraktionen, chemotaktische Reaktion, Enzym-Ligand-Bindung und dergleichen sind für die Pharmakologie, klinische Chemie und Grundlagenforschung von Relevanz. Die Hauptentwicklungsgebiete in pharmazeutischen Unternehmen zielen darauf ab, die effektivsten Molekülinteraktionen aufzufinden, die meistens eine hohe Affinität eines Moleküls für sein Ziel umfasst, die eine hohe Bindungskonstante Kon und eine niedrige Dissoziationskonstante Kdiss definiert.
  • Demgemäß verbleibt die Wichtigkeit von pharmakokinetischen Modellen unbestritten, und die erzeugte Pharmakokinetik verbleibt unabdingbar für, unter anderen Anwendungen, (1) die Vorhersage von Plasma-, Gewebe- und Urinkonzentrationen von Wirkstoffen bei jedem beliebigen Dosisverabreichungsschema; (2) die Berechnung des optimalen Dosisverabreichungsschemas für einen individuellen Patienten; (3) die Einschätzung der möglichen Akkumulierung von Wirkstoffen und/oder Metaboliten; (4) die Korrelierung von Wirkstoffkonzentrationen mit der pharmakologischen und toxikologischen Aktivität (d. h. Pharmakodynamik); die Evaluierung, von Unterschieden in der Rate oder dem Ausmaß der Verfügbarkeit. zwischen Formulierungen (d. h. Bioäquivalenz); (6) die Beschreibung, wie Veränderungen in der Physiologie oder der Erkrankung die Absorption, Verteilung und/oder die Eliminierung des Wirkstoffs beeinflussen; (7) die Erklärung von Wirkstoff-Wirkstoff- und Nahrungsmittel-Wirkstoff-Interaktionen und (8) die Charakterisierung von viel versprechenden neuen Wirkstoffkandidaten. Pharmakokinetische Daten gelten als äußerst wichtig für die Vorhersage des Verhaltens und des Schicksals des Wirkstoffkandidaten im menschlichen Körper.
  • Üblicherweise werden Zusammenstellungen von Molekülen oder "Bibliotheken" zubereitet und auf Moleküle hin durchmustert, die eine spezifizierte Bioaktivität aufweisen, wie sie anfänglich durch den Nachweis der Bindung zwischen einem oder mehreren Biomolekülen in der Bibliothek und einem Zielmolekül angezeigt wird, mit dem es reagiert, so dass z. B. ein biologischer Vorgang beeinflusst wird. Typischerweise bestehen Bibliotheken aus einem komplexen Sortiment von Molekülen, das ein oder mehrere Biomolekül(e) enthält, das/die an ein Ziel von Interesse binden kann/können. Die Identifizierung von Biomolekülen, die binden, kann einen Vorsprung hinsichtlich der Identifizierung von Verbindungen bereitstellen, die eine erwünschte biologische Aktivität aufweisen, z. B. als ein möglicher Wirkstoffkandidat.
  • Nachdem Verfahren erhältlich waren, um diese komplexen Gemische oder Bibliotheken effizienter zu durchmustern, ist das Interesse in der Ausnutzung dieses Ansatzes sogar noch angestiegen.
  • Der neueste Stand der Technik offenbart verschiedene Verfahren, um die Suche nach neuen Agenzien wie beispielsweise pharmakologische oder therapeutische Agenzien (d. h. Wirkstoffentdeckung), Agenzien, die für die Pflege oder Haltung von Tieren und den Menschen nützlich sind, landwirtschaftlich nützliche Chemikalien, selektive Biozide für Insekten, Unkräuter oder andere Schädlinge und katalytische und andere Einheiten, die für industrielle chemische, biochemische und pharmazeutische Verfahren nützlich sind, auszuführen.
  • Die monoklonale Antikörpertechnologie hat moderne chemische und medizinische analytische Techniken bedeutend verändert. Auf Antikörper beruhende Nachweissysteme wie ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays) und Radioimmunassays wurden entwickelt, um die Antikörperspezifität und -sensitivität vorteilhaft auszunutzen. Allerdings sind diese Techniken, wenn auch sensitiv, so doch zeitraubend und erfordern üblicherweise viele Handgriffe und/oder Reaktionsmittelzugaben.
  • Verfahren für die Identifizierung von Analytmolekülen für ein Ziel wurden früher beschrieben, z. B. in US 5,861,254 , das ein Zelldurchflussverfahren für die Analyse der molekularen Interaktionskinetik in Bezug auf Nukleinsäuren offenbart. Ein Nachteil dieses so genannten Biosensor-Chips besteht in der geringen Kapazität des Systems für verschiedene Zielspezies und die hohen Probenvolumina, die benötigt werden. Hochdurchsatzsysteme, welche die Durchmusterung von Arrays mit Zielmolekülen erlauben, beinhalten z. B. WO 02/18648, das ein Verfahren für die Analyse von Bindungsinteraktionen offenbart, wodurch Profile der Interaktionsstellen der Verbindung bereitgestellt werden; oder US 5,324,633 , das ein Verfahren und eine Vorrichtung für das Messen der Bindungsaffinität eines Rezeptors für einen Liganden offenbart, indem ein Array von immobilisierten Polymeren verwendet wird. Dennoch wurden diese bekannten Hochdurchsatzsysteme für ihren wichtigen Beitrag zur Erniedrigung der Probenvolumina anerkannt. Stillman und Tonkinson (2001, Analytical Biochemistry 295, 149–157) offenbaren Experimente für die Untersuchung der Bindungsbedingungen zwischen einem immobilisierten Ziel und einem Probenanalyten als Funktion der Zeit unter variierenden Längen der immobilisierten Spezies und Substrattypen. Ein Nachteil besteht allerdings darin, dass die beschriebenen Verfahren die Initiierung eines neuen Experiments für jede einzelne variierende Bindungsbedingung, die untersucht wird, nötig machen, wobei in diesem Fall entweder die Länge der immobilisierten Spezies variiert wird oder das Substrat variiert wird. Die benötigte Versuchszeit, Reproduzierbarkeit und Sensitivität müssen immer noch verbessert werden, und ununterbrochene Bemühungen auf diesen Gebieten werden von der Fachwelt hoch geschätzt.
  • Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Hochdurchsatzverfahren für das Hochgeschwindigkeitsüberwachen von Ziel/Analyt-Interaktionen mit einem stark verbesserten Sensitivitätsniveau bereitzustellen.
  • Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges Verfahren bereitgestellt, um die Interaktion eines Ziel/Analyt-Komplexes qualitativ und quantitativ zu evaluieren.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren für die Untersuchung von Zielmolekülen wie Wirkstoffkandidaten gerichtet. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein derartiges Verfahren für das Überwachen und Messen der Bindungsinteraktion zwischen wenigstens einem Analyten und einem Array von immobilisierten Zielmolekülen bereit, um die Parameter der Bindungsinteraktion und die pharmakokinetischen Parameter der Moleküle zu bestimmen.
  • Die zuvor genannten und zusätzlichen Ziele der Erfindung werden mit einem Verfahren für das, Überwachen von Interaktionen zwischen Zielmolekülen und wenigstens einem Analyten erreicht, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) In-Kontakt-bringen einer Vielzahl von Zielmolekülen mit einer Probe, wobei die Zielmoleküle auf einem porösen Substrat immobilisiert sind, und wobei die Probe mindestens einen Analyten umfasst;
    • (b) Inkubieren der Zielmoleküle mit der Probe unter Bedingungen, welche die Zielmolekül/Analyt-Interaktion unterstützen;
    • (c) Überwachen der in Schritt (b) definierten Interaktion, wobei das Überwachen eine Funktion der Zeit der Inkubation ist, wie sie in Schritt (b) definiert ist;
    • (d) gegebenenfalls Bestimmung mindestens eines Interaktionsparameters;
    • (e) Verändern der in Schritt (b) definierten Bedingungen durch Verändern eines Reaktionsparameters, wobei der Reaktionsparameter aus der die Temperatur, Fließgeschwindigkeit, pH- und Ionenstärke umfassenden Gruppe ausgewählt wird und;
    • (f) mindestens einmalige Wiederholung der Schritte (c) bis (e).
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Beschreibung erlaubt die hochsensitive Analyse von Ziel/Analyt-Interaktionen. Insbesondere erlaubt ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die kinetische Analyse eines Analyten, der in einer Probe in einer so geringen Konzentration wie einer Attomol-Konzentration vorliegt.
  • Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der detaillierten Beschreibung, die folgt, dargestellt werden, und sie werden zum Teil aus der Beschreibung ersichtlich sein, oder sie können bei der Durchführung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Ziele und anderen Vorteile der Erfindung werden durch das Verfahren, das insbesondere in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen dargelegt ist, realisiert und erhalten werden.
  • Die Erfindung betrifft Verfahren und entsprechende Arrays, die insbesondere geeignet sind, die Bindungskinetik von Ziel/Analyt-Interaktionen zu untersuchen.
  • In der vorliegenden Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen beinhalten die Singularformen "ein", "eine", "einer" und "der", "die", "das" die entsprechenden Pluralformen, wenn es der Kontext nicht eindeutig anderweitig vorgibt. Wenn nicht anderweitig definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann verstanden wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und entsprechende Arrays für Untersuchungen der Hochdurchsatzbindungsinteraktion und der Pharmakokinetik von Interaktionsereignissen zwischen Zielmolekülen und Analyten.
  • Die Begriffe "Analyt" und "Analytmolekül" werden in der gesamten Erfindung als miteinander austauschbar verwendet. Der Begriff "Analyt in einer Probe" betrifft ein Molekül in einer Probe, d. h. ein zu analysierendes Molekül. Üblicherweise liegen die Analytkonzentrationen, die in einer Probe für die Analyse gemäß einem Verfahren, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, vorliegen, in einem Bereich von 5 × 10–4 nM bis 50 nM. Üblicherweise liegen die Analytkonzentrationen, die in einer Probe für die Analyse gemäß einem Verfahren, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, vorliegen, in einem Bereich von 5 × 10–4 nM bis 10 nM. Noch üblicher liegen die Analytkonzentrationen in einer Probe im Bereich von 1 × 10–4 nM bis 5 nM. Noch üblicher liegen die Analytkonzentrationen in einer Probe im Bereich von 5 × 10–3 nM bis 1 nM. Noch üblicher liegen die Analytkonzentrationen in einer Probe im Bereich von 1 × 10–3 nM bis 1 × 10–1 nM. Noch üblicher liegen die Analytkonzentrationen in einer Probe im Bereich von 5 × 10–2 nM bis 1 × 10–1 nM. Noch üblicher liegen die Analytkonzentrationen in einer Probe im Bereich von 5 × 10–2 nM bis 5 × 10–1 nM.
  • Demgemäß stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereit, wie es hierin beschrieben ist, wobei der Analyt in der Probe in einer Konzentration von 5 × 10–4 nM bis 10 nM vorliegt.
  • In einer weiteren Ausführungsform liegt die Konzentration im Bereich von 5 × 10–3 nM bis 1 nM.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform liegt die Konzentration im Bereich von 5 × 10–2 nM bis 10–1 nM.
