-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Nachweis eines Antigen-Antikörper-Komplexes
durch die Bildung von Immunodendrimeren, d.h. Oligonucleotid-Antikörper-Konjugaten,
die an markierte Dendrimere hybridisiert sind, gerichtet. Immunodendrimere
können
das Signal verstärken,
das in herkömmlichen
Verfahren beobachtet wird, indem sie einem einzigen Antigen-Antikörper-Komplex
mehrere Markermoleküle
zuführen.
-
In
dieser Anmeldung wird auf mehrere Veröffentlichungen Bezug genommen,
deren vollständige Zitierungen
im Text der Beschreibung gefunden werden. Diese Literaturstellen
beschreiben den Stand der Technik, dem diese Erfindung angehört.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die
Antigen-Antikörper-Wechselwirkung
ist eine bimolekulare Assoziation, die einer Enzym-Substrat-Wechselwirkung ähnlich ist,
mit dem wichtigen Unterschied, dass es sich um einen reversiblen
Prozess handelt. Die Wechselwirkungen zwischen einem Antikörper und
einem Antigen werden von verschiedenen nichtkovalenten Wechselwirkungen
zwischen der Antigen-Determinanten oder dem Epitop des Antigens
und der Domäne
der variablen Region des Antikörper-Moleküls regiert.
Die Spezifität
eines Antikörpers
für ein
Antigen hat zu der Entwicklung einer Vielfalt von immunologischen
Assays geführt,
die zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörper oder Antigen verwendet
werden können,
um die Anwesenheit von Antikörper
oder Antigen nachzuweisen. Diese Assays sind Instrumente bei der
Diagnose von Krankheiten, der Überwachung
des Grades der humoralen Immunantwort und der Identifikation von Molekülen von
biologischem Interesse.
-
Antigene
werden routinemäßig auf
Membranen (Western-Blots) und in situ (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz,
Immunfärbung
usw.) nachgewiesen. Es gibt viele Abwandlungen der verfügbaren Verfahren
zum Nachweis von Antigenen, abhängig von
der Zahl und den Arten der verwendeten Antikörper, der Markierung und dem
Substrat. Unabhängig von
der Abwandlung hängt
der Antigen-Nachweis im Wesentlichen von einer spezifischen Antikörper-Antigen-Reaktion
ab, die einen Antikörper-Antigen-Komplex
bildet.
-
Die
nicht-kovalenten Wechselwirkungen, die eine Antigen-Antikörper-Bindung
umfassen, umfassen Wasserstoffbrückenbindungen
und ionische, hydrophobe und van-der-Waals-Wechselwirkungen, von
denen jede relativ schwach im Vergleich zu einer kovalenten Bindung
ist und wobei jede wirksame Wechselwirkung über eine sehr kurze Entfernung stattfindet.
Deshalb erfordert eine starke Antigen-Antikörper-Wechselwirkung eine große Zahl
derartiger Assoziationen und eine sehr starke Passgenauigkeit zwischen
dem Antigen und dem Antikörper
aufgrund des hohen Maßes
an Spezifität,
das für
Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
charakteristisch ist.
-
Der
Nachweis des primären
Antikörper-Antigen-Komplexes
ist auf zahllose Weisen demonstriert worden. Nachweisverfahren umfassen
direkt markierte monoklonale Antikörper, wobei die Markierung aus
einem Enzym, z.B. alkalischer Phosphatase (AP) und Meerrettichperoxidase
(HRP); einem Fluorochrom (einer fluoreszierenden Verbindung), z.B.
Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot, Cy-3 und Cy-5; einem Schwermetall-Chelat,
wie Europium, Lanthan, Yttrium und Gold; einem radioaktiven Isotop,
wie 125I, 131I, 3H, 14C und 35S, besteht oder die Markierung ein zweiter
Reporter sein kann, z.B. Biotin, Streptavidin, Avidin, Digoxigenin
oder Dinitrophenyl. Alternativ können
die Nachweisverfahren auch direkt markierte polyklonale Antikörper einschließen, wobei
die Markierung aus den oben beschriebenen Elementen besteht, die
für monoklonale
Antikörper
aufgeführt
wurden. Weiter kann ein markierter sekundärer Antikörper, der ein polyklonaler
anti-erster Antikörper
ist, wie Ziegen-anti-Maus-IgG-Konjugat, als Nachweisverfahren verwendet
werden. Andere Nachweisverfahren umfassen die Verwendung eines markierten zweiten
Reagens, bei dem es sich nicht notwendigerweise um einen Antikörper handelt,
wie AP-Streptavidin; eines markierten sekundären Antikörpers, der ein anti-konjugiertes
Epitop ist, wie HRP-Ziegen-Antifluorescein
und AP-Kaninchen-anti-DNP; und eines unmarkierten sekundären Antikörpers, der
mit einem markierten tertiären
Antikörper
oder einer markierten tertiären
Komponente nachgewiesen wird.
