EP1230213A1 - Artikel mit aktivierter oberfläche zur immobilisierung von makromolekülen und verfahren zur herstellung solcher artikel - Google Patents

Artikel mit aktivierter oberfläche zur immobilisierung von makromolekülen und verfahren zur herstellung solcher artikel

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Publication number
EP1230213A1
EP1230213A1 EP01925501A EP01925501A EP1230213A1 EP 1230213 A1 EP1230213 A1 EP 1230213A1 EP 01925501 A EP01925501 A EP 01925501A EP 01925501 A EP01925501 A EP 01925501A EP 1230213 A1 EP1230213 A1 EP 1230213A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dendrimeric
dendrimers
article
macromolecules
basic units
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01925501A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rüdiger BENTERS
Christof Niemeyer
Dieter WÖHRLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chimera Biotec GmbH
Original Assignee
Chimera Biotec GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chimera Biotec GmbH filed Critical Chimera Biotec GmbH
Publication of EP1230213A1 publication Critical patent/EP1230213A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to articles, in particular sensors, with an activated surface for immobilizing, in particular, bioorganic macromolecules, and to processes for their production.
  • the methods according to the invention include, in particular, methods for generating activated sensor surfaces for the highly efficient covalent immobilization, in particular of bioorganic macromolecules.
  • silicon dioxide surfaces can be activated by coating with an N-alkylamino-silane for the coupling of bioorganic macromolecules (Chrisey, L; O ' Ferrall, CE; Spargo, BJ; Dulcey, CS; Calvert, JM Nucleic Acids Research 24/15 3040-3047 (1996)).
  • the macromolecule to be immobilized contains thiol groups, direct coupling through chemisorption to the gold surface is possible, cf. DE 19807339 A1.
  • Glass surfaces can be functionalized by using suitable silanes. Glass surfaces activated with epoxyalkylsilane are frequently used to immobilize hydroxyl- or amino-functionalized biomolecules (see US Pat. No. 5,919,626), while thiolated macromolecules can be coupled to thiolsilane-activated surfaces via disulfide bridges (see US Pat. No. 5,837,860). Another possibility is to use surfaces coated with avidin / streptavidin, which have a high affinity for biotinylated substances (cf. DE 3640412 A1; DE 19724787 A1).
  • Beier et al. describes a method with which it is possible to increase the number of potential binding sites for macromolecules on the sensor surface through the in-situ construction of branched linker systems (see Beier, M .; Hoheisel, JD Vol27 / No9, 1970-1977 (1999 )).
  • silation, RFPE radio frequency plasma discharge in ammonia, etc.
  • a first (partial) object of the present invention was to provide an article, in particular a sensor, with an activated surface that has a high density reactive coupling groups and also has a high physical-chemical stability to thermal and chemical regeneration steps.
  • a third (partial) object of the present invention was to provide a corresponding method for producing an article (in particular a sensor) with a bioorganic macromolecule immobilized on the surface.
  • the first (partial) object is achieved by an article with an activated surface for immobilizing, in particular, bioorganic macromolecules, comprising an substrate with a surface, a dendrimeric framework linked to the substrate surface and a number of first linked to the dendrimeric framework
  • Coupling groups e.g. NHS or isothiocyanate groups
  • the article can in particular be a (bio) sensor or sensor element, such as a DNA microarray, a protein array of antibodies, receptors and / or enzymes, a test array of peptides, peptoids, or low-molecular compounds such as Act pharmacophores or other active ingredients.
  • a (bio) sensor or sensor element such as a DNA microarray, a protein array of antibodies, receptors and / or enzymes, a test array of peptides, peptoids, or low-molecular compounds such as Act pharmacophores or other active ingredients.
  • the dendrimeric scaffold can comprise a large number of identical or different first coupling groups (e.g. NHS esters, isothiocyanate groups, nucleic acid strands or the like).
  • first coupling groups e.g. NHS esters, isothiocyanate groups, nucleic acid strands or the like.
  • sensors should often be able to detect a wide variety of analytes, and it then makes sense to offer these different analytes different first coupling groups.
  • the substrate surface is linked to the dendrimeric scaffold via a linking unit, which (in the manufacture of the article, see below) by reaction of an initiator group assigned to the substrate surface with a complementary functional group assigned to the dendrimeric scaffold.
  • a linking unit which (in the manufacture of the article, see below) by reaction of an initiator group assigned to the substrate surface with a complementary functional group assigned to the dendrimeric scaffold.
  • the linking unit is an amide.
  • the dendrimeric skeleton can in particular comprise the following dendrimeric basic units, which can be crosslinked in the dendrimeric skeleton: starburst dendrimers and their in particular chemically or biochemically modified derivatives, metallodendrimers, carbosilane dendrimers, polysilane dendrimers, glycosyl-containing saccharide chargers and dendrimers - Dendrimers and their derivatives, peptide and oligopeptide dendrimers and their derivatives as well as nucleotide and oligonucleotide dendrimers and their derivatives.
  • the dendrimeric framework advantageously carries first coupling groups for immobilizing, in particular, bioorganic macromolecules or other substances which (during the manufacture of the article, see below) can be formed by reacting a functional group assigned to the dendrimeric framework with a homo- or heterobifunctional linker substance (linker molecule) , If the functional group assigned to the dendrimeric skeleton is, for example, an amino function and the linker substance is the homobifunctional substance phenylene-1,4-diisothiocyanate, the dendrimeric skeleton carries an isothiocyanate group as the first coupling group. Further examples of linker substances are given below in connection with the explanation of the production process according to the invention.
  • the dendrimeric framework advantageously comprises dendrimeric basic units linked to the substrate surface, which are cross-linked to one another, for example with the aid of bifunctional linker substances (linker molecules).
  • the second (partial) object is achieved by a method for producing an article with an activated surface for immobilizing, in particular, bioorganic macromolecules, with the following steps:
  • dendrimeric basic units in particular the basic units of a dendrimeric framework
  • the article produced is then usually an article as described in more detail above.
  • the substrate surface is usually first modified with a reactive initiator group, ie. the initiator group is connected to an (unmodified) substrate surface, before the (modified) substrate surface is then linked (and thus further modified) to the dendrimeric framework in a subsequent step.
  • the substrate surface can be modified using standard methods, cf. Fig. 6.
  • the reactive, surface-bound initiator group can be selected from one of the following chemically reactive groups: hydroxyl, amino, carboxyl, acyl halide, ester, aldehyde, epoxy or thiol group. It can also be selected from one of the following biologically or chemically reactive groups: disulfides, metal chelates, nucleotide and oligonucleotides, peptides or haptens, such as, for example, biotin, digoxigenin, dinitrophenyl groups or similar groups.
  • the (unmodified) substrate surface to which the reactive initiator group is coupled will preferably be selected from the following group: consists of: carrier materials based on metals, semimetals, semiconductor materials, metal and non-metal oxides; glasses; plastics; organic and inorganic polymers; organic and inorganic films and gels, in particular as a coating for one of the aforementioned materials.
  • the dendrimeric framework which is usually linked to it via the reactive initiator group of a modified substrate surface, can comprise several identical or different functional groups per basic dendrimer unit. These are preferably aminoalkyl, hydroxyalkyl or carboxyalkyl groups which are bonded in the periphery of the dendrimeric base unit and can be converted into the first coupling group with the aid of the linker substance.
  • the dendrimeric basic units can preferably be selected from the following group, which consists of: starburst dendrimers and their chemically and biochemically modified derivatives, metallodendrimers, glycosyl-containing dendrimers, saccharide and oligosaccharide dendrimers and their derivatives, peptide and oligopeptide dendrimers and their derivatives and nucleotide and oligonucleotide dendrimers and their derivatives.
  • the dendrimers to which the basic dendrimeric units correspond in the finished article according to the invention are generally synthesized in a conventional manner before carrying out the process according to the invention (Zeng, F .; Zimmerman, SC; Chem. Rev. 97, 1681-1712 (1997)) and provided for performing the method according to the invention.
  • the dendrimeric basic units ie the educt dendrimers or the dendrimeric skeleton formed therefrom
  • the dendrimeric basic units are equipped with a number of coupling groups for immobilization, in particular bioorganic macromolecules, by reacting functional groups assigned to the dendrimeric basic unit with a homo- or heterobifunctional linker substance (linker molecule).
  • the dendrimeric base units can be equipped with the first coupling groups before or after the substrate surface is linked to the dendrimeric base units.
  • homobifunctional linker substances that can be used are: photochemically, chemically, biochemically or biologically active compounds such as, for example, dicarboxylic acids and their anhydrides, disuccinimidyl glutarate,
  • heterobifunctional linker substances can be used in particular: photochemically, chemically, biochemically or biologically active compounds such as, for example, 3 - [(2-aminoethyl) dithio] propionic acid, ⁇ / - ⁇ -
  • a process design (and accordingly the resulting articles) is particularly preferred in which the surface-bound dendrimeric base units are crosslinked with the aid of homobifunctional linkers, with the exception of carboxylic acid anhydrides, so that a polymeric thin film is formed Basic dendrimeric units are created.
  • the linker substances are preferably but not necessarily the same ones that are used to generate the coupling groups; reference is made to the above explanations regarding preferred linker substances.
  • a process design (and accordingly the resulting articles) is particularly preferred in which the first coupling group is generated with the aid of heterobifunctional linkers or with carboxylic acid anhydrides.
  • each functional group of the dendrimeric base unit is converted into an active coupling group; reference is made to the above explanations regarding preferred linker substances.
  • dendrimers dendrimeric basic units
  • linker substances in particular with a view to the substances to be immobilized and with a view to good crosslinking of the dendrimeric basic units.
  • a macromolecular surface is built up from the surface-fixed dendrimers by covalent crosslinking.
  • the surfaces generated in this way have two decisive advantages compared to common linear linker systems. Due to the (covalent) cross-linking of the immobilized dendrimers, the surfaces have an increased physicochemical stability and thus enable the loss-free regenerability of the surfaces loaded with bioorganic macromolecules (for example sensor surfaces). Furthermore, the immobilization efficiency is drastically increased by using polyfunctionalized dendrimers.
  • a process design is particularly preferred in which the construction of the dendrimeric framework and thus an essential step in the production of articles according to the invention, for example the construction of aminodendrimer Sensor surfaces, via a sandwich preparation.
  • two substrates activated in each case for example by aminosilylation and subsequent activation using, for example, disuccinimidyl glutarate, for example two glass slides with an area of approximately 3 ⁇ 8 cm (any other sizes can also be used), are put together in pairs that the immobilization of the dendrimer can take place in the space between the two substrates (for example glass substrates).
