DE69731306T2 - Verfahren und kit zur bestimmung eines analyts mittels massenbestimmung - Google Patents

Verfahren und kit zur bestimmung eines analyts mittels massenbestimmung Download PDF

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    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Systeme sowie Testkits für die Bestimmung oder das Screening von Analyten in flüssigen Proben beruhend auf der markierungsfreien Bestimmung von Bindungsvorgängen an einer Festphasenoberfläche.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Vielzahl von Verfahren für die Bestimmung der Konzentration einer Verbindung, im Allgemeinen als Analyt bezeichnet, in einer flüssigen Probe, beruhend auf der Bindung des Analyten an einen auf einem festen Träger immobilisierten Liganden, weiter unten als Festphasentestverfahren bezeichnet. Üblicherweise gehören diese Testverfahren entweder zum Sandwich- oder Kompetitionstyp.
  • In einem Testverfahren des Kompetitionstyps wird es dem Analyten oder einem Analytenanalog erlaubt, mit dem Analyten um die Bindung an einen immobilisierten Liganden zu kompetieren, wobei in einem Testverfahren des Sandwichtyps ein spezifisches Reagenz an den Analyten gebunden wird, entweder vor oder nachdem der Analyt an den immobilisierten Liganden gebunden wird. Während die Markierung mit einem Marker üblicherweise verwendet wird, um den Nachweis der Bindungsereignisse zu erlauben, sind auch sogenannte markierungsfreie Verfahren bekannt, beispielsweise die, die auf Oberflächenplasmonresonanz (OPR) beruhen.
  • Für Festphasentestverfahren ist es gewünscht worden eine regenierbare Oberfläche allgemeinen Charakters zur Verfügung zu stellen, d. h. eine Oberfläche, die es einfach erlaubt den immobilisierten Liganden zu entfernen und durch das Binden eines anderen Liganden an die Oberfläche zu ersetzen.
  • Ein Typ einer solchen Oberfläche ist in der US 4,271,140 offenbart, bei der ein Komplex der Formel ABL(BL)nA1 an der Oberfläche adsorbiert wird. In dem Komplex ist BL, ein Bindungsligand, n beträgt mindestens 1, ABL ist ein für BL spezifischer Rezeptor, A1 ist ein Rezeptor für den nachgewiesenen Analyten, BL ist kovalent an A1 gebunden und ABL ist reversibel an BL gebunden. Somit kann eine einzelne Oberfläche, die mit dem Ligandenbindungsrezeptor ABL beschichtet ist, durch die reversible Bindung und Freisetzung verschiedener Konjugate (BL)nA1 an die Oberfläche für verschiedene Testverfahren verwendet werden. Dies ist ein besonderer Vorteil in automatisierten Flußtestverfahrensvorrichtungen. In einem kompetitiven spezifischen Bindungstestverfahren, das auf diesem Konzept beruht, wird bei spielsweise der Analyt und ein markiertes Analytanalog um die Bindung an das immobilisierte Konjugat (BL)nA1 kompetieren. Ein Nachteil des obigen Ansatzes ist es jedoch, daß in dem Konjugat (BL)nA1 die kovalente Bindung des Rezeptors A1 an den Bindungsliganden BL eine negative Auswirkung auf die Rezeptorfunktion haben kann.
  • Die Verwendung eines universellen Trägers in einem Festphasentestverfahren wird auch in der WO 95/24649 beschrieben. In diesem Testverfahren werden ein oder mehrere Bindungsmittel mit Schwanzgruppen zur Verfügung gestellt, das (die) spezifisch an ein oder mehrere Fängermittel, das (die) auf dem Träger immobilisiert ist (sind), binden kann (können). Das Bindungsmittel ist üblicherweise ein Antikörper und die Schwanzgruppen und das jeweilige Fängermittel sind komplementäre Oligonucleotidsequenzen, die aneinander hybridisieren können. Das Testverfahren wird durch das aufeinanderfolgende oder gleichzeitige In-Kontakt-bringen der Probe mit dem(n) Bindungsmittel(n) und dem(n) immobilisierten Fängermittel(n) und dem Bestimmen des Anteils der Bindungsstellen eines Bindungsmittels, die durch den Analyten besetzt sind, ausgeführt, um die Konzentration des Analyten in der Probe zu bestimmen.
  • Ein ähnlicher Ansatz wird in der WO 96/06948 beschrieben, wobei doppelsträngige Nucleinsäure-Doppelstränge als universelle, spaltbare Verknüpfungssysteme in verschiedenen Sorten von Immuntestverfahren dienen. In einer Ausführungsform des kompetitiven Testverfahrens wird ein Oligonucleotid an den Analyten oder ein Analog davon gebunden, dem es erlaubt wird mit dem Zielanalyten um ein markiertes Immunreagenz zu kompetieren. Das zweite Oligonucleotid wird an einen festen Träger gebunden. Der Kompetitor des Analyten wird kompetitiv mit dem freien Analyten an das Immunreagenz gebunden. Wenn die Reaktionslösung unter hybridisierenden Bedingungen mit dem festen Träger in Kontakt gebracht wird, wird der Oligonucleotid-gekoppelte Analyt oder das Analytanalog über ein Oligonucleotiddoppelstrang an den Träger binden. Durch das Bestimmen der Konzentration der Markierung in den Doppelsträngen kann die Konzentration des Analyten bestimmt werden.
  • Ein allen oben beschriebenen Verfahren gemeinsamer Nachteil ist der, daß sie eine Form der Markierung benötigen.
  • Kürzlich sind markierungsfreie, oberflächensensitive Messverfahren für das Messen und die Quantifizierung biomolekularer Wechselwirkungen entwickelt worden. Bei diesen Techniken wird ein Rezeptor, der dazu in der Lage ist an einen interessierenden Analyten zu binden, an einer Sensoroberfläche immobilisiert und die Bindung des Analyten an den Rezeptor wird als eine sich daraus ergebende Veränderung der Eigenschaften der Sensoroberfläche, wie die Änderung der Oberflächenmasse oder des Brechungsindex der Oberfläche, nachge wiesen. Eine Sorte eines solchen Massennachweisapparats verwendet das Phänomen der Oberflächenplasmonresonanz (OPR), um die Bindung von Analyten an Rezeptoren, die auf der Sensoroberfläche immobilisiert sind, zu untersuchen. Der Apparat und der theoretische Hintergrund sind in der Literatur beschrieben (siehe z. B. Jönsson, U., et al, BioTechniques 11:620-627 (1991)).
  • Für den Nachweis eines Bindungsereignisses an einer Massenachweissensoroberfläche muß die Spezies, die an die Oberfläche bindet, jedoch relativ groß sein, d. h. ein relativ hohes Molekulargewicht aufweisen, da die Bindung kleiner Moleküle an die Oberfläche zu keiner ausreichenden Masseänderung führt, um nachweisbar zu sein. Testverfahrensformate des Stands der Technik, die auf der Verwendung einer Markierung beruhen, können daher im allgemeinen nicht ohne weiteres auf ein markierungsfreies Testverfahrensformat, das auf dem Massenachweis an einer Sensoroberfläche beruht, abgewandelt werden.