-
In
Extrakten, in denen die antigenen Proteine nur einen winzigen Bruchteil
des Gesamt-Proteins darstellen, kann die Zahl und die Größe der Proteine mit
einem speziellen Epitop rasch durch Western-Blotting bestimmt werden.
Wester-Blotting besteht aus der elektrophoretischen Übertragung
eines antigenen Proteins oder antigener Proteine aus einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) auf ein Nitrocellulose-Filter,
das auf einer Seite auf das Gel gegeben wird, und wenn das Protein übertragen
wird, wird dessen Position auf dem SDS-PAGE-Gel konserviert. Das übertragene Protein
bindet fest und nicht-kovalent an die Nitrocellulose und kann einem
primären
Antikörper
ausgesetzt werden, der sich daran binden wird. Dieser gebundene
primäre
Antikörper
kann dann an einen sekundären
Antikörper
gebunden werden, der eine kovalent angebrachte Markierung enthält, die
sichtbar gemacht werden kann. Wenn ein markierter spezifischer Antikörper nicht
verfügbar
ist, können
Antigen-Antikörper-Komplexe
durch Zugabe eines sekundären
Anti-Isotop-Antikörpers,
der entweder radiomarkiert oder Enzym-markiert ist, nachgewiesen werden,
und die Bande wird durch Autoradiographie oder Substratzugabe sichtbar
gemacht. Nur die Proteine mit dem Epitop werden auf diese Weise
sichtbar gemacht, und wenn mehrere Proteine mit verschiedenen Molekulargewichten
das Epitop aufweisen, wird jedes als getrennte Bande auf der Nitrocellulose
gesehen (S. Hockfield et al., Selected Methods for Antibody and
Nucleic Acid Probes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993,
S. 293–316).
-
Western-Blotting
kann entweder ein gegebenes Protein-Antigen oder einen spezifischen
Antikörper
identifizieren. Zum Beispiel wurde Western-Blotting verwendet, um
die Hüllen-
oder Kernproteine von HIV und die Antikörper zu diesen Komponenten
im Serum von HIV-infizierten Individuen zu identifizieren.
-
Immuno-PCR,
ein Hybrid aus PCR- und Immunassay-System, vereinigt die vielseitige
molekulares Erkennung von Antikörpern
mit dem Amplifikationspotential der DNA-Replikation. Die Technik
beinhaltet die in-situ-Zusammenführung
des markierten DNA-Antikörper-Komplexes
während
des Assays, was eine variable Stöchiometrie
sowohl der Anbringung der DNA-Markierung als auch der Zusammenstellung
der Komponenten schafft.
-
Die
komplexe Vorgehensweise von Immuno-PCR ist durch die direkte chemische
Anbringung von DNA an analytische Antikörper verringert worden, wodurch
immobilisierte Einfang-Antikörper
und ein Reporter-Antikörper,
der eine kovalent angebrachte DNA-Markierung trägt, verwendet werden, und die
Assay-Antwort wird durch PCR der DNA-Markierung und den Nachweis
der Amplifikationsprodukte erhalten. Diese Technik ist modifiziert worden,
um einen Immuno-PCR-Sandwich-Assay
für mehrere
Analyten zu entwickeln (siehe R.D. Joerger et al., Clinical Chemistry,
1995, 41(9): 1371–1377; E.R.
Hendrickson et al., Nucl. Acids Res., 1995, 23(3): 522–529; und
T. Sano et al., Science, 1992, 258: 120–122).
-
Jedoch
ist Immuno-PCR, obwohl sie gegenüber
herkömmlichen
Verfahren eine erhöhte
Empfindlichkeit zeigt, zeitaufwändig,
komplex und eignet sich nicht für
eine Automatisierung.
-
Um
eine spezielle Nucleinsäuresequenz nachzuweisen,
wird eine hoch spezifische Sonden-DNA- oder RNA-Sequenz (die zum
Ganzen oder einem Teil der zu bestimmenden Sequenz komplementär ist) isoliert,
durch Klonieren amplifiziert, bis zur Homogenität gereinigt und mit einem geeigneten Marker
markiert. Die gereinigte, markierte DNA wird zu einer Hybridisierungslösung gegeben,
die denaturierte Nucleinsäuren
(RNA oder DNA) aus einer zu testenden Probe enthält. Die wässrigen Bedingungen der Hybridisierungslösung werden
so angepasst, dass eine Nucleinsäure-Hybridisierung
oder -Renaturierung dadurch ermöglicht
wird, dass markierte Moleküle
mit unmarkierten komplementären Sequenz-Gegenstücken hybridisieren.
Die Doppelstrang-Bildung kann durch Verdau mit Einzelstrang-spezifischen
Nucleasen (wie S1-Nuclease) überwacht
werden. Die Gewinnung und Quantifizierung von beständigem,
d.h. doppelsträngigem
rehybridisiertem Material liefert ein Maß für die Nucleinsäure-Sequenz, auf die
getestet wird. Die Hybridisierungsmenge ist eine Funktion der anfänglichen DNA-Konzentration
und der Zeit, die für
die Rehybridisierung gestattet wird. Deshalb kann eine erhöhte anfängliche
DNA-Konzentration zu wesentlich verringerten Hybridisierungszeiten
führen.
