DE60029802T2

DE60029802T2 - Reversibel immobilisierung von liganden an metalloberflächen, deren herstellung und verwendung als biosensoren

Info

Publication number: DE60029802T2
Application number: DE60029802T
Authority: DE
Inventors: E. Jamie Berkeley RAMIREZ-VICK
Original assignee: Iris Biotechnologies Inc
Current assignee: Iris Biotechnologies Inc
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-05-16
Also published as: PT1214594E; CA2409442A1; ATE335201T1; US20020160391A1; DE60029802D1; DK1214594T3; WO2000070345A1; CA2409442C; CY1105128T1; ES2269147T3; US20040091858A9; AU5017200A; US7108971B2; EP1214594A1; EP1214594B1

Description

Hintergrund der Erfindung
a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Immobilisierung von Liganden an festen Oberflächen und ihre Verwendung bei Hybridisierungs-, Reinigungs-, Immunoassay-, Biosensor- und anderen biochemischen Anwendungen.
b) Beschreibung des Stands der Technik
Feste Träger für die Immobilisierung von Liganden, wie Nucleotiden, Proteinen, Enzymen und Zellen, werden in umfangreichem Maße bei Hybridisierungs-, Reinigungs-, Immunoassay- und zahlreichen anderen biochemischen Anwendungen eingesetzt.
Das US-Patent 5 622 826 (Ausgabetag 22. April 1997) beschreibt ein Verfahren, mit dem aminomarkierte Oligonucleotide unter Verwendung eines Isocyanat-Linkers, insbesondere 1,3-Phenylendiisocyanat, an Glas immobilisiert werden. Dieser Weg leidet an der Einschränkung, dass 1,3-Phenylendiisocyanat sowohl mit Hydroxyl- als auch mit Thiolgruppen reagiert, was in drastischer Weise die Spezifität des Moleküls verringert. Ferner handelt es sich bei 1,3-Phenylendiisocyanat um ein kleines, inflexibles Molekül, das den Liganden nahe an der Oberfläche bindet.
Cohen et al. (Nucleic Acids Res., Bd. 25 (4), (1997), S. 911–912) beschreiben ein Verfahren zum Immobilisieren von Oligonucleotiden an Glas unter Anwendung der Phosphit-triester-Chemie für die Festphasen-Oligonucleotidsynthese. Die Phosphit-triester-Moleküle binden mehrere Hydroxylgruppen an der Glasoberfläche und die Phosphatgruppe am 5'-Ende des Nucleotids. Obgleich dieser Weg für eine stabile, kovalente Bindung an der Oberfläche sorgt, ist er mit Einschränkungen bezüglich der Bindung des Liganden nahe an der Oberfläche, was die Exposition des Liganden verringert, sowie bezüglich einer Besetzung von drei Hydroxylgruppen pro Ligand, was die Oberflächendichte des Liganden verringert, behaftet.
Alkylsiloxane gehören zu den am meisten verwendeten Klassen von Molekülen zur Aktivierung von Glasoberflächen mit funktionellen Gruppen (H. H. Weetall, Appl. Biochem. Biotechnol., Bd. 41 (1993), S. 157–188). Diese Moleküle bilden selbst-organisierende Monoschichten ("self-assembled monolayers; SAMs), wenn reaktive Siloxangruppen mit Hydroxylgruppen der Oberfläche eine Kondensation eingehen und benachbarte Siloxane eine Kondensation unter Bildung eines Netzwerks eingehen (M. Mrksich und G. M. Whitesides, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., Bd. 25 (1996), S. 55–78). Im US-Patent 5 837 860 (Ausgabetag 17. November 1998) beschreiben Anderson und Rogers ein Verfahren zum Immobilisieren von einzelnen Nucleinsäuren oder Oligonucleotiden, die mit funktionellen terminalen Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen markiert sind. Mercaptosilan-Moleküle werden zunächst an einer festen Glas- oder Polystyrol-Oberfläche immobilisiert, mit der die markierten Nucleotide eine kovalente Disulfidbindung bilden, wobei Mercaptoethanol oder Dithiothreit als Reduktionsmittel verwendet werden.