  • Ein Analyt, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, betrifft jedes beliebige Molekül, das mit einem Zielmolekül assoziiert oder an es bindet, wobei das Zielmolekül auf einem porösen Substrat zum Zweck der Durchführung einer Mikroarrayanalyse immobilisiert ist. Der Begriff Analyt, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, betrifft sowohl separate Moleküle als auch Teile von Molekülen, wie z. B. ein Epitop eines Proteins. Beispiele für Analyten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper einschließlich monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, aufgereinigte Antikörper, synthetische Antikörper, Antiseren, die mit spezifischen antigenen Determinanten (wie Viren, Zellen oder anderen Materialien) reagieren, Proteine, Peptide, Polypeptide, Enzymbindungsstellen, Zellmembranrezeptoren, Lipide, Proteolipide, Wirkstoffe, Polynukleotide, Oligonukleotide, Zucker, Polysaccharide, Zellen, zelluläre Membranen und Organellen, Nukleinsäuren einschließlich Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) und Peptid-Nukleinsäuren (PNA) oder jede beliebige Kombination davon; Cofaktoren, Lectine, Metaboliten, Enzymsubstrate, Metallionen und Metallchelate.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, wobei der Analyt ausgewählt wird aus der Gruppe, die Antikörper, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Antiseren, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Enzymbindungsstellen, Polysaccharide, Zellen, zelluläre Membranen und Organellen umfasst.
  • Die Analyten können natürlicherweise auftretende oder von Menschen hergestellte Moleküle sein. Sie können auch in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies verwendet werden. Analyte können Modifikationen enthalten, die sowohl natürlicherweise auftreten als auch in vitro oder in vivo induziert wurden. Induzierte Modifikationen beinhalten Adduktbildung wie eine Haptenanbringung, Multimerisierung, Komplexbildung mittels Interaktion mit anderen chemischen Einheiten, Verdau oder Spaltung (beispielsweise durch Protease) und Metallionenanbringung oder -entfernung. Analyten können kovalent oder nicht kovalent entweder direkt oder mittels eines vermittelnden Linkers an ein Bindeglied angebracht werden.
  • Spezifische Beispiele für Analyt/Ziel-Interaktionen, die mit der vorliegenden Erfindung untersucht werden können, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die im Folgenden genannten Ligand-Rezeptor-Interaktionen, wie sie auf dem Gebiet wohlbekannt sind:
    • (a) Rezeptoren von Mikroorganismen: Die Bestimmung von Liganden, die an Rezeptoren binden, beispielsweise spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben von Mikroorganismen essentiell sind, ist nützlich, beispielsweise bei der Entdeckung einer neuen Klasse von Antibiotika. Von besonderem Wert können Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoen und solche Bakterien sein, die gegenüber den zurzeit verwendeten Antibiotika resistent sind;
    • (b) Enzyme: Beispielsweise ist die Bestimmung der Bindungsstelle von Enzymen, beispielsweise den Enzymen, die für die Spaltung von Neurotransmittern verantwortlich sind, nützlich. Von Wert kann auch die Bestimmung von Liganden sein, die an bestimmte Rezeptoren binden, so dass die Wirkung der Enzyme, welche die verschiedenen Neurotransmitter spalten, moduliert wird, und sie ist nützlich bei der Entwicklung von Wirkstoffen, die für die Behandlung von Störungen der Neurotransmission verwendet werden können;
    • (c) Antikörper: Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung nützlich sein bei der Untersuchung der Ligandbindungsstelle auf dem Antikörpermolekül, die mit dem Epitop eines Antigens von Interesse zusammentritt; Die Bestimmung einer Sequenz, die ein antigenes Epitop nachahmt, kann zu der Entwicklung von Impfstoffen führen, in denen das Immunogen auf einer oder mehreren solcher Sequenzen beruht, oder sie kann zu der Entwicklung von verwandten diagnostischen Mitteln oder Verbindungen führen, die für therapeutische Behandlungen, beispielsweise von Autoimmunerkrankungen nützlich sind (z. B. durch die Blockierung der Bindung der "Selbst-" Antikörper). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Antikörper einen ganzen Antikörper oder ein Antikörperfragment (Fab oder (Fab)2);
    • (d) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die in der Lage sind, eine chemische Reaktion zu fördern, welche die Konversion eines oder mehrerer Reaktionsmittel in ein oder mehrere Produkte beinhaltet. Solche Polypeptide beinhalten im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die für wenigstens ein Reaktionsmittel oder ein Reaktionsintermediat spezifisch ist, und eine aktive Funktionalität, die in der Nähe der Bindungsstelle liegt, wobei die Funktionalität in der Lage ist, das gebundene Reaktionsmittel chemisch zu modifizieren;
    • (e) Hormonrezeptoren: Zum Beispiel die Rezeptoren für Insulin und Wachstumshormon. Die Bestimmung der Liganden, die mit hoher Affinität an einen Rezeptor binden, ist für die Entwicklung von beispielsweise einer oralen Austauschform der täglichen Injektionen nützlich, die Diabetiker einnehmen müssen, um die Symptome des Diabetes zu erleichtern, und für ein Austauschmittel für das seltene humane Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder mittels rekombinanter DNA-Technologie erhalten werden kann. Andere Beispiele sind vaso-konstriktive Hormonrezeptoren; die Bestimmung derjenigen Liganden, die an einen Rezeptor binden können, kann zu der Entwicklung von Wirkstoffen führen, die den Blutdruck kontrollieren;
    • (f) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist für die Entwicklung von weniger süchtig machenden Ersatzstoffen für Morphin und verwandte Wirkstoffe nützlich.
  • So gut wie jede Probe kann unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Beschreibung analysiert werden. Allerdings ist die Probe üblicherweise eine biologische oder eine biochemische Probe. Der Begriff "biologische Probe", wie er hierin verwendet wird, betrifft eine Probe, die von einem Organismus oder von Bestandteilen (z. B. Zellen) eines Organismus gewonnen wurde. Die Probe kann aus jedem/jeder biologischen Gewebe oder Flüssigkeit bestehen. Häufig wird die Probe eine "klinische Probe" sein, die eine Probe ist, die von einem Patienten stammt. Solche Proben beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Auswurf, Cerebrospinalflüssigkeit, Blut, Blutfraktionen wie Serum, einschließlich fötales Serum (z. B. SFC) und Plasma, Blutzellen (z. B. weiße Zellen), Gewebe- oder Feinnadelbiopsie-Proben, Urin, Peritonealflüssigkeit und Pleuraflüssigkeit oder Zellen daraus. Biologische Proben können auch Gewebeschnitte, beispielsweise gefrorene Schnitte, beinhalten, die für histologische Zwecke entnommen wurden.
  • Beispiele für biochemische Proben beinhalten, ohne Einschränkung darauf, Kulturen von Zelllinien, aufgereinigte funktionale Proteinlösungen, Polypeptidlösungen, Nukleinsäurelösungen einschließlich Oligonukleotidlösungen und anderes.
  • Die Proben können direkt analysiert werden, oder sie können vor der Verwendung in den Assays dieser Erfindung einer Zubereitung unterworfen werden. Nicht beschränkende Beispiele für eine Zubereitung beinhalten Suspension/Verdünnung der Probe in Wasser oder in einem geeigneten Puffer oder Entfernung von Zelltrümmern, z. B. durch Zentrifugation, oder Auswahl von besonderen Fraktionen der Probe vor der Analyse. Nukleinsäureproben werden zum Beispiel üblicherweise vor dem Assay isoliert und in einigen Ausführungsformen Verfahren wie einer reversen Transkription und/oder Amplifizierung (z. B. Polymerasenkettenreaktion, PCR) unterworfen, um die Konzentration der Nukleinsäuren in der gesamten Probe zu erhöhen (z. B. unter Verwendung von zufälligen Primern) oder spezifische Typen von Nukleinsäuren zu vermehren (z. B. unter Verwendung von Polynukleotidthymidylat, um Boten-RNA zu amplifizieren, oder von genspezifischen Primern, um spezifische Gensequenzen zu amplifizieren). Das Amplifizierungsverfahren, das in WO 99/43850 dargestellt ist, kann ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Begriffe "Ziel" und "Zielmolekül" werden in der gesamten vorliegenden Erfindung als miteinander austauschbar verwendet und betreffen Moleküle, die auf einem Substrat immobilisiert sind. Eine große Vielzahl von verschiedenen Molekülen kann auf dem Substrat der vorliegenden Arrays immobilisiert werden. In ähnlicher Weise sind die vorliegenden Verfahren auf eine große Vielzahl von verschiedenen Molekülen oder Zielen anwendbar, die auf dem Substrat der vorliegenden Arrays immobilisiert sein können. Ein Ziel oder Zielmolekül, wie es in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, betrifft jedes beliebige Molekül, das an ein Substrat zum Zweck der Durchführung einer Mikroarrayanalyse angebracht werden kann. Weiter betrifft ein Ziel ein Molekül, das von einem besonderen Analyten erkannt werden kann und/oder mit einem solchen interagiert.
  • Die Verfahren und Arrays werden hierin insbesondere beispielhaft im Rahmen von Antikörpern als Ziele dargestellt, die auf einem Substrat immobilisiert sind, sind aber genauso auf andere Molekültypen anwendbar. Zum Beispiel kann der Fachmann die vorliegenden Verfahren und Arrays leicht so anpassen, dass sie auf Ziele anwendbar sind, die Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren; Toxine und Gifte; virale Epitope; Hormone (z. B. Steroide, etc.) und Hormonrezeptoren; Peptide; Enzyme; Wirkstoffe; Lectine; Zucker; Kohlenhydrat bindende Proteine und andere interagierende Wirkstoffe; Oligonukleotide; Nukleinsäuren einschließlich Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) und Peptid-Nukleinsäuren (PNA) oder jede beliebige Kombination davon; Oligosaccharide; Proteine und mit Protein interagierende Wirkstoffe wie z. B. Avidin und seine Derivate; Antikörper einschließlich monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, synthetische Antikörper, aufgereinigte Antikörper und rohe (Serum) Antikörper; Antikörperfragmente, wie z. B. Fab-Fragmente; mit Antikörpern interagierende Wirkstoffe wie Protein A; Aptamere; und kleine chemische Einheiten wie Enzymsubstrate, Cofaktoren, Metallionen, Metallchelate und Haptene beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, wobei die Zielmoleküle ausgewählt werden aus der Gruppe, die Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Haptene und Aptamere umfasst.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind für die Untersuchung der Kinetik nützlich, die mit den dynamischen Vorgängen der Absorption, der Verteilung (Distribution), des Metabolismus und der Absonderung (Exkretion) (ADME) eines Wirkstoffs und/oder seiner Metaboliten in einem lebenden Organismus assoziiert sind. "Absorption" betrifft den Vorgang der Aufnahme einer Wirkstoffverbindung von der Stelle der Verabreichung in die systemische Zirkulation. Der Transfer von Wirkstoffen durch das Intestinallumen wird im Allgemeinen als orale Absorption bezeichnet, während der Transfer von Wirkstoffen durch eine externe physiologische Barriere als allgemeine Absorption bezeichnet wird. Ein pharmakokinetischer Parameter der Absorption kann ausgehend von den kinetischen Daten geschätzt werden, die mit einem Mikroarray assoziiert sind, der zum Beispiel eine Vielzahl von auf ihm immobilisierten geeigneten Liposomen aufweist.
