JPH03503681A - 質量増幅した因子を使用する圧電特異的結合アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 質量増幅しｔ；因子を使用する圧電特異的結合アッセイ発明の分野 本発明は、圧電結晶およびゾル粒子の間の結合が問題の分析物を含有することか 疑われる試料の添加により阻害まｌ；は増強される、圧電結晶に基づく特異的結 合アッセイ、例えば、イムノアッセイおよび核酸プローブアッセイに関する。

発明の背景 イムノアノ七イにおける石英結晶の微量てんびん（また、圧電共振器として知ら Ｊｌている）は従来記載された。これらの装置は２つの電極の間に挾まれた単結 晶のウェーファーから成る。電極は、これらの装置を、石英結晶をその共鳴振動 数で駆動する外部の共振器回路へ接続する手段を有する。二の振動数は結晶の質 量、ならびにその結晶の電極区域に拘束される層の質量に依存する。こうし−Ｃ １振動数は電極の表面上の質量またはそれらの電極上の層の変化により変更する 。一般に、これらの装置の共鳴振動数の変化は質量の変化に関係づけることがで きる；石英結晶の微量て、びんおよびそれに取り付けられＩ；層が硬質の挙動に 従う場合、質量のｔ化はサラエルプレイ（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ）の関係により振 動数の変化から決定することができる：ここで△ｆは測定した振動数偏移であり 、ｆ、は石英結晶の親振動数に示す、△ｍｉｉ質量の変化であり、Ａは圧電的に 活性な面積であり、？、は石英の密度（２，６４８ｇｃｍ”）であり、モしてμ 、は剪断弾性係数（ＡＴ切断石英について２．９４７Ｘ１０”ダインｃｍ−りで ある。

ションズ（Ｓｈｏｎｓ）らは、溶液中の抗体活性の決定のｔこめに変更した、圧 電石英結晶の微量てんびんを記載している。抗原を予備コーティングした石英結 晶を、変化する濃度および特異性の抗血清に暴露する。

抗原のコーティングに対して特異的な抗血清は、結晶上の追加のタンパク質層を 形成するであろう。乾燥した結晶の振動数偏移により測定した、抗体層の厚さは 、溶液中の特異的抗体の濃度に比例する。［Ｊ、Ｂｉ。

ｍｅｄ、Ｍａ　ｔ　ｅ　ｒ−、Ｒｅ　ｓ、　、Ｖｏ　１．６、ｐｐ−５６５−５ ７０（１９７２）］。

米国特許Ｍ４．２３５．９８３号（Ｒｉ　ｃ　ｅ、１９８０年１２月２日発行） は、抗体の特定のサブクラスの決定の方法を開示している。この有する圧電共振 器を利用する。抗体をコーティングした抗原を、未知の量の抗体を含有する溶液 に暴露する。溶液中の抗体を共振器上の抗原に取り付けたｆｋ、決定する抗体の 特定のサブクラスに選択的に結合する、いわゆるサントイツチング物質！ここの 共振器を暴露する。共振器の振動数を、サントイツチング物質への暴露の前後に 、乾燥した状態で測定する。振動数の変化を共振器に結合した抗体のサブクラス の量に関係づけ、そして溶液中の抗体のサブクラスの量を標準曲線を参照して決 定することができ５゜ レデレル（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ）らは、圧電石英結晶、ことに表面音波装置を使用 するその場のイムノアッセイを開示している。ヤギ抗ヒトＩｇＧを石英結晶の表 面上にカップリング剤で固定化する。次いで、圧電結晶を電気共振器回路中に配 置し、ぞして抗原ヒトＩｇＧの検出のために使用するＧ＠出は、吸着ｌ；より表 面質量の変化を結晶の共鳴振動数の偏移として反映されるという事実にに基づく 。著者らは、この方法は劣った感受性および劣っｔ；検出限界の両者に悩まされ ると結論した。著者らは、また、検出すべき抗原は高分子量をもたなくてはなら ないと結論した；低分子量の分析物はこの方法により直接検出することができな い。