  • the sandwich preparation can also be used to produce the first coupling group by applying a saturated solution of the linker substance, for example glutaric anhydride or 1,4-phenylenediisothiocyanate, to the substrates coated with dendrimeric units
  • a particularly advantageous embodiment of the method according to the invention consists in initially modifying large planar substrates, the area of which corresponds, for example, to a multiple of a desired chip surface, using the steps described above with dendrimer layers. Typically, this is done in such a way that a grid of the chip formats to be produced is first applied to known glass, for example 100 cm ⁇ 100 cm large glass panes (or corresponding panes of other substrates; significantly larger panes can also be used) by breaking edges are generated on which the glass pane (or the other substrate) can later be divided into the final chip format.
  • the chemical modification is then usually carried out by carrying out the steps described above (and in the examples below), for example cleaning, silylation and activation steps, for example in immersion baths.
  • the dendrimer is advantageously applied using the sandwich technique mentioned above, and the final activation of the dendrimers by means of homo- or heterobifunctional linkers is preferably carried out in sandwich or immersion treatment.
  • the large-area substrate wafers are then separated into the final format.
  • the large-area dendrimer-coated disks can first be cut up and only then activated as required using bifunctional linkers.
  • a cross-linked dendrimeric framework with free coupling groups as a macromolecular (intermediate) layer on a substrate surface (see FIG. 1), whereby (a) the number of potential binding sites for the immobilization of bioorganic macromolecules or other substances, (b) the physicochemical stability of the surface is improved and (c) the regenerability of the substrate surfaces (carrier) modified with the bioorganic macromolecules is improved.
  • the present invention also relates to articles which are obtainable by the process according to the invention (including the special process designs specified above).
  • the articles according to the invention comprise functionalized solid phases and can be used, for example, as sensor elements, reactor elements and elements with electrical, electronic or optical functions.
  • the articles functionalized with bioorganic molecules can also be used advantageously as solid phases in enzyme reactors, in which a high level of physical and chemical resistance and high occupancy densities are required.
  • resistant surfaces can also be used advantageously to build up electronic and optically active elements, for example for high-resolution displays.
  • the third (sub) task is finally solved by a method for producing an article with a (macro or other) molecule immobilized on the surface, with the following step:
  • bioorganic macromolecules In addition to bioorganic macromolecules, other substances such as macromolecular colloids and nanoparticles or low-molecular compounds such as pharmacological substances, hormones, antigens or other active substances can also be immobilized on appropriately prepared articles (a or b) according to the invention.
  • the invention also relates to articles comprising a (macro or other) molecule linked to the dendrimeric backbone.
  • the (macro) molecule can be, for example, one selected from the group consisting of: antibodies, in particular the classes IgG, IgM, IgA, enzymes; receptors; Membrane proteins, glycol proteins; carbohydrates; nucleic acids; such as. DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), pyranosyl ribonucleic acid (pRNA).
  • other substances includes in particular organic-chemical or inorganic-chemical groups with specific or also potentially active pharmacological, catalytic (for example photocatalytically active substances such as porphyrins and their derivatives or catalysts for the stereoselective transformation of organic or inorganic substrates), optical or electrical properties (eg fluorescent, electroluminescent or electrically conductive polymers (polyaniline, polypyrrole) compounds.
  • catalytic for example photocatalytically active substances such as porphyrins and their derivatives or catalysts for the stereoselective transformation of organic or inorganic substrates
  • optical or electrical properties eg fluorescent, electroluminescent or electrically conductive polymers (polyaniline, polypyrrole) compounds.
  • Substance libraries which are accessible, for example, by combinatorial solid-phase synthesis, are immobilized on the article in order to screen the functionality of these bound substances, for example their inhibitory action on biological enzymes or receptors.
  • the basis of the present invention is, among other things, the surprising observation that nucleic acid-functionalized glass surfaces, which were produced by the method according to the invention, not only have a drastically improved detection limit in the detection of complementary nucleic acids, but also show a significantly increased physicochemical stability that the regenerability of the nucleic acid-modified supports could be carried out many times by treatment with alkaline washing solutions without loss of activity on the surface. It was found that the articles produced by the process according to the invention have a significantly improved physicochemical stability and thus the loss-free regenerability of the carriers modified with the bioorganic macromolecules is possible.
  • the chemical nature of the dendrimeric basic units means that the linker system for the connection of the bioorganic macromolecules is highly flexible, which results in additional advantages over linear linker systems in terms of the efficiency of the heterogeneous affinity reaction.
  • a cross-linked dendrimeric framework with free coupling groups as a macromolecular (intermediate) layer on a substrate surface (cf. FIG. 1).
  • the attachment of the macromolecular layer is achieved, for example, by treating a glass surface (for example amino-, epoxy- or carboxyl-modified (as substrate surface) produced by standard processes) first with a dendrimeric macromolecule and then with a homo- or heterobifunctional linker reagent.
  • a glass surface for example amino-, epoxy- or carboxyl-modified (as substrate surface) produced by standard processes
  • a homo- or heterobifunctional linker reagent By connecting the dendrimeric component to the modified glass surface, the number of binding sites for the immobilization of bioorganic macromolecules (eg certain nucleic acids) is increased.
  • the dendrimer units linked to the substrate surface are used for the immobilization of the activated bioorganic macromolecules, ie equipped with free coupling groups and (b) covalently cross-linked the dendrimer units.
  • Bioorganic macromolecules can be immobilized very stably on the surface of an article produced in this way.
  • a glass substrate with a surface based on silicon dioxide was provided.
  • the glass surface was cleaned thoroughly (CH2CI2 - H2O2 / H2SO4 + ultrasound ⁇ Bidest).
  • the glass surface was then silylated (cf. FIG. 1; step 1) with 3-aminopropyltriethoxysilane in ethanol / water (95: 5) using a method described in the literature (Maskos, U .; Southern EM; Nucleic Acids Res ., 20 (7), 1679-1684 (1992) (other silylation processes are also applicable).
  • the aminosilylated glass surface prepared according to 1.1 was carboxy-functionalized with a 10 mM solution of disuccinimidyl glutarate in CH2Cl2 / n-ethyldiisopropylamine (100: 1) for 2 h at RT under argon (cf. Fig. 1, step 2). The surface was then thoroughly washed several times with CH2CI2. The carboxy group introduced in this way could then be used as an initiator group
  • the surface was covered with a 10% solution of an aminodendrimer (Fa. Aldrich Chem. Co, sold under the trade name Starburst (PAMAM), see also Yamakawa, Y et al. J. of Polymer Science: Part A 37 3638-3645 (1999) ) wetted in methanol (see Fig. 1, step 3).
  • PAMAM Starburst
  • This step can be carried out, for example, using the advantageous sandwich method already described.
  • After a reaction time of 30 minutes reaction of the carboxy groups with the amino groups of the dendrimer), the excess of dendrimer was removed by washing and the (glass carrier) surface now provided with dendrimer was dried in a stream of nitrogen.
  • the glass supports equipped with dendrimer in accordance with 1.3 were transferred into a 20 mM solution of a homobifunctional linker molecule, for example phenylene-1,4-diisothiocyanate, in CH2Cl2 / pyridine (100: 1) (cf. FIG. 1, step 4). After a reaction time of 30 minutes, the mixture was washed thoroughly with CH2Cl2.
  • the glass slide with a dendrimer surface could now be used directly for the immobilization of bioorganic macromolecules described in more detail below, or alternatively it could be kept under argon until use.
  • the surface prepared according to 1.4 was wetted with drops of an aqueous solution which contained a bio-organic macromolecule to be immobilized in a typical concentration range of 1 - 100 ⁇ M.
  • the bio-organic component was, for example, 5'-amino modified oligonucleotides, such as those available from a variety of commercial suppliers.
  • the wetted surfaces were incubated in a humidity chamber for several hours.
  • the optimal incubation time was dependent on the type and concentration of the component to be immobilized.
  • the glass carrier element was, for example, transferred to a 6-aminohexanol solution (100 mM in dimethylformamide (DMF)) in order to inactivate still active isothiocyanate groups of a phenylene diisothiocyanate linker (see 1.4 above).
  • the glass carrier surface was then freed of non-covalently bound bio-organic macromolecules with detergent-containing solutions, for example sodium dodecyl sulfate, then rinsed several times in bidistilled water and dried in a stream of N2.
  • the loaded sensors were stored at - 20 ° C until use.
  • Dendrimer-based, isothiocyanate-functionalized surfaces which are loaded, for example, with amino-functionalized oligonucleotides, are of particular interest as sensor surfaces for DNA chip technology, cf. Niemeyer, CM .; Blohm, D. Angew. Chem. 111/19 3039-3043 (1999). See also Fig.2 and the associated explanations in this context.
  • Example 1 The amination of a glass-based carrier was carried out as described in Example 1 under 1.1.
  • a carboxy-terminated dendrimer (trade name Starburst (PAMAM) dendrimer; Aldrich Chem. Co) was first used by known methods, for example as described by Johnsson, B .; Löfas, S .; Lindquist, G. Anal. Biochem. 198 268-277 (1991), esterified in the presence of dicyclohexylcarbodiimide / N-hydroxysuccinimd.
  • the activated dendrimer was placed in DMF on the aminosilylated surface and after a reaction time of 30 minutes the excess dendrimer was washed off with DMF.
  • the surfaces could then be used directly, as described in Example 1, for the immobilization of bioorganic macromolecules.
  • the activated surfaces could be stored under argon.
  • Example 1, 1.1 The glass surfaces are cleaned as described in Example 1, 1.1.
  • hydrolysis-stable silanes such as 3-carboxypropyltrialkoxysilane
  • the silanization is carried out as indicated in Example 1, 1.1.
  • it is a hydrolysis-sensitive silane, such as, for example, 3-glycidoxypryopyltrimethoxysilane, 2- (3,4-epoxycyclohexyl) ethyltriethoxysilane, 3-iodopropyltrimethoxysilane, 3-isothiocyanatotrialkoxysilane and the corresponding trihalosilanes
  • the silanization of the literature is preferably described under dry conditions such as in the literature and dry conditions (Southern, EM et al .; Nucleic Acids Res., 22 (8), 1368-1373 (1994); other methods are also conceivable.
  • Epoxy, isothiocyanato and iodo-terminated silane surfaces are used directly to bind the amino-functionalized dendrimer while carboxy-functionalized silane surfaces are first activated by reaction with DCC / NHS, as described in Example 7, 7.2
  • the further reaction of the dendrimer surface with a homo- or heterobifunctional spacer to produce the first coupling group and the macromolecules are attached to it as follows under Example 1, 1.4 - 1.5, see above as described in Example 7, 7.4.