  • "Verteilung" bezeichnet den Transfer einer Wirkstoffverbindung von der Stelle der Verabreichung in die gesamte systemische Zirkulation und anschließend zu den extrazellulären und intrazellulären Wasser und Geweben. Die Wirkstoffverteilung ist üblicherweise ein schneller und reversibler Vorgang. Ein pharmakokinetischer Parameter der Verteilung kann ausgehend von kinetischen Daten geschätzt werden, die mit einem Mikroarray assoziiert sind, der zum Beispiel eine Vielzahl von auf ihm immobilisierten geeigneten Plasmaproteinen, Liposomen und/oder Transportproteinen aufweist.
  • "Metabolismus" bezeichnet die Summe aller chemischen Reaktionen für die Biotransformation von endogenen und exogenen Substanzen, die in der lebenden Zelle stattfinden. Ein pharmakokinetischer Parameter des Metabolismus kann ausgehend von kinetischen Daten geschätzt werden, die mit einem Mikroarray assoziiert sind, der zum Beispiel eine Vielzahl von auf ihm immobilisierten geeigneten metabolischen Enzymen aufweist.
  • "Absonderung" bezeichnet die finale Eliminierung oder den Verlust eines Wirkstoffs aus dem Körper. Die Wirkstoffabsonderung beinhaltet sowohl passive Diffusion als auch eine relative durch spezifsche Träger vermittelte Absonderung. Wirkstoffe können unverändert oder als Metabolite im Urin durch die Nieren oder in den Fäzes durch die Gallenblase und/oder den Darm abgesondert werden. Flüchtige Verbindungen werden häufig in der ausgeatmeten Luft durch die Lungen abgesondert. Wie hierin offenbart ist, kann der pharmakokinetische Parameter der Absonderung basierend auf kinetischen Daten geschätzt werden, die mit einem Mikroarray assoziiert sind, der zum Beispiel einen Antikörper auf ihm immobilisiert aufweist, der den Wirkstoff spezifisch nachweist, sowie andere Proteine/Rezeptoren, die eine hohe Affinität/Spezifität für den Wirkstoffkandidaten aufweisen. Solche Antikörper und Proteine/Rezeptoren können verwendet werden, um die Konzentration/Menge des Wirkstoffs in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten (z. B. Urin/Fäzes) und Geweben unter Verwendung eines direkten Bindungsassays zu quantifizieren.
  • Demgemäß können auf dem Substrat immobilisierte Zielmoleküle Liposomen, Plasmaproteine, CYP 450-Enzyme, andere metabolische Enzyme und/oder Transport-Efflux-Proteine beinhalten.
  • Interaktionen, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung überwacht werden können, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Immunassays; Ligand- (Membran-) Rezeptor-Interaktionen; Antigen-Antikörper-Interaktionen; Protein-Protein-Interaktionen; Enzym-Substrat-Interaktionen; RNA-Protein-Interaktionen; DNA-Protein-Interaktionen; DNA-DNA-Interaktionen; Zell-Protein-Interaktionen; und Wirkstoffdurchmusterung. Weiter kann eine Einschätzung eines Absorptionsparameters eines Wirkstoffkandidaten aus den Bindungsinteraktionen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem oder mehreren geeigneten Liposomen bestimmt werden; eine Einschätzung eines Verteilungsparameters eines Wirkstoffkandidaten kann aus den Bindungsinteraktionen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Set an Plasmaproteinen bestimmt werden (z. B. spezifische und nicht spezifische Gewebebindung und Gewebedurchlässigkeit); eine Einschätzung eines Metabolismusparameters eines Wirkstoffkandidaten kann aus den Bindungsinteraktionen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Set an metabolischen Enzymen bestimmt werden; und eine Einschätzung eines Absonderungsparameters eines Wirkstoffkandidaten kann aus den Bindungsinteraktionen zwischen dem Wirkstoffkandidaten und einem geeigneten Set an Transportproteinen bestimmt werden.
  • Die Interaktionsereignisse können durch den Nachweis von Signalen überwacht werden, die als ein Ergebnis der Interaktion erzeugt werden.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Überwachen folgende Schritte umfasst:
    • (a) Nachweisen eines Signals, wobei das Signal aus einer Zielmolekül/Analyt-Interaktion resultiert, und;
    • (b) Aufnehmen des Niveaus des Signals, wie es in Schritt (a) definiert ist, wobei das Niveau die Stärke der Zielmolekül/Analyt-Interaktion aufzeigt.
  • Dafür werden die Proben üblicherweise so prozessiert, dass das Analytmolekül/die Analytmoleküle von Interesse mit einer nachweisbaren Markierung markiert wird/werden. Das System kann mehr Markierungen enthalten, die unterschiedliche Signale produzieren, die ein Bestandteil eines Interaktionsereignisses sein können oder durch ein solches freigesetzt werden können. Es kann jede beliebige Kombination von Markierungen, z. B. erste und zweite Markierungen, erste, zweite und dritte Markierungen, etc. für die Analyt-Sets verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Markierungen voneinander unterscheidbar sind. Beispiele für unterscheidbare Markierungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und beinhalten: zwei oder mehr fluoreszente Farbstoffe verschiedener Wellenlänge wie Cy3 und Cy5 oder Alexa 542 und Bodipy 630/650; zwei oder mehr Isotope mit unterschiedlichen Emissionsenergien wie 32P und 33P, Markierungen, die Signale unter verschiedenen Behandlungsbedingungen erzeugen wie Temperatur, pH-Behandlung, durch zusätzliche chemische Agenzien, etc.; und Markierungen, die Signale zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung erzeugen.
  • Die Verwendung eines oder mehrer Enzyme für die Signalerzeugung erlaubt die Verwendung von einer noch größeren Vielzahl von unterscheidbaren Markierungen, basierend auf unterschiedlichen Substratspezifitäten der Enzyme (z. B. alkalische Phosphatase/Peroxidase).
  • Der Begriff "Markierung", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das ein Signal propagiert, das den Nachweis und die Quantifizierung unterstützt. Das Signal kann entweder visuell (z. B. weil es eine Farbe besitzt oder ein farbiges Produkt erzeugt oder eine Fluoreszenz emittiert) oder durch Verwendung eines Detektors nachgewiesen werden, der Eigenschaften des Reportermoleküls nachweist (z. B. Radioaktivität, magnetisches Feld, etc.). In der vorliegenden Beschreibung erlauben die Markierungen den Nachweis der Interaktion oder Assoziierung von zwei Molekülen. Nachweisbare Markierungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten jede Zusammensetzung, die mittels spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunchemischer, elektrischer, optischer oder chemischer Mittel nachweisbar sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung beinhalten zum Beispiel Biotin für die Färbung mit markiertem Streptavidinkonjugat, Digoxigenin, Anti-Digoxigenin, Luciferase, P-Galaktosidase, Antigene, Enzyme und Enzymkonjugate (z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder andere, die man üblicherweise z. B. bei ELISA verwendet).
  • Magnetische Kügelchen (z. B. DynabeadsTM), gefärbte Glas- oder Plastik- (z. B. Polystyrol-, Polypropylen-, Latex-, etc.) -Kügelchen, isotopische Markierungen einschließlich Radiomarkierungen (z. B. 3H, 125I, 35S, 14C, 33P oder 32P), colorimetrische Markierungen wie kolloidales Gold (z. B. Goldpartikel im Durchmessergrößenbereich von 40 nm bis 80 nm streuen grünes Licht mit hoher Effizienz), Zucker und Lectine können auch nützlich sein. Patente, welche die Verwendung solcher Markierungen lehren, beinhalten die US-Patente Nrn. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; und 4,366,241. Moleküle, die ihre Fluoreszenz oder Aktivität nach einer Bindungsänderung verändern, können ebenfalls nützlich sein.
  • Besonders geeignete Markierungen, die in der Erfindung verwendet werden können, können Chromogene sein, einschließlich derjenigen, die Licht in einem charakteristischen Wellenlängenbereich absorbieren, so dass eine Farbe beobachtet werden kann, oder die, alternativ, Licht emittieren, wenn sie mit Strahlung einer besonderen Wellenlänge oder eines besonderen Wellenlängenbereichs bestrahlt werden, z. B. fluoreszente Moleküle. Besonders nützliche fluoreszente Markierungen beinhalten, lediglich beispielhaft und nicht beschränkend, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Malachitgrün, Oregongrün, Texasrot, Kongorot, SybrGreen, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2'-, 7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy X-Rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Cyaninfarbstoffe (z. B. Cy5, Cy3), BODIPY-Farbstoffe (z. B. BODIPY 630/650, Alexa 542, etc.), grün fluoreszierendes Protein (GFP), blau fluoreszierendes Protein (BFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), rot fluoreszierendes Protein (RFP) und dergleichen (siehe z. B. Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA).
  • Mittel für den Nachweis solcher Markierungen sind den Fachleuten wohlbekannt. Daher können zum Beispiel Radiomarkierungen unter Verwendung eines fotografischen Films oder eines Szintillationszählers nachgewiesen werden, fluoreszente Markierungen können unter Verwendung eines Fotodetektors nachgewiesen werden, um emittiertes Licht nachzuweisen. Enzymatische Markierungen werden üblicherweise nachgewiesen, indem für das Enzym ein Substrat bereitgestellt wird und das Reaktionsprodukt nachgewiesen wird, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat erzeugt wird, und colorimetrische Markierungen werden nachgewiesen, indem die farbige Markierung einfach visualisiert wird.
  • Fluoreszente Markierungen sind besonders geeignet, weil sie sehr starke Signale mit einem geringen Hintergrund bereitstellen. Fluoreszente Markierungen sind auch optisch in hoher Auflösung und Sensitivität durch ein schnelles Durchmusterungsverfahren nachweisbar. Fluoreszente Markierungen bieten den zusätzlichen Vorteil, dass die Bestrahlung einer fluoreszenten Markierung mit Licht eine Vielzahl von Emissionen erzeugen kann. Daher kann eine einzige Markierung eine Vielzahl messbarer Ereignisse bereitstellen.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, wobei das nachweisbare Signal ein Licht emittiertes Signal ist.
  • Wie von einem Fachmann anerkannt werden wird, können nachweisbare Signale das Auftreten, das Verschwinden oder Veränderungen eines nachweisbaren Signals sein.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Licht emittierte Signal ein fluoreszentes Signal ist.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei ein fluoreszentes Signal durch einen markierten Analyten emittiert wird, wobei der Analyt mit einem Zielmolekül assoziiert ist.
  • Wünschenswerterweise sollten fluoreszente Markierungen Licht über 300 nm, üblicherweise über etwa 350 nm und noch üblicher über etwa 400 nm absorbieren, und üblicherweise bei Wellenlängen emittieren, die um etwa 10 nm höher liegen als die Wellenlänge des absorbierten Lichts.
  • Es sollte erwähnt werden, dass die Absorptions- und Emissionscharakteristika einer gebundenen Licht emittierenden Markierung von denen der ungebundenen Markierung verschieden sein können. Es wird daher besonders erwähnt, dass die verschiedenen Wellenlängenbereiche und Charakteristika der Markierungen die Markierungen anzeigen, wie sie verwendet werden, und nicht die Markierung, die unkonjugiert ist und in einem beliebigen Lösungsmittel charakterisiert wird. Man wird erkennen, dass fluoreszente Markierungen nicht auf einzelne Arten organischer Moleküle beschränkt werden sollen, sondern sie können anorganische Moleküle, multimolekulare Gemische von organischen und/oder anorganischen Molekülen, Kristallen, Heteropolymeren und dergleichen beinhalten.
