DE10013993A1 - Verfahren zur Erzeugung von aktivierten Sensoroberflächen zur hocheffizienten kovalenten Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle - Google Patents

Verfahren zur Erzeugung von aktivierten Sensoroberflächen zur hocheffizienten kovalenten Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle

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DE10013993A1
DE10013993A1 DE2000113993 DE10013993A DE10013993A1 DE 10013993 A1 DE10013993 A1 DE 10013993A1 DE 2000113993 DE2000113993 DE 2000113993 DE 10013993 A DE10013993 A DE 10013993A DE 10013993 A1 DE10013993 A1 DE 10013993A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur hocheffizienten Immobilisierung von bioorganischen Makromolekülen. DOLLAR A Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß mit Standardverfahren voraktivierte Trägermaterialien, wie beispielsweise aminofunktionalisierte Glas-, Kunststoff- oder Goldoberflächen, zunächst mit dendrimeren Makromolekülen beschichtet werden. In einem sich anschließenden Modifikationsschritt mit einem homobifunktionalen Linkerreagenz werden die terminalen Dendrimerendgruppen für die Immobilisierungsreaktion aktiviert. Gleichzeitig wird aus den oberflächenfixierten Dendrimeren durch kovalente Vernetzung eine makromolekulare Oberfläche aufgebaut. DOLLAR A Die so generierten Oberflächen weisen im Vergleich zu gängigen linearen Linkersystemen zwei entscheidende Vorteile auf. Durch die kovalente Quervernetzung der immobilisierten Dendrimere besitzen die Oberflächen eine erhöhte physikalisch-chemische Stabilität und ermöglichen damit die verlustfreie Regenerierbarkeit der mit bioorganischen Makromolekülen beladenen Sensoren. Desweiteren wird durch die Verwendung polyfunktionalisierter Dendrimere die Immobilisierungseffizienz drastisch erhöht. In Kombination mit der in der chemischen Natur der Dendrimere begründeten hohen Flexibilität des Linkersystems ergibt sich eine hohe Sensitivität bei heterogenen Affinitätsreaktionen.

Description

Aufgabenstellung
Verfahren zur Erzeugung von aktivierten Sensoroberflächen zur hocheffizienten kovalenten Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle.
Hinterrund/Stand der Technik
Der Nachweis von bioorganischen Makromolekülen über Affinitätsreaktionen an Biosensoren erfordert Oberflächen, die mit einem Reaktionpartner der wechselwirkenden Biomoleküle beschichtet sind (Festphasen-Methode). Um den Reaktionspartner dauerhaft auf der Sensormatrix fixieren zu können, ist diese zuvor chemisch so zu modifizieren, daß reaktive Kupplungsgruppen zur Immobilisierung bereitgestellt werden. Hierbei handelt es sich typischerweise um reaktive Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Aldehyd-, Isothiocyanat- oder Epoxygruppen, die über Alkylspacer kovalent mit der Oberfläche verknüpft sind. Besonders attraktiv, weil kostenminimierend ist es, wenn der Sensor regenerierbar und damit mehrfach verwendbar ist. Deshalb ist die Immobilisierungsmethode so zu konzipieren, daß die Fixierung der Biomoleküle auf der Oberfläche über kovalente, oxidationsstabile Linkersysteme erfolgt.
Frühere Strategien zur Immobilisierung gehen von linearen Linkem aus. So lassen sich beispielsweise Siliciumdixoid-Oberflächen durch Beschichtung mit einem N-Alkylamino-Silan für die Kupplung bioorganischer Makromoleküle aktivieren1. Eine andere Möglichkeit besteht darin, Gold-beschichtete Oberflächen einzusetzen, indem die Kupplung der Makromoleküle über eine ω-funktionalisierte Alkylthiol-SAM2, 3 erfolgt. Enthält das zu immobilisierende Makromolekül Thiol-Gruppen, ist die direkte Kupplung durch Chemisorption an die Goldoberfläche möglich4. Glasoberflächen lassen sich durch den Einsatz geeigneter Silane funktionalisieren. Zur Immobilisierung von hydroxyl- oder aminofunktionalisierten Biomolekülen werden häufig mit Epoxyalkylsilan aktivierte Glasoberflächen eingesetzt5, während thiolierte Makromoleküle über Disulfidbrücken an Thiolsilan-aktivierte Oberflächen gekuppelt werden können6. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Avidin/­ Streptavidin beschichteten Oberflächen, die sich als hochaffin gegenüber biotinylierten Substanzen erweisen7.