  • Die WO 91/05261 offenbart ein Biosensortestverfahren, das für den Nachweis biologischer Ziele auf der Masseabtastung beruht, wobei ein Zielkomplex an ein Oberflächenfängerreagenz, das an der Oberfläche eines piezoelektrischen Sensors befestigt ist, bindet. Der Zielkomplex wird in einer flüssigen Probe, die einen Zielanalyt, ein bifunktionelles Bindungskonjugat und ein Enzymreporterkonjugat enthält, gebildet. Das bifunktionale Bindungskonjugat hat eine Bindungsstelle, die komplementär zu dem Oberflächenfängerreagenz ist, und eine weitere Bindungsstelle, die komplementär zu dem Zielanalyten ist. Das Enzymreporterkonjugat hat eine spezifische Bindungsstelle für den Analyten. Ein signalerzeugendes Substrat, das für das Enzym des Zielkomplexes spezifisch ist, wird zu dem Testsystem hinzugefügt und zu einem unlöslichen, signalerzeugenden Produkt, das sich auf der Oberfläche des piezoelektrischen Sensors akkumuliert, umgewandelt, wodurch es die Masse auf der Oberfläche erhöht, wobei die Masseerhöhung durch den Sensor nachgewiesen wird. Das abgelagerte, unlösliche Produkt macht die Sensoroberfläche jedoch nicht regenierbar.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Testverfahren und Systeme zur Verfügung zu stellen, die eine regenierbare oder wiederaufladbare feste Trägeroberfläche universellen Charakters verwenden und die auf der Oberflächenmasseabtastung beruhen und daher markierungsfrei sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe zur Verfügung, das die Schritte:
    • a) zur Verfügung stellen eines festen Trägers, der darauf immobilisiert ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaars, das dazu in der Lage ist reversibel an das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars zu binden, aufweist,
    • b) zur Verfügung stellen eines Konjugats, das (i) den Analyten oder ein Kompetitor des Analyten, (ii) das andere Mitglied des ersten spezifische Bindungspaars und (iii) ein Mitglied eines zweiten spezifischen Bindungspaars umfaßt,
    • c) gleichzeitig oder aufeinanderfolgend In-Kontakt-bringen einer flüssigen Probe, die den Analyten enthält oder von der vermutet wird ihn zu enthalten, mit einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und mit dem Konjugat, wobei der Bindungspartner auf der Oberfläche der festen Phase oder auf einem teilchenförmigen Träger gehalten wird, die (der) im wesentlichen nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger, der darauf immobilisiert, ein Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars aufweist, getrennt ist,
    • d) In-Kontakt-bringen der reagierten flüssigen Probe mit dem festen Träger, um nicht-reagiertes Konjugat an den festen Träger zu binden, Komplexbildung zwischen dem Konjugat und dem gehaltenen spezifischen Bindungspartner, wodurch das Konjugat daran gehindert wird den festen Träger zu erreichen,
    • e) In-Kontakt-bringen des festen Trägers mit dem anderen Mitglied des zweiten spezifischen Bindungspaars, um dem anderen Mitglied zu erlauben an das Konjugat zu binden, wobei das andere Mitglied ein Molekulargewicht von mindestens dem fünffachen des Konjugats aufweist,
    • f) Bestimmen der Menge des anderen Mitglieds, das im Schritt e) an das an den festen Träger gebundene Konjugat gebunden hat, durch Massenabtastung an den festen Träger, um dadurch den Analyt in der Probe zu bestimmen und
    • g) Regenerieren des festen Trägers durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen, die die Bindung zwischen den Mitgliedern des ersten spezifischen Bindungspaars zerstören, um das Konjugat von dem festen Träger freizusetzen und die Oberfläche für eine anschließende Bestimmung vorzubereiten,
    umfaßt.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Ausführungsform zur Verfügung, bei der ein Mitglied des zweiten Bindungspaars ein Molekulargewicht von mindestens dem 10-fachen und vorzugsweise mindestens dem 25-fachen des Konjugats aufweist.
  • In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe zur Verfügung, das die Schritte:
    • a) zur Verfügung stellen eines festen Trägers, der darauf immobilisiert, ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaars, das dazu in der Lage ist reversibel an das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars binden, aufweist,
    • b) zur Verfügung stellen eines Konjugats, das (i) den Analyten oder einen Kompetitor des Analyten, (ii) das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars (iii) ein Träger, der ein Molekulargewicht von mindestens 5.000 Dalton aufweist, umfaßt,
    • c) gleichzeitig oder aufeinanderfolgend In-Kontakt-bringen einer flüssigen Probe, die den Analyten enthält oder von der vermutet wird ihn zu enthalten, mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyt und mit dem Konjugat, wobei der Bindungspartner auf der Oberfläche der festen Phase oder auf einem teilchenförmigen Träger gehalten wird, die (der) im wesentlichen in der Probe nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger, der darauf immobilisiert ein Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars aufweist, getrennt ist,
    • d) In-Kontakt-bringen der reagierten flüssigen Probe mit dem festen Träger, um nicht reagiertes Konjugat an den festen Träger zu binden, Komplexbildung zwischen dem Konjugat und dem gehaltenen spezifischen Bindungspartner, wodurch das Konjugat daran gehindert wird, den festen Träger zu erreichen,
    • e) Bestimmen der Menge des Konjugats, das im Schritt d) an den festen Träger gebunden hat durch Masseabtasten, um dadurch den Analyten in der Probe zu bestimmen und
    • f) Regenieren des festen Trägers durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen, die die Bindung zwischen dem Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaars zerstören, um das Konjugat von dem festen Träger freizusetzen und die Oberfläche für eine anschließende Bestimmung vorzubereiten,
    umfaßt.
  • Eine Ausführungsform, bei der der Träger ein Molekulargewicht von mindestens 10.000 Dalton aufweist.
  • In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Testkit für einen Analyten, wie im Anspruch 12 definiert, zur Verfügung.
  • In einem fünften Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein Testkit für einen Analyten, wie im Anspruch 13 definiert, zu Verfügung.
  • In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren und Systeme für die Konzentrationanalyse, vorzugsweise von kleinen Molekülen, und für das Arzneistoffscreening zur Verfügung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Inhibitionskurve für die OPR-Antwort versus der Konzentration des Haptens H5, die in einer Verfahrensausführungsform der Erfindung erhalten wurde.
  • 2 ist eine Inhibitionskurve für die OPR-Antwort versus der Konzentration des Theophyllins, die in einer Verfahrenausführungsform der Erfindung erhalten wurde.
  • 3 ist eine Inhibitionskurve für die OPR-Antwort versus der Konzentration des FITCs, die in einer Verfahrensausführungsform der Erfindung erhalten wurde.
  • 4 ist eine Inhibitionskurve für die OPR-Antwort versus der Konzentration des FITCs, wie in der 3 erhalten mit dem Unterschied, daß ein zweites Reagenz für die Bestimmung der Oberflächenantwort verwendet wurde.
  • 5 ist eine Inhibitionskurve für die OPR-Antwort versus der Konzentration des Biotinjeffamins, die in einer Verfahrensausführungsform der Erfindung erhalten wurde.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie oben erwähnt, ist die Erfindung auf Verfahren und Kits für das Prüfen von Analyten in flüssigen Proben, unter Verwendung einer Oberflächenmasseabtastungstechnik, gerichtet.
  • Solchen Massenachweisverfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt und umfassen piezoelektrische, optische, thermooptische, oberflächenakkustische Wellen (SAW „surface acoustic wave") Verfahren, sowie elektrochemische Verfahren, wie potentiometrische, voltrametrische, konduktometrische, amperometrische und Kapazitätsverfahren.