-
Ein
Beispiel für
die Verwendung von spezifischer Hybridisierung, um Sequenzen von
Oligonucleotiden nachzuweisen, ist jenes, das von Southern, E.,
J. Mol. Biol. 98: 503, 1997, beschrieben wurde. In diesem Assay
wird eine Probe, welche die nachzuweisende DNA-Sequenz enthält, gereinigt,
mit geeigneten Restriktionsendonucleasen verdaut, und die Fragmente
werden durch Gelelektrophorese getrennt. Die Fragmente werden dann
an einen geeigneten festen Träger,
wie Nitrocellulose, gebunden. Diese Bindung erfordert mindestens
12 bis 16 Stunden in Anwesenheit einer Lösung, die eine relativ hohe
Konzentration an Natriumchlorid enthält. Eine markierte Sonde, die
komplementär
zu den zu bestimmenden Sequenzen ist, wird dann zu der Nitrocellulose
gegeben und über
eine Zeitspanne von 12 bis 48 Stunden hybridisieren gelassen. Nach
dieser Zeitspanne muss die Nitrocellulose unter geeigneten Salz-
und Temperaturbedingungen gewaschen werden, da anderenfalls die
markierte Sonde nichtspezifisch sowohl an die Membran als auch an
andere nicht-homologe DNA-Sequenzen
binden, was zu Hintergrund "rauschen" oder "falsch Positiven" führt.
-
In
einer vereinfachten Version des oben beschriebenen Southern-Hybridisierungsassays
werden zu analysierende Nucleinsäure-Proben
in nicht-fraktioniertem Zustand auf einen festen Träger "getüpfelt". Der feste Träger wird
dann wie in dem Southern-Hybridisierungsassay sondiert, gewaschen,
und die Menge an gebundener Probe wird quantifiziert.
-
Jedoch
gibt es keine Lehren im Stand der Technik zur Verwendung der oben
identifizierten Techniken als Mittel zur Überwachung der Anwesenheit
eines interessierenden Antigens in einer Western-Blot-Assay ohne
das zusätzliche
Erfordernis der PCR der DNA-Markierung und des Nachweises der Amplifikationsprodukte.
-
Die
internationale Veröffentlichung
Nr. WO 95/27902 betrifft den statistischen Nachweis von Antigenen
mit Antikörpern,
die an Reagenzien vom Dendrimer-Typ immobilisiert sind. Die in dieser
Patentveröffentlichung
offenbarten Dendrimere sind "starburst*"-Dendrimere, die
von der Dow Chemical Company hergestellt werden und die keine Nucleinsäuren enthalten.
Die Veröffentlichung
in Clinical Chemistry (Band 42, Nr. 6, S. S202) betrifft eine Dendrimer-Signalverstärkung in
Blot-Assays, welche die Anwesenheit von Nucleinsäuren nachweisen. Die internationale
Veröffentlichung
Nr. WO 94/26932 ist auf einen Assay gerichtet, der die Anwesenheit
eines Antigens oder Antikörpers,
das auf einem festen Träger immobilisiert
ist, durch Umsetzen desselben mit einem immunoreaktiven Liganden
nachweist, der an ein Oligonucleotid gebunden ist. Die Anwesenheit des
Antigens oder Antikörpers
wird indirekt durch Nachweisen der Anwesenheit des Oligonucleotids auf
dem festen Träger
nachgewiesen.
-
Die
U.S. Patente Nr. 5,175,270 und 5,487,973 an Nilsen et al. sind auf
Dendrimere gerichtet, eine Klasse von Reagenzien zum Bestimmen von
Nucleinsäuresequenzen,
die aufeinanderfolgende Schichten von Polynucleotiden umfassen,
die eine doppelsträngige
Taille und einzelsträngige
freie Arme an den Enden des Moleküls einschließen und durch
Hybridisierung der Arme an benachbarte Molekülarme gebildet werden. Die
Polynucleotide der Außenschicht
sind durch ihre nicht-hybridisierten freien einzelsträngigen Arme
für die
zu identifizierende Sequenz spezifisch, wie in der US-A-5 175 270
beschrieben; das heißt,
ein dendritisches Polynucleotid mit einer Vielzahl von einzelsträngigen Hybridisierungsarmen;
wobei das dendritische Polynucleotid eine Vielzahl von Matrix-Polynucleotid-Monomeren umfasst,
die durch Hybridisierung zusammengebunden sind; wobei jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer,
bevor es durch Hybridisierung an andere Matrix-Polynucleotid-Monomere
gebunden wird, mindestens drei einzelsträngige Hybridisierungsregionen
aufweist; und in dem dendritischen Polynucleotid ist jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer
an mindestens ein weiteres Matrix-Polynucieotid-Monomer an mindestens
einer derartigen Hybridisierungsregion durch Hybridisierung gebunden,
und wenn es durch Hybridisierung an mehr als eine derartige Hybridisierungsregion
desselben Matrix-Polynucleotid-Monomers gebunden ist, gibt es eine
Zwischenregion, wo die zwei Monomere nicht durch Hybridisierung
gebunden sind; wobei jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer vor der Bindung
durch Hybridisierung eine lineare doppelsträngige Taillenregion mit einem
ersten Ende und einem zweiten Ende aufweist, wobei das erste Ende
in zwei einzelsträngigen
Hybridisierungsregionen endet, jede aus einem Strang aus der Taillenregion,
und das zweite Ende mit einer oder zwei einzelsträngigen Hybridisierungsregion(en)
endet, jede aus einem Strang der Taillenregion; und die Vielzahl
der vorhandenen Polynucleotid-Monomere
nicht die Sättigung
des dendritischen Polynucleotids überschreitet.