Die aufgeführten Verfahren sind jedoch optimierungsbedürftig, da sie im allgemeinen nur zu einer geringen Belegungsdichte und einer mangelnden Regenerierbarkeit der so hergestellten Oberflächen führen. Beispielsweise wird die Au-Schwefel-Bindung in Gegenwart von Sauerstoff oxidativ zerstört, Avidin/Streptavidin-Oberflächen werden bei termischer Regeneration denaturiert und silylierte Glas-Oberflächen sind instabil gegenüber alkalischen Medien mit einem pH < 8 8. Die durch Silylierung erhaltenen Glas-Oberflächen weisen zudem nur eine geringe Beladungsdichte auf, was häufig zu einer ungenügenden Sensitivität der Sensoren führt9.
Inzwischen gibt es mehrere Arbeiten mit dem Ziel, die Beladungsdichte und Regenerierbarkeit der Oberflächen zu verbessern, z. B. durch den Einsatz von kovalent10 oder chemisorptiv auf Gold11 gebundenen Dextran-Zwischenschichten mit Hydrogeleigenschaften. Die Immobilisierung an diesen Oberflächen erfolgt jedoch statistisch innerhalb der Hydrogelmatrix, was sich nachteilig auf die Zugänglichkeit der immobilisierten Komponente auswirkt, da die heterogene Interphasen-Reaktion durch Diffusionsprozesse limitiert wird 12. Dieses Problem tritt auch bei dem Ansatz auf, oberflächenaktivierte Mikropartikel (CPG, Magnetic Beads, Merrifield Harz, etc.) auf den Sensoroberflächen kovalent zu binden, um hierdurch eine Oberflächen-Vergrößerung zu erreichen13. Die so präparierten Oberflächen sind mikroporös und erweisen sich bei Affinitätsreaktionen aufgrund limitierter Diffusion als problematisch.
Von Beier et al. wird ein Verfahren beschrieben, mit dem es gelingt, die Anzahl potentieller Bindungsstellen für Makromoleküle auf der Sensoroberfläche durch den in-situ- Aufbau verzweigter Linkersysteme zu erhöhen14. Allerdings ist hierzu, nach vorhergehender Aminierung des Supports (Silylierung, RFPE15 in Ammoniak, etc.), die sukzessive Wiederholung einer ca. 1-2 Tage dauernden, 2-stufigen Synthese, gefolgt von einer abschließenden Endgruppenaktivierung, notwendig. Typischerweise sind so 8 und mehr Reaktionsschritte an mehreren Tagen erforderlich, um die aktivierten Oberflächen herzustellen.
Stattdessen wird eine Methode benötigt, die es erlaubt, aktivierte Oberflächen in nur wenigen Reaktionsschritten aufzubauen, die über eine hohe Dichte an reaktiven Kupplungsgruppen verfügen und darüber hinaus eine hohe physikalisch-chemische Stabilität gegenüber thermischen und chemischen Regenerationsschritten aufweisen.
Lösung
Dieses Problem wird durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren gelöst, indem auf einer Oberfläche eine vorgeformte makromolekulare Zwischenschicht aufgebracht wird (Abb. 1), die nicht nur die Anzahl potentieller Bindungsstellen für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle erhöht, sondern auch die physikalisch-chemische Stabilität der Oberfläche verbessert und damit die Regenerierbarkeit der mit den bioorganischen Makromolekülen modifizierten Träger verbessert.