  • Unter den optischen Verfahren können insbesondere die erwähnt werden, die die Oberflächenkonzentration (oder dem Brechungsindex) erkennen, wie reflektionsoptische Verfahren, die sowohl interne und externe Reflektionsverfahren umfassen, z. B. Ellipsometry und Nahfeldspetroskopie (EWS = „evanescent wave spectroscopy"), wobei die letztere Oberflächenplasmonresonanzspetroskopie (SPRS „surface plasmon resonance spectroscopy"), Brewster-Winkelrefractometry, Refractometry des kritischen Winkels, frustrierte totale Reflektion (FTR), Nahfeldellipsometry („evanescent wave ellipsometry"), gestreute totale interne Re flektion (STIR „scattered total internal reflection"), optische Lichtleitersensoren, Bildgebung, die auf einem Nahfeld beruhen, wie aufgelöste Bildgebung mit kritischem Winkel, aufgelöste Bildgebung mit Brewster-Winkel, aufgelöste Bildgebung mit SPR-Winkel, etc., sowie Verfahren, die auf Nahfeldfluoreszenz (TIRF) und Phosphoreszenz beruhen, umfaßt. Des weiteren können optische Verfahren, die auf Interferenz beruhen, sowie Verfahren, die auf der oberflächenverstärkten Ramanspectroscopy und oberflächenverstärkte Ramanspectroscopy beruhen, erwähnt werden.
  • Die analytischen Vorrichtungen, die auf Oberflächenmasseabtastung beruhen, sind auch kommerziell erhältlich. Eine Sorte einer solchen Vorrichtung (mit zugehörigen Computerkontroll- und Datenbearbeitungsmitteln) umfaßt das kommerzielle Instrument BIACORE® (BIACORE ist eine Marke der Biacore AB, Uppsala, Schweden; wobei BIA für die biospezifische Interaktionsanalyse steht), das das Phänomen der Oberflächenplasmonresonanz (OPR) verwendet, um die Bindung von Analyten an Rezeptoren, die auf dem Sensorchip immobilisiert sind, zu untersuchen. Die Vorrichtung und der theoretische Hintergrund sind vollständig in der Literatur beschrieben (siehe z. B. Jönsson, U. et al., BioTechniques 11:620-627 (1991)). Im wesentlichen beinhaltet die Technik die Immobilisierung eines Rezeptors an einer besonderen Oberfläche eines Sensorchips, das in-Kontakt-bringen des Sensorchips mit einem Probenfluß, der den interessierenden Analyt enthält, und das Messen der Änderung der optischen Oberflächencharakteristika des Sensorchips, die sich aus der interessierenden Bindung ergeben.
  • Ein verwandtes, kommerzielles Instrument, das anstelle der OPR auf der FTR beruht, wird unter dem Handelsnamen IASYS durch die Affinity Systems Ltd, U.K. vermarktet.
  • Für den Nachweis eines Bindungereignisses an einer Sensoroberfläche für den Massenachweis muß die Spezies, die an die Oberfläche bindet, relativ groß sein, d. h. ein relativ hohes Molekulargewicht aufweisen. In anderen Worten die Bindung von kleinen Molekülen an die Oberfläche kann üblicherweise nicht direkt gesehen werden. Testformate des Stands der Technik, die auf der Verwendung einer Markierung beruhen, sind deshalb nicht ohne weiteres in ein markierungsfreies Testsystemformat, das auf dem Massenachweis an einer Sensoroberfläche beruht, umzuwandeln.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein kompetitives Testverfahren bzw. -system zur Verfügung, das den Oberflächenmassenachweis an einer regenerierbaren Sensoroberfläche verwendet. Regenerierbar in diesem Zusammenhang bedeutet, daß der Ligand oder die Bindungsspezies, die an der Oberfläche immobilisiert ist, einfach entfernt und durch denselben oder einen anderen Liganden oder Bindungsspezies ersetzt werden kann.
  • Ein herausstechendes Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines Konjugats, das mit dem Analyten um die Bindung an einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten kompetiert. Dieses Konjugat enthält (i) einen veränderlichen Teil, der den Analyten oder einen Analog des Analyten umfaßt und (ii) einen konstanten oder gemeinsamen Teil, der ein Mitglied eines spezifischen Bindungspartners ist. (Der Begriff Analog bedeutet hierbei ein Kompetitormolekül, das zu einer spezifischen Bindung an den Bindungspartner in derselben Weise wie der Analyt in der Lage ist). Das andere Mitglied dieses Bindungspaars ist an die Sensoroberfläche gebunden. Somit ist, obwohl die Konjugate abhängig von dem zu untersuchenden Analyten verschiedene Analyten oder analoge Teile des Analyten, aufweisen, der Teil des Bindunspaarmitglieds immer gleich. Die Sensoroberfläche, die das andere Mitglied des Bindungspaars trägt, kann daher üblicher oder universeller Natur sein und kann für eine Anzahl verschiedener Konjugate verwendet werden.
  • In dem Konjugat kann der Analyt oder das Analog des Analyten direkt an das Bindungspaar Mitglied oder über eine chemische Struktur, wie eine Kopplungssequenz oder einen Linker gebunden sein. Der Entwurf und die Zubereitung eines geeigneten Konjugats für jede bestimmte Situation liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeit des Fachmanns und muß hierbei nicht im Detail beschrieben werden.
  • Über den Bindungspartner kann gesagt werden, daß er zusammen mit dem Analyten ein Ligandenrezeptorpaar bildet. Während als allgemeine Regel der Rezeptor die größere der Komponenten des Paars ist, können Rezeptoren auch Substanzen mit niederem Molekulargewicht umfassen. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird der Rezeptor einfach als eine Komponente eines Bindungspaars mit dem Analyten ausgelegt, in dem der Rezeptor größer oder kleiner als der Analyt sein kann.
  • Üblicherweise ist der Bindungspartner jedoch ein Makromolekül, typischerweise ein Immunreaktant, wie ein Antikörper oder ein immunreaktives Fragment davon.
  • Der Analyt ist auf der anderen Seite typischerweise ein kleines Molekül, das nicht direkt durch übliche Massenabtastungsverfahren nachgewiesen werden kann. Beispielhafte Analyten sind Vitamine, Arzneistoffe, Pathogene, Steroide, Hormone, Pestizide und Toxine, wie bakterielle Toxine.
  • Das oben erwähnte spezifische Bindungspaar, von dem ein Mitglied teil des Konjugats ist und von dem das andere Mitglied auf der Sensoroberfläche immobilisiert ist, sollte reversibel sein, d. h. die Bindung sollte ohne Beeinflussung des oberflächengebundenen Mitglieds auflösbar sein, um es zu erlauben die Sensoroberfläche zu regenieren oder wiederaufzuladen, in dem Sinne, daß das oberflächengebundene Mitglied für eine erneute Bindung eines anderen Mitglieds des Bindungspaars vorbereitet wird. Beispielhaft sind solche spezifische Bindungspaare Antigen-Antikörper, Antikörper-Hapten, Oligonucleotid-Oligonucleotid, Hormon-Hormonrezeptor, Protein A- oder G-Immunglobulin, Lectin-Kohlenhydrat. Andere geeignete Bindungspaare werden dem Fachmann offensichtlich sein.
  • Im Hinblick auf die Begriffe Antikörper und Haptene wie hierin verwendet sind Antikörper-Immunglobulinmoleküle (Serumproteine), von denen es mehrere Klassen gibt. Jede Klasse hat ihre eigene charakteristische Molekulargröße, elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit, Kohlenhydratgehalt, etc. Antikörper können in Fragmenten, wie das Fab-Fragment und das Fc-Fragment gebrochen werden. Das Fab-Fragment kann wie intakte Antikörper an antigene Substanzen, z. B. Antigene und Haptene, binden. Es ist beabsichtigt, daß der Begriff Antikörper auch aktive Antikörperfragmente, sowie rekombinant erzeugte Antikörper und aktive Fragmente davon, umfaßt.