［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、５５、（１９８３） ］ ネーングフイビ（Ｎｇｅ　ｈ−Ｎｇｗａ　ｉ　ｎ　ｂ　ｉ）らは、気相中のパラ チオンのアッセイｊ二使用する、パラチオンに対する抗体でコーティングした圧 電石英結晶の使用を記載している。コーティングした抗体が気相中の直接反応に よりパラチオンと結合するとき、結晶上の生ずる質量の変化は農薬の濃度に対し て比例する振動数偏移を発生する。［Ｊ、Ｍａｔ、Ｃｈｅ＋ｎ、Ｓｏｃ、　、Ｖ ｏ　１．１０ｇ、ｐｐ、５４４４−５４４７（１９８６）］ 欧州特許出願第０　２１５　６６９号（１９８”１年３月２５日発行）は、生化 学的物質、微生物および細胞のその場の分析のｔ；めの分析装置および方法？開 示している。再び、この方法は、検出すべき分析物に対して特異的な受容体物質 がその上に固定化された、圧電結晶の表面上の変化Ｉ；より引き起こされる共鳴 振動数の変化についてであると断定される。

グラッペ（Ｇｒａｂｂｅ）らは、銀電極においてヒト１．ｇＧおよび抗ＩｇＧの 結合を研究するために、サイクル的電圧測定に関して使用する、石英結晶の共鳴 子を記載している。［Ｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、〜’ｏ１．２２３、ｐｐ、６７−７８　（１９８７）］レデレル（Ｒ ｏｅｄｅｒｅｒ）らが論じているように、抗原と抗体との間の免疫学的反応にの みに質量の変化が起因する、圧電結晶ｔこ基づくイムノアッセイは、ある環境下 で、劣った感度および劣った検出限界に悩まされうる。結局、結合因子とその配 位子との間の反応を増幅して、より感度および信頼性があるアッセイを提供する ことができる、圧電結晶に基づく特異的結合アッセイが、この分野において、要 求されている。

発明の要約 この要求は、本発明により満足される。１つの面において、また、結合因子で変 性された石英結晶の微量てんびんの表面にすることができる粒子を作る結合因子 を含有するように変性された、かさのあるゾル粒子を利用して分析物の濃度を測 定する方法を記載する。変性された石英結晶の微量てんびんは、ここでは生物学 的に変性される石英結晶の微量てんびん、まｊ；はＢＭＱＣＭと呼ぶ。石英結晶 の微量てんびんは、プライミング層、コーティング層または因子層の任意の組み 合わせにより変性されたその表面の少なくとも１つを有することができる。ＢＭ ＱＣＭへゾル因子が結合すると、Ｂ　Ｍ　Ｑ　ＣＭの表面において質量の変化が 生じ、この変化は石英結晶の共鳴振動数の対応する変化を生成する。実際のアッ セイは競争的モードで実施することができ、ここで分析物は変性されたゾル粒子 上の結合因子へまたはＢＭＱＣＭの表面上の結合因子へ結合し、これによりＢ　 Ｍ　Ｑ　ＣＭ上の結合因子へのゾルの結合を阻害する。この場合において、Ｂ　 Ｍ　Ｑ　ＣＭの応答は分析物の濃度に対して逆比例する。アッセイはいわゆるサ ンドイッチモードで実施することができ、ここで変性されｔ：ゾル粒子は分析物 への複合化によりＢＭＱＣＭの表面へ間接的に結合し、分析物それ自体は石英結 晶の微量てんびんに間接的に結合する。

作業の両者のモードにおいて、変性されたゾル粒子の大きい有効質量はＢ　Ｍ　 Ｑ　ＣＭと結合するとき質量の質量の大きい変化を生じ、それゆえ共鳴振動数の 大きい偏移を生ずる。さらに、振動数の測定は結合したおよび遊離のゾル因子の 分離のための追加の旭理を必要としないで、ゾル因子の存在下になすことができ る。

図面の簡単な説明 図面は４つの図面から成る。第１図〜第３図は本発明を実施する種々のモードを 描写する。第４図は、Ｂ　Ｍ　Ｑ　ＣＭの共鳴振動数を測定する適当な回路を描 写する。