  • plastic carriers made of, for example, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, polyacrylonitrile or their copolymers were produced by known methods, for example by the method of Hartwig, A. et al. Advances in Colloid and Interface Science 52, 65-78 (1994) aminated by radio frequency plasma discharge in an ammonia atmosphere.
  • Gold layers were applied in a conventional manner to various supports and aminated by known methods, for example by producing an amino-terminated SAM on gold, as described by Glodde, M .; Hartwig, A .; Hennemann, O.-D .; Stohrer, W.-D. Intern. J. of Ahesion & Adhesivs 18 359-364 (1998).
  • Metal and semiconductor surfaces were aminated using known methods, for example by silylation with amino, epoxy, carboxy or thiolsilanes (see Chrisey, L .; O'Ferrall, CE; Spargo, BJ; Duicey, CS; Calvert, JM Nucleic Acids Research 24/15 3040-3047 (1996) and Bhatia, SK et al. Anal. Biochem. 178, 408-413 (1989)) or by hydrosilylation with ⁇ -undecenecarboxylic acid (Sieval, AB et al .; Langmuir 14 (7) 1759-1768 (1998).
  • Biorganic macromolecules were immobilized as described in Example 1 under 1.5.
  • the aminosilylated glass surface prepared according to 1.1 was carboxy-functionalized with a saturated solution of glutaric anhydride in DMF for 4 h at RT under argon. The surface was then thoroughly washed several times with DMF and water. The free carboxyl groups were then activated with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). For this purpose, the surface was wetted with a solution of 1 M DCC and 1 M NHS in DMF. After a reaction time of 4 hours, the supports were washed thoroughly with DMF and acetone.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the glass supports equipped with dendrimeric basic units according to 1.3 were transferred into a saturated solution of glutaric anhydride in DMF. After a reaction time of 4 hours, the mixture was washed thoroughly with DMF and water. The free carboxyl groups were then activated with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). For this purpose, the surface was wetted with a solution of 1 M DCC and 1 M NHS in DMF. After a reaction time of 4 hours, the supports were washed thoroughly with DMF and acetone.
  • the glass slide with a dendrimer surface could now be used directly for the immobilization of bioorganic macromolecules described in more detail below, or alternatively it could be kept under argon until use.
  • FIGS. 1 and 2 which are explained in more detail below. They represent:
  • Figure 1 Surface modification to produce dendrimer-based, macromolecular sensor surfaces.
  • FIG. 2 attachment of biomolecules to the surfaces according to FIG. 1
  • FIG. 1 shows the surface modification of a glass carrier, plastic carrier or gold-coated carrier (as a substrate), cf. especially Examples 1, 4, 5 and 7.
  • Step 1 shows the amino activation of the surface by silylation, RFPD or ⁇ -aminoalkylthiol-SAM, cf.
  • Example 1 1.1.
  • Step 2 leads to a carboxylated surface by binding a dicarboxylic acid, cf.
  • step 3 a polyfunctionalized amino dendrimer is fixed on this surface.
  • a 4th generation dendrimer with 64 amino groups is typically used for this, cf. Example 1, 1.3.
  • step 4 The final end group activation and crosslinking of the fixed dendrimers can be seen in step 4.
  • the intramolecular crosslinking of amino end groups is not shown, cf. Example 1, 1.4.
  • FIG. 2 shows a dendrimer-based, isothiocyanate-functionalized surface which is loaded with bioorganic macromolecules.
  • the macromolecules are amino-functionalized oligonucleotides.
  • Such surfaces are of particular interest as sensor surfaces for DNA chip technology, cf. Niemeyer, CM .; Blohm, D. Angew. Chem. 111/19 3039-3043 (1999).
  • the oligonucleotides are bound as described in Example 1 under 1.5; regeneration can take place, for example, in an alkaline medium (e.g. under the following conditions: use of 50 mM NaOH, room temperature, 2 x 3 min).
  • Figure 3-1 shows a conventional DNA array carrying 5 ' amino modified capture oligonucleotides which are surface-fixed via a conventional linear linker.
  • the surface was activated as follows: After silylation with 3-aminopropyltriethoxysilane as described in Example 1 under 1.1, 1,4-phenylenediisothiocyanate was bound.
  • the individual spots were applied to the conventional surface with a piezoceramic pipette to form the oligonucleotide array.
  • the concentration of the spotted oligomer solution was 10 ⁇ mol / l in bidest.
  • FIG. 3-2 shows a DNA array according to the invention with a (sensor) surface according to the invention.
  • the spot volume was varied within the respective rows 1-16: upper 7 spots: 2 nl; lower 8 spots: 4 nl.
  • the concentration of the spotted oligomer solution was 10 ⁇ mol / l in bidest.
  • the DNA array shown in FIGS. 4-1 to 4-3 comprises a conventional linear linker, while the array shown in FIGS. 4-4 to 4-8 has a (sensor) surface according to the invention.
  • the surface modification and hybridization of the arrays was carried out as described in Example 7. Quadrupoles with varying volumes of 1.4 - 5.6 nl were scoffed at. Regeneration was carried out in each case 2 ⁇ 3 min with 50 mM NaOH at RT.
  • Fig. 4-1 shows the array with linear linker after the first hybridization
  • Fig. 4- 2 shows the array after the regeneration
  • Fig. 4-3 shows the array after the second hybridization. It can be clearly seen that after the first regeneration step, the signal intensity is greatly reduced. The cause is Detachment of the capture oligonucleotide during the regeneration process due to the inherent instability of the conventional linker.
  • 4-4 to 4-8 show the regeneration properties improved by the method according to the invention. Even after a repeated regeneration process, no decrease in the signal intensity can advantageously be observed.
  • FIG. 5 is a highly schematic illustration of the preferred sandwich preparation technique, see above.
  • FIG. 6 is a highly schematic illustration of a preferred method according to the invention for producing an article with an activated surface for immobilizing macromolecules or other compounds.

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Abstract

Beschrieben werden Artikel mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle, umfassend ein Substrat mit einer Oberfläche, ein mit der Substrat-Oberfläche verknüpftes dendrimeres Gerüst und eine Anzahl von mit dem dendrimeren Gerüst verknüpften ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle. Die Artikel lassen sich durch ein Verfahren mit folgenden Schritten herstellen: Bereitstellen eines Substrates mit einer Oberfläche. Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit einem dendrimeren Gerüst und; Ausrüsten des dendrimeren Gerüstes mit einer Anzahl von ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle.

Description

Artikel mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung von Makromolekülen und Verfahren zur Herstellung solcher Artikel
Die vorliegende Erfindung betrifft Artikel, insbesondere Sensoren, mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen insbesondere Verfahren zur Erzeugung von aktivierten Sensoroberflächen zur hocheffizienten kovalenten Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle.
Der Nachweis von beispielsweise bioorganischen Makromolekülen über Affinitätsreaktionen an Biosensoren erfordert Substrat-Oberflächen, die mit einem Reaktionspartner der wechselwirkenden Biomoleküle beschichtet sind (Festphasen-Methode). Um diesen Reaktionspartner dauerhaft auf einer Sensormatrix (als Beispiel einer Substratoberfläche) fixieren zu können, ist diese zuvor chemisch so zu modifizieren, dass reaktive Kupplungsgruppen zur Immobilisierung bereitgestellt werden. Bei diesen Kupplungsgruppen handelt es sich typischerweise um reaktive Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Aldehyd-, Isothiocyanat- oder Epoxygruppen, die über Spacer kovalent mit der Oberfläche verknüpft sind. Besonders attraktiv, weil kostenminimierend ist es, wenn der Sensor regenerierbar und damit mehrfach verwendbar ist. Deshalb sollte die Immobilisierungsmethode so konzipiert werden, dass die Fixierung der Makromoleküle auf der Oberfläche über kovalente, oxidationsstabile Linkersysteme erfolgt.
Frühere Strategien zur Immobilisierung gehen von linearen Linkern aus. So lassen sich beispielsweise Siliciumdioxid-Oberflächen durch Beschichtung mit einem N- Alkylamino-Silan für die Kupplung bioorganischer Makromoleküle aktivieren (Chrisey, L; O'Ferrall, C.E.; Spargo, B.J.; Dulcey, C.S.; Calvert, J.M. Nucleic Acids Research 24/15 3040-3047 (1996)). Eine andere Möglichkeit besteht darin, Gold-beschichtete Oberflächen einzusetzen, indem die Kupplung der Makromoleküle über eine -f u nktionalisierte Alkylthiol-SAM (SAM=self- assambled-monolayer) (Bardea, A.; Dagan, A.; Willner, I. Anal. Chim. Acta 385, 33-43 (1998)) erfolgt. Enthält das zu immobilisierende Makromolekül Thiol- Gruppen, ist die direkte Kupplung durch Chemisorption an die Goldoberfläche möglich, vgl. DE 19807339 A1. Glasoberflächen lassen sich durch den Einsatz geeigneter Silane funktionalisieren. Zur Immobilisierung von hydroxyl- oder aminofunktionalisierten Biomolekülen werden häufig mit Epoxyalkylsilan aktivierte Glasoberflächen eingesetzt (vgl. US-Patent 5,919,626), während thiolierte Makromoleküle über Disulfidbrücken an Thiolsilan-aktivierte Oberflächen gekuppelt werden können (vgl. US-Patent 5,837,860). Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Avidin / Streptavidin beschichteten Oberflächen, die sich als hochaffin gegenüber biotinylierten Substanzen erweisen (vgl. DE 3640412 A1; DE 19724787 A1).
Die aufgeführten Verfahren sind jedoch optimierungsbedürftig, da sie im allgemeinen nur zu einer geringen Belegungsdichte und einer mangelnden Regenerierbarkeit der so hergestellten Oberflächen führen. Beispielsweise wird die Au-Schwefel-Bindung in Gegenwart von Sauerstoff oxidativ zerstört, Avidin/Streptavidin-Oberflächen werden bei thermischer Regeneration denaturiert und silylierte Glas-Oberflächen sind instabil gegenüber alkalischen Medien mit einem pH > 8 (vgl. Sandoval, J.E. et. al., Anal. Chem. 63, 2634-2641 (1991)). Die durch Silylierung erhaltenen Glas-Oberflächen weisen zudem nur eine geringe Beladungsdichte auf, was häufig zu einer ungenügenden Sensitivität der Sensoren führt (vgl. Southern et al. Nature genetics Supplement 21 , 5-9 (1999)).