  • Ein Antigen ist jede Substanz, die eine Immunantwort auslöst. Im allgemeinen wird angenommen, daß Antigene ein Molekulargewicht von größer als 10.000 aufweisen und Proteine, Kohlenhydrate oder Glycoproteine sind. Kleinere, weniger steife Moleküle sind normalerweise nicht in reiner Form antigen, aber können durch deren Verknüpfung an größere Moleküle so gemacht werden. Diese kleineren Moleküle werden Haptene genannt.
  • In einer anderen Verfahrensauführungsform wird eine Probe, die ein Analyt enthält oder von der vermutet wird ihn zu enthalten, mit dem Konjugat und einem spezifischen Bindungspartner für den Analyt in Kontakt gebracht. Das Konjugat wird dann mit dem Analyten um die Bindung an den Analytenbindungspartner kompetieren. Die Reaktionslösung wird dann mit der Sensoroberfläche in Kontakt gebracht, um das Konjugat daran zu binden. Sowohl unreagiertes Konjugat und Konjugat-Analyten-Bindungspartnerkomplexe, die sich gebildet haben, werden über das spezifische Bindungspaar an die Oberfläche binden.
  • Die Menge des Bindungspartners, der über das Konjugat an die Oberfläche gebunden ist, wird dann durch das Abtasten der Massenveränderung an der Oberfläche bestimmt. Diese Menge ist invers mit der Konzentration des Analyts in der Probe korreliert, d. h. je weniger Analyt in der Probe, desto mehr Bindungspartner wird an die Oberfläche gebunden.
  • Die Menge des oberflächengebundenen Komplexes zwischen Bindungspartner und Konjugat kann entweder durch (i) Abtasten der Oberflächenmasseänderung, die durch die Bindung des Bindungspartner/Konjugatkomplexes an die Oberfläche ausgelöst wird, oder (ii) durch das In-Kontakt-bringen des Bindungspartner/Konjugatkomplexes auf der Sensoroberfläche mit einem spezifischen Bindungsreagenz für den Bindungspartner und das Abtasten der Oberflächenmasseänderung, die durch die Bindung dieser Reagenz an den Bindungspartner/Konjugatkomplex auf der Sensoroberfläche ausgelöst wird, bestimmt werden.
  • In dem ersten Fall (i) sollte der Bindungspartner, damit die Masseänderung durch übliche Masseabtastverfahren, wie die oben erwähnten, nachweisbar ist, eine Masse aufweisen, die mindestens das 5-fache, vorzugsweise mindestens das 10-fache und am meisten bevorzugt mindestens das 25-fache der des Konjugats beträgt. In der Praxis wird der Bindungspartner in den meisten Fällen ein Molekulargewicht von mindestens 5.000 Dalton und üblicherweise von mindestens 10.000 Dalton aufweisen. Auf der anderen Seite liegt ein typisches Molekulargewicht des Konjugats im Bereich von 500 bis 1.500 Dalton.
  • Im zweiten Fall (ii) sollte, damit die Masseänderung an der Oberfläche nachweisbar ist, das spezifische Reagenz gegen den Bindungspartner eine Masse aufweisen, die mindestens etwa das 5-fache, vorzugsweise mindestens das 10-fache und noch bevorzugter mindestens das 25-fache der des Bindungspartner/Konjugatkomplexes, beträgt.
  • Nachdem das Masseabtastungsverfahren an der Sensoroberfläche abgeschlossen ist, wird die Oberfläche durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen regeneriert, die die Bindung zwischen dem Konjugat und dem Bindungspaarmitglied, das auf der Oberfläche immobilisiert ist, brechen oder auflösen, ohne die Bindungsaktivität des immobilisierten Bindungspaarmitglieds zu beeinflussen. Geeignete Bedingungen für die Regeneration hängen unter anderem von dem jeweiligen Konjugat und seiner Bindung an die Oberfläche ab und sind dem Fachmann wohl bekannt. Die Sensoroberfläche wird dann für die Verwendung in einem weiteren Testverfahren für denselben oder einen anderen Analyten zur Verfügung stehen.
  • In einer Variante der obigen Ausführungsform wird das Konjugat zuerst über das spezifische Bindungspaarmitglied an die Sensoroberfläche gebunden und die Sensorboberfläche wird dann mit der flüssigen Probe und dem Bindungspartner für den Analyten in Kontakt gebracht.
  • Ein Kit, um die obige Verfahrensausführungsform auszuführen, kann einen festen Träger, wie einen Sensorchip mit einem daran immobilisierten Konjugatbindungsmittel, ein Konjugat zwischen (i) dem Analog des Analyten und (ii) einer Komponente, die zur Bindung an das an den festen Träger gebundene Konjugat in der Lage ist, und einen spezifischen Bindungspartner für den Analyt und dem Analog des Analyten umfassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das oben beschriebene Konjugat in einem Maße verändert, so daß es zusätzlich zu dem Analyt oder dem Analog des Analyten und den Bestandteilen des spezifischen Bindungspaars auch einen dritten Bestandteil in der Form eines Mitglieds eines zweiten spezifischen Bindungspaars aufweist, das vom selben Typ wie das des oben beschriebenen ersten spezifischen Bindungspaars sein kann. Das andere Mitglied dieses zweiten Bindungspaars wird für die Identifizierung des an die Sensoroberfläche gebundenen Konjugats verwendet. Ein charakteristisches Merkmal dieser Ausführungsform ist, daß der gebildete Analytbindungspartner/Konjugatkomplex an der Bindung an die Sensoroberfläche gehindert wird. Diese Verfahrensausführungsform wird wie folgt ausgeführt.
  • Die Probe wird mit dem Analytenbindungspartner und mit dem Konjugat entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in Kontakt gebracht. Der Analyt in der Probe wird dann mit dem Konjugat um die Bindung an den Bindungspartner kompetieren. Dann wird die Reaktionslösung mit der Sensoroberfläche, die das andere Mitglied des ersten Bindungspaars immobilisiet auf der Obefläche aufweist, in Kontakt gebracht. Wie oben erwähnt und wie unten im größeren Detail beschrieben werden wird, ist das reagierte Konjugat, d. h. der gebildete Analytbindungspartner/Konjugatkomplex nicht dazu in der Lage die Sensoroberfläche zu erreichen oder daran zu binden. Daher wird nur nicht-reagiertes Konjugat an die Sensoroberfläche binden. Das andere Mitglied des zweiten Bindungspaars oder das „Zweitreagenz", z. B. ein Antikörper wird dann hinzugefügt, um die Bindung des Konjugats an die Oberfläche durch Massenabtastung zu bestimmen.
  • Damit die Masseänderung an der Sensoroberfläche nachweisbar ist, sollte das oben erwähnte andere Mitglied des zweiten Bindungspaars eine Masse aufweisen, die mindestens das 5-fache, vorzugsweise mindestens das 10-fache und noch bevorzugter mindestens das 25-fache der des Konjugats beträgt.
  • Die Menge der Bindung des zweiten Bindungspaarmitglieds an das sensorgebundene Konjugat ist positiv mit der Konzentration des Analyten in der Probe korreliert, d. h. je mehr Analyt sich in der Probe befindet, desto mehr Konjugat wird an die Oberfläche gebunden und desto mehr Zweitreagenz wird an das immobilisierte Konjugat gebunden.