Im US-Patent 5 760 130 (Ausgabetag 2. Juni 1998) beschreiben Johnston und Trounstine ein Verfahren zum Immobilisieren von DNA unter Verwendung von Aminoalkylsilanen. Nachdem die Aminoalkylsilane an der Glasoberfläche immobilisiert worden sind, bildet eine Carbodiimidlösung in einem Imidazolpuffer ein Zwischenprodukt, das mit der Phosphatgruppe am 5'-Ende der DNA reagiert. B. Lom et al., J. Neurosci. Meth., Bd. 50 (1993), S. 385–397, verwendeten Alkylsiloxane mit einem Gemisch von Amino- und Alkanfunktionalitäten zur Bindung von Proteinen durch Wechselwirkung mit ihren hydrophilen und hydrophoben Resten. Andere Autoren verwendeten mit Iod, Benzylchlorid und Epoxid funktionalisierte Alkylsiloxane zur Wechselwirkung mit Amino- und Thiolgruppen von Antikörpern (N. M. Pope et al., Bioconj. Chem., Bd. 4 (2) (1993), S. 166–171). Maskos und Southern (Nucleic Acids Res., Bd. 20 (7) (1992), S. 1679–1684) verwendeten Epoxyalkylsilane und Ethylenglykolderivate zur Immobilisierung von Nucleotiden für die Festphasensynthese. Die Epoxyalkylsilane dienen als Abstandshalter, während die Ethylenglykolderivate Hydroxylgruppen bereitstellen, die zur Umsetzung mit der Phosphatgruppe am 5'-Ende des Nucleotids oxidiert werden.
Aminoalkylsiloxane wurden auch zur Immobilisierung von DNA in Längsrichtung an Glasoberflächen verwendet (Yokota et al., Nucleic Acids Res., Bd. 25 (5) (1997), S. 1064–1070). Der Mechanismus, gemäß dem die aminierte Oberfläche die DNA bindet, ist nicht klar, es wird jedoch angenommen, dass die Bindung auf der Grundlage von elektrostatischen Wechselwirkungen erfolgt. Diese Wechselwirkung ist alles andere als spezifisch, da diese aminierten Oberflächen auch zur Bindung beliebiger Nucleotidsequenzen befähigt sind. Ferner ist die Stärke der Wechselwirkung gering, da die DNA nach der Bindung durch Verteilung der Flüssigkeit auf der Glasoberfläche begradigt wird.
Eine Schwierigkeit bei der Verwendung von Alkylsiloxanen besteht darin, dass sie nicht notwendigerweise SAMs bilden, wie ursprünglich angenommen wurde (Vandenberg et al., J. Colloid Inter. Sci., Bd. 147 (1) (1991), S. 103–118). Anstelle einer geordneten, gut definierten Struktur können sie Aggregate an der Oberfläche bilden, wodurch die Oberflächenbindungskapazität verringert wird. Die Struktur, die Alkylsiloxane an der Glasoberfläche bilden, ist hochgradig von den Reaktionsbedingungen abhängig.
Ein weiterer Weg zur Bindung von DNA in Längsrichtung (oder mindestens an verschiedenen Punkten entlang ihrer Länge) an einer Glasoberfläche verwendet Poly-I-lysin (Schena et al., Science, Bd. 270 (1995), S. 467–470; und Shalon et al., Genome Res., Bd. 6 (1996), S. 639–645). Wie bei der Verwendung von Aminoalkylsiloxanen ist diese Wechselwirkung nicht spezifisch und somit schwach, was zu einem Ligandenverlust führt, wenn stringente Waschbedingungen erforderlich sind.
Die Wechselwirkung von Metallionen mit speziellen Aminosäuren an der Oberfläche von Proteinen wurde erstmals von Porath et al. (Nature, Bd. 258 (1975), S. 598–607) bei der Chromatographie eingesetzt, um Serumproteine unter Verwendung von Metallionen, die mit Imidoacetat immobilisiert sind, zu trennen. Im Anschluss daran stützten sich die meisten Bindungsuntersuchungen unter Verwendung von Metallionen auf Übergangsmetallionen (z. B. Cu(II), Ni(II), Fe(III), und Zn(II)), die mit Indol- und Imidazolgruppen, die in Proteinen vorliegen, in Wechselwirkung treten.