-
Es
wäre vorteilhaft,
ein Verfahren zum Antikörper-Nachweis
zu entwickeln, das eine Western-Blot-Technik mit den Oligonucleotid-Antikörper-Konjugaten
und der Empfindlichkeit von DNA-Dendrimeren ohne die Notwendigkeit
zur Durchführung
von PCR der Oligonucleotid-Markierung verwendet, um den Antigen-Antikörper-Komplex nachzuweisen.
-
GEGENSTÄNDE UND
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum
Nachweis eines Antigens bereitzustellen, wie es in den Ansprüchen 1,
9 oder 16 beansprucht ist. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung
sind in den Ansprüchen
2–8, 10–15 und
17 beansprucht.
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel zum In-Kontakt-Bringen
eines immobilisierten Antigens mit einem primären oder sekundären Antikörper bereit,
der durch ein an dem Antikörper
angebrachtes Oligonucleotid an ein Dendrimer komplexiert ist, wodurch
ein Immunodendrimer gebildet wird, das mittels einer an dem Dendrimer
angebrachten Markierung oder durch In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit
einem Anti-Dendrimer-Antikörper
nachgewiesen werden kann.
-
Weiter
ist es ein Gegenstand der Erfindung, einen Oligonucieotid-Antikörper-Komplex bereitzustellen,
in dem das Oligonucleotid mit 32P markiert
ist.
-
Es
ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis
eines markierten Immunodendrimers bereitzustellen, in dem die Markierung
ein Fluorochrom, ein Enzym, ein Schwermetall-Chelat, ein zweiter
Reporter oder ein radioaktives Isotop ist.
-
Diese
und andere Ausführungsformen
sind in der folgenden detaillierten Beschreibung offenbart oder
werden daraus ersichtlich.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1A zeigt
eine schematische Darstellung eines 32P-Assays
für den
Nachweis eines Antigen-Antikörpers-Komplexes
mit einem C(–)-Oligonucleotid-konjugierten
sekundären
Antikörper,
der durch 32P-markiertes C(+)-Oligonucleotid markiert
ist; und
-
1B zeigt
eine schematische Darstellung eines 32P-Immunodendrimer-Assays, in dem C(+)-Arme
des Dendrimers durch ein C(–)-Oligonucleotid an einen
sekundären
Antikörper
konjugiert sind und in dem das Dendrimer durch ein 32P-markiertes A(–)-Oligonucleotid
nachgewiesen wird, das an die A(+)-Arme des Dendrimers hybridisiert
ist.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Der
Nachweis von Antigen kann über
Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate,
die unter Bildung von Immunodendrimeren an Dendrimere hybridisiert sind,
signifikant verstärkt
werden. Einer der Schlüsselvorteile
der Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate ist die
leichte Markierung der Oligonucleotid-Einheit mit radioaktivem Phosphor,
Biotin, Digoxigenin und vielen anderen Marker. Immunodendrimere
können das
Signal in herkömmlichen
Western-Blots und in der Immunhistochemie amplifizieren, indem sie
mehrere Markermoleküle
einem einzigen Antigen-Antikörper-Komplex
zuführen.
-
In
einem herkömmlichen
Western-Blot-Assay wird das Antigen mit einem primären Antikörper markiert,
und der primäre
Antikörper
wird durch einen an ein Reportermolekül konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen.
Der Antigen-Antikörper-Komplex
wird durch Analyse der Anwesenheit jedes Reportermoleküls nachgewiesen,
was auf ein einziges Reportermolekül pro Antigen-Antikörper-Komplex beschränkt ist.
Wenn der Antigen-Antikörper-Komplex
bei sehr niedrigen Konzentrationen vorliegt, kann der Nachweis des
Reportermoleküls
schwierig und von unspezifischen Wechselwirkungen überschattet
sein.