  • Nachdem das Masseabtastverfahren an der Sensoroberfläche abgeschlossen ist, wird die Oberfläche, wie oben beschrieben durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen, die die Bindung zwischen dem Konjugat und dem Bindungspaarmitglied, das auf der Sensoroberfläche immobilisiert ist, brechen oder auflösen, regeniert.
  • Wie oben erwähnt, wird in diesem Testverfahren der gebildete Analytbindungspartner/Konjugatkomplex an der Bindung an der Sensoroberfläche gehindert. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Beispielsweise kann der Bindungspartner auf einem teilchenförmigen Träger, der im wesentlichen in der Probe nicht löslich ist, getragen werden und ist typischerweise ein Zellrezeptor. Wenn dieses Testverfahren in einer Flußzelle oder etwas ähnlichem, bei der die Probe in einem Flüssigkeitsfluß über die Sensoroberfläche hinübergeführt wird, können die Flußbedingungen so ausgewählt werden, daß Partikel mit der Größe einer Zelle keine Neigung dazu zeigen an die Wände der Flußzelle zu diffundieren, sondern im Kern des Flüssigkeitsstroms gesammelt bleiben. Dieses Phänomen ist im Allgemeinen als der Fahreus-Lindquist-Effekt bekannt und wird bei einem Laminarfluß mit einer hohen Rate erzielt. Die Verwendung dieses Effekts in einer Biosensorflußzelle wird in der WO 95/27208, auf die für weitere Details verwiesen wird, beschrieben.
  • Das unlösliche partikuläre Material kann natürlich auch durch andere Mittel daran gehindert werden die Oberfläche zu erreichen, wie dadurch, daß die Reaktionslösung vor dem In-Kontakt-bringen der Lösung mit der Sensoroberfläche einem Trennungsverfahren unterzogen wird. In noch einer weiteren Alternative kann der Bindungspartner an eine unterstützende Oberfläche gebunden werden, die mit der Probe, die den Analyten enthält, und dem Konjugat in Kontakt gebracht wird bevor die Reaktionslösung mit der Sensoroberfläche in Kontakt gebracht wird, um reagiertes Konjugat daran zu binden.
  • Es kann ohne weiteres erkannt werden, daß die oben beschriebene Verfahrensausführungsform für das Durchsuchen oder die Charakterisierung der Bindung von Verbindungen niederen Molekulargewichts (Analyten) an Zell-gebundene und lösliche Rezeptoren verwendet werden kann. In anderen Worten, das Verfahren kann nicht nur für die Messung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, sondern auch zum Zwecke des Durchsuchens, wie das Arzneistoffscreening, verwendet werden, bei dem der Analyt eine Gruppe von Molekülen ist, z. B. Arzneistoffkandidaten, für die gewünscht wird sie auf ihre Bindung an, z. B. einen Zellrezeptor, zu durchsuchen. Ein allgemeines Konjugat kann daher für die Analyse verschiedener Verbindungen niederen Molekulargewichts verwendet werden. Dies macht es wiederum möglich ein spezielles Reagenz zu entwerfen, das im Hinblick auf die Bindung an die Sensoroberfläche und auf die Regenerationsbedingungen optimiert ist.
  • Ein Kit zur Ausführung des obigen Verfahrens, kann einen festen Träger, wie einen Sensorchip mit einem daran immobilisierten Konjugatbindungsmittel, ein Konjugat wie oben spezifiziert und ein sekundäres Reagenz, das dazu in der Lage ist an das Konjugat zu binden, umfassen.
  • In einer Variation der oben beschriebenen Ausführungsform wird die Bindung des freien Konjugats in dem Reaktionslösungskonjugat direkt an der Sensoroberfläche statt unter der Verwendung einer sekundären Reagenz gemessen, um deren Oberflächenbindung zu bestätigen. Das bedeutet das Konjugat selbst muß eine ausreichende Masse aufweisen, damit seine Bindung an die Oberfläche eine durch Massenabtastung nachweisbare Massenänderung hervorruft, üblicherweise von mindestens 5.000 Dalton und vorzugsweise von mindestens 10.000 Dalton, wobei der Bindungspartner für das sekundäre Reagenz an dem zweiten Konjugat natürlich nicht notwendig sein wird. Solch ein Konjugat kann durch die Konjugation des Analyten oder eines Analogs davon und des oberflächenbindenden Moleküls an ein Makromolekül einer bestimmten Sorte erzeugt werden. Das letztere kann, z. B. ein Protein oder ein anderes Biomolekül sein, kann aber auch eine andere Polymersorte, z. B. ein sternförmiges Dendrimermolekül, das ein Polymer mit einem spezifischen Molekulargewicht und mit im Hinblick auf die Hydrophilität und die Kopplungsgruppen geeignet ausgewählten Eigenschaften ist. Optional kann man ein erstes Konjugat zwischen dem Analyten oder einem Analog des Analyten und dem Oberflächenbindungsmolekül herstellen und dann dieses Konjugat an den makromolekularen Träger binden. Alternativ kann ein Konjugat, das eine dritte Bindungskomponente aufweist, hergestellt werden und dann (vorzugsweise durch nicht kovalente Bindung) an ein Makromolekül, das dazu in der Lage ist daran zu binden, gekoppelt werden. Noch eine weitere Alternative besteht darin ein Epitop in ein Fusionsprotein zusammen mit einer Kopplungsstelle, beispielsweise einem Cysteinrest, für die Verknüpfung des Analyten oder des Analog des Analyten einzuführen.
  • Ein Kit zur Ausführung der obigen Verfahrensvariante kann einen festen Träger, wie einen Sensorchip mit einem daran immobilisierten Konjugatbindungsmittel und ein modifiziertes Konjugat wie oben spezifiziert, umfassen.
  • In all den oben erwähnten Kitvarianten kann das Konjugat optional durch ein Vorkonjugat in der Form des (der) „gemeinsamen" Teils oder Teilen davon, d. h. der Oberflächenbindungskomponente und, wenn vorhanden, der Komponente, die an das sekundäre Reagenz bindet, ersetzt werden, so daß der Kunde das Konjugat durch die Bindung eines gewünschten veränderbaren Teils, d. h. des Analyten oder des Analogs des Analyten daran selbst herstellen kann.
  • Die verschiedenenen oben beschriebenen Verfahrensausführungsformen können ohne weiteres durch den Fachmann optimiert werden. So können geeignete Mengen und Verhältnisse zwischen dem Konjugat und dem Analyte-Bindungspartner, sowie die Konzentration des immobilisierten Konjugatfängermittels auf der Sensoroberfläche ohne weiteres durch den Fachmann in jedem einzelnen Fall bestimmt werden, um eine optimale Sensitivität und Genauigkeit zu erhalten.
  • Im folgenden wird die Erfindung durch einige nicht einschränkende Beispiele verdeutlicht.
  • Die Messungen wurden mit einem analytischen BIACORE®-Instrument (Biacore AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Das Instrument mißt die Bindung zwischen zwei (oder mehreren) Molekülen in einer hydrophilen Gelmatrix von etwa 100 nm Dicke. Ein Molekül (Ligand) wird kovalent an eine Carboxymethyldextran-modifizierte Goldoberfläche gekoppelt, die eine beschränkte Diffusion des Liganden erlaubt. Diese Oberfläche bildet eine Seite einer Flußkammer, durch die eine Lösung des anderen Moleküls (des Analyten) fließt. Die Brechungsindexänderung, die sich aus der Bindung des an den Liganden gebundenen Analyten in dieser Oberflächenschicht ergibt, wird durch Oberflächenplasmonresonanz überwacht (Karlsson, R., et al, J. Immunol. Methods 145:229-240 (1991)). Die Sensitivität dieses Verfahrens wird durch das Rauschen bei einem Resonanzsignal bei etwa 1 RU (Resonanzeinheit) beschränkt, die zu 10-9 kg/m2 äquivalent ist.