  • Ein nachweisbares Signal kann gleichermaßen von chemilumineszenten als auch biolumineszenten Markierungen bereitgestellt werden. Chemilumineszente Quellen beinhalten Verbindungen, die von einer chemischen Reaktion elektronisch angeregt werden und dann Licht emittieren können, das als das nachweisbare Signal dient oder einem fluoreszenten Akzeptor Energie spendet. Alternativ können Luciferine zusammen mit Luciferase oder Lucigenine verwendet werden, um Biolumineszenz bereitzustellen.
  • Analytmolekül(e) kann/können bevor, während oder nachdem die Probe die immobilisierten Zielmoleküle kontaktiert mittels jeden bekannten Verfahrens auf dem Gebiet markiert werden. So genannte "direkte Markierungen" sind nachweisbare Markierungen, die vor der Interaktion mit oder der Bindung an den entsprechenden Interaktions- oder Bindungspartner direkt an das Analytmolekül angebracht oder in dieses eingebaut werden.
  • "Indirekte Markierungen" werden an einem Bestandteil angebracht, der in der Lage ist, an den Analyten oder an ein Mitglied eines Bindungspaares zu binden, dessen anderes Mitglied an das Analytmolekül angebracht ist. Bei der indirekten Markierung kann der markierte Bestandteil bevor, während oder nachdem die analythaltige Probe die immobilisierten Zielmoleküle kontaktiert, mit dem Analyten verknüpft werden. Daher kann/können das/die Analytmolekül(e) zum Beispiel biotinyliert werden und anschließend an den entsprechenden Zielmolekül bindenden Partner gebunden werden. Nach der Bindung kann ein Avidin-konjugiertes Fluorophor das Biotin tragende Analytmolekül binden, was eine Markierung bereitstellt, die leicht nachgewiesen wird. Markierungen können an dem/die Analytmolekül(e) direkt oder über eine Linkereinheit angebracht werden. Im Allgemeinen ist die Stelle, an welche die Markierungs- oder Linker-Markierungs-Anbringung erfolgt, nicht auf eine spezifische Position beschränkt. Zum Beispiel kann bei der Markierung von Nukleinsäuren eine Markierung an ein Nukleosid, Nukleotid oder ein Analogon davon an jeder beliebigen Position angebracht werden, die nicht den Nachweis oder die erwünschte Hybridisierung stört.
  • Alternativ kann ein nachweisbares Signal für das Überwachen eines Interaktionsereignisses gemäß einem Verfahren, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, ein Brechungsindex, eine zelluläre Aktivität, eine Absorption, eine Farbverschiebung, ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, eine radioaktive Emission, eine pH-Änderung, eine Temperaturänderung oder eine Massenänderung sein.
  • Demgemäß wird ein Verfahren für das Überwachen von Interaktionen zwischen Zielmolekülen und wenigstens einem Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei das nachweisbare Signal ausgewählt wird aus der Gruppe, die einen Brechungsindex, eine zelluläre Aktivität, eine Lichtemission einschließlich der Fluoreszenz, eine Absorptionsänderung, eine Fluoreszenzänderung, eine Absorption, eine Farbverschiebung, einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, eine radioaktive Emission, eine pH-Änderung, eine Temperaturänderung und eine Massenänderung umfasst.
  • Der Signalnachweis kann eine quantitative oder eine qualitative Beobachtung oder beides sein. Ausgehend von der Stärke des nachgewiesenen Signals kann die Stärke der Interaktionsereignisse abgeleitet werden, und ein Interaktionsparameter kann berechnet werden. Der Interaktionsparameter kann eine Funktion der Menge an Interaktion zwischen einem immobilisierten Zielmolekül und einem Analyten sein.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, wobei der Interaktionsparameter eine Bindung, Bindungsaffinität, relative Affinität, apparente Affinität, Assoziationskonstante, Dissoziationskonstante, ein Logarithmus einer Affinität, eine freie Energie der Bindung, ein Absorptionsparameter, ein Verteilungsparameter, ein Metabolismusparameter oder ein Absonderungsparameter des Analyten für ein immobilisiertes Zielmolekül sein.
  • Genauer gesagt, und in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird der Interaktionsparameter ausgewählt aus der Gruppe, die Spezifität, Affinität, Assoziationskonstante, Absorptionsparameter, Verteilungsparameter, Metabolismusparameter und Absonderungsparameter umfasst.
  • Der Begriff "Bindungsaffinität", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet die Tendenz eines Zielmoleküls mit einem Analyten zu assoziieren. Die Assoziation kann dauerhaft oder transient sein und ist üblicherweise durch eine Veränderung in einem oder mehreren physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften eines der oder beider assoziierender Moleküle gekennzeichnet. Ziel- und Analytmoleküle, die eine Affinität füreinander aufweisen, können spezifisch aneinander binden. Bindungsaffinität, wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet die Stärke der Summe der gesamten nicht kovalenten Interaktion zwischen zwei Molekülen.
  • Das Messen der Bindungsaffinität oder Berechnung der Bindungsaffinität, wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, bezeichnet ein Messen oder Berechnen der Assoziationskonstante für eine Reaktion, wie sie im Folgenden dargestellt ist: Zielmolekül + Analyt → Zielmolekül/Analyt-Komplex.
  • Der Begriff "Assoziationskonstante", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation eines Ziels mit einem Analyten. Wie von einem Fachmann erkannt werden wird, wird die Assoziationskonstante für eine übliche Reaktion (Zielmolekül + Analyt → Zielmolekül/Analyt-Komplex) üblicherweise als kass oder kon oder k1 benannt und als M–1 sec–1 ausgedrückt.
  • Der Begriff "Dissoziationskonstante", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet die Rate oder "Ab-Rate" für die Dissoziation eines Zielmoleküls vom Analyten, mit dem es assoziiert, und stellt eine Anzeige der Stärke der Bindung zwischen zwei Molekülen in der Form dar, dass sie anzeigt, wie einfach es ist, den Komplex zu trennen. Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, wird die Dissoziationskonstante für eine typische Reaktion üblicherweise als kdiss oder koff oder k–1 oder k2 bezeichnet und wird als sec–1 ausgedrückt.
  • Die Natur und Geometrie des porösen Substrats, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich unter anderem dem Typ von Array (z. B. eindimensional, zweidimensional oder dreidimensional) und der Art der Anbringung (z. B. kovalent oder nicht kovalent). Im Allgemeinen kann das Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung aus jedem beliebigen porösen Material bestehen, das die Immobilisierung eines Zielmoleküls erlauben wird und das unter den verwendeten Reaktionsbedingungen nicht schmelzen oder anderweitig wesentlich degradieren wird. Darüber hinaus sollte, in den Fällen, in denen eine kovalente Immobilisierung in Erwägung gezogen wird, das Substrat polyfunktional sein oder in der Lage sein, polyfunktionalisiert oder mit reaktiven Gruppen aktiviert zu werden, die in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit dem Ziel, das immobilisiert werden soll, auszubilden (z. B. Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen).
  • Funktionale Gruppen, die auf der Oberfläche vorliegen und für die Verknüpfung verwendet werden können, werden wenigstens bifunktional sein, d. h. sie werden eine funktionale Gruppe oder Einheit aufweisen, die in der Lage ist, eine Verknüpfung mit dem aktivierten Substrat auszubilden, und eine beliebige andere funktionale Gruppe oder Einheit, die in der Lage ist, eine Verknüpfung mit einem weiteren Linker-Molekül oder dem Zielmolekül auszubilden. Linker können dafür nützlich sein, die Zielmoleküle in einem Abstand vom Substrat zu halten. Linker können, in Abhängigkeit von der besonderen Anwendung, lang oder kurz, flexibel, halbsteif oder steif, geladen oder ungeladen, hydrophob oder hydrophil sein.
  • Unter bestimmten Umständen können Linker verwendet werden, um eine funktionale Gruppe in eine andere "umzuwandeln". Zum Beispiel kann ein Amino-aktiviertes Substrat in ein Hydroxylaktiviertes Substrat durch Reaktion mit beispielsweise 3-Hydroxypropionsäure umgewandelt werden. Auf diese Weise können Substratmaterialien, die nur schwer mit einer bestimmten reaktiven funktionalen Gruppe aktiviert werden können, auf bequeme Weise in ein geeignet aktiviertes Substrat umgewandelt werden. Die für die "Umwandlung" solcher reaktiver Gruppen geeignete Chemie und Reagenzien sind wohlbekannt und werden dem Fachmann offensichtlich sein.
  • Linker können auch verwendet werden, wo notwendig, um die Anzahl reaktiver Gruppen auf dem aktivierten Substrat zu erhöhen oder zu "amplifizieren". Für diese Ausführungsform wird der Linker drei oder mehr funktionale Gruppen aufweisen. Nach Anbringung an das aktivierte Substrat mittels einer der funktionalen Gruppen, sind die verbliebenen zwei oder mehr Gruppen für die Anbringung von Polynukleotiden verfügbar. Die Amplifizierung der Anzahl von funktionalen Gruppen auf dem aktivierten Substrat auf diese Weise ist besonders vorteilhaft, wenn das Substrat nur schwer mit einer ausreichenden Anzahl reaktiver Gruppen aktiviert werden kann.
  • Geeignete Linker oder Quervernetzungsmoleküle beinhalten, in nur beispielhafter Aufzählung und ohne Beschränkung, Polypeptide wie Polyprolin oder Polyalanin, gesättigte oder ungesättigte bifunktionale Kohlenwasserstoffe, wie 1-Amino-Hexansäure, Polymere wie Polyethylenglycol, etc., 1,4-Dimethoxytrityl-polyethlyenglycol, Phosphoramidite, die für die Ausbildung von Phosphordiesterbindungen mit Hydroxylgruppen nützlich und zum Beispiel in Zhang et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 3929–3933 und Durand et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 6353–6359 beschrieben sind. Andere nützliche Linker sind kommerziell erhältlich.
  • Das in WO 01/12846 beschriebene Verfahren kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Im Stand der Technik ist eine Anzahl von Materialien beschrieben, die für die Verwendung als Substrate in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Besonders geeignete Materialien für die Verwendung als Substrate in der vorliegenden Erfindung beinhalten jede Art von porösen Substraten, die im Stand der Technik bekannt sind. Ganz besonders geeignete Materialien für die Verwendung als Substrate in der vorliegenden Erfindung beinhalten jede Art von festen porösen Substraten, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Das Substrat kann in Form von Kügelchen, Partikeln, Blättern, Filmen oder Membranen vorliegen, und es kann durchlässig sein. Zum Beispiel kann das Substrat aus Kügelchen oder Partikeln (beispielsweise konventionelle Trägermaterialien für die Festphasensynthese), Fasern (wie Glaswolle oder andere Glas- oder Plastikfasern), Kapillarröhrchen aus Glas oder Plastik oder aus Metalloxidmembranen bestehen. Das poröse Substrat kann planar sein oder eine einfache oder komplexe Form aufweisen. Die Oberfläche, an der das Molekül anhängt, kann eine äußere Oberfläche oder eine innere Oberfläche des porösen Substrats sein. Insbesondere im Fall, in dem die Oberfläche porös ist, wird das Molekül wahrscheinlich an einer inneren Oberfläche angebracht sein. In dem Fall, in dem die feste Oberfläche porös ist, können in Abhängigkeit von der Natur des Systems verschiedene Porengrößen verwendet werden.