-
Es
wurde überraschend
gefunden, dass durch die Verwendung eines entweder primären oder sekundären Antikörpers, der
mit einem interessierenden Antigen einen Antigen-Antikörperkomplex
bilden kann, wobei der Antikörper
mit einem Oligonucleotid komplexiert ist, das mit einem markierten
DNA-Dendrimer hybridisiert ist, die Empfindlichkeit des Nachweises
des Antigen-Antikörper-Komplexes wesentlich
erhöht
wird. Die markierten DNA-Dendrimere, die als Reportermoleküle dienen,
ermöglichen,
dass eine Mehrzahl von Markermolekülen mit einem einzigen Antikörper-Antigen-Komplex
assoziiert ist, wodurch das Nachweissignal um einen Faktor gleich
der Zahl der markierten Dendrimere, die an das Oligonucleotid komplexiert
sind, verstärkt
wird.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Antigen an einem festen Träger immobilisiert
und mit einem ersten Antikörper
in Kontakt gebracht, wodurch ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird.
Der feste Träger
wird dann mit einer Lösung
in Kontakt gebracht, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das
Immunodendrimer einen anti-ersten Antikörper (oder sekundären Antikörper) umfasst,
der ein daran komplexiertes Oligonucleotid und ein markiertes Dendrimer aufweist,
das durch ein oder mehrere der äußersten Schichten
des Dendrimers, d.h. die einzelsträngigen ("Arm-")
Sequenzen des Dendrimers, an das Oligonucleotid hybridisiert ist.
Der anti-erste Antikörper des
Immunodendrimers bildet einen Komplex mit dem ersten Antikörper, und
das Antigen wird durch Nachweis der Anwesenheit von Immunodendrimer quantifiziert.
-
Alternativ
kann ein Antigen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung
nachgewiesen werden, indem man ein Antigen an einem festen Träger immobilisiert
und den festen Träger
mit einer Lösung in
Kontakt bringt, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer
einen Antikörper
umfasst, der einen Antigen-Antikörper-Komplex
mit dem immobilisierten Antigen bilden kann, wobei Antikörper ein
daran komplexiertes Oligonucleotid aufweist, wobei ein markiertes
Dendrimer mit dem Oligonucleotid hybridisiert ist. Das Antigen wird
durch Nachweis der Anwesenheit von Immunodendrimer quantifiziert.
-
In
einer weiteren alternativen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann ein Antigen nachgewiesen werden,
indem man das Antigen an einem festen Träger immobilisiert und den festen
Träger
mit einer Lösung
in Kontakt bringt, die einen ersten Antikörper umfasst, wodurch ein Antigen-Antikörper-Komplex
gebildet wird. Anschließend
wird der feste Träger
mit einer Lösung
in Kontakt gebracht, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das
Immunodendrimer einen anti-ersten Antikörper (d.h. sekundären Antikörper) umfasst,
der ein daran komplexiertes Oligonucleotid und ein mit dem Oligonucleotid
hybridisiertes Dendrimer aufweist, wobei der anti-erste Antikörper einen
Komplex mit dem ersten Antikörper bildet.
Danach wird der feste Träger
mit einer Lösung in
Kontakt gebracht, die einen markierten teritären Anti-Dendrimer-Antikörper umfasst,
wobei der tertiäre
Antikörper
einen Komplex mit dem mit dem Oligonucleotid hybridisierten Dendrimer
bildet und die Menge an Antigen durch Nachweis der Anwesenheit von
markiertem tertiärem
Antikörper
quantifiziert wird.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung können
die Dendrimere durch Standardtechniken, d.h. durch die Verwendung
von Fluorochromen (oder fluoreszierenden Verbindungen), Enzymen
(z.B. alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase), Schwermetall-Chelaten,
zweiten Reportern oder radioaktiven Isotopen, markiert werden.
-
Alternativ
können
die Oligonucleotide, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, mit radioaktivem Phosphor radiomarkiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Oligonucleotid am 5'-Ende
an den Antikörper komplexiert,
und das 3'-Ende
wird mit 32P markiert. Die 32P-markierten
Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate
können
durch dem Fachmann wohlbekannte herkömmliche Verfahren gebildet
werden, z.B. durch direkte kovalente Verknüpfung des Oligonucleotids mit
dem Antikörper,
wobei der Antikörper
und das 5'-Amino-modifizierte
Oligonucleotid unabhängig
mittels getrennter heterobifunktioneller Vernetzungsmittel aktiviert
werden (siehe E. Hendrickson, T. Hatfield Truby, R. Joerger, W.
Majarian und R. Ebersole, Nucl. Acids Res., 1995, 23(3): 522-529).
Derartige Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate
sind aufgrund der hohen Energie von radioaktivem Phosphor und der
relativ kurzen Halbwertszeit sehr attraktive Markierungen. Weiter
ermöglicht
die Verwendung von radioaktivem Phosphor die Verwendung einer Phosphorbildgebungsvorrichtung
zum Nachweis der Menge an Isotop in dem Antigen-Antikörper-Komplex.