Im US-Patent 5 620 850 (Ausgabetag 15. April 1997) brachten Bamdad et al. ein Konstrukt eines langkettigen Hydroxyalkylthiols und eines Ni(II)-Chelators an einer Goldoberfläche an. Ni(II) ist ein Übergangsmetallion, das mit funktionellen Gruppen, die in Proteinen vorliegen, in Wechselwirkung tritt.
Die Arbeiten von Garcia und Mitarbeitern haben gezeigt, dass die weichen Metallsäuren Ag(I) und Pt(II) zur Immobilisierung von Proteinen und Oligonucleotiden verwendet werden können. Von immobilisierten Silberionen wurde gezeigt, dass sie über eine besondere Affinitätsserie bei der chromatographischen Trennung von Aminosäuren sorgen (A. A. Garcia et al., Reactive Polymers, Bd. 23 (1994), S. 249–259), wobei Biotin-markiertes BSA gegenüber dem entsprechenden unmarkierten Produkt bevorzugt wird (A. A. Garcia et al., Ind. Eng. Chem. Res., Bd. 35 (4) (1996), S. 1097–1106). Ferner wurde gezeigt, dass ein mit Biotin markiertes Nucleotid (b-dUTP) durch Affinitätswechselwirkungen an einer immobilisierten Silberionen-Säule bei Überschreiten einer Natriumchloridkonzentration von 0,001 M festgehalten wurde, während dUTP nicht festgehalten wurde (Agarwal et al., Sep. Sci. Technol., Bd. 33 (1) (1998), S. 1–18). Ferner wurden Silberionen an kolloidalen paramagnetischen Teilchen immobilisiert, um mit Biotin markierte Oligonucleotide aus einer gemischten Population zu gewinnen (J. E. Ramirez-Vick und A. A. Garcia, Reactive and Functional Polymers, Bd. 35 (1998), S. 123–132).
Die Verwendung von weichen Metallionen als Ankergruppen wurde nachgewiesen, wenn das Protein Clathrin an einer Goldoberfläche unter Verwendung von mit NHS-ester aktivierten Dodecanthiolen immobilisiert wurde (Wagner et al., FEBS Letters, Bd. 356 (1994), S. 267–271).
Im US-Patent 5 622 826 (Ausgabetag 22. April 1997) beschreibt Varma ein Verfahren zur Verwendung von Platin-Wafern als feste Oberfläche zur Immobilisierung von aminomarkierten Oligonucleotiden unter Verwendung von 1,4-Phenylendiisothiocyanat. Diesem Molekül fehlt die erforderliche Flexibilität, um eine Bindung des markierten Liganden mit hoher Oberflächendichte zu ermöglichen, während die Bereitstellung der erforderlichen Verfügbarkeit zur Bindung der maximalen Menge des Rezeptor-Biomoleküls möglich ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung von markierten Liganden an festen Oberflächen bereitzustellen. Mehrere, seit langem bestehende Probleme bei Hybridisierungs-, Reinigungs-, Immunoassay-, Biosensor- und anderen biochemischen Anwendungen werden erfindungsgemäß gelöst.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein ligandenbindender, fester Träger mit einer festen Weichmetalloberfläche und einem heterobifunktionellen Abstandshalter, der an der festen Weichmetalloberfläche über eine Weichmetall-weiche Base-Bindung chemi- oder physisorbiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der festen Weichmetalloberfläche um Silber, Kupfer, Gold, Platin(II), Quecksilber, Quecksilber(II), Thallium, Kadmium(II), Platin(IV) oder Palladium(II). Beim heterobifunktionellen Abstandshalter handelt es sich vorzugsweise um einen Kohlenwasserstoff mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis etwa 40 Kohlenstoffatomen, der mindestens eine Weichbasen-Ankergruppe und mindestens eine Nucleotid-Bindungsgruppe aufweist. Die weiche Base wird aus Biotinamid und Iodacetyl ausgewählt. Gegebenenfalls ist ein Oligonucleotid vorher an den Abstandshalter gebunden.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung einer ligandenbindenden, festen Oberfläche bereit, indem man eine feste Weichmetalloberfläche auswählt und einen heterobifunktionellen Abstandshalter an dieser festen Oberfläche über eine Weichmetall-weiche Base-Bindung immobilisiert.