Inzwischen gibt es mehrere Arbeiten mit dem Ziel, die Beladungsdichte und Regenerierbarkeit der Oberflächen zu verbessern, z. B. durch den Einsatz von kovalent (vgl. Löfas, S. et al. Pure Appl. Chem. 67, 829-834 (1995)) oder chemisorptiv auf Gold (vgl. Johnsson, B.; Löfas, S.; Lindquist, G. Anal. Biochem. 198, 268-277 (1991)) gebundenen Dextran-Zwischenschichten mit Hydrogeleigenschaften. Die Immobilisierung an diesen Oberflächen erfolgt jedoch statistisch innerhalb der Hydrogelmatrix, was sich nachteilig auf die Zugänglichkeit der immobilisierten Komponente auswirkt, da die heterogene Interphasen- Reaktion durch Diffusionsprozesse limitiert wird (vgl. Southern et al. Nature genetics Supplement 21 , 5-9 (1999)). Dieses Problem tritt auch bei dem Ansatz auf, oberflächenaktivierte Mikropartikel (CPG, Magnetic Beads, Merrifield Harz, etc.) auf den Sensoroberflächen kovalent zu binden, um hierdurch eine Oberflächen-Vergrößerung zu erreichen (vgl. US-Patent 5,900,481). Die so präparierten Oberflächen sind mikroporös und erweisen sich bei Affinitätsreaktionen aufgrund limitierter Diffusion als problematisch.
Von Beier et al. wird ein Verfahren beschrieben, mit dem es gelingt, die Anzahl potentieller Bindungsstellen für Makromoleküle auf der Sensoroberfläche durch den in-situ-Aufbau verzweigter Linkersysteme zu erhöhen (vgl. Beier, M.; Hoheisel, J.D. Vol27/No9, 1970-1977 (1999)). Allerdings ist hierzu, nach vorhergehender Aminierung des Supports (Substrats) (Silylierung, RFPE = Radiofrequenzplasmaentladung in Ammoniak, etc.), die sukzessive Wiederholung einer ca. 1-2 Tage dauernden, 2-stufigen Synthese, gefolgt von einer abschließenden Endgruppenaktivierung, notwendig. Typischerweise sind so 8 und mehr Reaktionsschritte an mehreren Tagen erforderlich, um die aktivierten Oberflächen herzustellen.
Angesichts der bestehenden Nachteile der bekannten Verfahren war eine erste (Teil-)Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Artikels, insbesondere Sensors, mit einer aktivierten Oberfläche, die über eine hohe Dichte an reaktiven Kupplungsgruppen verfügt und zudem eine hohe physikalischchemische Stabilität gegenüber thermischen und chemischen Regenerationsschritten aufweist.
In verfahrensmäßiger Hinsicht war es eine zweite (Teil-)Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Methode anzugeben, die es erlaubt, in wenigen Reaktionsschritten eine derartige aktivierte Oberfläche aufzubauen.
Eine dritte (Teil-)Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Angabe eines entsprechenden Verfahrens zur Herstellung eines Artikels (insbesondere Sensors) mit einem auf der Oberfläche immobilisierten bioorganischen Makromolekül.
Die erste (Teil-)Aufgabe wird gelöst durch einen Artikel mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle, umfassend ein Substrat mit einer Oberfläche, ein mit der Substrat-Oberfläche verknüpftes dendrimeres Gerüst und eine Anzahl von mit dem dendrimeren Gerüst verknüpften ersten
Kupplungsgruppen (also z.B. NHS oder Isothiocyanatgruppen) zur
Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle.
Bei dem Artikel kann es sich insbesondere um einen (Bio-)Sensor oder Sensorelement, wie beispielsweise ein DNA-Mikroarray, ein Protein-Array aus Antikörpern-, Rezeptoren- und/oder Enyzmen, ein Testarray aus Peptiden, Peptoiden, oder niedermolekularen Verbindungen wie Pharmakophore oder andere Wirkstoffe handeln.
Das dendrimere Gerüst kann den Anforderungen des Einzelfalls entsprechend eine Vielzahl von identischen oder unterschiedlichen ersten Kupplungsgruppen (also z.B. NHS-Ester, Isothiocyanatgruppen, Nucleinsäurestränge o.dgl.) umfassen. So sollen Sensoren häufig in der Lage sein unterschiedlichste Analyten nachzuweisen, und es ist dann sinnvoll, diesen unterschiedlichen Analyten unterschiedliche erste Kupplungsgruppen anzubieten.
Vorteilhafterweise ist die Substrat-Oberfläche mit dem dendrimeren Gerüst über eine Verknüpfungseinheit verknüpft, die (bei der Herstellung des Artikels, siehe dazu unten) durch Umsetzung einer der Substrat-Oberfläche zugeordneten Initiator-Gruppe mit einer dem dendrimeren Gerüst zugeordneten komplementären funktioneilen Gruppe gebildet werden kann. War ursprünglich beispielsweise der Oberfläche eine Initiatorgruppe mit einer freien Carboxy-Funktion zugeordnet und war die komplementäre Gruppe des dendrimeren Gerüsts eine Aminofunktion, so handelt es sich bei der Verknüpfungseinheit um ein Amid. Weitere Beispiele für Initiatorgruppen und komplementäre funktioneile Gruppen werden weiter unten im Zusammenhang mit der Erläuterung der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren angegeben. Dem Fachmann ist in Kenntnis der Edukt- Gruppen klar, wie die (Produkt-)Verknüpfungseinheit aufgebaut ist.
Das dendrimere Gerüst kann insbesondere folgende dendrimeren Grundeinheiten umfassen, die im dendrimeren Gerüst miteinander vernetzt sein können: Starburst-Dendrimere und deren insbesondere chemisch oder biochemisch modifizierte Derivate, Metallodendrimere, Carbosilan-Dendrimere, Polysilan- Dendrimere, Glycosyl-haltige Dendrimere, Saccharid- und Oligosaccharid- Dendrimere und deren Derivate, Peptid- und Oligopeptid-Dendrimere und deren Derivate sowie Nucleotid- und Oligonucleotid-Dendrimere und deren Derivate.
Vorteilhafterweise trägt das dendrimere Gerüst erste Kupplungsgruppen zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle oder sonstiger Substanzen, die (bei der Herstellung des Artikels, siehe dazu unten) durch Umsetzung einer dem dendrimeren Gerüst zugeordneten funktionellen Gruppe mit einer homo- oder heterobifunktionellen Linkersubstanz (Linkermolekül) gebildet werden können. Handelt es sich bei der dem dendrimeren Gerüst zugeordneten funktionellen Gruppe beispielsweise um eine Aminofunktion und handelt es sich bei der Linkersubstanz um die homobifunktionelle Substanz Phenylen-1,4- diisothiocyanat, so trägt das dendrimere Gerüst als erste Kupplungsgruppe eine Isothiocyanatgruppe. Weitere Beispiele für Linkersubstanzen werden weiter unten im Zusammenhang mit der Erläuterung der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren angegeben. Dem Fachmann ist in Kenntnis der Edukt- Gruppen klar, wie die erste (Produkt-)Kupplungsgruppe, die bei Einsatz bifunktioneller Linkermoleküle monofunktionell ist, aufgebaut ist. Vorteilhafterweise umfasst das dendrimere Gerüst mit der Substrat-Oberfläche verknüpfte dendrimere Grundeinheiten, die untereinander vernetzt sind, beispielsweise mit Hilfe bifunktioneller Linkersubstanzen (Linkermoleküle). Zu den hieraus resultierenden Vorteilen siehe unten.
Die zweite (Teil-)Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Artikels mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen eines Substrates mit einer Oberfläche
Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit dendrimeren Grundeinheiten (insbesondere den Grundeinheiten eines dendrimeren Gerüsts) und
Ausrüsten des dendrimeren Gerüstes mit einer Anzahl von ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle.
Der hergestellte Artikel ist dann in der Regel ein Artikel, wie er zuvor näher beschrieben wurde.
Die Substrat-Oberfläche wird üblicherweise zunächst mit einer reaktiven Initiator- Gruppe modifiziert, dh. die Initiatorgruppe wird mit einer (unmodifizierten) Substrat-Oberfläche verbunden, bevor dann in einem Folgeschritt die (modifizierte) Substrat-Oberfläche mit dem dendrimeren Gerüst verknüpft (und somit weiter modifiziert) wird. Die Modifikation der Substrat-Oberfläche kann unter Einsatz von Standardmethoden erfolgen, vgl. Fig. 6.
Die reaktive, oberflächengebundene Initiator-Gruppe kann dabei ausgewählt sein aus einer der folgenden chemisch reaktiven Gruppen: Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Acylhalogenid-, Ester-, Aldehyd-, Epoxy- oder Thiolgruppe. Sie kann auch ausgewählt sein aus einer der folgenden biologisch oder chemisch reaktiven Gruppen: Disulfide, Metallchelate, Nucleotide- und Oligonucleotide, Peptide oder Haptene, wie beispielsweise Biotin-, Digoxigenin-, Dinitrophenylgruppen oder ähnliche Gruppen.
Die (unmodifizierte) Substrat-Oberfläche, an die die reaktive Initiator-Gruppe gekuppelt wird, wird vorzugsweise ausgewählt sein aus der folgenden Gruppe, die besteht aus: Trägermaterialien auf der Basis von Metallen, Halbmetallen, Halbleitermaterialien, Metall- und Nichtmetalloxiden; Gläser; Kunststoffe; organische und anorganische Polymere; organische und anorganische Filme und Gele, insbesondere als Beschichtung eines der vorgenannten Materialien.
Das dendrimere Gerüst, welches üblicherweise über die reaktive Initatior-Gruppe einer modifizierten Substrat-Oberfäche mit dieser verknüpft wird, kann mehrere gleiche oder unterschiedliche funktioneile Gruppen pro dendrimerer Grundeinheit umfassen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Carboxyalkyl-Gruppen, die in der Peripherie der dendrimeren Grundeinheit gebunden sind und mit Hilfe der Linkersubstanz in die erste Kupplungsgruppe überführbar sind.
Die dendrimeren Grundeinheiten können vorzugsweise ausgewählt sein aus der folgenden Gruppe, die besteht aus: Starburst-Dendrimere und deren chemisch und biochemisch modifizierte Derivate, Metallodendrimere, Glycosyl-haltige Dendrimere, Saccharid- und Oligosaccharid-Dendrimere und deren Derivate, Peptid- und Oligopeptid-Dendrimere und deren Derivate sowie Nucleotid- und Oligonucleotid-Dendrimere und deren Derivate.