発明の詳細な説明 本発明は図面を参照することによって理解することができ、ここで同様な参照数 字を使用して同様な要素を示す。

ここで第１図を参照すると、参照数字１０により全体的に示す生物学的に変性さ ｔｌｌ：石英結晶の微量てんびん（ＢＭＱＣＭ）が見られる。ＢＭＱＣＭは２つ の電極１４．１６の間に挟まれた石英結晶のウェーファー１２からなる。ここで 頭文字ｒＭＯｓＢＰ−ＩＪと呼ぶ、特異的結合対２０の第１ＩＩ成員がＢＭＱＣ Ｍｌ　Ｏの１つの表面１８に取り付けられている。表面１８は、ＭＯＳＢＰ−１ ２０の取り付けを増強する働きをするプライミング層またはコーティング層２２ で、を極１δの表面を変性することによって形成することができる。ＭＯＳＢＰ −１２０は、物理学的吸着または共有結合により、石英結晶の微量てんびんの表 面１Ｂへ取り付けることができる。他のよく知られている化学的技術、例えば、 タンパク質へ適用されたグルタルアルデヒド架橋剤は、また、石英結晶の微量て んびんへのＭＯＳＢＰ−１の取り付けに利用することができる。

層２２はポリマーフィルムおよびシラン因子から形成することができ、これらは 疏水性を提供するか、あるいは共有結合の取り付けのための官能基を提供するこ とによって、石英結晶へのＭＯＳＢＰ−１の取り付けを増強する働きをする。ポ リマーフィルムの１つの例はポリスチレンであり、これは普通の方法、例えば、 スピンコーティングにより適用することができる。より大きい因子の被覆面積の ためのより高い表面積のコーティングは、不規則の三次元に造形された表面の製 作により、例えば、エアゾールの適用またはリトグラフィーにより達成すること ができる。

適当なシランは一般クラスのフルキルトリクロロシランを包含し、これらは石英 結晶の微量てんびんの金属およびガラス表面に、それぞれ、Ｍ−Ｏ−３＋８よび ５ｔ−０−３ｒにより、共有結合する。

それに結合したＭＯＳＢＰ−１を有するＢＭＱＣＭを、ここで頭文字ｒＭＯ３Ｂ Ｐ−２４と呼ぶ、特異的結合対２６の第２構成員で変性されたゾル粒子２４を含 有する溶液（図示せず）に暴露し、その結合部位はＭＯＳＢＰ−１のそれらに対 して相補的である。ゾル粒子２４およびＭＯＳＢＰ−２から構成されｔ；因子は 、ここで「変性されｔ；ゾル粒子」２８と呼ぶ。変性されたゾル粒子２８はＭＯ ＳＢＰ−１と複合化することができる。ＢＭＱＣＭの表面における複合化のため に生ずる質量の増加は、外部の回路３０により測定したとき、共鳴振動数の変化 を生ずる。

ＭＯＳＢＰ−１２０として働くことができる適当な因子は、Ｍｏ５ＥＰ−２との 複合化に参加することができるものである。好ましい因子は、次のものを包含す るが、これらに限定されない：抗体／抗原の対、レクチン、千レート剤、結合性 タンパク質、ＤＮＡとよびＲＮＡポリ核酸および細胞受容体。ＭＯＳＢＰ−１の 選択は測定すべき分析物に依存する。なぜなら、それは、問題の分析物と、同一 ない場合、同様な結合部位を含有しなくてはならないからである。

ＭＯＳＢＰ−２として働くことができる適当な因子は、ＭＯ５ＢＰ〜ｌに対して 相補的であり、したがって、ＭＯＳＢＰ−１との複合化に参加することができる ものであり、抗体／抗原の対、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ＤＮ ＡおよびＲＮＡポリ核酸および細胞受容体の構成員を包含する。

適当な分析物は、タンパク質、ホルモン、酵素、抗体、薬物、炭水化物、核酸な どを包含する。

一般に、ｉｎ当なゾル粒子は、それを取り付ける結合因子のそれを越える密度を 有するものを包含する。詳しくは、変性されたゾル粒子２８のいわゆる面密度は 、ＢＭＱＣＭ表面１Ｂに結合したとき、ＭＯＳＢＰ−２単独の面密度を越えなく てはならない。好ましいゾル粒子の直径は５−１００旧ｎの範囲である。好まし い因子は、単一の元素系、例えば、金および鉛、および二成分系、例えば、Ｃｄ 　Ｓｓ　Ｚ　ｎ　Ｓ、　Ｃｒ　ＯＨ１鉄酸化物およびＴｉＯ２を包含することが できる。高い密度のポリマーは、また、適当であることがある。