Testsysteme mit festen Weichmetalloberflächen und einem heterobifunktionellen Abstandshalter, der an die feste Weichmetalloberfläche über eine Weichmetall-weiche Base-Bindung chemi- oder physisorbiert ist, werden ebenfalls bereitgestellt, sowie Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines biologischen Moleküls, indem man eine Probe mit einem Gehalt an biologischen Molekülen einer Oberfläche gemäß der vorstehenden Definition aussetzt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das grundlegende Verfahren zur Aktivierung einer Weichmetalloberfläche zur Immobilisierung von aminomarkierten Oligonucleotiden.
2 zeigt das grundlegende Verfahren zur Aktivierung einer Weichmetalloberfläche zur Immobilisierung von aminomarkierten Antikörpern.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben die nachstehend definierten Ausdrücke die folgenden Bedeutungen:
Der Ausdruck "Ankergruppe" bezieht sich auf die funktionelle chemische Gruppe, die die weiche Base enthält, die die Sorption des Abstandshalters an der Weichmetalloberfläche bewirkt.
Der Ausdruck "Bindungsdichte" bezieht sich auf die Anzahl an reaktiven endständigen Gruppen pro Oberflächeneinheit, die für die Bindung des markierten Biopolymeren verfügbar ist.
Der Ausdruck "Biopolymeres" bezieht sich auf biologische Moleküle, wie Proteine, Oligonucleotide, DNA und dergl., die die Grundlage für Hybridisierungs-, Reinigungs-, Immunoassay- und zahlreiche andere biochemische Anwendungen sind.
Der Ausdruck "Hybridisierung" bezieht sich auf die Bindungsreaktion zwischen komplementären Partnern von Biopolymermolekülen.
Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf ein Mitglied des Ligand/Rezeptor-Bindungspaars, z. B. Oligonucleotide, DNA und Proteine.
Der Ausdruck "nicht-spezifische Wechselwirkung" bezieht sich auf individuelle physiko-chemische Wechselwirkungen (d. h. Wasserstoffbrücken-Bindungen, ionische Bindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und van der Waals-Kräfte), wobei die Struktur nicht beteiligt ist.
Der Ausdruck "Protein" bezieht sich auf Enzyme, Antikörper und beliebige andere Polypeptide.
Der Ausdruck "weiche Basen" bezieht sich auf Spezies, die definitionsgemäß eine kleine Ladung und eine umfangreiche Größe aufweisen und bevorzugt eine Bindung mit weichen Metallen eingehen.
Der Ausdruck "weiche Metalle" bezieht sich auf Spezies, die definitionsgemäß eine kleine Ladung und eine umfangreiche Größe aufweisen und bevorzugt eine Bindung mit weichen Basen eingehen.
Der Ausdruck "Abstandshalterarm" bezieht sich auf das Molekül, das dazu beiträgt, dem immobilisierten Liganden eine ausreichende Flexibilität zu verleihen, um ihn für den Rezeptor zugänglich zu machen. Dabei handelt es sich üblicherweise um einen langkettigen Kohlenwasserstoff, der gegebenenfalls Heteroatome enthält und mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist.
Der Ausdruck "spezifische Wechselwirkungen" bezieht sich auf die Gesamtsumme eines speziellen Satzes von physiko-chemischen Wechselwirkungen, wobei die Struktur eine Hauptrolle spielen kann. Diese Wechselwirkungen umfassen Wasserstoffbrückenbindungen, ionische Bindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und van der Waals-Kräfte.
Der Ausdruck "sterische Hinderung" bezieht sich auf den Einfluss von großen Gruppen in der Nähe des Liganden, die dessen Zugangsmöglichkeit zum Rezeptormolekül begrenzen.
II. Immobilisierung von Molekülen an weichen Metalloberflächen
Die Erfindung bezieht sich auf die Immobilisierung von markierten Liganden an festen Oberflächen unter Einsatz der Bindung von weichem Metall und weicher Base. Die Erfindung stellt Verfahren für die Entwicklung zuverlässiger Techniken zur Immobilisierung von biologisch aktiven Biopolymer-Sondenmolekülen bereit, wobei eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Selektivität erzielt werden und aufgrund der Wiederverwendung von Sensorelementen geringere Kosten entstehen.