  • BEISPEIL 1: Messung des H5-Haptens
  • Zubereitung des H5-Aminotheophyllinkonjugats
  • Zu einer Lösung aus 12,3 mg (40 μmol) Aminotheophyllin in 1,0 ml DMF wurde unter Stickstoff 6,2 mg (73,8 μmol) NaHCO3 und 0,9 mg (20,5 μmol) Hapten-H5a (4-[[5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-1,5-dioxopentyl]amino]-N,N-dimethyl-N-phenylbenzolmethanaminiumbromid, Molekulargewicht 422 Dalton, gemäß Janda et al., J. Am. Chem. Soc., 113, 5427-5434 (1991)) synthetisiert. Das Gemisch wurde unter Stickstoff für drei Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann verdampft und durch Blitzchromatography gereinigt.
  • Immobilisierung des anti-Aminotheophyllinantikörpers
  • Der anti-Aminotheophyllin-IgG-Antikörper 451 (Biacore AB, Uppsala, Schweden) (Mg etwa 150.000) wurde auf den Sensorchip CM5 (Biacore AB) mit EDC, NHS und Ethanolamin gemäß den Herstellerangaben durch die Injektion von 30 μl des anti-Aminotheophyllinantikörpers, der auf 67 μg/ml in 10 mmol/l Essigsäure, pH 4,5 verdünnt war, immobilisiert. Eine Antwort von etwa 9.500 RU wurde bei der Immobilisierung erhalten.
  • Inhibitionsstudien
  • Zu 2:1-Gemischen des H5-Aminotheophyllinkonjugats und dem anti-H5-IgG-Antikörper (Mg etwa 150.000, Biacore AB) wurden verschiedene Konzentrationen des freien H5-Haptens hinzugefügt und 35 μl der Proben, die in Antriebspuffer (HBS) verdünnt waren, über der CM5-Oberfläche injiziert. Aus den erhaltenden Sensogrammen wurde die Konzentration des freien H5 in jeder Probe berechnet. Eine beispielhafte Inhibitionskurve, die erhalten wurde, wird in der 1 gezeigt.
  • Regeneration der Sensorchipoberfläche
  • Die Regeneration der CM5-Oberfläche zwischen den Injektionen wurde durch 5 μl Regenerationsstöße mit 10 mmol/l NaOH mit pH 10,85 ausgeführt.
  • BEISPIEL 2: Messung von Theophyllin
  • Zubereitung des H5-Aminotheophyllinkonjugats
  • Das H5-Aminotheophyllinkonjugat wurde wie in Beispiel 1 oben zubereitet.
  • Immobilisierung des anti-H5-Antikörpers
  • Der anti-H5-IgG-Antikörper wurde auf einem Sensorchip CM5 (Biacor AB) mit EDC, NHS und Ethanolamin gemäß den Herstellerinstruktionen durch die Injektion von 30 μl des anti-H5-Antikörpers, der mit 40 μg/ml in 10 mmol/l Essigsäure, pH 5,05 verdünnt war, immobilisiert. Eine Antwort von etwa 10.900 RU wurde bei der Immobilisierung erhalten.
  • Inhibitionsstudien
  • Zu 10:9-Gemischen aus H5-Aminotheophyllinkonjugat (133,3 nMol/l) und anti-H5-Antikörper (Mg etwa 150.000, Biacore AB) (121,3 nmol/l) wurden verschiedene Konzentrationen freien Theophyllins hinzugefügt und 35 μl Proben wurden in Antriebspuffer (HBS) über der CM5-Oberfläche injiziert. Aus den erhaltenen Sensogrammen wurde die Konzentration des freien Theophyllins in jeder Probe berechnet. Eine beispielhafte Inhibitionskurve, die erhalten wurde, wird in der 2 gezeigt.
  • Regeneration der Sensorchipoberfläche
  • Die Regeneration der CM5-Oberfläche zwischen den Injektionen wurde durch 5 μl Regenerationsstöße mit 10 mmol/l Glycin, das mit 1 mol/l /HCl auf pH 2,2 angepasst war, ausgeführt.
  • BEISPIEL 3: Messung von FITC
  • Immobilisierung des biotinylierten Oligonucleotids
  • Ein 17 bp biotinyliertes Oligonucleotid der Sequenz 5'-Biotin-AAGACACTCTTTCTCCC wurde hergestellt und auf einem streptavidinbeschichteten Sensorchip, Sensor Chip SA (Biacore AB, Uppsala, Schweden) gemäß den Herstellerangaben immobilisiert.
  • Inhibitionsstudien
  • FITC (Fluorescinisothiocyanat) in dem Konzentrationsbereich 0,1-50 nmol/l wurde mit 10 nmol/l eines FITC-markierten Oligonucleotids der Sequenz TTCTGTGAGAAAGAGGG-5', das zu dem obigen immobilisierten Oligonucleotid komplementär war, gemischt.. Ein monoclonaler anti-FITC-Antikörper wurde dann mit einer Konzentration von 1 μg/ml hinzugefügt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und wurden dann in das BIACORE®-Instrument über der oben zubereiteten SA-Sensorchipoberfläche injiziert. Die Antwort wurde durch die Injektion des RAMG1-Antikörpers (als sekundäres Reagenz) erhöht. Aus den erhaltenen Sensogrammen wurde die Konzentration des freien FITC in jeder Probe berechnet und gegenüber der Antwort aufgetragen. Zwei Inhibitionskurven wurden erhalten, eine beruhte auf der direkten Messung der Hybridisierungsantwort an der Sensoroberfläche, 3, und die andere beruhte auf der Messung der verstärkten Antwort, die durch RAMG1-bindung, 4, erhalten wurde. Wie in den 3 und 4 gezeigt, ist die Verstärkung der Antwort durch das Hinzufügen einer sekundären Reagenz (RAMG1) in diesem besonderen Fall nicht notwendig.
  • Regeneration der Sensorchipoberfläche
  • Die oligonucleotid-modifizierte SA-Oberfläche wurde zwischen den Analysezyklen mit 100 nmol/l NaOH regeneriert.
  • BEISPIEL 4: Verwendung eines PEG-Konjugats für einen kompetitiven auf einer Zelle beruhenden Test
  • Herstellung des Polyetylenglycol-LC-Biotin-Jeffamin-H1 (m-PEG-LC-Biotin-JA-H1)-konjugats
  • N-H1-N'-BOC-3,6-dioxaoctan-1,8-diamin (H1-Jeffamin-BOC)
  • 26 μl (150 μmol/l) N,N-Diisopropylethylamin wurden zu einer gerührten Lösung von 30,9 mg (100 μmol/l) des Haptens H1 (N-Methyl-N-p-nitrobenzyl-5-aminopentanonsäure) in 0,3 ml DMF, 0,3 ml Dioxan und 0,3 ml deionisierten Wasser, hinzugefügt gefolgt von 33,2 mg (110 μmol/l) des TSTU (O- (N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat). Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 25 Minuten gerührt, dann wurden 32,3 mg (130 μmol/l) N-BOC-3,6-dioxaoctan-1,8-diamin hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 110 Minuten gerührt, dann wurden 5,6 mg (12,6 μmol/l) TSTU hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 35 Minuten gerührt, dann wurden 3,8 mg (18,6 μmol/l) TSTU hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Dioxan und das Wasser wurden in vacuo entfernt und der Rückstand wurde in 4 ml 1:40 Ammoniak/Methanol aufgelöst. Die Reinigung durch MPLC (Säulenlänge 100 mm, I. D. 15 mm, Fluß 15 ml/min.) unter Verwendung von 40, 50 und 100 ml von 1:40, 1:20, 1:10 Ammoniak/Methanol als Elutionsmittel ergab 60,3 mg des Produkts als gelben Feststoff. TLC Rf 0,40 (1:10 Ammoniak/Methanol).