  • Das Material des porösen Substrats kann zum Beispiel ein Metall, ein Keramikmetalloxid oder ein organisches Polymer sein. Mit Blick auf die Stärke und Steilheit kann ein Metall oder ein Keramikmetalloxid verwendet werden. Vor allem kann mit Blick auf die Hitzeresistenz und auf die Resistenz gegenüber Chemikalien ein Metalloxid verwendet werden. Darüber hinaus stellen Metalloxide ein Substrat bereit, das sowohl eine hohe Kanaldichte als auch eine hohe Porosität aufweist, das Arrays hoher Dichte erlaubt, die unterschiedliche erste Bindungssubstanzen pro Einheit der Oberfläche für den Probenauftrag umfassen. Darüber hinaus sind Metalloxide für sichtbares Licht hoch durchlässig. Metalloxide sind relativ billige Substrate, die keine Verwendung irgendeiner üblichen Mikrofabrikationstechnologie benötigen und die eine verbesserte Kontrolle über die Flüssigkeitsverteilung über der Oberfläche des Trägers bieten, beispielsweise eine elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembran. Metalloxidmembranen mit durchgehenden, gerichteten Kanälen können mittels elektrochemischer Ätzung eines Metallblatts hergestellt werden.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, wie es hierin beschrieben ist, wobei das poröse Substrat ein Metalloxidsubstrat ist.
  • Die Art des Metalloxids ist nicht auf eine besondere beschränkt, sondern kann je nach Vorliebe verwendet werden. Als ein Metall kann zum Beispiel ein poröses Substrat aus Edelstahl (gesintertes Metall) verwendet werden. Für Anwendungen, die keine Hitzeresistenz benötigen, kann auch ein poröses Substrat aus einem organischen Polymer verwendet werden, wenn es steif ist.
  • Metalloxide, die in Erwägung gezogen werden, sind unter anderem Oxide von Zirkonium, Silizium, Mullit, Cordierit, Titan, Zeolit oder eines Zeolitanalogons, Tantal und Aluminium sowie Legierungen von zwei oder mehr Metalloxiden und dotierte Metalloxide und Legierungen, die Metalloxide enthalten.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das poröse Substrat ein Aluminiumoxid-Träger ist.
  • Die Metalloxidmembranen sind transparent, insbesondere wenn sie nass sind, was Assays unter Verwendung verschiedener optischer Techniken erlaubt. Solche Membranen besitzen gerichtete durchgehende Kanäle mit gut kontrolliertem Durchmesser und nützlichen chemischen Oberflächeneigenschaften. Die Patentanmeldung WO 99/02266 steht in dieser Hinsicht als Beispiel und wird spezifisch in die vorliegende Erfindung mit aufgenommen. Diese Anmeldung zeigt die Verwendung von AnoporeTM, das ein bevorzugtes Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das poröse Substrat ein Durchflusssubstrat ist.
  • Ein besonders nützliches Substrat besitzt lange verzweigte oder teilweise verzweigte Kapillaren, die innerhalb des Substrats miteinander verbunden sind. Diese so genannten Verbindungsleitungen erlauben eine präzisere Bestimmung von kinetischen Bindungsparametern, die eine verbesserte Sicht auf das Interaktionsverhalten in natürlichen Umgebungen erlauben. Üblicherweise spiegeln die Reaktionen, die mit bekannten Verfahren erhalten werden, eher "isolierte" Interaktionsereignisse wieder, d. h. es werden "Eins-zu-Eins"-Interaktionen untersucht, und sie erlauben möglicherweise nicht die Extrapolation auf unter natürlichen Reaktionsbedingungen erwartete Reaktionen.
  • Eine nützliche Substratdicke gemäß der Erfindung kann zum Beispiel im Bereich von 50 μm bis 150 μm liegen. Ein besonders geeignetes Beispiel der Substratdicke ist 60 μm. Besonders geeignete Größen der Substratporen betragen etwa 200 nm. Diese Größenangaben sollen nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung beschränken.
  • Die poröse Natur des Substrats erleichtert die durch Druck hervorgerufene Bewegung von Flüssigkeit, z. B. der Probenlösung, durch seine Struktur. Im Gegensatz zu zweidimensionalen Substraten ergibt die Durchflussnatur eines dreidimensionalen Substrats oder Mikroarrays, wie sie in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, signifikant reduzierte Hybridisierungszeiten und verstärkte Signal- und Signal/Hintergrund-Verhältnisse. Weiter kann ein positiver oder negativer Druck auf die Arrays ausgeübt werden, um die Probenlösung dynamisch auf und ab durch die Substratporen zu pumpen. Dies kann die Diffusion des Analyten zu den Zielmolekülen verstärken, die Anhäufungsrate eines spezifisch an einen Bindungszielpartner gebundenen Analyten erhöhen und demgemäß in einer verbesserten Möglichkeit für seltene Analytmoleküle hoher Affinität resultieren, an ein Ziel zu binden. Weiter können gebundene Analytmoleküle während eines ausgedehnten Expositionszeitraums gegenüber dem Ziel durch Analytmoleküle höherer Affinität ersetzt werden, was die Selektion derjenigen Analytmoleküle mit der höchsten Affinität für ein gegebenes Ziel erlaubt.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das Inkubieren der Zielmoleküle und der Probe dynamisch ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die dynamische Inkubation die Unterwerfung des porösen Substrats unter mindestens einen Zyklus des Vorwärts- und Rückwärtsflusses der Probe durch das poröse Substrat.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Vorwärts- und Rückwärtsfluss durch die Ausübung von alternierendem positivem und negativem Druck etabliert.
  • Die Dauer eines Zyklus eines Vorwärts- und Rückwärtsflusses der Probe durch das poröse Substrat kann zwischen 10 min und 1 sec liegen. Üblicherweise liegt die Dauer eines Zyklus zwischen 5 min und 10 sec. Noch üblicher liegt die Dauer eines Zyklus zwischen 5 min und 10 sec Noch üblicher liegt die Dauer eines Zyklus zwischen 1 min und 45 sec. Ein besonders geeignetes Beispiel der Dauer eines einzelnen Zyklus eines Vorwärts- und Rückwärtsflusses ist 30 sec.
  • Eine optimale Flussrate ist solchermaßen, dass die Aufenthaltszeit der Analytmoleküle in der Nähe der immobilisierten Zielmoleküle ausreichend lang ist, um Interaktionsereignisse messbarer Mengen an markierten Analytmolekülen in der kürzest möglichen Zeit zu erzeugen.
  • Es könnte allerdings wünschenswert sein, die Flussrate zu manipulieren, um das Überwachen von Interaktionsereignissen zwischen Zielmolekülen und Analyten mit vordefinierten kinetischen Eigenschaften bereitzustellen; z. B. hohe kass-Werte. Zum Beispiel mit hohen Flussraten nur diejenigen Analytmoleküle mit sehr schnellen Auf-Raten und langsamen Ab- Raten oder diejenigen, die schnell wieder binden, um auf dem Substrat Zielmolekül/Analyt-Komplexe auszubilden. Die Flussrate kann mit einem Zeitfaktor von 2 angehoben oder abgesenkt werden; d. h. z. B. von 1 Zyklus/15 sec auf 1 Zyklus/30 sec bis 1 Zyklus/60 sec usw. Genauso geeignet sind Zeitfaktorsteigerungen von 4, 6, 8 oder 10.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das Messen und das Überwachen eine Funktion der Flussgeschwindigkeit sind.
  • Es ist üblich, die Analyse bei einer einzigen konstanten Temperatur auszuführen; die bevorzugte Temperatur wird von der Anwendung abhängen. Typischerweise werden thermophile auf Zellen beruhende Anwendungen bei einer Temperatur ausgeführt, die von 0 °C bis 100 °C ausgewählt wird, typische physiologische Assays werden bei 37 °C ausgeführt, Raumtemperatur-Assays benötigen Temperaturen von 20 °C bis 30 °C.
  • Die Anpassung der Reaktionstemperatur kann erreicht werden, indem das Substrat mittels eines Substrathalters mit einer Heizvorrichtung wie beispielsweise einem Wasserbad oder einer leitfähigen Heizplatte gekoppelt wird.
  • Allerdings könnte es wünschenswert sein, die Temperatur während des Zeitverlaufs der Inkubation der Analytmoleküle mit den Zielmolekülen zu variieren. Ein solches Experiment unter Variation der Temperatur erlaubt eine Spezifitätsanalyse der interagierenden Moleküle. Die Temperatur des Substrats kann schrittweise mit jeder beliebigen vorteilhaften Steigerung angehoben werden. Eine geeignete Temperatursteigerung liegt im Bereich zwischen 20 °C und 1 °C. Geeignetere Temperatursteigerungen liegen im Bereich zwischen 15 °C und 2 °C; 10 °C und 5 °C; einschließlich der äußeren Grenzen. Darüber hinaus kann die Temperaturvariation kontinuierlich sein.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das Messen und das Überwachen eine Funktion der Temperatur sind.
  • Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei ein Reaktionsparameter ausgewählt wird aus der Gruppe, die Temperatur, Flussgeschwindigkeit, pH- und Ionenstärke umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei die Variation eines Reaktionsparameters graduell erfolgt.
  • Darüber hinaus erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein kontinuierliches sowie ein diskontinuierliches Überwachen von Interaktionen zwischen Zielmolekülen und einem Analyten.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das Messen und das Überwachen in Echtzeit erfolgen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das Messen und das Überwachen in Halbechtzeit erfolgen.
  • In der vorliegenden Erfindung wird eine erste Bindungssubstanz oder ein Zielmolekül auf dem Substrat in einem räumlich definierten Bereich, d. h. an einem bestimmten Spot, immobilisiert. Der Begriff "erste Bindungssubstanz", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bezeichnet jedes Molekül, das direkt an das Substrat gebunden ist, beispielsweise aktivierende Gruppen einschließlich Linker, und Zielmoleküle.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei das poröse Substrat eine Vielzahl von Zielmolekülen innerhalb vorbestimmter Bereiche auf dem porösen Substrat umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei die vorbestimmten Bereiche räumlich so angeordnet sind, dass sie Mikroarrays ausbilden.
  • Die Mikroarrays der vorliegenden Erfindung können jede erwünschte Größe aufweisen, ausgehend von zwei Spots bis 106 Spots oder sogar mehr. Die oberen und unteren Grenzen der Größe des Substrats werden nur durch praktische Erwägungen hinsichtlich des Arbeitens mit extrem kleinen oder großen Substraten bestimmt.
  • Die Begriffe "vorbestimmter Bereich" oder "Spot" werden in der gesamten vorliegenden Erfindung als miteinander austauschbar verwendet. Der letztere Begriff bezeichnet individuelle, räumlich adressierbare Positionen auf einem Array.