Die Dendrimere, denen im fertigen erfindungsgemäßen Artikel die dendrimeren Grundeinheiten entsprechen, werden in der Regel vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf übliche Weise synthetisiert (Zeng, F.; Zimmerman, S.C.; Chem. Rev. 97, 1681-1712 (1997)) und zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt.
Es kann sich um Dendrimere handeln, die
(a) in-situ durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen durch einen parallelen Prozess, beispielsweise durch die Selbstorganisation auf der Basis von Wasserstoffbrücken-Bindung, Van-der-Waals-, Coulomb- oder Metall-Ligand Wechselwirkung, oder
(b) in-situ durch einen sukzessiven Prozess über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen wie beispielsweise der Selbstorganisation durch Wasserstoffbrücken-Bindung, Coulomb-Wechselwirkung oder der Metall- Ligand Wechselwirkung aufgebaut werden. Vorteilhafterweise werden die dendrimeren Grundeinheiten (d.h. die Edukt- Dendrimere oder das daraus gebildete dendrimere Gerüst) mit einer Anzahl von Kupplungsgruppen zur Immobilisierung insbesondere bioorganischer Makromoleküle ausgestattet, indem der dendrimeren Grundeinheit zugeordnete funktionelle Gruppen mit einer homo- oder heterobifunktionellen Linkersubstanz (Linkermolekül) umgesetzt werden.
Die dendrimeren Grundeinheiten können vor oder nach dem Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit den dendrimeren Grundeinheiten mit den ersten Kupplungsgruppen ausgerüstet werden.
Als homobifunktionelle Linkersubstanzen können insbesondere eingesetzt werden: photochemisch, chemisch, biochemisch oder biologisch aktive Verbindungen wie beispielweise Dicarbonsäuren und deren Anhydride, Disuccinimidylglutarat,
Phenylendiisothiocyanate, ß/s-[ß-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfide, 1 ,4-ß/s-
Maleimidoalkane, 1 ,6-Hexan-b/s-vinylsulfon.
Als heterobifunktionelle Linkersubstanzen können insbesondere eingesetzt werden: photochemisch, chemisch, biochemisch oder biologisch aktive Verbindungen wie beispielweise 3-[(2-Aminoethyl)dithio]propionsäure, Λ/-α-
Maleimidoacetoxy]succinimid, 4-[p-Azidosalicylamido]butylamin, Λ/-[(ß-Malimido- propoyloxyjsuccinimid, Λ/-[κ-Malimidoundecansäure]hydrazid, Succinimidyl-6-[3-
(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Λ/-Succinimidyl-iodoacetat.
In Kenntnis der den dendrimeren Grundeinheiten zugeordneten funktionellen Gruppen und der einzusetzenden bifunktionellen Linkersubstanzen kann der Fachmann präzise vorhersagen, welche Funktionalitäten das dendrimere Gerüst des fertigen Artikels trägt.
Im Hinblick auf eine hohe physikalisch-chemische Stabilität besonders bevorzugt ist eine Verfahrensgestaltung (und sind es dementsprechend die dann resultierenden Artikel), bei der die Oberflächen-gebundenen dendrimeren Grundeinheiten mit Hilfe homobifunktionaler Linkersubstanzen, ausgenommen Carbonsäureanhydride, quervernetzt werden, so dass ein polymerer Dünnfilm aus dendrimeren Grundeinheiten entsteht. Die Linkersubstanzen sind dabei vorzugsweise aber nicht notwendigerweise die gleichen, die zur Erzeugung der Kupplungsgruppen eingesetzt werden; auf die obigen Ausführungen zu bevorzugten Linkersubstanzen wird verwiesen.
Im Hinblick auf eine hohe Immobilisierungskapazität besonders bevorzugt ist hingegen eine Verfahrensgestaltung (und sind es dementsprechend die dann resultierenden Artikel), bei der die erste Kupplungsgruppe mit Hilfe heterobifunktionaler Linkersubstanzen oder mit Carbonsäureanhydriden erzeugt wird. Bei dieser Verfahrensgestaltung wird jede funktionelle Gruppe der dendrimeren Grundeinheit in eine aktive Kupplungsgruppe umgewandelt; auf die obigen Ausführungen zu bevorzugten Linkersubstanzen wird verwiesen.
Die Auswahl von Dendrimeren (dendrimeren Grundeinheiten) und Linkersubstanzen wird der Fachmann dementsprechend insbesondere mit Blick auf die zu immobilisierenden Substanzen und mit Blick auf eine gute Vernetzung der dendrimeren Grundeinheiten vornehmen.
Gemäss der bevorzugten Verfahrensgestaltung wird aus den oberflächenfixierten Dendrimeren durch kovalente Vernetzung eine makromolekulare Oberfläche aufgebaut. Die so generierten Oberflächen weisen im Vergleich zu gängigen linearen Linkersystemen zwei entscheidende Vorteile auf. Durch die (kovalente) Quervernetzung der immobilisierten Dendrimere besitzen die Oberflächen eine erhöhte physikalisch-chemische Stabilität und ermöglichen damit die verlustfreie Regenerierbarkeit der mit bioorganischen Makromolekülen beladenen Oberflächen (beispielsweise Sensor-Oberflächen). Des weiteren wird durch die Verwendung polyfunktionalisierter Dendrimere die Immobilisierungseffizienz drastisch erhöht. In Kombination mit der in der chemischen Natur der Dendrimere begründeten hohen Flexibilität des Linkersystems ergibt sich eine hohe Sensitivität bei heterogenen Affinitätsreaktionen, wie beispielsweise der Hybridisierung von Nucleinsäuren und von Antikörper-Antigen, von Protein-Protein-, von Protein- Ligand- oder von Rezeptor-Substrat Wechselwirkungen.
Besonders bevorzugt ist eine Verfahrensgestaltung, bei der der Aufbau des dendrimeren Gerüsts und somit ein wesentlicher Schritt bei der Herstellung erfindungsgemäßer Artikel, z.B. der Aufbau von Aminodendrimer- Sensoroberflächen, über eine Sandwich-Präparation erfolgt. Wie in Fig. 5 schematisch gezeigt, werden hierbei jeweils zwei z.B. durch Aminosilylierung und anschließende Aktivierung mittels z.B. Disuccinimidylglutarat aktivierte Substrate, beispielsweise zwei Glas-Objektträger einer Fläche von ca. 3 x 8 cm (beliebige andere Größen sind ebenfalls einsetzbar), paarweise so zusammengesetzt, dass die Immobilisierung des Dendrimers im Zwischenraum zwischen den zwei Substraten (z.B. Glasträgern) erfolgen kann. Bei Verwendung von Glas- Objektträgern werden hierzu typischerweise etwa 100 Mikroliter einer 10%igen Lösung des (Amino-)Dendrimers auf die Oberfläche eines der zwei Objektträger aufgetragen, und anschließend durch Auflegen des zweiten Objektträgers der Tropfen der (Amino-)Dendrimer-Lösung gespreitet, so dass sich ein dünner Film der (Amino-)Dendrimer-Lösung zwischen den zwei Substraten ausbildet. Von besonderem Vorteil bei diesem Vorgehen ist einerseits, dass durch den aufgetragenen Dünnfilm die Reaktionsgeschwindigkeit und Homogenität der Oberflächenreaktion verbessert werden, und andererseits, dass nur geringe Mengen der teuren Reagenzienlösungen benötigt werden. Die Sandwich- Präparation kann ebenfalls zur Erzeugung der ersten Kupplungsgruppe angewendet werden, indem eine gesättigte Lösung der Linkersubstanz, z.B. Glutarsäureanhydrid oder 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat auf die, mit dendrimeren Einheiten beschichteten Substrate aufgebracht wird
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, zunächst große planare Substrate, deren Fläche beispielsweise einem Vielfachen einer angestrebten Chip-Oberfläche entspricht, mit Hilfe der oben beschriebenen Schritte mit Dendrimer-Schichten zu modifizieren. Typischerweise wird hierbei so vorgegangen, dass auf beispielsweise etwa 100 cm x 100 cm großen Glasscheiben (oder entsprechenden Scheiben anderer Substrate; einsetzbar sind auch wesentlich größere Scheiben) zunächst durch bekannte physikalische, mechanische oder chemische Verfahren ein Raster der herzustellenden Chipformate aufgebracht wird, indem Bruchkanten erzeugt werden, an denen die Glasscheibe (öder das sonstige Substrat) später in das endgültige Chipformat zerteilt werden kann. Anschließend erfolgt üblicherweise die chemische Modifizierung indem die oben (und in den Beispielen weiter unten) beschriebenen Schritte, also z.B. Reinigungs-, Silylierungs- und Aktivierungsschritte, beispielsweise in Tauchbädern durchgeführt werden. Die Auftragung des Dendrimers erfolgt vorteilhafterweise nach der oben genannten Sandwich-Technik, und die endgültige Aktivierung der Dendrimere mittels homo- oder heterobifunktioneller Linker erfolgt bevorzugt in Sandwich- oder durch Tauchbehandlung. Anschließend erfolgt die Zertrennung der großflächigen Substratscheiben in das entgültige Format. Alternativ können die großflächig Dendrimer-beschichteten Scheiben zunächst zerteilt und erst anschließend, je nach Bedarf, mittels bifunktioneller Linker aktiviert werden.
Der Vorteil dieser Verfahrensgestaltung (inklusive der genannten Alternativen) besteht darin, dass hierdurch eine Maßstabsvergrößerung bei der Herstellung von Chips erreicht wird, so dass große Stückzahlen der aktivierten Chip-Oberflächen mit der vorteilhaften Sandwich-Technik hergestellt werden können.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, auf einer Substrat- Oberfläche ein vernetztes dendrimeres Gerüst mit freien Kupplungsgruppen als makromolekulare (Zwischen-)Schicht anzubringen (vgl. Fig. 1), wodurch (a) die Anzahl potentieller Bindungsstellen für die Immobilisierung von bioorganischen Makromolekülen oder sonstigen Substanzen erhöht, (b) die physikalischchemische Stabilität der Oberfläche verbessert und (c) die Regenerierbarkeit der mit den bioorganischen Makromolekülen modifizierten Substrat-Oberflächen (Träger) verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Artikel, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (inklusive der oben angegebenen besonderen Verfahrensgestaltungen) erhältlich sind.