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die überraschende Beobachtung, daß Nucleinsäure-funktionalisierte Glasoberflächen, die durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren hergestellt wurden, nicht nur eine drastisch verbesserte Nachweisgrenze bei der Detektion komplementärer Nucleinsäuren aufweisen, sondern darüber hinaus auch eine deutlich gesteigerte physikalisch-chemische Stabilität zeigten, so daß die Regenerierbarkeit der Nucleinsäure-modifizierten Träger durch Behandlung mit alkalischen Waschlösungen viele Male ohne Aktivitätsverlust der Oberfläche durchgeführt werden konnte.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Oberflächenmodifikation, indem auf einer Oberfläche zunächst eine vorgeformte makromolekulare Zwischenschicht aufgebracht wird (Abb. 1), die nicht nur die Anzahl potentieller Bindungsstellen für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle erhöht, sondern auch die physikalisch-chemische Stabilität der Oberfläche verbessert und damit die Regenerierbarkeit der mit den bioorganischen Makromolekülen modifizierten Trägern verbessert. Dies wird typischerweise dadurch erreicht, indem eine durch Standardverfahren hergestellte, z. B. Amino- oder Carboxyl-modifizierte Glasoberfläche zunächst mit einem dendrimeren Makromolekül und anschließend mit einen homobifunktionalen Linkerreagenz behandelt wird. Durch die Anbindung der dendrimeren Komponente wird die Anzahl der Bindungsstellen für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle erhöht. Durch die Behandlung mit dem homobifunktionalen Linkerreagenz werden einerseits die Dendrimergruppen für die Immobilisierung der bioorganischen Makromoleküle aktiviert. Andererseits erfolgt durch die Behandlung mit dem homobifunktionalen Linkerreagenz eine kovalente Vernetzung der Oberflächen-fixierten, dendrimeren Makromoleküle, so daß die durch das Verfahren hergestellten Oberflächen eine signifikant verbesserte physikalisch-chemische Stabilität aufweisen und damit die verlustfreie Regenerierbarkeit der mit den bioorganischen Makromolekülen modifizierten Trägern möglich wird. Darüber hinaus bewirkt die chemische Natur der dendrimeren Makromoleküle, daß das Linkersystem für die Anknüpfung der bioorganischen Makromoleküle hochgradig flexibel ist, wodurch zusätzliche Vorteile gegenüber linearen Linkersystemen hinsichtlich der Effizienz der heterogenen Affinitätsreaktion resultieren.
Ausführungsbeispiele Verfahren Modifikation von Glasträgern unter Verwendung aminoterminierter Dendrimere 1. Aminierung einer Oberfläche auf der Basis von Siliciumdioxid
Nach gründlicher Reinigung der Glasoberfläche (CH2Cl2 → H2O2/H2SO4 + Ultraschall → Bidest) erfolgt eine Silylierung der Glasoberfläche (Abb. 1; Schritt 1) mit 3-Aminopropyltriethoxysilan nach bekannten Verfahren, wie sie beispielsweise in der Literatur beschrieben sind16.
2. Aufbau einer Aminodendrimer-Sensoroberfläche
Die aminosilylierte Glasoberfläche wird mit einer 10 mM Lösung aus Disuccinimidylglutarat in CH2Cl2/n-Ethyldiisopropylamin (100 : 1) für 2 h bei RT unter Argon carboxyfunktionalisiert (Abb. 1, Schritt 2). Die Oberfläche wird anschließend mehrfach gründlich mit CH2Cl2 gewaschen. Zur Immobilisierung eines aminoterminierten Dendrimers wird die Oberfläche mit einer 10%igen Lösung eines Aminodendrimers17,18 in Methanol benetzt (Abb. 1, Schritt 3). Nach 30minütiger Reaktionszeit wird der Überschuß an Dendrimer durch Waschen entfernt und die Sensoroberfläche wird im Stickstoffstrom getrocknet. Die Glasträger werden dann in eine 20 mM Lösung eines homobifunktionalen Linkermoleküls, beispielsweise Phenylen-1,4-diisothiocyanat, in CH2Cl2/Pyridin (100 : 1) überführt (Abb. 1, Schritt 4). Nach 30minütiger Reaktionszeit wird gründlich mit CH2Cl2 gewaschen. Die Sensoroberflächen werden jetzt direkt für die im folgenden näher beschriebene Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle eingesetzt oder alternativ bis zur Verwendung unter Argon aufbewahrt.