  • Ein vorbestimmter Bereich ist eine lokalisierte Fläche auf einem Substrat, das für die Anbringung, direkt oder mittels Synthese, eines Zielmoleküls verwendet wird, verwendet wurde oder verwendet werden soll. Der vorbestimmte Bereich kann jede beliebige vorteilhafte Form aufweisen, z. B. rund, rechteckig, elliptisch, keilförmig, etc. Ein vorbestimmter Bereich und daher die Fläche, auf der jedes einzelne Zielmolekül angebracht wird, ist kleiner als etwa 1 cm2 oder weniger als 1 mm2. Üblicherweise weisen die Bereiche eine Fläche von weniger als 10.000 μm2 oder noch üblicher von weniger als 100 μm2 auf und können weniger als 10 μm2 betragen. Innerhalb dieser vorbestimmten Bereiche ist das Zielmolekül in einer im Wesentlichen reinen Form angebracht.
  • "Im Wesentlichen rein" bedeutet das Aufweisen von Charakteristika, die sie von anderen vordefinierten Bereichen unterscheidet. Üblicherweise kann die Reinheit in Form der biologischen Aktivität oder Funktion als ein Ergebnis einer einheitlichen Sequenz gemessen werden. Solche Charakteristika werden typischerweise mittels Bindung an einen ausgewählten Rezeptor gemessen. Üblicherweise ist der Bereich ausreichend rein, so dass die vorherrschende Spezies in dem vordefinierten Bereich die erwünschte Spezies ist.
  • Der Ausdruck "räumlich angeordnet", um deutliche Arrays auszubilden, bedeutet, dass die vorbestimmten Bereiche auf dem Substrat, auf denen die Zielmoleküle angebracht sind, in präzisen Mustern angeordnet sind, beispielsweise in Reihen von Punkten oder Reihen von Quadraten oder in Linien.
  • Der Begriff "Mikroarray", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet ein poröses Substrat, das eine Matrix von Zielmolekülen aufweist, die an bestimmten Positionen angeordnet sind.
  • Die Ausdrücke "angebracht an" oder "anhängend an" oder "gebunden an" ein poröses Substrat besagen, dass die Zielmoleküle direkt oder indirekt auf dem Substrat fixiert oder immobilisiert sind und dass mehr als 95 % der Zielmoleküle mit dem Substrat assoziiert bleiben, wenigstens bis alle Handgriffe vollendet wurden und das Bindungsniveau ermittelt wurde.
  • Der Ausdruck "auf einem porösen Substrat immobilisiert", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet die Anbringung oder das Anhängen eines oder mehrer Zielmoleküle auf der Oberfläche eines porösen Substrats, einschließlich der Anbringung oder des Anhängens an die innere Oberfläche des Substrats.
  • Moleküle oder Verbindungen können entweder kovalent (z. B. unter Verwendung einzelner reaktiver Thiolgruppen von Cystein-Resten) oder nicht kovalent, jedoch spezifisch (z. B. mittels immobilisierter Antikörper, dem Biotin/Streptavidin-System und dergleichen) mittels jedes auf dem Gebiet bekannten Verfahrens immobilisiert werden. Weitere Beispiele der verschiedenen Verfahren, die verfügbar sind, um Zielmoleküle an poröse Substrate anzubringen, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Biotin-Ligand, nicht-kovalent komplexiert mit Streptavidin, S-H-Ligand, kovalent verknüpft mittels eines alkylierenden Reagenzes wie einem Jodacetamid oder Maleimid, das mit SH reagiert und eine Thioetherbindung ausbildet, Aminligand, kovalent verknüpft mittels einer aktivierten Carboxylatgruppe (z. B. EDAC-gekoppelt, etc.), Phenylborsäure (PBA)-Ligand, komplexiert mit Salicylhydroxamsäure (SHA) und acrylische Verknüpfungen, welche die Polymerisation mit freien Acrylsäuremonomeren erlauben, so dass Polyacrylamid ausgebildet wird, oder die Reaktion mit SH oder Silanoberflächen. Insbesondere kann die Immobilisierung von Proteinen mit Anbringungsagenzien erreicht werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die Cyanbromid, Succinimide, Aldehyde, Tosylchlorid, Avidin-Biotin, Photo-quervernetzende Agenzien, einschließlich heterobifunktionaler kreuzvernetzender Agenzien wie N-[y-Maleimidbutyryloxylsuccinimidester (GMBS), Epoxide und Maleimide umfasst. Antikörper können an ein poröses Substrat angebracht werden, indem eine freie Aminogruppe auf dem Antikörper chemisch mit reaktiven Seitengruppen quervernetzt wird, die auf dem Träger vorhanden sind. Zum Beispiel können Antikörper chemisch mit einem Substrat quervernetzt werden, das freie Amino-, Carboxyl- oder Schwefelgruppen enthält, wenn Glutaraldehyd, Carbodiimide oder heterobifunktionale Agenzien wie GIVMS als Quervernetzer verwendet werden.
  • Die Verfahren für das Überwachen von Interaktionen zwischen Zielmolekülen und Analyten, wie sie hierin beschrieben sind, erlauben die Bestimmung von Interaktionsparametern einschließlich Bindungskonstanten sowie Dissoziationskonstanten.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Überschuss an unmarkierten Analytmolekülen zugefügt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der Überschuss an unmarkierten Analytmolekülen nach abgeschlossener Ausbildung des Komplexes zwischen immobilisiertem Zielmolekül und Analyt zugefügt.
  • Die Zugabe von unmarkierten Analytmolekülen nach der Ausbildung des Komplexes zwischen Zielmolekül und markiertem Analyten resultiert in der Dissoziation des markierten Analyten, der durch das unmarkierte Analytmolekül ersetzt wird, was eine so genannte Neubindung verhindert. Eine Neubindung führt häufig zu einer Unterschätzung der Dissoziationskonstante.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens, wie es hierin beschrieben ist, um die Analytmolekül-Bindungskinetik zu untersuchen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens, wie es hierin beschrieben ist, für das Messen von Dissoziationskonstanten von Ligand-Rezeptor-Paaren.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens, wie es hierin beschrieben ist, für die Durchmusterung von Bibliotheken therapeutischer Verbindungen.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens, wie es hierin beschrieben ist, für die Durchmusterung von Bibliotheken diagnostischer Proteine.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines porösen Substrats für die Zubereitung eines Mikroarray-Kits für die Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt die Anordnung eines Lama VHH-Antikörperarrays dar, wie er in Beispiel 1 verwendet wird. Der Array umfasst 7 VHH-Proteine in doppelter Ausführung, die als C1, C4, E7, C12, B5, H2 und G11 bezeichnet werden; eine Anzahl von PBS-Negativkontrollen und ein Fluorescein-markiertes Referenzoligonukleotid.
  • 2 stellt die Nachweisergebnisse von Cy3-markiertem Gesamt-IgG dar, das mit einem Antikörperarray, wie in 1 gezeigt, mit Lama VHH-Antikörperfragmenten, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Kontakt gebracht wurde. Gesamt-IgG und IgG1 werden in Konzentrationen von 1 μg/ml (6,7 nM) verwendet. Die Expositionszeiten liegen im Bereich von 55 ms (2A) bis 110 ms (2C und 2D) bis 220 ms (2B).
  • 2A stellt die Ergebnisse dar, die mit Gesamt-IgG nach einem Zyklus des Durchflusspumpens gewonnen wurden;
  • 2B stellt die Ergebnisse dar, die mit IgG1 nach 2 Zyklen des Durchflusspumpens gewonnen wurden;
  • 2C stellt die Ergebnisse dar, die mit Gesamt-IgG nach 120 Zyklen des Durchflusspumpens (Dauer: 1 Stunde) gewonnen wurden; und
  • 2D stellt die Ergebnisse dar, die mit IgG1 nach 120 Zyklen des Durchflusspumpens (Dauer: 1 Stunde) gewonnen wurden.
  • 3 stellt die konzentrationsabhängige Bindung von Gesamt-IgG an VHH E7 dar (siehe Beispiel 1). au, willkürliche Einheit.
  • 4 stellt die Kinetik der Bindung von Gesamt-IgG (1 nM) an immobilisiertes C4 und E7 von VHH dar (siehe Beispiel 1).
  • 5 stellt den Einfluss der Zugabe von Serum zu einem Mab57.9-Antikörperkomplex vor dem In-Kontakt-Bringen mit einem Peptid-Array, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf die Hintergrundfluoreszenz dar:
  • 5A stellt das Fluoreszenzergebnis bei fehlendem Serum dar;
  • 5B stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 10 % Serum dar;
  • 5C stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 20 % Serum dar; und
  • 5D stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 40 % Serum dar.
  • Kameraeinstellung: Gain 255, Gamma 100, Expositionszeit 770 ms.
  • 6 stellt den Einfluss der Zugabe von Serum zu einem Mab3418-Antikörperkomplex vor dem In-Kontakt-Bringen mit einem Peptid-Array, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf die Hintergrundfluoreszenz dar:
  • 6A stellt das Fluoreszenzergebnis bei fehlendem Serum dar;
  • 6B stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 10 % Serum dar;
  • 6C stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 20 % Serum dar; und
  • 6D stellt das Fluoreszenzergebnis nach Zugabe von 40 % Serum dar.
  • Kameraeinstellung: Gain 255, Gamma 100, Expositionszeit 77,8 ms.
  • 7 stellt den Einfluss der Zugabe von Serum auf die Komplexbildung von Mab57.9 und Ziege-Anti-Maus-Fluorescein dar. Die Expositionszeit beträgt 440 ms.
  • 8 stellt den Nachweis der Interaktion zwischen Mab3418/gam-Flu-Antikörper und 6 verschiedenen Peptiden bei fehlendem Serum dar.
  • 9 stellt den Nachweis der Interaktion zwischen Mab3418/gam-Flu-Antikörper und 6 verschiedenen Peptiden bei der Anwesenheit von 10 % Serum dar.
  • 10 stellt eine Arrayanordnung dar, wie sie in den Beispielen 3 und 4 verwendet wird (doppelte Ausführung: Reihen A bis B und E bis H sind identisch). Der Array umfasst PBS-Negativkontrollen und ein Referenz-Oligo.
  • 11 stellt die Fluoreszenzergebnisse nach Inkubation verschiedener Fluorescein-markierter Antikörper mit einem IgG-Array dar, wie in 10 gezeigt und in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Expositionszeit beträgt 220 ms.
  • 11A stellt die Bindung von Anti-Maus-IgG an Maus-IgG und Ratte-IgG dar,
  • 11B stellt die Bindung von Anti-Ziege-IgG an Ziege-IgG und Rinder-IgG dar und
  • 11C stellt die Bindung von Anti-Ratte-IgG an alle aufgetropften IgGs dar.
  • 12 stellt die Fluoreszenzergebnisse nach Inkubation verschiedener Cy3-markierter Antikörper mit einem IgG-Array dar, wie in 10 gezeigt und in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Expositionszeit beträgt 55 ms.
  • 12A stellt die Bindung von Anti-Maus-IgG an Maus-IgG und Ratte-IgG dar,
  • 11B stellt die Bindung von Anti-Ziege-IgG an Ziege-IgG und Rinder-IgG dar, und
  • 11C stellt die Bindung von Anti-Ratte-IgG an Maus-IgG und Ratte-IgG dar.
  • 13 stellt die Ergebnisse dar, die nach Inkubation eines IgG-Arrays, wie in 10 gezeigt, mit Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG gewonnen wurden. Die Konzentration an Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG beträgt 0,02 μg/ml. Die Expositionszeit beträgt 220 ms.