  • N-H1-3,6-dioxaoctan-1,8-diamin (H1-Jeffamin oder JA-H1)
  • 1,0 ml von 5,6 mol/l Salzsäure in 2-Propanol wurde zu einer gerührten Lösung von 60,3 mg (≤ 100 μmol/l) N-H1-N'-BOC-3,6-dioxaoctan-1,8-diamin in 5,0 ml 2-Propanol hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 110 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt der Rückstand wurde in 2,5 ml 8:2 Methylenchlorid/Methanol aufgelöst. Die Reinigung durch MPLC (Säulenlänge 75 mm, I. D. 15 mm, Fluß 15 ml/min.) unter Verwendung von 110 ml 8:2 Methylenchlorid/Methanol, gefolgt von 110 ml 32:7:1 Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak als Elutionsmittel ergab 26,7 mg des Produkts als weißen Feststoff. TLC Rf 0,54 (32:7:1 Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak).
  • Nα-(tert-Butyloxycarbonyl)-Nβ-(LC-biotin)-L-diaminopropionsäure (BOC-DAP-LC-Biotin)
  • 30,0 mg (66 μmol/l) NHS-LC-Biotin wurde zu einer gerührten Lösung von 13,5 mg (66 μmol/l) der Nα-(tert-Butyloxycarbonyl)-L-diaminopropionsäure in 1,0 ml DMF und 0,6 ml deionisierten Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für sechs Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der Rückstand wurde in 2,5 ml 80:17,5:2,5 Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak aufgelöst. Die Reinigung durch MPLC (Säulenlänge 85 mm, I. D. 15 mm, Fluß 15 ml/min.) unter Verwendung von 50, 100 und 50 ml von 80:17,5:2,5, 70:25,7:4,3, 70:35:5 Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak als Elutions mittel ergab 25,6 mg des Produkts als weißen Feststoff. TLC Rf 0,28 (70:25,7:4,3 Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak).
  • BOC-DAP-LC-Biotin-JA-H1
  • 2,0 mg (20 μmol/l) des Triethylamins wurde zu einer gerührten Lösung von 5,44 mg (10 μmol/l) des BOC-DAP-LC-Biotins in 1,09 ml DMF, gefolgt von 1,5 mg (11 μmol/l) Isobutylchlorformat hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten gerührt, dann wurden 4,75 mg (11 μmol/l) JA-H1 in 0,95 ml Methanol gelöst hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der Rückstand wurde in 2,0 ml 9:1 Methylenchlorid/Methanol aufgelöst. Die Reinigung durch MPLC (Säulenlänge 90 mm, I. D. 15 mm, Fluß 15 ml/min.) unter Verwendung von 40, 100 und 50 ml von 9:1, 8:2, 7:3 Methylenchlorid/Methanol als Elutionsmittel ergab 7,9 mg des Produkts als cremefarbenen Feststoff. TLC Rf 0,52 (7:3 Methylenchlorid/Methanol).
  • DAP-LC-Biotin-JA-H1
  • Ein Gemisch aus 7,9 mg (8,2 μmol/l) BOC-DAP-LC-Biotin-JA-H1, 2,0 ml 5,6 mol/l Salzsäure in 2-Propanol und 2,0 ml Methanol wurden über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt um 7,9 mg zu ergeben. TLC Rf 0,07 (7:3 Methylenchlorid/Methanol).
  • m-PEG-LC-Biotin-JA-H1
  • 17,4 mg (3,4 μmol/l) des m-PEG-Succinimidylcarbonat (Mg Å 5.000 Dalton) und 0,5 ml 0,1 mol/l NaHPO4, pH 7,5, wurde zu einer gerührten Lösung von 1,5 mg (1,2 μmol/l) DAP-LC-Biotin-JA-H1 in 0,2 ml deionisierten Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 25 Minuten gerührt, dann wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rückstand wurde in 2,0 ml Methylenchlorid aufgelöst. Die Reinigung durch MPLC (Säulenlänge 30 mm, I. D. 15 mm, Fluß 15 ml/min.) unter Verwendung von 25, 25 und 25 ml 9:1, 8:2, 7:3 Methanol/Ammoniak als Elutionsmittel ergab 15,4 mg des Produkts als cremefarbenen Feststoff. TLC Rf 0,88 (7:3 Methylenchlorid/Methanol).
  • Immobilisierung des anti-H1-Antikörpers
  • Der monoclonale anti-H1-IgG-Antikörper (Biacore AB, Uppsala, Schweden) (Mg etwa 150.000) wurde auf einem Sensorchip CM5 (Biacore AB) mit EDC, NHS und Ethanolamin gemäß den Herstellerangaben durch die Injektion von 35 μl des in 10 mmol/l Acetat puffers, pH 5,0, auf 50 μg/ml verdünnten Anti-H1-antikörpers immobilisiert. Eine Antwort von etwa 12.000 RU wurde erhalten.
  • Kompetetive Teststudien
  • Streptavidin-modifizierte magnetische Teilchen (Dynabeads M-280-Streptavidin, DYNAL) (Duchmesser 2,8 μm) in einer Suspension wurden gemäß den Herstellerangaben in HBS-Puffer überführt. Die Perlensuspension (Endkonzentration 0,3 mg/ml) wurde mit m-PEG-LC-Biotin-JA-H1 (Endkonzentration 0,3 μmol/l) und dem Modelanalyten Biotinjeffamin in verschiedenen Konzentrationen, die 0-400 nmol/l in dem Antriebspuffer HBS reichten, gemischt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Es wurde den Perlen erlaubt sich in dem Probengefäß zu sedimentieren, worauf die Lösung über der CM5-Oberfläche mit immobilisierten anti-H1 für vier Minuten injiziert wurde. Aus den erhaltenen Sensogrammen wurde die Konzentration des freien Biotinjeffamins in jeder Probe berechnet. Die 5 zeigt die Antworten der Konjugatbindung, die durch ansteigende Mengen hinzugefügter Biotinjeffaminprobe ausgelöst werden. Es ist aus diesem Beispiel offensichtlich, daß die Wechselwirkungen zwischen den kleinen Molekülen und den großen Partikeln, z. B. Arzneistoffkandidaten und Rezeptoren auf Zellen unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens, untersucht werden können.
  • Regeneration der Sensoroberfläche
  • Nach jeder Analyse wurde die CM5-Oberfläche mit immobilisierten anti-H1-Antikörper mit einem einminütigen Stoß aus 10 mmol/l Glycin, pH 1,5, regeneriert.