Phosphorbildgebungsvorrichtungen liefern eine quantitative Information über die
Menge an Isotop auf einer Membran, wodurch die Quantifizierung des
Signals in einem Western-Blot-Assay verbessert wird.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten DNA-Dendrimere sind Konstrukte,
die DNA-Schichten umfassen. Die äußerste Schicht
eines gegebenen DNA-Dendrimers
weist einzelsträngige
Sequenzen ("Arme") auf, die an der
Oberfläche freiliegen
und mit einer vorbestimmten Nucleinsäuresequenz hybridisieren werden,
die an den Antikörper komplexiert
ist.
-
Weiter
kann das Oligonucleotid mit einer ersten Sequenz des Dendrimers
hybridisiert werden und gleichzeitig auch mit einer zweiten Sequenz
des Dendrimers hybridisiert werden. Alternativ können mehrere markierte Dendrimere,
von denen jedes Sequenzen aufweist, die zu einer anderen Sequenz
der Oligonucleotid-Arme komplementär sind, mit einem einzigen
an einen Antikörper
komplexierten Oligonucleotid hybridisiert werden, wodurch ermöglicht wird, dass
eine Mehrzahl von markierten Molekülen an den Antigen-Antikörper-Komplex komplexiert
wird und der Nachweis des Signals verstärkt wird, das mit jedem Antigen-Antikörper-Komplex
verbunden ist.
-
Jede
Schicht des Dendrimer-Moleküls
ist aus einer speziellen Klasse von Matrix-Monomeren zusammengesetzt. Matrix-Monomere
weisen die Eigenschaft auf, dass die aufeinanderfolgende Addition von
Monomeren eine dreidimensionale DNA-Dendrimer-Matrix liefert. Die
Dendrimere sind analog zu biologischen Membranen, indem sie für spezifische Substanzen,
z.B. komplementäre
DNA-Sequenzen, die
an einen Antikörper
komplexiert sind, selektiv permeabel sind.
-
Verfahren
zur Herstellung und Verwendung der DNA-Dendrimere, die in dem Assay
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in den U.S. Patenten
Nr. 5,175,270 und 5,487,973 beschrieben.
-
Zusätzlich kann
ein direkt markierter monoklonaler oder polyklonaler primärer Antikörper, der
an ein Oligonucleotid konjugiert ist, das mit einem Dendrimer hybridisiert
werden kann, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Dendrimer kann durch einen zweiten Reporter, wie Biotin, ein
Fluorochrom, ein Enzym, ein Schwermetall-Chelat oder ein radioaktives
Isotop, markiert werden und durch Standardverfahren nachgewiesen
werden. Alternativ kann das Dendrimer (oder Immunodendrimer) durch
In-Kontakt-Bringen des festen Trägers
mit einem markierten Anti-Dendrimer-Antikörper und Verwendung herkömmlicher
Verfahren zur Quantifizierung der vorhandenen Markierungsmenge nachgewiesen
werden.
-
Die
im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper können entweder
monoklonal oder polyklonal sein. Kurz gesagt, werden monoklonale
Antikörper
durch Hybridome sekretiert, welche durch Fusion einer unsterblichen
Zelle (einer Myelomzelle) mit einer Antikörper-sekretierenden Zelle (einem
Lymphozyten), die aus einem immunisierten Tier geerntet wird, produziert
werden. Die polyklonale Antwort eines Tiers auf ein Antigen oder
eine Mischung derselben kann dadurch durch den Einzelzellen-Klonierungsprozess,
der an der Hybridom-Produktion
beteiligt ist, in ihre einzelnen Komponenten zerlegt werden.
-
Zusätzlich kann
auch ein Antikörper,
der ein anti-konjugiertes Hapten ist, im Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Antikörper dieser Art sind typisch
monoklonal und erkennen das spezielle Hapten, wie Dinitrophenol
(DNP), wenn es typisch an einen zweiten Antikörper, wie Ziegen-anti-Maus,
konjugiert ist.
-
Darüber hinaus
kann markierter sekundärer Antikörper, bei
dem es sich um polyklonalen anti-ersten Antikörper handelt, verwendet werden.
Alternativ können
unmarkierte sekundäre
Antikörper,
die durch einen markierten tertiären
antisekundären
Antikörper oder
einen tertiären
Anti-Dendrimer-Antikörper (wenn
ein Dendrimer, das an ein Oligonucleotid komplexiert ist, welches
an einen gebundenen sekundären
Antikörper
geknüpft
ist, verwendet wird) nachgewiesen wird, in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
-
Verfahren
zur Erzeugung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern können in
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. von J. Sambrook,
E.F. Fritsch und T. Maniatis (1989), Bd. 3, S. 18.2–18.18,
und Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, von S.
Hockfield et al. (1993), S. 59–109,
gefunden werden.