Das allgemeine Verfahren beinhaltet die Verwendung von Substraten mit einem Gehalt an Weichmetall-Dünnfilmen. Anschließend werden heterobifunktionelle Abstandshaltermoleküle zugegeben. Bei diesem heterobifunktionellen Abstandshalter handelt es sich vorzugsweise um einen Kohlenwasserstoff mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis etwa 40 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise von etwa 15 bis etwa 25 Kohlenstoffatomen, wobei der Kohlenwasserstoff mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist. Von den beiden funktionellen Gruppen handelt es sich bei einer um eine weiche Base, die einem Sorptionsvorgang mit der weichen Metalloberfläche unterliegt. Die andere funktionelle Gruppe am Abstandshalter wird so gewählt, dass er die funktionelle Gruppe an der Markierung des Liganden bindet. Gegebenenfalls wird vorher ein Oligonucleotid am Abstandshalter angebracht, bevor die Sorption an der Metalloberfläche erfolgt. Durch dieses Verfahren entsteht eine aktive feste Oberfläche, die dazu befähigt ist, markierte Liganden in hoher Dichte und unter minimaler nicht-spezifischer Bindung zu binden.
Die Ankerstruktur (Ankergruppe-Abstandshalterarm-reaktiver endständiger Rest) ergibt eine stabile Ankerbindung an der festen Oberfläche, einen Abstandshalterarm, der dem Liganden eine flexible Beschaffenheit verleiht, was es ihm ermöglicht, mit seiner Umgebung so in Wechselwirkung zu treten, dass etwaige sterische Hinderungen auf ein Minimum beschränkt werden, und einen reaktiven endständigen Rest, der den Liganden bindet. Gegebenenfalls kann ein Oligonucleotid als reaktiver endständiger Rest dienen. Die Wahl der einzelnen Komponenten dieser Immobilisierungsstruktur hängt von der Kombination ab, die ein Minimum an nicht-spezifischen Wechselwirkungen und sterischer Hinderung sowie ein Maximum an Bindungsdichte ergibt. Der Typ der verwendeten Ankergruppe verleiht dem festen Träger die geeignete Funktionalität, um einen Abstandshalterarm mit einer reaktiven endständigen Gruppe zu immobilisieren. Diese Immobilisierungsstruktur kann entweder stückweise auf dem festen Substrat aufgebaut werden oder vorher zusammengebaut werden und als eine einzige Einheit einem Sorptionsvorgang an der Oberfläche unterliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Immobilisieren von Oligonucleotiden, die mit Aminogruppen markiert sind, an Weichmetalloberflächen bereit, die mit einem heterobifunktionellen Biotin-NHS-ester-Abstandshalterarm aktiviert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Immobilisieren von cDNA oder PCR-amplifizierter DNA, die mit Aminogruppen markiert sind, an Weichmetalloberflächen bereit, die mit einem heterobifunktionellen Iod-NHS-ester-Abstandshalterarm aktiviert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen an Weichmetalloberflächen bereit, die mit einem heterobifunktionellen Sulfhydryl-NHS-ester-Abstandshalterarm aktiviert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Gewinnung der immobilisierten Liganden bereit, wobei schwefelhaltige konkurrierende Moleküle verwendet werden, um die heterobifunktionellen Abstandshalter zu verdrängen. Aufgrund der hochgradigen Wasserlöslichkeit von Thiodiglykol und seiner funktionellen Thioethergruppe lässt sich eine hohe Elutionsausbeute unter Verwendung einer konzentrierten Lösung von Thiodiglykol erreichen. Das Substrat kann anschließend wiederverwendet werden, indem man es mit Wasser und Ethanol wäscht und anschließend unter einem partiellen Vakuum erwärmt, um das relativ flüchtige Thiodiglykol auszutreiben.