Die erfindungsgemäßen Artikel umfassen funktionalisierte Festphasen und können beispielsweise als Sensorelemente, Reaktorelemente und Elemente mit elektrischen, elektronischen oder optischen Funktionen eingesetzt werden. So lassen sich die mit bioorganischen Molekülen-funktionalisierten Artikel neben den oben bereits genannten Biosensoren (DNA- und Protein-Arrays) auch vorteilhaft als Festphasen in Enzym-Reaktoren einsetzen, in denen eine hohe physikalischchemische Widerstandsfähigkeit und hohe Belegungsdichten benötigt werden. Wegen der Möglichkeit, DNA-Mikroarrays hoher Integrationsdichte mit anorganischen Kolloiden und Halbleiter-Nanokristallen zu funktionalisieren (vgl. hierzu Niemeyer, Curr. Opin. Chem. Biol., 4, 609 (2000)) lassen sich die widerstandsfähigen Oberflächen auch vorteilhaft zum Aufbau elektronisch- und optisch-aktiver Elemente, beispielsweise für hochauflösende Displays, einsetzen.
Die dritte (Teil-)Aufgabe schließlich wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Artikels mit einem auf der Oberfläche immobilisierten (Makrooder sonstigen) Molekül mit folgendem Schritt:
Kontaktierung eines mindestens eine zweite Kupplungsgruppe umfassenden Makromoleküls
(a) mit einem erfindungsgemäßen Artikel oder
(b) mit einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Artikel mit aktivierter Oberfläche unter Bedingungen, bei denen zumindest eine erste Kupplungsgruppe des Artikels und eine zweite Kupplungsgruppe des Makromoleküls unter Ausbildung einer Verknüpfung zwischen Makromolekül und Artikel miteinander reagieren.
Neben bioorganischen Makromolekülen lassen sich auch andere Substanzen wie makromolekulare Kolloide und Nanopartikel oder niedermolekulare Verbindungen wie pharmakologische Substanzen, Hormone, Antigene oder andere Wirkstoffe auf entsprechend präparierten erfindungsgemäßen Artikeln (a oder b) immobilisieren.
Die Erfindung betrifft auch Artikel, die ein mit dem dendrimeren Gerüst verknüpftes (Makro- oder sonstiges) Molekül umfassen. Das (Makro-)Molekül kann dabei beispielsweise eines sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Antikörpern, insbesondere der Klassen IgG, IgM, IgA, Enzymen; Rezeptoren; Membranproteinen, Glykolproteinen; Kohlenhydraten; Nucleinsäuren; wie z.B. DNA, RNA, Peptid Nucleinsäure (PNA), Pyranosyl-Ribonucleinsäure (pRNA).
Unter den Begriff „andere Substanzen" fallen insbesondere organisch-chemische oder anorganisch-chemische Gruppen mit spezifischen oder auch potentiell wirksamen pharmakologischen, katalytischen (z.B. photokatalytisch aktive Substanzen wie Porphyrine und ihre Derivate oder Katalysatoren für die stereoselektive Umformung organischer oder anorganischer Substrate), optischen oder elektrischen Eigenschaften (z.B. fluoreszente, elektrolumineszente oder elektrisch-leitfähige Polymere (Polyanilin, Polypyrrol) Verbindungen. Auch können Substanzbibliotheken, die beispielsweise durch kombinatorische Festphasensynthese zugänglich sind, auf dem Artikel immoblisiert werden, um die Funktionalität dieser gebundenen Substanzen, z.B. deren Inhibitorwirkung auf biologische Enzyme oder Rezeptoren, zu screenen.
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist unter anderem die überraschende Beobachtung, dass Nucleinsäure-funktionalisierte Glasoberflächen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, nicht nur eine drastisch verbesserte Nachweisgrenze bei der Detektion komplementärer Nucleinsäuren aufweisen, sondern darüber hinaus auch eine deutlich gesteigerte physikalischchemische Stabilität zeigen, so dass die Regenerierbarkeit der Nucleinsäure- modifizierten Träger durch Behandlung mit alkalischen Waschlösungen viele Male ohne Aktivitätsverlust der Oberfläche durchgeführt werden konnte. Es wurde festgestellt, dass die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Artikel eine signifikant verbesserte physikalisch-chemische Stabilität aufweisen und damit die verlustfreie Regenerierbarkeit der mit den bioorganischen Makromolekülen modifizierten Trägern möglich wird. Darüber hinaus bewirkt die chemische Natur der dendrimeren Grundeinheiten, dass das Linkersystem für die Anknüpfung der bioorganischen Makromoleküle hochgradig flexibel ist, wodurch zusätzliche Vorteile gegenüber linearen Linkersystemen hinsichtlich der Effizienz der heterogenen Affinitätsreaktion resultieren.
Wie bereits erwähnt, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auf einer Substrat-Oberfläche ein vernetztes dendrimeres Gerüst mit freien Kupplungsgruppen als makromolekulare (Zwischen-)Schicht anzubringen (vgl. Fig. 1). Die Anbringung der makromolekularen Schicht wird beispielsweise erreicht, indem eine durch Standardverfahren hergestellte, z.B. Amino- , Epoxy- oder Carboxyl-modifizierte Glasoberfläche (als Substratoberfläche) zunächst mit einem dendrimeren Makromolekül und anschließend mit einem homo- oder heterobifunktionalen Linkerreagenz behandelt wird. Durch die Anbindung der dendrimeren Komponente an die modifizierte Glasoberfläche wird die Anzahl der Bindungsstellen für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle (z.B. bestimmter Nucleinsäuren) erhöht. Durch die Behandlung mit dem homobifunktionalen Linkerreagenz werden vorzugsweise (a) die mit der Substrat- Oberfläche verknüpften Dendrimer-Einheiten für die Immobilisierung der bioorganischen Makromoleküle aktiviert, d.h. mit freien Kupplungsgruppen ausgerüstet und (b) die Dendrimer-Einheiten kovalent vernetzt. Bioorganische Makromoleküle lassen sich sehr stabil auf der Oberfläche eines so hergestellten Artikels immobilisieren.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1:
Verfahren zur Herstellung eines Glasträgers mit einem auf der Glasträgeroberfläche angebrachten, gecrosslinktem Dendrimergerüst mit freien Isothiocyanat-Kupplungsgruppen, sowie Immobilisierung eines bioorganischen Makromoleküls durch Ankopplung an die Kupplungsgruppen
1.1 Aminosilylierung einer Glasoberfläche (Oberflächenaktivierung):
Es wurde ein Glasträger mit einer Oberfläche auf der Basis von Siliziumdioxid bereitgestellt. Die Glasoberfläche wurde gründlich gereinigt (CH2CI2 - H2O2/H2SO4 + Ultraschall → Bidest). Danach wurde die Glasoberfläche silyliert (vgl. Fig. 1; Schritt 1), und zwar mit 3-Aminopropyltriethoxysilan in Ethanol / Wasser (95:5) mit einem in der Literatur beschriebenem Verfahren (Maskos, U.; Southern E.M.; Nucleic Acids Res., 20(7), 1679-1684 (1992) (andere Silylierungsverfahren sind ebenfalls anwendbar).
1.2 Carboxyfunktionalisierung der Oberfläche
Die gemäß 1.1 hergestellte aminosilylierte Glasoberfiäche wurde mit einer 10 mM Lösung aus Disuccinimidylglutarat in CH2Cl2/n-Ethyldiisopropylamin (100:1) für 2h bei RT unter Argon carboxyfunktionalisiert (vgl. Fig.1, Schritt 2). Die Oberfläche wurde anschließend mehrfach gründlich mit CH2CI2 gewaschen. Die auf diese Weise eingeführte Carboxygruppe konnte anschließend als Initiatorgruppe eingesetzt werden
1.3 Verknüpfung der Oberfläche mit einem aminoterminierten Dendrimer (Amino-Dendrimer-Immobilisierung)
Die Oberfläche wurde mit einer 10%igen Lösung eines unter dem Handelsnamen Starburst (PAMAM) gehandelten Aminodendrimers (Fa. Aldrich Chem. Co, vgl auch Yamakawa, Y et al. J. of Polymer Science: Part A 37 3638-3645 (1999)) in Methanol benetzt (vgl. Fig.1, Schritt 3). Dieser Schritt kann beispielsweise mit dem bereits beschriebenen, vorteilhaften Sandwich-Verfahren durchgeführt werden. Nach 30minütiger Reaktionszeit (Umsetzung der Carboxygruppen mit den Aminogruppen des Dendrimers) wurde der Uberschuss an Dendrimer durch Waschen entfernt und die nun mit Dendrimer versehene (Glasträger-)Oberfläche im Stickstoffstrom getrocknet.
1.4 Umsetzen mit Linkersubstanz (Erzeugen von freien Kupplungsgruppen und Vernetzen der Dendrimer-Einheiten)
Die gemäss 1.3 mit Dendrimer ausgerüsteten Glasträger wurden in eine 20 mM Lösung eines homobifunktionalen Linkermoleküls, beispielsweise Phenylen-1 ,4- diisothiocyanat, in CH2Cl2/Pyridin (100:1) überführt (vgl. Fig.1 , Schritt 4). Nach 30minütiger Reaktionszeit wurde gründlich mit CH2CI2 gewaschen. Der Glasträger mit Dendrimer-Oberfläche konnte jetzt direkt für eine im folgenden näher beschriebene Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle eingesetzt oder alternativ bis zur Verwendung unter Argon aufbewahrt werden.
1.5. Anknüpfung (Immobilisierung) bioorganischer Makromoleküle - allgemeine Verfahrensvorschrift:
Die gemäss 1.4 vorbereitete Oberfläche wurde mit Tropfen einer wässrigen Lösung benetzt, die ein zu immobilisierendes bioorganisches Makromolekül in einem typischen Konzentrationsbereich von 1 - 100 μM enthielt. Bei der bioorganischen Komponente handelte es sich beispielsweise um 5'-Amino- modifizierte Oligonucleotide, wie sie von einer Vielzahl kommerzieller Lieferanten bezogen werden können.
Die benetzten Oberflächen wurden in einer Feuchtigkeitskammer mehrere Stunden inkubiert. Die optimale Inkubationszeit war dabei abhängig von Art und Konzentration der zu immobilisierenden Komponente.
Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen bei gegebenenfalls vorgesehenen Affinitätsreaktionen wurden die während der Inkubationszeit nicht abreagierten Kupplungsgruppen anschließend deaktiviert. Hierzu wurde das Glasträger- Element zum Beispiel in eine 6-Aminohexanollösung (100 mM in Dimethylformamid (DMF)) überführt, um noch aktive Isothiocyanatgruppen eines Phenylendiisothiocyanatlinkers (siehe 1.4 oben) zu inaktivieren. Die Glasträger- Oberfläche wurde daraufhin mit detergenzhaltigen Lösungen, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, von nicht kovalent angebundenen bioorganischen Makromolekülen befreit, dann mehrmals in bidestilliertem Wasser gespült und im N2-Strom getrocknet. Bis zur Verwendung wurden die beladenen Sensoren bei - 20 °C gelagert.