  • 13A stellt den Nachweis unmittelbar nach dem Waschen des Arrays dar;
  • 13B stellt den Nachweis zum Zeitpunkt 5 min nach dem Waschen dar; und
  • 13C stellt den Nachweis zum Zeitpunkt 50 min nach dem Waschen dar.
  • 14 stellt die Bindung von Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG in verschiedenen Konzentrationen an Ziege-IgG dar, wie in Beispiel 4 beschrieben ist.
  • 15 stellt die Bindung von Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG bei einer niedrigen Konzentration an einen Array verschiedener IgGs dar (siehe 10), wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Konzentration an Cy3-markiertem Anti-Ziege beträgt 0,002 μg/ml. Die Expositionszeit beträgt 990 ms.
  • 15A stellt den Nachweis unmittelbar nach dem Waschen des Arrays dar;
  • 15B stellt den Nachweis zum Zeitpunkt 60 min nach dem Waschen dar; und
  • 15C stellt den Nachweis zum Zeitpunkt 150 min nach dem Waschen dar.
  • 16 stellt die Bindung von Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG bei verschiedenen Konzentrationen an Ziege-IgG dar, wie in Beispiel 4 beschrieben ist.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele der Erfindung sind nur beispielhaft und sollten in keiner Weise als Beschränkung aufgefasst werden.
  • Beispiel 1: Schneller und spezifischer Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung eines Antikörperarrays mit Lama VHH-Antikörperfragmenten, die auf einem festen Substrat immobilisiert sind
  • Lama-Einzeldomänen-Antikörperfragmente (VHHs) wurden für den Nachweis von Proteinen verwendet. Immunglobuline des G-Typs sind die Proteine von Interesse und wurden bei der Auswahl der VHHs verwendet. VHHs sind bei der Erzeugung von Mikroarrays wegen einer Reihe von Gründen gut anwendbar; unter anderem wegen ihrer hohen Stabilität, der einfachen molekularen Klonierung (klein, etwa 125 Aminosäuren) und hohen Löslichkeit.
  • 1.1. Isolierung von VHH-Proteinen
  • Es wurde die Phagen-Display-Technologie verwendet, um die VHH-Proteine zu isolieren. Die VHH-Proteine wurden aus Bibliotheken ausgewählt, die ausgehend von RNA zweier Lamas erzeugt wurden, die entweder mit IgG1 und IgG2a oder einem Gemisch von Fc-Fragmenten von humanen und Maus-Immunglobulinen immunisiert wurden. Aufeinanderfolgende Selektionsrunden ergaben 7 VHH-Proteine mit einer Spezifität oder Kreuzreaktivität gegenüber Maus-IgG-Subklassen.
  • 1.2. Zubereitung des Mikroarrays
  • Die VHH-Proteine, die einen C-terminalen Cysteinrest umfassen (der die kovalente Kopplung an Maleimidgruppen ermöglicht), wurden bei einer Konzentration von 10 μM auf einen Maleimidmodifizierten festen Träger (ANOPORETM Aluminiumoxidmembran; Kat.-Nr. 68090084, Whatman Scientific Ltd.) in einem Arrayformat aufgetropft.
  • 1.3. In-Kontakt-Bringen des VHH-Arrays mit Cy3-markiertem Gesamt-IgG oder IgG1 der Maus und Signalnachweis
  • Nach extensivem Waschen wurde die Membran mit Cy3-markiertem Gesamt-IgG (gesamtes Immunglobulin G) oder IgG1 (Subklasse) der Maus bei einer Konzentration von 1 μg/ml (6,7 nM) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert, die mit Tween-20 (0,05 %) supplementiert war.
  • In beiden Fällen wurde ein Signal nach 1- oder 2-maligem Durchflusspumpen der Probe leicht an bestimmten VHH-Spots nachgewiesen (2a und 2b). Nach einer einstündigen Inkubation, während der ein Durchflusspumpen gemäß einem Schnellinkubationsverfahren durchgeführt wurde (1 Zyklus/0,5 min; die Probe passiert immobilisiertes VHH 4 Mal pro Minute), wurden starke Signale aufgenommen (siehe 2c und 2d). Die Signale von verschiedenen VHH-Spots variierten in einem großen Ausmaß, was eine spezifische Erkennung des Immunglobulins durch die immobilisierten VHH-Proteine anzeigt. Die Bindung ist konzentrationsabhängig und wird für die Bindung von Gesamt-IgG an VHH in 3 gezeigt (siehe E7). Die niedrigste Konzentration an Gesamt-IgG, die nachgewiesen wurde, betrug 0,1 nM in einer 20 μl-Probe (2 Femtomol).
  • 1.4. Bindungskinetik
  • Der Nachweis der Signale durch die Bindung von Cy3-markiertem Gesamt-IgG, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurde über die Zeit hinweg aufgenommen, um die Bindungskinetik zu untersuchen. 4 zeigt die Assoziierungskurven der Bindung von Cy3-markiertem Gesamt-IgG (1 nM) an VHH C4 bzw. VHH E7. Indem die Daten angepasst wurden und die Formel 1 verwendet wurde, wurden die Geschwindigkeitskonstanten (kass) bestimmt (siehe Tabelle 1). B = Bmax·(1-exp(-k·t)] Formel 1
  • Sogar bei geringen Konzentrationen an VHH-Proteinen, z. B. im Fall eines VHH-Proteins (B5), das aus einer Lösung von 3 μM aufgetropft wurde, wobei weniger als 0,9 Femtomol VHH immobilisiert wurden, wurde nach Inkubation mit Gesamt-IgG ein Signal erhalten.
  • Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung einen schnellen und spezifischen Nachweis von Interaktionen zwischen Immunglobulinen und Lama-VHH-Proteinen erlaubt, die auf einem festen Träger immobilisiert sind. Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen auch Kinetikuntersuchungen von Molekülinteraktionen.
  • Beispiel 2: Nachweis von Antikörper-Peptid-Interaktionen bei der Anwesenheit von Serum
  • Es wurde der Einfluss der Zugabe von Serum vor und nach einer Komplexausbildung zwischen einem Antikörper und einem Fluorescein-markierten sekundären Antikörper analysiert.
  • 2.1. Strategie
  • Es wurden frische Peptidarrays unter Verwendung von Standardverfahren zubereitet; die unterschiedlichen Peptide, die verwendet wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt. Zwei Antikörper (Mab3418, 31 mg/ml und Mab57.9, 1,87 mg/ml; Pepscan Systems) wurden mit einem Fluorescein-markierten Ziege-Anti-Maus-Antikörper vorinkubiert. Serum (ABV-HIV-MCV-; erhalten von P. Schneeberger, BMC) wurde vor (Mab3418: 0 % und 10 % Serum, Mab57.9: 0 %, 10 %, 20 % und 40 % Serum) oder nach (0 %, 10 %, 20 % und 40 % Serum) der Antikörper-Komplexausbildung hinzugefügt. Nach der Vorinkubation wurde der Antikörper-Komplex in PBS/Tween (25x; Organon) bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml bzw. 0,3 μg/ml verdünnt. Der verdünnte Antikörper-Komplex wurde zu dem Peptidarray hinzugefügt und dynamisch bei 37 °C inkubiert. Der Mab3418-Komplex wurde 15 Minuten lang inkubiert, und der Mab57.9-Komplex wurde 25 Minuten lang inkubiert. Bilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen (Kameraaufbau mit der MAS-Vorrichtung; Hamilton-Pumpe und Wasserbad; Olympus-Mikroskop Bx41, Tokio, Japan, CCD-Kamera Kappa Typ PS2, Serien-Nr. DXP1206, Fabr.-Nr. 0280).
  • 2.2. Einfluss von Serum auf die Bindung der Antikörper an den Peptidarray
  • Bilder wurden 15 Minuten nach Inkubation aufgenommen und sind in den 5 und 6 gezeigt. Die Hintergrundfluoreszenz steigt durch die Zugabe von Serum zu dem Antikörper-Komplex an. Mehr Serum resultierte in einem stärkeren Hintergrund. Auch die Fluoreszenz der Spots nahm mit dem Anstieg von Serum ab.
  • 2.3. Einfluss von Serum auf die Komplexausbildung
  • Mab57.9-Antikörper-Fluorescein-Komplex
  • Die Zugabe von Serum wies keinen großen Einfluss auf die Ausbildung des Mab57.9-Antikörper-Fluorescein-Komplexes und die nachfolgende Bindung des Komplexes an den Peptidarray auf. 7 stellt die Vergleichsergebnisse dar. Tabelle 3 stellt eine Fluoreszenzanalyse eines 180 μM MDG21-Peptidspots dar.
  • Mab3418-Antikörper-Fluorescein-Komplex
  • Die Zugabe von 10 % Serum wies keinen Einfluss auf die Ausbildung des Mab3418-Antikörper-Fluorescein-markierten sekundären Antikörper-Komplexes und die nachfolgende Bindung des Komplexes an den Peptidarray auf. Die Ergebnisse sind in den 8 und 9 gezeigt.
  • Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Serum nach der Komplexausbildung zwischen dem Antikörper und dem markierten sekundären Antikörper in abgeschwächten Signalen nach Inkubation des Komplexes mit dem Peptidarray resultierte. Die Zugabe von Serum während der Komplexausbildung zwischen dem Antikörper und dem markierten sekundären Antikörper beeinflusste die Stärke der Signale nicht, wenn der Komplex mit dem Peptidarray inkubiert wurde. Die Hintergrundfluoreszenz war höher, wenn Serum zu dem markierten Antikörper-Komplex zugefügt wurde.
  • Beispiel 3: Analyse absorptiv gekoppelter Antikörper auf einer Anopore Aluminiumoxidmembran
  • Es wurde der Nachweis verschiedener Arten absorptiv-gekoppelter IgGs auf einer Anopore-Membran (0,2 μm, Kat.-Nr. 68090084, Whatman) nach Inkubation mit Anti-IgG-Antikörpern getestet, die mit Fluorescein oder Cy3 markiert waren.
  • 3.1. Zubereitung von IgG Arrays und Antikörpermarkierung
  • IgG-Arrays wurden mittels Auftropfung (Biochip Arrayer; Packard Biochip Technologies) von 200 μM-, 50 μM- und 25 μM-Lösungen von IgGs (Sigma; siehe Tabelle 4) auf einen festen Träger zubereitet. Die Arrayanordnung ist in 10 gezeigt. Anti-IgG-Antikörper (Ratte-, Ziege- und Maus-Anti-IgG, Sigma; siehe Tabelle 4) wurden mit Fluorescein-Succinimmidylester (5-FAM SE; Kat.-Nr. C2210, Molecular Probes) oder mit Cy3 unter Verwendung des Fluorolink-Ab-Cy3-Markierungskits (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Nach der Markierung wurden die Antikörper unter Verwendung von Sephadex G25-Säulen aufgereinigt. Die Konzentration der markierten Antikörper wurde unter Verwendung des Mikro BCATM-Assays (Pierce) bestimmt. Um den Markierungsgrad zu bestimmen, wurden die markierten Antikörper mit einem Spektrophotometer bei den folgenden Wellenlängen gemessen: 280 nm (Protein), 494 nm (Fluorescein) und 552 nm (Cy3). Die Tabelle 5 zeigt das Ergebnis des Markierungsgrades.