Claims (15)

  1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe umfassend die Schritte: a) zur Verfügung stellen eines festen Trägers, der darauf immobilisiert ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaares, das dazu in der Lage ist reversibel an das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares zu binden, aufweist, b) zur Verfügung stellen eines Konjugats, das (i) den Analyten oder einen Kompetitor des Analyten, (ii) ein anderes Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares und (iii) ein Mitglied eines zweiten spezifischen Bindungspaares umfaßt, c) gleichzeitig oder aufeinanderfolgend In-Kontakt-bringen einer flüssigen Probe, die den Analyt enthält oder von der vermutet wird ihn zu enthalten, mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyt und mit dem Konjugat, wobei der Bindungspartner auf der Oberfläche der festen Phase oder auf einem Teilchen-förmigen Träger gehalten wird, die (der) im wesentlichen in der Probe nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger, der darauf immobilisiert ein Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares aufweist, getrennt ist, d) In-Kontakt-bringen der reagierten flüssigen Probe mit dem festen Träger, um nicht-reagiertes Konjugat an den festen Träger zu binden, Komplexbildung zwischen dem Konjugat und den gehaltenen spezifischen Bindungspartner wodurch das Konjugat daran gehindert wird, den festen Träger zu erreichen, e) In-Kontakt-bringen des festen Trägers mit dem anderen Mitglied des zweiten spezifischen Bindungspaares, um dem anderen Mitglied zu erlauben an das Konjugat zu binden, wobei das andere Mitglied ein Molekulargewicht von mindestens dem 5-fachen des Konjugats aufweist, f) Bestimmen der Menge des anderen Mitglieds, das im Schritt (e) an das an den festen Träger gebundene Konjugat gebunden hat, durch Masseabtastung an dem festen Träger, um dadurch den Analyt in der Probe zu bestimmen und g) Regenerieren des festen Trägers durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen, die die Bindung zwischen den Mitgliedern des ersten spezifischen Bindungspaares zerstören, um das Konjugat von dem festen Träger freizusetzen und die Oberfläche für eine anschließende Bestimmung vorzubereiten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Mitglied des zweiten spezifischen Bindungspaares ein Molekulargewicht von mindestens dem 10-fachen und vorzugsweise mindestens dem 25-fachen des Konjugats aufweist.
  3. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe umfassend die Schritte: a) zur Verfügung stellen eines festen Trägers, der darauf immobilisiert ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaares, das dazu in der Lage ist reversibel an das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares zu binden, aufweist, b) zur Verfügung stellen eines Konjugats, das (i) den Analyten oder einen Kompetitor des Analyten, (ii) ein anderes Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares und (iii) ein Träger, der ein Molekulargewicht von mindestens 5000 Dalton aufweist, umfaßt, c) gleichzeitig oder aufeinanderfolgend In-Kontakt-bringen einer flüssigen Probe, die den Analyt enthält oder von der vermutet wird ihn zu enthalten, mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyt und mit dem Konjugat, wobei der Bindungspartner auf der Oberfläche der festen Phase oder auf einem Teilchen-förmigen Träger gehalten wird, die (der) im wesentlichen in der Probe nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger, der darauf immobilisiert ein Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares aufweist, getrennt ist, d) In-Kontakt-bringen der reagierten flüssigen Probe mit dem festen Träger, um nicht reagiertes Konjugat an den festen Träger zu binden, Komplexbildung zwischen dem Konjugat und den gehaltenen spezifischen Bindungspartner wodurch das Konjugat daran gehindert wird, den festen Träger zu erreichen, e) Bestimmen der Menge des Konjugats, das im Schritt (d) an den festen Träger gebunden hat, durch Masseabtasten an dem festen Träger, um daraus den Analyt in der Probe zu bestimmen und f) Regenerieren des festen Trägers durch das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Bedingungen, die die Bindung zwischen den Mitgliedern des ersten spezifischen Bindungspaares zerstören, um das Konjugat von dem festen Träger freizusetzen und die Oberfläche für eine anschließende Bestimmung vorzubereiten.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Träger ein Molekulargewicht von mindestens 10 000 Dalton aufweist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bindungspartner ein Zellrezeptor ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration des Analyten bestimmt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das erste und/oder zweite spezifische Bindungspaar ein Antipkörper-Hapten ist (sind), wobei das Hapten Teil des Konjugats ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das erste und/oder das zweite spezifische Bindungspaar ein Oligonukleotid-Oligonukleotid ist (sind).
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Masseabtasten durch ein optisches internes Reflektionsverfahren durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das optische interne Reflektionsverfahren ausgewählt ist aus Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR = „surface plasmon resonace") und frustrierter Totalreflektion (FTR).
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der feste Träger in einer Flußzelle zur Verfügung gestellt wird.
  12. Ein Testkit für einen Analyt umfassen: a) einen festen Träger, der darauf immobilisiert ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaares, das dazu in der Lage ist reversibel an das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares zu binden, aufweist, b) einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten, wobei der Bindungspartner unmarkiert ist und auf der Oberfläche einer festen Phase oder auf einem Teilchen-förmigen Träger gehalten wird, die (der) im wesentlichen in der Probe nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger getrennt ist, c) ein Konjugat, das (i) den Analyten oder einen Kompetitor des Analyten, (ii) das andere Mitglied des ersten spezifischen Bindungspaares und (iii) ein Mitglied des zweiten spezifischen Bindungspaares oder ein Vorkonjugat davon ist, dem der Teil des Analyten oder der Teil des Kompetitors des Analyten des Konjugats fehlt und an das der Teil des Analyten oder der Teil des Kompetitors des Analyten gekoppelt werden kann, um das Konjugat zu bilden, umfaßt, wobei das Konjugat kompetitiv mit nicht-konjugierten Analyt an den Bindungspartner bindet, wobei die Bindung des Bindungspartners an das Konjugat das Konjugat an der Bindung an dem festen Träger hindert, d) das andere Mitglied des zweiten spezifischen Bindungspaares, das ein unmarkiertes Mitglied ist und ein Molekulargewicht von mindestens dem 5-fachen des Konjugats aufweist und e) ein Apparat für den Nachweis von Bindungsvorgängen an dem festen Träger durch Masseabtastung.
  13. Ein Testkit für einen Analyt umfassend: a) einen festen Träger, der darauf immobilisiert ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, das dazu in der Lage ist reversibel an ein anderes Mitglied eines spezifischen Bindungspaares zu binden, aufweist, b) ein spezifischer Bindungspartner für den Analyten, wobei der Bindungspartner unmarkiert ist und auf einer Oberfläche einer festen Phase oder eines Teilchen-förmigen Trägers gehalten wird, die (der) in der Probe nicht löslich ist und die (der) von dem festen Träger getrennt ist, c) ein Konjugat, das (i) den Analyten oder einen Kompetitor des Analyten, (ii) das andere Mitglied des spezifischen Bindungspaares und (iii) ein Trägermolekül, das ein Molekulargewicht von mindestens 5000 Dalton aufweist oder ein Vorkonjugat davon ist, dem der Teil des Analyten oder der Teil des Kompetitors des Analyten des Konjugats fehlt und an das der Teil des Analyten oder der Teil des Kompetitors des Analyten gekoppelt werden kann, um das Konjugat zu bilden, umfaßt, wobei das Konjugat kompetitiv mit dem nicht-konjugierten Analyt an den Bindungspartner bindet, wobei die Bindung des Bindungspartners an das Konjugat das Konjugat an der Bindung an dem festen Träger hindert und d) ein Apparat für den Nachweis von Bindungsvorgängen an dem festen Träger durch Masseabtastung.
  14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für das Arzneistoffscreening.
  15. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zum Bestimmen der Affinität eines Analyten für einen spezifischen Bindungspartner.
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