Dendrimer-basisierte, Isothiocyanat-funktionalisierte Oberflächen, die beispielsweise mit amino-funktionalisierten Oligonucleotiden beladen sind, sind als Sensoroberflächen von besonderem Interesse für die DNA-Chiptechnologie, vgl. Niemeyer, CM.; Blohm, D. Angew. Chem. 111/19 3039-3043 (1999). Vgl. in diesem Zusammenhang auch Fig.2 und die zugehörigen Erläuterungen.
Beispiel 2:
1. Variation: Modifikation von Glasträger-Oberflächen unter Verwendung carboxyterminierter Dendrimere
Die Aminierung eines Trägers auf Glasbasis erfolgte wie in Beispiel 1 unter 1.1 beschrieben. Zum Aufbau einer Carboxydendrimer-Oberfläche wurde zunächst ein carboxyterminiert.es Dendrimer (Handelsname Starburst (PAMAM) Dendrimer; Aldrich Chem. Co) nach bekannten Methoden, beispielsweise wie von Johnsson, B.; Löfas, S.; Lindquist, G. Anal. Biochem. 198 268-277 (1991) beschrieben, in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimd verestert. Das aktivierte Dendrimer wurde in DMF auf die aminosilylierte Oberfläche gebracht und nach 30minütiger Reaktionszeit wurde das überschüssige Dendrimer mit DMF abgewaschen. Die Oberflächen konnten anschließend direkt, wie in Beispiel 1 beschrieben für die Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle eingesetzt werden. Alternativ konnten die aktivierten Oberflächen unter Argon gelagert werden.
Beispiel 3:
2. Variation: Aufbau makromolekularer Sensoroberflächen auf Basis aminoreaktiver Silanoberflächen
Die Reinigung der Glasoberflächen erfolgt wie unter Beispiel 1, 1.1 beschrieben. Im Falle hydrolysestabiler Silane wie 3-Carboxypropyltrialkoxysilan erfolgt die Silanisierung wie unter Beispiel 1, 1.1 angegeben. Sofern es sich um ein hydrolyseempfindliches Silane handelt, wie beispielsweise 3- Glycidoxypryopyltrimethoxysilan, 2-(3,4-Epoxycyclohexyl)-ethyltriethoxysilan, 3- lodopropyltrimethoxysilan, 3-lsothiocyanatotrialkoxysilan und den entsprechenden Trihalogensilanen wird die Silanisierung vorzugsweise unter trockenen Bedingungen wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Southern, E.M. et al.; Nucleic Acids Res., 22(8), 1368-1373 (1994); andere Verfahren ist ebenfalls denkbar. Epoxy-, Isothiocyanato- und lodo-terminierte Silanoberflächen werden direkt zur Anbindung des aminofunktionalisiertem Dendrimer eingesetzt, während carboxyfunktionalisierte Silanoberflächen zunächst durch Umsetzung mit DCC/NHS, wie unter Beispiel 7, 7.2 beschrieben, aktiviert werden. Die weitere Umsetzung der Dendrimeroberfläche mit einem homo-, oder heterobifunktionalem Spacer zur Erzeugung der ersten Kupplungsgruppe und die Anknüpfung der Makromoleküle an diese erfolgt wie unter Beispiel 1 , 1.4 - 1.5, sowie Beispiel 7, 7.4 beschrieben. Beispiel 4:
3. Variation: Verwendung von Kunststoffträgern
Oberflächen von Kunststoffträgern aus beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polycarbonat, Polyacrylnitril oder deren Copolymere wurden nach bekannten Verfahren, beispielsweise nach der Methode von Hartwig, A. et al. Advances in Colloid and Interface Science 52, 65-78 (1994) durch Radiofrequenz- Plasmaentladung in einer Ammoniak-Atmosphäre aminiert.
Der Aufbau Dendrimer-basierter Oberflächen erfolgte dann wie in Beispiel 1, 2 oder 7 beschrieben.
Beispiel 5:
4. Variation: Verwendung von Gold-beschichteten Trägermaterialien
Gold-Schichten wurden auf übliche Weise auf diverse Träger aufgetragen und durch bekannte Verfahren aminiert, beispielsweise indem eine aminoterminierte SAM auf Gold hergestellt wird, wie dies von Glodde, M.; Hartwig, A.; Hennemann, O.-D.; Stohrer, W.-D. Intern. J. of Ahesion & Adhesivs 18 359-364 (1998) beschrieben wurde.
Der Aufbau Dendrimer-basierter Oberflächen und die Anbindung bioorganischer Makromoleküle erfolgte wie in den Beispielen 1-3 beschrieben.
Beispiel 6:
5. Variation: Verwendung von Oberflächen auf der Basis von Silicium und anderen Metall und Halbleiter-Trägermaterialien
Metall- und Halbleiter-Oberflächen wurden mittels bekannter Verfahren aminiert beispielsweise durch Siliylierung mit Amino- , Epoxy- , Carboxy- oder Thiolsilanen (vgl. Chrisey, L.; O'Ferrall, C.E.; Spargo, B.J.; Duicey, C.S.; Calvert, J.M. Nucleic Acids Research 24/15 3040-3047 (1996) und Bhatia, S.K. et al. Anal. Biochem. 178, 408-413 (1989)) oder durch Hydrosilylierung mit ω-Undecencarbonsäure (Sieval, A.B. et al.; Langmuir 14(7) 1759-1768 (1998).
Die jeweiligen aktivierten Oberflächen wurden anschließend entsprechend den Beispielen 1-3 mit einer dendrimeren Komponente modifiziert.
Biorganische Makromoleküle wurden immobilisiert wie in Beispiel 1 unter 1.5 beschrieben.
Beispiel 7:
6.Variation: Verfahren zur Herstellung eines Glasträgers mit einem auf der Glasträgeroberfläche angebrachten , nicht vernetzten Dendrimergerüst mit freien NHS-Ester-Kupplungsgruppen
7.1 Aminosilylierung einer Glasoberfläche (Oberflächenaktivierung): Die Silylierung erfolgte wie in Beispiel 1 unter 1.1 ausgeführt.
7.2 Carboxyfunktionalisierung der Oberfläche
Die gemäß 1.1 hergestellte aminosilylierte Glasoberfläche wurde mit einer gesättigten Lösung aus Glutarsäureanhydrid in DMF für 4h bei RT unter Argon carboxyfunktionalisiert. Die Oberfläche wurde anschließend mehrfach gründlich mit DMF und Wasser gewaschen. Anschließend wurden die freien Carboxylgruppen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert. Hierzu wurde die Oberfläche mit einer Lösung aus 1 M DCC und 1 M NHS in DMF benetzt. Nach 4stündiger Reaktionszeit wurden die Träger gründlich mit DMF und Aceton gewaschen.
Die auf diese Weise eingeführte NHS-Ester-aktiverte Carboxygruppe konnte anschließend als Initiatorgruppe eingesetzt werden
7.3 Verknüpfung der Oberfläche mit einem aminoterminierten Dendrimer (Amino-Dendrimer-Immobilisierung) Die der dendrimeren Grundeinheit mit dem Substrat erfolgte wie in Beispiel 1 unter
1.3 ausgeführt.
7.4 Umsetzen mit Linkersubstanz (Erzeugen von freien Kupplungsgruppen)
Die gemäss 1.3 mit dendrimeren Grundeinheiten ausgerüsteten Glasträger wurden in eine gesättigte Lösung von Glutarsäureanhydrid in DMF überführt. Nach 4stündiger Reaktionszeit wurde gründlich mit DMF und Wasser gewaschen. Anschließend wurden die freien Carboxylgruppen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert. Hierzu wurde die Oberfläche mit einer Lösung aus 1 M DCC und 1 M NHS in DMF benetzt. Nach 4stündiger Reaktionszeit wurden die Träger gründlich mit DMF und Aceton gewaschen. Der Glasträger mit Dendrimer-Oberfläche konnte jetzt direkt für eine im folgenden näher beschriebene Immobilisierung bioorganischer Makromoleküle eingesetzt oder alternativ bis zur Verwendung unter Argon aufbewahrt werden.
Zu den vorstehenden Beispielen 1 - 7 gehören die beigefügten Figuren 1 und 2, die nachfolgend noch näher erläutert werden. Es stellen dar:
Figur 1 : Oberflächenmodifikation zur Erzeugung Dendrimer- basierender, makromolekularer Sensoroberflächen.
Figur 2: Anknüpfung von Biomolekülen an die Oberflächen gemäss Fig. 1
In Figur 1 ist die Oberflächenmodifikation eines Glasträgers, Kunststoffträgers oder Gold-beschichteten Trägers (als Substrat) dargestellt, vgl. insbesondere die Beispiele 1 , 4, 5 und 7.
Schritt 1 zeigt die Aminoaktivierung der Oberfläche durch Silylierung, RFPD oder ω-Aminoalkylthiol-SAM, vgl. Beispiel 1, 1.1. Schritt 2 führt durch Anbindung einer Dicarbonsäure zu einer carboxylierten Oberfläche, vgl. Beispiel 1, 1.2.
An dieser Oberfläche wird gemäss Schritt 3 ein polyfunktionalisiertes Amino- Dendrimer fixiert. Typischerweise wird hierfür ein Dendrimer der 4. Generation mit 64 Aminogruppen verwendet, vgl. Beispiel 1, 1.3.
Die abschließende Endgruppenaktivierung und das Crosslinking der fixierten Dendrimere kann aus Schritt 4 ersehen werden. Aus Übersichtsgründen nicht dargestellt ist die intramolekular auftretende Vernetzung (Crosslinking) von Aminoendgruppen, vgl. Beispiel 1, 1.4.
In Figur 2 ist eine Dendrimer-basierte, Isothiocyanat-funktionalisierte Oberfläche dargestellt, die mit bioorganischen Makromolekülen beladen ist. Bei den Makromolekülen handelt es sich um amino-funktionalisierte Oligonucleotide. Derartige Oberflächen sind als Sensoroberflächen von besonderem Interesse für die DNA-Chiptechnologie, vgl. Niemeyer, CM.; Blohm, D. Angew. Chem. 111/19 3039-3043 (1999). Die Anbindung der Oligonucleotide erfolgt wie zu Beispiel 1 unter 1.5 beschrieben; eine Regeneration kann beispielsweise im alkalischen Medium erfolgen (z.B unter folgenden Bedingungen: Einsatz von 50 mM NaOH, Raumtemperatur, 2 x 3 min).