変性されたゾル粒子は、次の参考文献に記載されているものを包含する、よく知 られている方法により作ることができる：１１ムラ−（Ｍｕｌｌｅｒ）　　ｅｔ 　　ａｌ−１Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、３７．１８５　（１９８０）；２、ロス（Ｒｏ　ｔ　ｈ）　、 免疫皮膚化学における技術（７ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｃ ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏｌ。

２１．２８５、ブロック（Ｂｌｌｏｃｋ）ｅｔ　　ａｌ、ｌｆｉ、アカデミツク ・プレス（１９８３）； ３、バイン７エルド（Ｈａｉｎｆｅｌｄ）、５ｃｉｅｎｃｅｓ　２３６．４５０ 　（１９８７）。

第１図に描写する実際のアッセイは、競争的モードで実施し、ここで分析物２０ はＢＭＱＣＭ表面上のＭＯＳＢＰ−１２０のそれらと同一の結合部位を有する。

変性されｌ；ゾル粒子２８への分析物の特異的結合は、ＭＯＳＢＰ−２変性され ｔ；ゾル粒子を不活性化し、これによりＢＭＱＣＭの表面上のＭＯＳＢＰ−１へ のその結合を阻害する。したがってＢＭＱＣＭび表面上のＭＯＳＢＰ−１への変 性されたゾル粒子２８の結合のための共鳴振動数の変化は、前述したように、分 析物の不存在下にあるときほど大きくない。振動数の減少は溶液中の分析物の濃 度に比例する。標準参照曲線を使用して、分析物の濃度を定量的に決定すること ができる。ゾル粒子ｌ；ついての質量の大きい変化は、ＭＯＳＢＰ−２単独と比 較して、所定量の結合についての振動数の変化をより大きく変化させ、これによ り圧電アッセイの全体の感度および検出限界を増加する。

変性されＩ；ゾル粒子２８因子および分析物２０の添加は順次にまたは同時に寅 施することができることを理解すべきである。

別の実施態様は、また、競争的モードで寅施し、第２図に描写する。

ここで、分析物２６はゾル粒子２４上にＭＯＳＢＰ−２２６と同一であるか、あ るいは類似する。ＢＭＱＣＭの表面上のＭＯＳＢＰ−１への変性されたノル粒子 ２８の結合のための共鳴振動数の変化は、ＭＯＳＢＰ−１２０への分析物２６の 特異的結合により減少する。したがって、ＢＭＱＣＭＩＯの表面上のＭＯＳＢＰ −１２（ｌへの変性されたゾル粒千２８の結合のための共鳴振動数の変化は、前 述したように分析物２６の存在下におけるほど大きくなく、変性されたゾル粒子 ２８およびＭＯ５ＢＰ−２２６の間の質量の差を反映する。振動数の減少は溶液 中の分析物の濃度に比例する。標準参照曲線を使用して、分析物の濃度を定量的 に決定することができる。変性されたゾル粒子２８因子および分析物の添加は順 次にまたは同時に実施することができることを理解すべきである。

ＭＯ５ＢＰ−１２０として働くことができる適当な因子は、ＭＯ５ＥＰ−２との 複合化に参加することができるものである。好ましい因子は、次のものを包含す るが、これらに限定されない：抗体／抗原の対、レクチン、キレート剤、結合性 タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡポリ核酸および細胞受容体。ＭＯ５ＢＰ−１の 選択は測定すべき分析物に依存する。なぜなら、それは、問題の分析物と、同一 ない場合、同様な結合部位を含有しなくてはならないからである。

ＭＯ５ＢＰ−２として働くことができる適当な因子は、ＭＯ３ＢＰ−１に対して 相補的であり、したがって、ＭＯ３ＢＰ−１との複合化に参加することかできる ものであり、抗体／抗原の対、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ＤＮ ＡおよびＲＮＡポリ核酸および細胞受容体の構成員を包含する。