3. Anknüpfung der bioorganischen Makromoleküle
Die wie oben beschrieben vorbereitete Oberfläche wird mit Tropfen einer wässrigen Lösung benetzt, die das zu immobilisierende bioorganische Makromolekül in einem typischen Konzentrationsbereich von 1-100 µM enthält. Bei der bioorganischen Komponente handelt es sich beispielsweise um 5'-Amino- modifizierte Oligonucleotide, wie sie von einer Vielzahl kommerzieller Lieferanten bezogen werden können. Man läßt die benetzten Oberflächen in einer Feuchtigkeitskammer mehrere Stunden inkubieren. Die optimale Inkubationszeit ist abhängig von Art und Konzentration der zu immobilisierenden Komponente. Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen bei der Affinitätsreaktion werden die während der Inkubationszeit nicht abreagierten Kupplungsgruppen anschließend deaktiviert. Hierzu überführt man das Sensorelement zum Beispiel in eine 6- Aminohexanollösung (100 mM in Dimethylformamid (DMF)), die noch aktive Isothiocyanatgruppen eines Phenylendiisothiocyanatlinkers inaktiviert. Die Oberfläche wird daraufhin mit detergenzhaltigen Lösungen, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, von nicht kovalent angebundenen bioorganischen Makromolekülen befreit, dann mehrmals in bidestilliertem Wasser gespült und im N2-Strom getrocknet. Bis zur Verwendung werden die beladenen Sensoren bei -20°C gelagert.
Variation 1 Modifikation von Glasträgern unter Verwendung carboxyterminierter Dendrimere
Die Aminierung eines Trägers auf Glasbasis erfolgt wie unter herfahren beschrieben. Zum Aufbau einer Carboxydendrimer-Sensoroberfläche wird zunächst ein carboxyterminiertes Dendrimer19 nach bekannten Methoden, beispielsweise wie in der Literatur beschrieben20, in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid/N- Hydroxysuccinimd verestert. Das aktivierte Dendrimer wird in DMF auf die aminosilylierte Sensoroberfläche gebracht und nach 30minütiger Reaktionszeit wird das überschüssige Dendrimer mit DMF abgewaschen. Die Oberflächen können anschließend direkt, wie oben beschrieben für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle eingesetzt werden. Alternativ kann die Lagerung der aktivierten Oberflächen unter Argon erfolgen.
Variation 2 Aufbau makromolekularer Sensoroberflächen auf Basis aminoreaktiver Silanober­ flächen
Wie unter Verfahren bei 1 beschrieben erfolgt die Modifizierung der Glasoberfläche mit 3-Glycidoxyalkyl-, 2-(3,4-Epoxycyclohexyl)ethyl-, 3- Isothiocyanato- oder 3-Carboxypropyltrialkoxysilan, bzw. den entsprechenden Trichlorosilanen. Im Falle hydrolyseempfindlicher Silane wird die Silanierung durchgeführt wie in der Literatur beschrieben21. Epoxy- und Isothiocyanato- modifizierte Oberflächen werden direkt mit aminofunktionalisiertem Dendrimer umgesetzt; im Falle carboxy-modifizierter Oberflächen ist vor der Bindung des Dendrimers eine Aktivierung der Carboxylgruppe notwendig. Die weitere Umsetzung mit einem homobifunktionalem Spacer und die Anbindung der Biomoleküle erfolgt wie unter Verfahren bei 2 und 3 beschrieben.
Variation 3 Verwendung von Kunststoffträgern
Die Aminierung der Kunststoffoberflächen, beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polycarbonat, Polyacrylnitril oder Copolymere aus diesen, erfolgt nach bekannten Verfahren, beispielsweise nach der in der Literatur beschrieben Methode22 durch Radiofrequenz-Plasmaentladung in einer Ammoniak- Atmosphäre. Der Aufbau der Dendrimer-basierten Oberflächen erfolgt wie unter Verfahren oder Variation 1 beschrieben.
Variation 4 Verwendung von Gold-beschichteten Trägermaterialien
Die Auftragung und Aminierung der Gold-Schicht auf diversen Trägern erfolgt durch bekannte Verfahren, beispielsweise indem eine aminoterminierte SAM auf Gold hergestellt wird, wie dies in der Literatur beschrieben wird23. Der Aufbau der Dendrimer-basierten Oberflächen und die Anbindung der bioorganischen Makromoleküle erfolgt wie unter Verfahren oder Variation 1, 2 beschrieben.