  • 3.2. Inkubation mit Fluorescein-markierten Antikörpern
  • Die markierten Antikörper wurden in PBS/Tween auf eine Endkonzentration von 1,8 μg/ml verdünnt. Der verdünnte Antikörper-Komplex wurde zu dem IgG-Array hinzugefügt und dynamisch bei 37 °C 40 Minuten lang inkubiert. Bilder wurden zu mehreren Zeitpunkten während der Inkubation aufgenommen.
  • 11 zeigt die Bindung von Fluorescein-markierten Antikörpern an die IgGs auf dem Array nach 40 Minuten Inkubation. Die Anti-Ziege- und Anti-Maus-Antikörper ergaben ein Ergebnis, das erwartet werden konnte: Anti-Maus-IgG-Fluo bindet an Maus-IgG und Ratte-IgG, Anti-Ziege-IgG-Fluo bindet an Ziege-IgG und Rinder-IgG. Ein Test auf Kreuzreaktivität von Anti-Maus-IgG mit humanem IgG zeigte ein negatives Ergebnis. Eine Kreuzreaktivität mit Ratte-IgG war nicht unwahrscheinlich. In diesem Experiment band der Anti-Ratten-Antikörper unerwarteterweise an alle aufgetropften IgGs, was möglicherweise an dem hohen Markierungsgrad mit Fluorescein lag.
  • 3.3. Inkubation mit Cy3-markierten Antikörpern
  • 12 zeigt die Bindung von Cy3-markierten Antikörpern an die IgGs auf dem Array nach 40 Minuten Inkubation. Die Anti-Maus- und Anti-Ziege-Antikörper, die mit Cy3 markiert waren, ergaben in etwa die gleichen Ergebnisse wie die gleichen Antikörper, die mit Fluorescein markiert waren. Der mit Cy3 markierte Anti-Ratten-Antikörper ergab viel spezifischere Ergebnisse, obwohl der Antikörper immer noch stärker an Maus-IgG als an Ratte-IgG band. Der Markierungsgrad mit Cy3 betrug die Hälfte der Menge des Markierungsgrads mit Fluorescein. Daher kann der Markierungsgrad die Spezifität des Antikörpers bestimmen.
  • Ein Vergleich der Signale der oben beschriebenen Experimente mit Fluorescein- und Cy3-markierten Antikörpern zeigt, dass die Signale von Cy3 um einen Faktor 10 stärker sind als die Signale von Fluorescein.
  • Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, absorptiv gekoppelte IgGs auf einem festen Träger mit Cy3- oder Fluorescein-markierten Anti-IgGs nachzuweisen. Die Bindung der markierten Antikörper war höchst spezifisch, wenn der Markierungsgrad unter 6 lag.
  • Beispiel 4: Bestimmung der Nachweisgrenze eines Multi-Antikörper-Arrays
  • Die Nachweisgrenze von Antikörper-Antikörper-Interaktionen wurde auf einem Anopore Aluminiumoxid-Träger (Kat.-Nr. 68090084, Whatman, Scientific Ltd.) bestimmt, und die Sensitivitäten von Cy3- und Fluorescein-markierten Antikörpern wurden verglichen.
  • 4.1 Zubereitung von IgG Arrays und Antikörpermarkierung
  • Für die folgenden Experimente wurden die IgG-Arrays aus Beispiel 3 verwendet. Die Arrayanordnung ist in 10 gezeigt. Auch die Cy3- und Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgGs aus Beispiel 3 wurden für diese Experimente verwendet.
  • Die markierten Antikörper wurden in PBS/Tween auf die Endkonzentrationen 0,02 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml und 5 μg/ml für Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG und 0,002 μg/ml, 0,02 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml und 5 μg/ml für Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG verdünnt. Der verdünnte Antikörperkomplex wurde zu dem IgG-Array hinzugefügt und dynamisch bei 37 °C maximal 150 Minuten lang inkubiert. Bilder wurden zu mehreren Zeitpunkten während der Inkubation aufgenommen.
  • 4.2. Inkubation mit Fluorescein-markiertem Anti-Ziege-IgG
  • 13 zeigt die Ergebnisse der niedrigsten Konzentration an Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG, die auf dem IgG-Array getestet wurden. Es wurde beobachtet, dass 0,02 μg/ml an Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG die niedrigste Konzentration war, die auf dem Array innerhalb einer vernünftigen Zeit (d. h. ein Signal kann nach 5 Minuten gesehen werden) ein Bindungssignal ergibt, innerhalb einer vernünftigen Expositionszeit. Die Ergebnisse der Bindung der verschiedenen Konzentrationen von Fluorescein-markierten Anti-Ziege-IgG an Ziege-IgG (50 μM) sind in 14 gezeigt.
  • 4.3. Inkubation mit Cy3-markiertem Anti-Ziege IgG
  • Die 15 und 16 zeigen die Ergebnisse der geringsten Konzentration an Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG, die auf dem Array getestet wurden. Längere Expositionszeiten (z. B. 2,4 s) zeigten bereits bei 30 Minuten Inkubation Signale, aber sie ergaben eine sehr hohe Hintergrundfluoreszenz. Es wurde beobachtet, dass 0,002 μg/ml an Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG die geringste Konzentration war, die auf dem Array innerhalb einer vernünftigen Zeit ein Bindungssignal ergab.
  • Die Ergebnisse der Bindung von verschiedenen Konzentrationen von Cy3-markierten Anti-Ziege-IgG an Ziege-IgG (50 μM) sind in 16 gezeigt.
  • Die oben beschriebenen Experimente zeigen, dass die Nachweisgrenze für Fluorescein-markierte Anti-Ziege-IgG etwa bei 0,02 μg/ml (0,13 nM) liegt und dass die Nachweisgrenze für Cy3-markierte Anti-Ziege-IgG bei etwa 0,002 μg/ml(13 pM) liegt. Tabelle 1
    Figure 00380001
    Tabelle 2
    Figure 00380002
    Tabelle 3
    Figure 00380003
    Tabelle 4
    Figure 00390001
    Tabelle 5
    Figure 00390002
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00400001
    Figure 00410001

Claims (30)

  1. Verfahren für das Überwachen von Interaktionen zwischen Zielmolekülen und mindestens einem Analyten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) In-Kontakt-bringen einer Vielzahl von Zielmolekülen mit einer Probe, wobei die Zielmoleküle auf einem porösen Substrat immobilisiert sind, und wobei die Probe mindestens einen Analyten umfasst; (b) Inkubieren der Zielmoleküle mit der Probe unter Bedingungen, die die Zielmolekül/Analyteninteraktion unterstützen; (c) Überwachen der in Schritt (b) definierten Interaktion, wobei das Überwachen eine Funktion der Zeit der Inkubation ist, wie sie in Schritt (b) definiert ist; (d) gegebenenfalls Bestimmung mindestens eines Interaktionsparameters; (e) Verändern der in Schritt (b) definierten Bedingungen durch Verändern eines Reaktionsparameters, wobei der Reaktionsparameter aus der die Temperatur, Fließgeschwindigkeit, pH- und Ionenstärke umfassenden Gruppe ausgewählt wird und; (f) mindestens einmalige Wiederholung der Schritte (c) bis (e).
  2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das poröse Substrat ein Durchflusssubstrat ist.
  3. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das poröse Substrat ein Metalloxidsubstrat ist.
  4. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das poröse Substrat ein Aluminiumoxidsubstrat ist.
  5. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Inkubation dynamisch ist, und wobei die dynamische Inkubation die Unterwerfung des porösen Substrats für mindestens einen Zyklus des Vorwärts- und Rückwärtsflusses der Probe durch das poröse Substrat umfasst, wobei der Vorwärts- und Rückwärtsfluss durch die Anwendung von alternierendem positiven und negativen Druck etabliert wird.
  6. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Interaktionsparameter aus einer Gruppe ausgewählt wird, die Spezifität, Affinität, Assoziationskonstante, Absorptionsparameter, Verteilungsparameter, Metabolismusparameter und Absonderungsparameter umfasst.
  7. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Überwachen folgende Schritte umfasst: (a) Nachweisen eines Signals, wobei das Signal aus einer Interaktion resultiert, wie sie in Schritt (b) aus Anspruch 1 definiert ist, und; (b) Aufnehmen des Niveaus des Signals, wie es in Schritt (a) definiert ist, wobei das Niveau die Stärke der Ziel-Molekül/Analyt-Interaktion aufzeigt.
  8. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Messen und das Überwachen in Echtzeit erfolgen.
  9. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Messen und das Überwachen in Halbechtzeit erfolgen.
  10. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Messen und das Übwerwachen eine Funktion der Temperatur sind.
  11. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Messen und das Überwachen eine Funktion der Flussgeschwindigkeit sind.
  12. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verändern eines Reaktionsparameters stufenweise erfolgt.
  13. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei Zielmoleküle aus einer Gruppe ausgewählt sind, die Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Haptene und Aptamere umfasst.
  14. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Analyt aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Antikörper, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Antiseren, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Enzym-Bindestellen, Polysaccharide, Zellen, zelluläre Membrane und Organellen umfasst.
  15. Ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 14, wobei das poröse Substrat eine Vielzahl von Zielmolekülen innerhalb vordefinierter Regionen auf dem porösen Substrat umfasst.
  16. Ein Verfahren nach Anspruch 15, wobei die vordefinierten Regionen räumlich so angeordnet sind, dass sie Mikroarrays bilden.
  17. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das nachweisbare Signal aus einer Gruppe ausgewählt ist, die einen Brechungsindex, eine zelluläre Aktivität, eine Lichtemission, einschließlich Fluoreszenz, ein Wechsel in der Absorption, ein Wechsel in der Fluoreszenz, eine Absorption, eine Farbveränderung, einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, eine radioaktive Emission, ein Wechsel des pH-Wertes, ein Wechsel der Temperatur und ein Wechsel der Masse, umfasst.
  18. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das nachweisbare Signal ein Licht emittiertes Signal ist.
  19. Ein Verfahren nach Anspruch 18, wobei das nachweisbare Signal ein Fluoreszenzsignal ist.
  20. Ein Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Fluoreszenzsignal durch einen markierten Analyten, der mit einem Zielmolekül assoziiert ist, emittiert wird.
  21. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der Analyt in der Probe in einer Konzentration von 5 × 10–4 nM bis 10 nM vorhanden ist.
  22. Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Konzentration im Bereich von 5 × 10–3 nM bis 1 nM vorliegt.
  23. Ein Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Konzentration im Bereich von 5 × 10–2 nM bis 10–1 nM vorliegt.
  24. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei ein Überschuss an unmarkierten Analyten zugegeben wird.
  25. Ein Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Überschuss an unmarkierten Analyten nach Vollendung der Bildung des immobilisierten Ziel-Molekül/Analyt-Komplexes zugegeben wird.
  26. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, um die Analyt-Molekül-Bindungskinetiken zu untersuchen.
  27. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, um die Dissoziationskonstanten der Liganden-Rezeptorpaare zu messen.
  28. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, um therapeutische Verbindungsbibliotheken zu durchmustern.
  29. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, um diagnostische Proteinbibliotheken zu durchmustern.
  30. Verwendung eines porösen Substrates für die Zubereitung eines Mikroarray-Kits für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25.
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