適当な分析物は、ダンバク質、ホルモン、酵素、抗体、薬物、炭水化物、核酸な とを包含する。

好ましいゾルは前述のものを包含する。

第３実施態様は第３図に描写されており、ここでアッセイは、競争的モードの代 わりに、いわゆるサンドイッチモードで実施する。このモードにおいて、ＢＭＱ ＣＭＩＯは、石英結晶１２、金属の電極１４および１６、任意の変性層２２およ びそれに取り付けられた第１結合因子３２、ここでＢＲ−１と呼ぶ、から構成さ れている。ＢＭＱＣＭを分析物３４を含有する試料に暴露し、次いで洗浄して非 特異的に結合しｔ；分析物を除去する。次いで、結合しｔ；分析物を含有するＢ ＭＱＣＭＩＯを、ゾル粒子２４８よび第２結合因子３６、ここでＢＲ−２と呼ぶ 、からなる因子３８の溶液に暴露する。変性されたゾル粒子３８はＢＭＱＣＭの 表面上の分析物３４に特異的に結合し、質量の変化を生じ、これにより共鳴振動 数を変化させる。振動数の変化は、ＢＲ−２に比較してゾル粒子２４の密度か耳 意に大きいのために、ＢＲ−２３６（ゾル粒子をもたない）の簡単な直接結合に ついて実現されるもののより大きい。標準参照曲線を使用して、分析物の濃度を 定量的に決定することができる。変婢されｌ；ゾル粒子２８因子および分析物の 添加は順次にまたは同時に実施することができることを理解すべきである。

ＢＲ−１３２の役割を働くことができる適当な因子は、分析物３４との複合化反 応に参加することができるものである。好ましい因子は、抗体、レクチン、キレ ート剤、結合性タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡポリ核酸および細胞受容体を包 含する。ＢＲ−２の役割を働くことができる適当な因子は、分析物３４がＢＲ− １と結合した後、それとの複合化反応に参加することができかぎり、ＢＲ−１に ついて記載したものと同一である。ＢＲ−１およびＢＲ−２は同一であるか、あ るいは異なるすることができることを理解すべきである。

適当な分析物は、タンパク質、ホルモン、酵素、抗体、薬物、炭水化物、核酸な どを包含する。

好ましいゾルは前述のものを包含する。

この第３実施態様は、ポリ核酸中の特異的遺伝子、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ からなる分析物の検出ｌこことに適することを理解すべきである。このような分 析物のｔ；めに、ＢＲ−１は検出すべき配列に対して相補的である合成ポリヌク レオチドであろう。ＢＲ−２は、また、検出すべきポリ核酸内（；含有された別 の配列に対して相補的である合成ポリヌクレオチドであろう。

本発明は、所望の因子で処理した結晶および変性層、および石英結晶の微量てん びんの共鳴振動数の読み出し器をもつ共振器回路からなる診断キットにおいて具 体化することができる。典型的な使用において、分析物溶液、例えば、患者の第 ２構成員をＢＭＱＣＭを含有する隔室に添加し、次いでゾル因子を添加する。振 動数は分析物の濃度に比例１２、そして標準曲線に対する参照を使用してその濃 度を決定することができる。

作業の好ましいモードは、別の隔室中の参照結晶の使用を包含するであろう。参 照結晶は、また、同一因子で変性されるであろう。このモードにおいて、ｆル因 子を試験隔室および同一隔室の両者Ｉ；添加する。次いで、２つの隔室の間の振 動数偏移の差は、溶液中の分析物の濃度を反映する。

衷裏り 次の非限定的実施例は、本発明の基本および独特の利点を例示する。

−ヒトＩ　ｇＧ　（ｈ　Ｉ　ｇＧ）のアッセイこの実施例は、分析物を使用して 、第１図に描写するうように、粒子の結合に影響を与えることによって、結晶の 振動数を変更することができることを示すことによって本発明を例示する。さら に、この実施例は、粒子の結合の測定は、普通のイムノアッセイ手順において要 求されるような「結合した」粒子と「遊離の」粒子との分離のための結晶の洗浄 を必要としないで、達成することができることを例示する。こうして、アッセイ の手順を簡素化することができる。