-
Die
verschiedenen Permutationen bei den Antikörpern, die zur Verwendung im
Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sind dem gewöhnlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie offenkundig. Der Fachmann
erkennt, dass ungeachtet der Kombinationen von verwendeten Antikörpern das
Verfahren der vorliegenden Erfindung universell verwendet werden
kann, um ein Dendrimer an einen Antikörper für den Nachweis von Antigen
zu komplexieren.
-
Weiter
kann jedes herkömmliche
Verfahren zur Markierung von Dendrimeren (oder Oligonucleotiden)
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese
Verfahren umfassen die Verwendung von Enzymen, wie alkalischer Phosphatase
und Meerrettichperoxidase, zweiten Reportern, wie Biotin, mit zweiten
Reportermolekülen,
die dazu komplementär
sind, wie Avidin, Streptavidin und Anti-Biotin-Antikörpern, Schwermetall-Chelaten, wie
Gold, radioaktiven Isotopen, d.h. 125I, 3H, 35S und 32P, und Fluorochromen (fluoreszierenden
Verbindungen), d.h. Fluorescein und Rhodamin.
-
Ähnlich kann
jedes Verfahren, das für
den Nachweis der oben angegebenen Markierungen verfügbar ist,
im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie Autoradiographie,
Fluorographie, Phosphorbildgebung und Fluorimetrie. Der Fachmann
erkennt, dass jede der oben erwähnten Permutationen
im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ohne
vom Geist oder Bereich derselben abzuweichen und ohne die Bürde übermäßiger Experimente.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben
und erläutert.
Weitere Gegenstände
dieser Erfindung werden zusammen mit zusätzlichen Merkmalen, die dazu
beitragen, und Vorteile, die daraus erwachsen, aus den folgenden
Beispielen der Erfindung ersichtlich. Man wird anerkennen, dass
Abwandlungen und Modifikationen der Produkte und Verfahren vom Fachmann
vorgenommen werden können,
ohne vom Geist oder Bereich der Erfindung abzuweichen, wie er in
den beigefügten
Ansprüchen
definiert ist.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1 - Signal-Amplifikation
in Western-Blot
-
Beta-Galactosidase
(Sigma) wurde 1:10 reihenverdünnt
und auf 4–20%
SDS-PAGE-Gel (Novex) aufgetragen.
Monoklonaler Maus-anti-bgal (Klon gal-13) wurde als primärer Antikörper verwendet.
Polyklonaler Kaninchen-anti-Maus-AP wurde als der markierte sekundäre Antikörper im
herkömmlichen Western-Blot-Nachweismodus verwendet.
Polyklonaler Ziegen-anti-Maus-Antikörper wurde durch Synthetic
Genetics an 5'-NH3-Oligonucleotid konjugiert. DNA-Dendrimere
wurden von Polyprobe Inc. erhalten und wurden mit dem Rad-FreeTM-Markierungssystem
mit Biotin markiert.
-
In
einem Standard-Western-Blot-Assay wurden reihenverdünnte Proben
von beta-Galactosidase-Antigen
durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Proteinbanden wurden unter Verwendung
einer halbtrockenen Vorrichtung (Novex) auf das Nitrocellulose-Filter übertragen.
-
Als
die Übertragung
der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von
dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in einer konzentrierten nichtantigenen
Proteinlösung,
d.h. Blockierungslösung,
z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch, eingeweicht. Das Protein
in der Lösung
bindet sich unspezifisch an alle Bereiche auf der Nitrocellulose,
die nicht bereits Protein aus dem SDS-PAGE-Gel adsorbiert haben, in einem Versuch,
zu verhindern, dass die Antikörper
unspezifisch an die Nitrocellulose binden, und um die Wahrscheinlichkeit zu
erhöhen,
dass sie nur an die immobilisierten Antigen-Proteine binden. Um
weiter sicherzustellen, dass die Antikörper nicht unspezifisch an
die Nitrocellulose oder irrelevante Proteine auf der Nitrocellulose binden,
wurden die Antikörper
in der nicht-antigenen Proteinlösung
verdünnt,
bevor sie auf die Nitrocellulose aufgetragen wurden.
-
Die
Nitrocellulose wurde mit verdünntem
monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase
sondiert, und die Membran wurde daraufhin in Puffer (TBS/Tween 20,
worin TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung ist und Tween 20 PEG (20)-Sorbitanmonolaurat
ist; der TBS/Tween 20-Puffer besteht aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,
150 mM NaCl und 0,1% Tween 20) bei Raumtemperatur gewaschen. Die
Waschlösung wurde
verworfen, und die Membran wurde mit Kaninchen-anti-Maus-AP sondiert.
Die Antikörperlösung wurde
entfernt, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen.
Luminphos-530 wurde dazugegeben, und die Nitrocellulose wurde Röntgenfilm
ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Im
Assay der vorliegenden Erfindung wurden reihenverdünnte Proben
von beta-Galactosidase-Antigen
(unter Verwendung des gleichen Verdünnungsverhältnisses, das im vorstehend
beschriebenen herkömmlichen
Western-Assay verwendet wird) durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die
Proteinbanden wurden auf das Nitrocellulose-Filter übertragen.