Variation 5 Verwendung von Oberflächen auf der Basis von Silicium und anderen Metall und Halbleiter-Trägermaterialien
Die Aminierung der Metall- und Halbleiter-Oberflächen erfolgt durch bekannte Verfahren, beispielsweise die Siliylierung mit Amino-, Epoxy-, Carboxy- oder Thiolsilanen1, 21 oder durch Hydrosilylierung mit ω-Undecencarbonsäure 24. Die aktivierte Oberfläche wird anschließend mit der dendrimeren Komponente modifiziert wie unter Verfahren oder Variation 1, 2 beschrieben. Die Anbindung der bioorganischen Makromoleküle erfolgt wie unter Verfahren bei 3 beschrieben.
Abbildungen
Abb. 1: Darstellung der Oberflächenmodifikation zur Erzeugung Dendrimer­ basierender, makromolekularer Sensoroberflächen.
Abb. 2: Anknüpfung von Biomolekülen.
Abb. 3: Beladungsdichte und Homogenität der erfindungsgemäßen Sensoroberflächen.
Abb. 4: Regenerationsstabilität der erfindungsgemäßen Sensoroberflächen.
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1: Dargestellt ist die Oberflächenmodifikation eines Glas, Kunststoff oder Gold-beschichteten Trägers. Schritt 1 zeigt die Aminoaktivierung der Oberfläche durch Silylierung, RFPD oder ω-Aminoalkylthiol-SAM. Schritt 2 beschreibt die durch Anbindung einer Dicarbonsäure erhaltene carboxylierte Oberfläche. An diese Oberfläche wird im Schritt 3 ein polyfunktionalisiertes Amino-Dendrimer fixiert. Typischerweise wird hierfür ein Dendrimer der 4. Generation mit 64 Aminogruppen verwendet. Die abschließende Endgruppenaktivierung und das Crosslinking der fixierten Dendrimere kann aus Schritt 4 ersehen werden. Aus Übersichtsgründen nicht dargestellt ist das auch intramolekular auftretende Crosslinking von Aminoendgruppen.
Abb. 2: Dargestellt ist eine Dendrimer-basisierte, Isothiocyanat-funktionalisierte Sensoroberfläche, die mit bioorganischen Makromolekülen beladen ist. Bei den Makromolekülen handelt es sich um amino-funktionalisierte Oligonucleotide. Derartige Sensoroberflächen sind von besonderem Interesse für die DNA-Chiptechnologie 25. Die Anbindung der Oligonucleotide erfolgt wie unter Verfahren bei 3 beschrieben; die Regeneration kann beispielsweise im alkalischen Medium erfolgen (50 mM NaOH, RT, 2 × 3 min).
Abb. 3: Mit Bezug auf Homogenität und Beladungsdichte vergleichende Darstellung eines DNA-Arrays mit konventionellem linearem Linker und eines, durch erfindungsgemäße Oberflächenmodifikation erhaltenen DNA- Arrays.
Die Abb. 3-1 zeigt einen DNA-Array, dessen 5'-aminomodifizierte Fängeroligonucleotide über einen linearen Linker oberflächen-fixiert sind. Die Aktivierung der Oberfläche wurde folgendermaßen durchgeführt: nach Silylierung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan wie unter Verfahren bei 1 beschrieben wurde 1,4-Phenylendiisothiocyanat angebunden. Die einzelnen Spots wurden mit einer piezokeramischen Pipette (Gesim) auf den Array aufgetragen. Die Spots einer senkrechten Reihe wurden jeweils mit dem gleichen Volumen an Fängeroligonucleotidlösung erzeugt: Reihen 1-4, 9-­ 12 = 2 nl; 5-8, 13-16 = 4 nl. Innerhalb der waagerechten Spotreihen 1-16 wurden verschiedene Additive zur Fängeroligolösung gegeben.
Abb. 3-2 zeigt einen DNA-Array mit einer erfindungsgemäßen Sensoroberfläche. Der Modifikationsweg ist unter Verfahren beschrieben. Immobilisiert wurde das gleiche Fängeroligonucleotid wie im Falle des Array aus Abb. 3-1. Das Spotvolumen innerhalb der Reihen 1-16 wurde variiert: obere 7 Spots: 2 nl; untere 8 Spots: 4 nl. Innerhalb der waagerechten Spotreihen 1-16 wurden verschiedene Additive zur Fängeroligolösung gegeben.