結晶／ｈ１ｇＧの調製は、まず石英結晶の微量てんびん（ＱＣＭ）をポリスチレ ン（ＰＳ）の層（約０゛、５μ）で、０−クロロトルエン中のＰＳのｌＯ？６溶 液で結晶をコーティングすることによって、コーティングして達成Ｉ−だ、空気 乾燥後、リン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中のｈｌｇＧの溶液（０，２％）のｉ、 ５ｍｃ中でＱ　ＣＭを４℃において２時間平衡化するごとによって、夕）・バク 質をＱＣＭ表面上に吸着させた。“使用前、ＱＣＭをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し て結合しないｈｌｇＧを除去し、次いでＰＢＳｔｉｌｌ液中で使用まで貯蔵しｔ ；。

そのように調製されたとき、単一のＢＭＱＣＭをまずＰＢＳ！１ｆｆｉ液中の１ ％のＢＳＡの溶液の０−４ｍＱで処理して、基線の結晶の応答を確立した。次い で、金のゾル因子［Ｅ−Ｙラボラトリーズ・インフーポレーテッド（カリフォル ニア州サンマチオ）から購入しｔ；金ゾル（１５ナノモル）／プロティンＡ、（ ｌ　ｌμｇ／ｍ１２）懸濁液の２００μ４をＰＢＳ溶液中の１％のＢＳＡの溶液 の３００μＱで希釈することによって調製した］ｆ：ＢＭＱＣＭに添加し、そし て粒子因子の結合速度を室温において、粒子の結合速度が定常状態になるまで、 追跡しＩ；。これはｈ１ｇＧ分析物の不存在下の粒子の結合速度を確立した。こ の速度は９Ｈ２／分であると決定されｊ；。（より高い応答、すなわち、８８ｎ ｇ／分、はＢＭＱＣＭ表面上のグルタルアルデヒド架橋したｈｌｇＧを使用して 調製した表面について達成された）。前述したように、ｈＩｇＧで処理した第２ 結晶を、まずｈ　Ｉ　ｇＧ　（２００μｇ／ｍ（ｉ）を含有するＰＢＳ緩衝液中 の１％のＢＳＡの０．４ｍＱに暴露して、基線の振動数の応答を確立した。次い で、金ゾル／プロティンＡ因子（０，６ｍ１２）を添加し、そして粒子の結合速 度を追跡した。この場合において、ｈｌｇＧの存在下および不存在下における振 動数の変化の定常速度の間の差は、結晶への粒子因子の取り付けを明瞭に実証す る。

本発明は次の請求の範囲により規定されるが、当業者は理解するように、種々の 変更はその精神を逸脱しないで可能である。

ＦＩＧ、Ｉ ＦｆＧ、ＩＡ ＦＩＧ、２ 人 ＦＩＧ、３ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年ｌＯ月５日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１００４０１ 、発明の名称 質量増幅Ｌ　ｆ−因子を使用する圧電特異的結合アッセイ３、特許出願人 名　称　イー・アイ・デュポン・デ・ニモアス・アンド・カンパニー ４、代理人　〒１０７ ７、補正の説明 補正書翻訳文の第１頁は明細書翻訳文の第３頁第１９行〜第４頁第１６行の差し 替えであります。

補正書翻訳文の第２頁〜第３頁は明細書翻訳文第５頁第１４行−・第６頁第１６ 行の差し替えであります。

変化により引き起こされる共鳴振動数の変化についてであると断定される。

グラッペＣＧｒａｂｂｅ）らは、銀電極においてヒトＩｇＧおよび抗ＩｇＧの結 合を研究するために、サイクル的電圧測定に関して使用する、石英結晶の共鳴子 を記載している。［Ｇ、Ｅ］ｅｃｔｒｏａｎａ１．Ｃｈｅｍ、Ｖｏ　１．２２３ 、ｐｐ、６７−７８　（１９８７）］１１デレル（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ）らが論じ ているように、抗原と抗体との間の免疫学的反応にのみに質量の変化が起因する 、圧電結晶に基づくイム／アラ七づは、ある環境下で、劣った感度および劣った 検出限界に悩まされうる。結局、結合因子とその配位子との間の反応を増幅ｔ、 て、より感度および信頼性があるアッセイを提供することができる、圧電結晶に 基づく特異的結合アッセイが、この分野において、要求されている。