Beispiel 8:
Vergleichende Betrachtung von Homogenität und Beladungsdichte bei DNA- Arrays die (a) mit konventionellem linearem Linker und (b) durch erfindungsgemäße Oberflächenmodifikation erhalten wurden
Die durchgeführte Untersuchung wird anhand der Fig. 3 (mit Fig. 3-1 und 3-2) näher erläutert.
Fig. 3-1 zeigt einen konventionellen DNA-Array, der 5'-aminomodifizierte Fängeroligonucleotide trägt, die über einen konventionellen linearen Linker oberflächen-fixiert sind. Die Aktivierung der Oberfläche wurde folgendermaßen durchgeführt: Nach Silylierung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan wie zu Beispiel 1 unter 1.1 beschrieben wurde 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat angebunden. Die einzelnen Spots wurden dabei mit einer piezokeramischen Pipette auf die konventionelle Oberfläche aufgetragen um den Oligonucleotid-Array zu bilden. Die Spots einer senkrechten Reihe wurden jeweils mit dem gleichen Volumen an Fängeroligonucleotidlösung erzeugt: Reihen 1-4, 9-12 = 2 nl; 5-8, 13-16 = 4 nl. Die Konzentration der gespotteten Oligomerlösung betrug 10μmol/I in Bidest.
Figur 3-2 zeigt zum Vergleich einen erfindungsgemäßen DNA-Array mit einer erfindungsgemäßen (Sensor-)Oberfläche.
Der Modifikationsweg ist in Beispiel 1 beschrieben.
Immobilisiert wurde das gleiche Fängeroligonucleotid wie im Falle des Arrays aus Abb. 3-1.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Arrays wurde das Spotvolumen innerhalb der jeweiligen Reihen 1-16 variiert: obere 7 Spots: 2 nl; untere 8 Spots: 4 nl. Die Konzentration der gespotteten Oligomerlösung betrug 10μmol/I in Bidest.
Hybridisierung und vergleichende Array-Auswertung:
In beiden Fällen wurde 1h lang bei Raumtemperatur mit einer 1 nM Lösung der 3'- Cy5-markierten, komplementären Nucleinsäure hybridisiert. Die Array-Auswertung erfolgte durch Fluoreszenz-Anregung und Auslesung mit einer handelsüblichen CCD-Kamera.
Der nach einem herkömmlichen Verfahren, nämlich durch Isothiocyanataktivierung amino-silylierter Glasoberflächen hergestellte Array aus Fig. 3-1 zeigt deutliche Inhomogenitäten in der Signalintensität innerhalb der senkrechten Reihen 1 - 16, obwohl aufgrund identischer Bedingungen die gleiche Intensität zu erwarten war. Dieser Effekt ist auf eine inhomogene Oberflächenmodifikation zurückzuführen und lässt sich bei Arrays ohne erfindungsgemäßer Oberflächenmodifikation nur schwer verhindern. Derartige Effekte würden eine quantitative Auswertung des Arrays stark behindern.
Hingegen weisen die einzelnen Signale des Arrays mit erfindungsgemäßer Oberflächenaktivierung aus Fig. 3-2 innerhalb einer senkechten Reihe nahezu die gleiche Intensität auf. Die Homogenität der Oberflächenmodifikation ist durch das erfindungsgemäße Verfahren also deutlich verbessert.
Die unterschiedliche Beladungsdichte mit Fängeroligonucleotiden wird aus den verschiedenen Belichtungszeiten während der Aufnahme deutlich. Für die Aufnahme Fig. 3-1 war eine Belichtungszeit von 120 sec notwendig, um Signale detektieren zu können; für Aufnahme Fig. 3-2 lediglich 10 sec.
Beispiel 9:
Vergleichende Betrachtung der Regenerationsstabilität eines DNA-Arrays mit konventionellem linearem Linker und eines durch erfindungsgemäße Oberflächenmodifikation erhaltenen DNA-Arrays
Die durchgeführte Untersuchung wird anhand der Fig. 4 (mit Fig. 4-1 bis 4-8) näher erläutert.
Der in den Fig. 4-1 bis 4-3 dargestellte DNA-Array umfasst einen konventionellen linearen Linker, während der in den Fig. 4-4 bis 4-8 dargestellte Array eine erfindungsgemäße (Sensor-)Oberfläche aufweist. Die Oberflächenmodifikation und Hybridisierung der Arrays erfolgte so wie zu Beispiel 7 beschrieben. Bespottet wurden jeweils Quadrupole mit variierenden Volumina von 1,4 - 5,6 nl. Regeneriert wurde jeweils 2 x 3 min mit 50 mM NaOH bei RT.
Fig. 4-1 zeigt den Array mit linearem Linker nach der ersten Hybridisierung, Fig. 4- 2 zeigt den Array nach der Regeneration und Abb. 4-3 zeigt den Array nach der zweiten Hybridisierung. Deutlich ist zu sehen, daß bereits nach dem ersten Regenerationsschritt die Signalintensität stark verringert ist. Ursache ist die Ablösung des Fängeroligonucleotides während des Regenerationsprozesses aufgrund der inhärenten Instabilität des konventionellen Linkers.
Fig. 4-4 bis 4-8 zeigen die durch das erfindungsgemäße Verfahren verbesserten Regenerationseigenschaften. Auch nach wiederholtem Regenerationsprozess kann vorteilhafterweise keine Abnahme der Signalintensität beobachtet werden.
Weitere Figuren:
Fig. 5 ist eine stark schematische Darstellung der bevorzugten Sandwich- Präparationstechnik, siehe oben.
Fig. 6 ist eine stark schematische Darstellung eines bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Artikels mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung von Makromolekülen oder sonstigen Verbindungen.

Claims

Patentansprüche
1. Artikel mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung von Makromolekülen, umfassend ein Substrat mit einer Oberfläche, ein mit der Substrat-Oberfläche verknüpftes dendrimeres Gerüst und eine Anzahl von mit dem dendrimeren Gerüst verknüpften ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung von Makromolekülen
2. Artikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Artikel ein Sensor oder Sensorelement, ein Array wie z.B. ein DNA-(Mikro-)Array, ein Protein-(Mikro-)Array, ein Peptide, Peptoide oder niedermolekulare Verbindungen wie Pharmakophore tragendes Testarray, ein Bestandteil eines (Mikro)Reaktionsgefäßes oder ein optisch oder elektronisch-aktives Element ist.
3. Artikel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das dendrimere Gerüst eine Anzahl von dendrimeren Grundeinheiten umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: organischen Dendrimeren, Starburst- Dendrimeren, Metallodendrimeren, Halbmetallodendrimeren, Carbosilan- Dendrimeren, Polysilan-Dendrimere, Glycosyl-haltigen Dendrimeren, Saccharid- und Oligosaccharid-Dendrimeren, Peptid- und Oligopeptid-Dendrimeren, Nucleotid- und Oligonucleotid-Dendrimeren sowie Derivaten der vorgenannten Dendrimere.
4. Artikel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das dendrimere Gerüst dendrimere Grundeinheiten umfasst, die untereinander vernetzt sind.
5. Verfahren zur Herstellung eines Artikels mit aktivierter Oberfläche zur Immobilisierung von Makromolekülen, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen eines Substrates mit einer Oberfläche
Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit dendrimeren Grundeinheiten und Ausrüsten der dendrimeren Grundeinheiten mit einer Anzahl von ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung von Makromolekülen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Substrat-Oberfläche zum Verknüpfen mit den dendrimeren Grundeinheiten mit einer Anzahl von Initiatorgruppen ausgerüstet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Initiatorgruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Ester-, Acylhalogenid-, Aldehyd-, Epoxy- und Thiolgruppen sowie Disulfide, Metallchelate, Nucleotide- und Oligonucleotide, Peptide und Haptene, wie beispielsweise Biotin-, Digoxigenin-, Dinitrophenylgruppen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7 wobei, das Substrat ein Trägermaterial umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: Trägermaterialien auf der Basis von Metallen, Halbmetallen, Halbleitermaterialien, Metall-, Halbmetall- und Nichtmetalloxiden; Gläsern; Kunststoffen; organischen und anorganischen Polymeren; organischen und anorganischen Filmen, Gelen und Monoschichten, insbesondere als Beschichtung eines der vorgenannten Materialien.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, wobei die dendrimeren Grundeinheiten ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: Starburst- Dendrimeren, Metallodendrimeren, Glycosyl-haltigen Dendrimeren, Saccharid- und Oligosaccharid-Dendrimeren, Peptid- und Oligopeptid-Dendrimeren, Nucleotid- und Oligonucleotid-Dendrimeren sowie Derivaten der vorgenannten Dendrimere.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-9, wobei die dendrimeren Grundeinheiten mit einer Anzahl von ersten Kupplungsgruppen zur Immobilisierung von Makromolekülen ausgerüstet werden, indem funktionelle Gruppen der dendrimeren Grundeinheiten mit einer bifunktionellen Linkersubstanz umgesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die dendrimeren Grundeinheiten vor dem Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit den dendrimeren Grundeinheiten mit den ersten Kupplungsgruppen ausgerüstet werden.
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die dendrimeren Grundeinheiten erst nach dem Verknüpfen der Substrat-Oberfläche mit den dendrimeren Grundeinheiten mit den ersten Kupplungsgruppen ausgerüstet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-12, wobei die dendrimeren Grundeinheiten zu einem dendrimeren Gerüst vernetzt werden.
14. Verfahren zur Herstellung eines Artikels mit einem auf der Oberfläche immobilisierten Makromolekül mit folgendem Schritt:
Kontaktierung eines mindestens eine zweite Kupplungsgruppe umfassenden Makromoleküls
(a) mit einem Artikel gemäß einem der Ansprüche 1-4 oder
(b) mit einem gemäss einem der Ansprüche 5-13 hergestellten Artikel mit aktivierter Oberfläche unter Bedingungen, bei denen zumindest eine erste Kupplungsgruppe des Artikels und eine zweite Kupplungsgruppe des Makromoleküls unter Ausbildung einer Verknüpfung zwischen Makromolekül und Artikel miteinander reagieren.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-14, wobei das Makromolekül bzw. die Makromoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: bioorganischen Makromolekülen wie Nucleinsäuren, Antikörpern, Enzymen, Rezeptoren, Membranproteinen, Glykoproteinen, Kohlenhydraten; makromolekularen und kolloidalen Nanopartikeln; niedermolekularen Verbindungen wie pharmakologisch aktiven Substanzen, Hormonen, Antigenen.
16. Artikel, dadurch gekennzeichnet, dass er gemäss einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6-15 erhältlich ist.
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