In beiden Fällen wurde 1 h lang bei RT mit einer 1 nM Lösung der 3'-Cy5- markierten, komplementären Nucleinsäure hybridisiert. Die Array- Auswertung erfolgte durch Fluoreszenz-Anregung und Auslesung mit einer handelsüblichen CCD-Kamera.
Der Array aus Abb. 3-1 zeigt deutliche Inhomogenitäten in der Signalintensität innerhalb der senkrechten Reihen 1-16, obwohl aufgrund identischer Bedingungen die gleiche Intensität zu erwarten ist. Dieser Effekt ist auf eine inhomogene Oberflächenmodifikation zurückzuführen und würde eine quantitative Auswertung des Arrays nicht erlauben.
Hingegen weisen die einzelnen Signale des Arrays aus Abb. 3-2 innerhalb einer senkechten Reihe nahezu die gleiche Intensität auf. Die Homogenität der Oberflächenmodifikation ist durch das erfindungsgemäße Verfahren also deutlich verbessert.
Die unterschiedliche Beladungsdichte mit Fängeroligonucleotiden wird aus den verschiedenen Belichtungszeiten während der Aufnahme deutlich. Für die Aufnahme Abb. 3-1 waren 120 sec notwendig, um Signale detektieren zu können; für Aufnahme Abb. 3-2 lediglich 10 sec.
Abb. 4: Mit Bezug auf Regenerationsstabilität vergleichende Darstellung eines DNA-Arrays mit konventionellem linearem Linker und eines durch erfindungsgemäße Oberflächenmodifikation erhaltenen DNA-Arrays.
Der dargestellte DNA-Array aus Abb. 4-1 bis 4-3 besitzt einen linearen Linker, während der Array aus den Abb. 4-4 bis 4-8 eine erfindungsgemäße Sensoroberfläche aufweist. Die Oberflächenmodifikation und Hybridisierung der Arrays erfolgte so wie unter Ausführung zu Abb. 3 beschrieben. Bespottet wurden jeweils Quadrupole mit variierenden Volumina von 1,4-5,6 nl. Regeneriert wurde 2 × 3 min mit 50 mM NaOH bei RT.
Abb. 4-1 zeigt den Array mit linearem Linker nach der ersten Hybridisierung, Abb. 4-2 zeigt den Array nach der Regeneration und Abb. 4-3 zeigt den Array nach der zweiten Hybridisierung. Deutlich ist zu sehen, daß bereits nach dem ersten Regenerationsschritt die Signalintensität stark verringert ist. Ursache ist die Ablösung des Fängeroligonucleotides während des Regenerationsprozesses aufgrund eines instabilen Linkers.
Abb. 4-4 bis 4-8 zeigen die durch das erfindungsgemäße Verfahren verbesserten Regenerationseigenschaften. Durch den wiederholten Regenerationsprozeß kann keine Abnahme der Signalintensität beobachtet werden.
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15 RFPE Radiofrequenzplasmaentladung
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23 Glodde, M.; Hartwig, A; Hennemann, O.-D.; Stolbrer, W.-D. Intern. J. of Ahesion & Adhesivs 18 359-364 (1998)
24 Sieval, A. B. et al.; Langmuir 14 (7) 1759-1768 (1998)
25 Niemeyer, C. M.; Blohm, D. Angew. Chem. 111/19 3039-3043 (1999)

Claims (21)

1. Verfahren zur Herstellung aktivierter Oberflächen zur hocheffizienten Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierte Oberfläche unter Zuhilfenahme dendrimerer Makromoleküle erzeugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oberfläche zunächst durch Standardmethoden mit einer reaktiven Initiator-Gruppe modifiziert wird, an die die dendrimeren Makromoleküle angekuppelt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der reaktiven Initiator-Gruppe um chemisch reaktive Gruppen wie Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Aldehyd- oder Epoxy- oder Thiolgruppen oder um biologisch reaktive Gruppen wie Disulfide, Metallchelate, Peptide oder Haptene, wie beispielsweise Biotin-, Digoxigenin-, Dinitrophenylgruppen oder ähnlichen Gruppen handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Oberfläche an die die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelt wird um Trägermaterialien auf der Basis von Metallen, Halbmetallen, Halbleitermaterialien, Metall- und Richtmetalloxiden, Kunststoffen, organische und anorganische Polymere oder auf diese Materialien aufgezogene organische und anorganische Filme und Gele handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den an die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelten dendrimeren Makromolekülen um Komponenten handelt, die mehrere gleiche oder ungleiche reaktive Gruppen enthalten.