-
Als
die Übertragung
der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von
dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in einer konzentrierten nichtantigenen
Proteinlösung
(d.h. Blockierungslösung,
z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch) eingeweicht.
-
Die
Nitrocellulose wurde mit verdünntem, monoklonalem
Maus-anti-beta-Galactosidase
sondiert, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen.
Die Waschlösung
wurde verworfen, und die Membran wurde mit Ziegen-anti-Maus-Dendrimer
sondiert. Die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen,
und die Membran wurde mit Streptavidin-AP sondiert. Die Antikörper-Lösung wurde
entfernt, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen.
Luminphos-530 wurde dazugegeben, und die Nitrocellulose wurde Röntgenfilm
ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Die
Daten (nicht gezeigt) demonstrierten klar eine überlegene Empfindlichkeit des
Blots, der mit DNA-Dendrimeren sondiert wurde.
-
Beispiel 2 - 32P-Western-Assay
-
Beta-Galactosidase
(Sigma) wurde reihenverdünnt
(1:10) und auf 4–20%
SDS-PAGE (NOVEX) aufgetragen.
Monoklonaler Maus-anti-bgal (Klon gal-13) war der primäre Antikörper; polyklonaler
Ziegen-anti-Maus-Antikörper,
der durch Synthetic Genetics an 5'-Oligonucleotid konjugiert war (das
C(–)-Oligonucleotid),
war der sekundäre
Antikörper;
und 5'-32P-markiertes
C(+)-Oligonucleotid war die Sonde. Immunodendrimere wurden durch
Vereinigen von etwa 100 ng C(–)-Oligonucleotid
eines C(–)-Antikörper-Konjugats
(Synthetic Genetics) und insgesamt 1 μg Vierschicht-Dendrimer in 100 μl TBS/Tween
20 gebildet. Man ließ das
Oligonucleotid mindestens 1 Stunde lang bei 37°C hybridisieren.
-
In
einem 32P-Western-Assay wurden reihenverdünnte Proben
von beta-Galactosidase
durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Proteinbanden wurden auf ein
Nitrocellulose-Filter überführt.
-
Als
die Übertragung
der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von
dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in konzentrierter nichtantigener Proteinlösung, d.h.
Blockierungslösung,
z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch, eingeweicht.
-
Die
Nitrocellulose wurde mit verdünntem
monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase
sondiert, die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen,
und die Waschlösung
wurde verworfen. 32P-C(+)-Oligonucleotid
wurde mit sekundärem C(–)-Antikörper-Konjugat
hybridisiert. Die Membran wurde mit dem 32P-C(+)-Oligonucleotid-C(–)-Antikörper-Konjugat
sondiert, daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen und Röntgenfilm
ausgesetzt. Der Assay ist schematisch in 1A gezeigt.
-
Zum
Vergleich ist ein Antigen-Nachweis durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung, d.h. unter Verwendung eines Immunodendrimers und einer 32P-markierten
Oligonucleotid-Sonde, schematisch in 1B gezeigt.
Kurz gesagt, wurden in einem 32P-Western-Assay
reihenverdünnte
Proben von beta-Galactosidase
durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen,
wie vorstehend beschrieben.
-
Die
Nitrocellulose wurde mit verdünntem
monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase
sondiert, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen.
-
Ein
Vierschicht-Dendrimer mit C(+)-Oligonucleotid-Armen, die komplementär zu dem
C(–)-Oligonucleotid
waren, das an den sekundären
Antikörper komplexiert
war, und A(+)-Oligonucleotid-Armen (wobei die Oligonucleotid-Arme,
die als A(+) und C(+) bezeichnet werden, verschieden sind), wurde
als Sonde verwendet. 32P-A(–)-Oligonucleotid
und C(–)-Antikörper-Konjugat
wurden mit einem Vierschicht-Dendrimer
hybridisiert, wobei das 5'-32P-markierte A(–)-Oligonucleotid komplementär zu den A(+)-Armen
des Immunodendrimers war. Die Membran wurde mit der vorhybridisierten
markierten Konjugat-Dendrimer-Zusammenstellung sondiert, und die Membran
wurde in TBS/Tween 20 gewaschen. Die Membran wurde daraufhin in
TBS/Tween 20 gewaschen und Röntgenfilm
ausgesetzt.
-
Die
Ergebnisse demonstrierten klar das verstärkte Signal, das mit der Verwendung
eines Immunodendrimers verbunden war. 32P-markierte
Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate
sind aufgrund der hohen Energie von 32P
und der kurzen Halbwertszeit sehr attraktive Markierungen. Zusätzlich können als Alternative
zum Röntgennachweis
Phosphorbildgebungsvorrichtungen verwendet werden, die in der Lage
sind, eine quantitative Information über die Menge an Isotop auf
einem Western-Blot zu liefern, wodurch die Quantifizierung des Western-Blot-Assays
verbessert wird.