及盟二来り この要求は、本発四により満足される。１′）の面において、また、結−合因子 で変性された石英結晶の微量でんびんの表面にすることができる粒子を作る結８ 因子を含有するように変性された、かさのあるゾル粒子を利用して分析物の濃度 を測定する方法を記載する。変性された石英結晶の微量てんびＡ、は、ここでは 生物学的に変性される石英結晶の微量てんびん、ま１こはＢＭＱＣＭと呼ぶ。石 英結晶の微量てんびんは、プライミング層、コーティング層または因子層の任意 の組み合わせにより変性されたその表面の少なくとも１つを有することができる 。ＢＭＱＣＭへゾル因子が結合すると、Ｂ　Ｍ　Ｑ　ＣＭの表面において質量の 変化が生じ、的に変性された石英結晶の微量てんびん（ＢＭＱＣ；Ｍ）が見られ る。ＢＭ　Ｑ　ＣＭは２つの電極１４．１６の間に挟まれた石英結晶のつλ−フ ァー１２からする。ここで頭文字ｒＭＯ５ＢＰ−ＩＪと呼ぶ、特異的結合対２０ の第１４１成員がＢＭＱＣＭＩＯの１つの表面１８に取り付けられている。表面 １８は、ＭＯ５ＥＰ−１２０の取り付けを増強する働きをするプライミング層ま たはコーティング層２２で、電極１６の表面を変性することによって形成するこ とができる。ＭＯ５ＥＰ−１２０は、物理学的吸着まｔ；は共有結合により、石 英結晶の微量てんびんの表面１８へ取り付けることができる。他のよく知られて いる化学的技術、例えば、タンバタ質へ適用されたグルタルアルデヒド架橋剤は 、まフ一、石英結晶の微量てんびんへのＭＯ５ＢＰ−１の取り付けに利用するこ とができる。

層２２はポリマーフィルムおよびシラン因子から形成することができ、これらは 疎水性を提供するか、あるいは共有結合の取り付けのための官能基を提供するこ とによって、石英結晶へのＭＯ５ＢＰ−１の取り付けを増強する働きをする。ポ リマ・−フィルムの１つの例はポリスチレンであり、これは普通の方法、例えば 、スピンコーティングにより適用することができる。より大きい因子の被覆面積 のためのより高い表面積のコーティングは、不規則の三次元に造形された表面の 製作により、例えば、エアゾールの適用まＩ；はリトグラフィーにより達成する ことができる。

適当なシランは一般クラスのアルキルトリクロロシランを包含し、これらは石英 結晶の微量てんびんの金属およびガラス表面に、それぞれ、Ｍ−○−５ｉ８よび ５ｉ−０−５ｉにより、共有結合する。

それに結せしたＭＯ３ＢＰ−１を有するＢＭＱＣＭを、ここで頭文字ｒＭＯ３Ｂ Ｐ−２Ｊと呼ぶ、特異的結合対２６の第２構成員で変性されたゾル粒子２４を含 有する溶液（図示せず）に暴露し、その結合部位はＭＯ５ＥＰ−１のそれらに対 して相補的である。ゾル粒子２４およびＭ請求の範囲 ■、工程： （１）　　　（ｉ）その表面に取り付けられｔ：特異的結合対の第１ｉｔ成員を 有するＱＣＭ、および（ｉ　ｉ）それに取り付けられた前記特異的結合対の第２ 構成員を有するゾル粒子、前記ゾル粒子は前記特異的結合対の前記第２構成員の それを越える密度を宵し、ここで前記ゾル粒子は前記ＱＣＭの表面に結合するこ とができ、こうして前記第２構成員の結合に比較して前記表面における質量の変 化を増幅することができる、かもなる反応系を形成し、そして （２）　試料を前記反応系に順次にまたは同時に添加し、これにより前記ＱＣＭ 表面への前記ゾル粒子の前記結合は分析物により増強まｔ；は阻害され、そして （３）　前記増強または阻害の量を試料中に最初に存在する分析物の債に関係づ ける、 からなる、試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。