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den an die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelten dendrimeren Makromolekülen um Starburst-Dendrimere und deren chemisch und biochemisch modifizierte Derivate, Metallodendrimere, Glycosyl­ haltige Dendrimere, Saccharid- und Oligosaccharid-Dendrimere und deren Derivate, Peptid- und Oligopeptid-Dendrimere und deren Derivate oder um Nucleotid- und Oligonucleotid- Dendrimere und deren Derivate handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den an die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelten dendrimeren Makromolekülen um vorab synthetisierte Komponenten handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den an die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelten dendrimeren Makromolekülen um Komponenten handelt, die in-situ durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen durch einen parallelen Prozess aufgebaut werden, beispielsweise durch die Selbstorganisation auf der Basis von Wasserstoffbrücken-Bindung, Van-der-Waals-, Coulomb- oder Metall-Ligand Wechselwirkung.
9. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den an die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelten dendrimeren Makromolekülen um Komponenten handelt, die in-situ durch einen sukzessiven Prozess über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen wie beispielsweise der Selbstorganisation durch Wasserstoffbrücken- Bindung, Coulomb-Wechselwirkung oder der Metall-Ligand Wechselwirkung aufgebaut werden.
10. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen­ gebundenen dendrimeren Makromoleküle mit homobifunktionalen Linkermolekülen aktiviert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den homobifunktionalen Linkermolekülen um photochemisch, chemisch, biochemisch oder biologisch aktive Verbindungen wie beispielweise p-Phenylendiisothiocyanat, Bis-[β-(4- azidosalicylaniido)ethyl]disulfide, 1,4-Bis-Maleimidoalkane, Disuccinimidylglutarat, 1,6- Hexan-bis-vinylsulfon, handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen­ gebundenen dendrimeren Makromoleküle mit heterobifunktionalen Linkermolekülen aktiviert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den heterobifunktionalen Linkermolekülen um photochemisch, chemisch, biochemisch oder biologisch aktive Verbindungen wie beispielweise 3-[(2-Aminoethyl)dithio]propionsäure, N-α- Maleimidoacetoxy]succinimid, 4-[p-Azidosalicylamido]butylamin, N-[(β-Malimido­ propoyloxy]succinimid, N-[κ-Malimidoundecansäure]hydrazid, Succinimidyl-6-[3-(2- pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, N-Succinimidyl-iodoacetat handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen­ gebundenen dendrimeren Makromoleküle mit Hilfe der bifunktionalen Linkermoleküle quervernetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen­ gebundenen dendrimeren Makromoleküle zur Immobilisierung von bioorganischen Komponenten verwendet werden.
16. Verfahren nach Anspruch 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu immobilisierenden Komponenten um biologische Makromoleküle, wie Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Membranproteine, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren oder andere Biomoleküle handelt.
17. Verfahren nach Anspruch 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu immobilisierenden Komponenten um organisch-chemische oder anorganisch-chemische Gruppen mit spezifischen katalytischen, optischen oder elektrischen Eigenschaften handelt.
18. Verfahren nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Sensorelemente hergestellt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Reaktorelemente hergestellt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Elemente mit elektrischen, elektronischen oder optischen Funktionen hergestellt werden.
21. Verfahren nach Anspruch 1-20, dadurch gekennzeichnet, daß die zu immobilisierenden Makromoleküle im ersten Schritt an die dendrimeren Makromoleküle gekuppelt werden, um anschließend auf der mit einer reaktiven Initiator-Gruppe modifizierten Oberfläche immobilisiert zu werden.
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