２、特異的結合対の第１構成員は抗体である、上記第１項記載の方法。

３、特異的結合対の第２構成員は前記抗体の抗原である、上記第２項記載の方法 。

４、前記＃１子は金からなる、上記第３）ｌＪ起載の方法。

５、工程： （１）　　　（ｉ）その表面に取り付けられた第１結合因子、および（ｉｉ）そ れに取り付けられた第２結合因子を有するゾル粒子、前記第１結合因子および第 ２結合因子は同一であるか、あるいは異なり、ここで前記ゾル粒子は前記ＱＣＭ の表面に特異的に結合することができない、 からなる反応系を形成し、そして （２）　第１結合因子および第２結合因子の両者と反応することができる分析物 を含有することが疑われる試料を、前記反応系に、順次にまたは同時に添加し、 ここで前記前記ゾル粒子は前記ＱＣＭ表面に結合し、これによりサンドイッチの 複合体を形成し、そしてその共鳴振動数を変化させ、そして（３）　　ＦｃＩ！ ！振動数の変化を試料中に最初に存在する分析物の量に関係づける、 からなる、試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。

６、増強または阻害は振動数の変化の速度または合計の振動数の変化から決定す る、上記第１項記載の方法。

７、ゾル粒子は２ｇ／ｃｍ３より大きいまたはそれに等しい密度を有する、上記 第１項記載の方法。　　　。

８、ゾル粒子は２〜２５ｇ／ｃｍ”の範囲の密度を有する、上記第７項記載の方 法。

９、ゾル粒子は、金、銀、白金、鉄およびチタンから成る群より選択される、上 記第３項記載の方法。

】０、ゾル粒子は金からなる、上記第９項記載の方法。

１１、ゾル粒子は２ｇ／ａｍ”より大きいまｔ；はそれに等しい密度を有するポ リマーである、上記第３項記載の方法。

１２、ゾル粒子は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（クロロトリフルオロエ チレン）、ポリテトラフルオロエチレンおよびパーフルオロエチレンのコポリマ ーから成る群より選択されるハロゲン化ポリマーである、上記ｙｇ１１項記載の 方法。

１３、ゾル粒子は、二酸化クロム、二酸化チタン、酸化銀、および鉄酸化物から 成る群より選択される、上記第３項記載の方法。

１４、ゾル粒子は二酸化クロムからなる、上記第１３項記載の方法。

１５、ゾル粒子は、硫化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉛および硫化水銀から成る 群より選択される、上記第３項記載の方法。

１６、ゾル粒子は硫化カドミウムからなる、上記第１５項記載の方法。

国際調査報告 １″″′坤−１＾−−１１・　ＰＣＴ／υＳ　８９１００４０１国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （１）（ｉ）その表面に取り付けられた特異的結合対の第１構成員を有するＱＣ Ｍ、および （ｉｉ）それに取り付けられた前記特異的結合対の第２構成員を有するゾル粒子 、前記ゾル粒子は前記ＱＣＭの表面に結合し、これにより前記ＱＣＭの共鳴振動 数を変化させることができる、 からなる反応系を形成し、そして （２）試料を前記反応糸に順次にまたは同時に添加し、これにより前記ＱＣＭ表 面への前記ゾル粒子の前記結合は分析物により阻害され、そして （３）前記阻害の量を試料中に最初に存在する分析物の量に関係づける、 からなる、試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。 ２、特異的結合対の第１構成員は抗体である、上記第１項記載の方法。 ３、特異的結合対の第２構成員は前記抗体の抗原である、上記第２項記載の方法 。 ４、前記粒子は金からなる、上記第３項記載の方法。 ５、工程： （１）（ｉ）その表面に取り付けられた第１結合因子、および（ｉｉ）それに取 り付けられた第２結合因子を有するゾル粒子、前記第１結合因子および第２結合 因子は同一であるか、あるいは異なり、ここで前記ゾル粒子は前記ＱＣＭの表面 に特異的に結合することができない、 からなる反応系を形成し、そして （２）試料を前記反応系に順次にまたは同時に添加し、これにより前記前記ゾル 粒子は前記ＱＣＭ表面に結合し、これによりその共鳴振動数を変化させ、そして （３）共鳴振動数の変化を試料中に最初に存在する分析物の量に関係づける、 からなる、試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。