Die sorbierten Moleküle werden an der festen Oberfläche durch Valenzkräfte gebunden, die eine ähnliche Stärke wie die an kovalenten Bindungen beteiligten Kräfte haben. Jedoch besteht im Gegensatz zu kovalenten Wechselwirkungen ein dynamisches Gleichgewicht, bei dem adsorbierte Moleküle ohne Aufbrechen von irgendwelchen Bindungen desorbiert werden können. Die Wechselwirkung zwischen Weichmetallionen und weichen Basen wird qualitativ durch das Prinzip der harten und weichen Säuren und Basen (Hard and Soft Acids and Bases, HSAB) auf der Grundlage der Lewis-Definition von Säuren und Basen beschrieben (R. G. Pearson, Chem. Brit., Bd. 3 (1967), S. 103–107; R. G. Pearson, J. Chem. Ed., Bd. 45 (1968), S. 581–587; R. G. Pearson, J. Chem. Ed., Bd. 45 (1968), S. 643–648). Dieses Prinzip besagt in einfacher Weise, dass harte Säuren eine Koordination mit harten Basen sowie weiche Säuren eine Koordination mit weichen Basen bevorzugen. Das Prinzip definiert harte Säuren als Säuren, die eine geringe Größe und eine hohe positive Ladung aufweisen und keine nicht-gemeinsamen Elektronenpaare in ihrer Valenzschale aufweisen. Diese Eigenschaften führen zu einer hohen Elektronegativität und einer geringen Polarisierbarkeit. Weiche Säuren weisen eine umfangreiche Größe und eine geringe positive Ladung auf und enthalten nicht-gemeinsame Elektronenpaare (p oder d) in ihrer Valenzschale. Dies führt zu einer hohen Polarisierbarkeit und einer geringen Elektronegativität. Somit bilden weiche Säuren stabile Komplexe mit Basen, die hochgradig polarisierbar sind. Dagegen bilden harte Säuren, für die das Proton typisch ist, üblicherweise stabile Komplexe mit Basen, so dass die Polarisierbarkeit nur eine untergeordnete Rolle spielt. Säuren und Basen können somit gemäß diesen Prämissen in harte, weiche oder Grenzfall-Basen eingeteilt werden (Tabelle 1). Da diese Säure/Base-Wechselwirkungen eine Anzahl unterschiedlicher Eigenschaften umfassen, gibt es mehr als eine Theorie zu ihrer Beschreibung. Bei diesen Theorien handelt es sich um die ionisch-kovalente, die π-Bindungs- und die Elektronenkorrelationstheorie. Tabelle 1 Einteilung von Lewis-Säuren und -Basen

¹R bedeutet eine Alkylgruppe, z. B. CH₃, C₂H₅ und dergl.

Die ionisch-kovalente Theorie ist die älteste und offensichtlichste Theorie. Sie führt aus, dass harte Säuren in Wechselwirkung mit harten Basen treten, vorwiegend durch ionische Kräfte aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer hohen Ladung. Weiche Säuren und Basen, die eine umfangreiche Größe und eine geringe Ladung aufweisen, können keinen stabilen Komplex durch ionische Kräfte bilden. Die π-Bindungstheorie führt aus, dass weiche Säuren (üblicherweise Metalle) mit locker festgehaltenen d-Orbitalelektronen π-Bindungen mit weichen Basen, die leere d-Orbitale enthalten, bilden können. Schließlich führt die Elektronenkorrelationstheorie aus, dass London- oder Van der Waals-Dispersionsenergien zwischen Atomen oder Gruppen im gleichen Molekül zu einer Stabilisierung des Moleküls führen können. Diese Kräfte sind in Komplexen, die durch hochgradig polarisierbare weiche Säuren und Basen gebildet werden, hoch, was eine zusätzliche Stabilität ergibt.
Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten verschiedenen Methoden sind dem Fachmann geläufig. Derartige Methoden finden sich beispielsweise in folgenden Standardwerken: G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, (1996), Academic Press, San Diego, Kalifornien; B. Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual, (1995), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Die erste Stufe beim Immobilisierungsvorgang besteht in der Herstellung von Weichmetall-Dünnfilmen (etwa 20 nm) auf dem Substrat der Wahl (z. B. Quarzglas, Kalkglas, Quarz, oxidiertes Silicium und dergl.). Dies wird durch bekannte Verfahren erreicht, z. B. durch Elektronenstrahlverdampfung.
Nach Waschen und Trocknen wird der heterobifunktionelle Abstandshalterarm absorbiert. Verschiedene Typen von heterobifunktionellen Abstandshaltern sind im Handel erhältlich oder es finden sich Verfahren zu ihrer Synthese in der Literatur. Von den verschiedenen funktionellen Gruppen im Abstandshalter handelt es sich bei mindestens einer Gruppe um eine weiche Base, die eine Bindung mit der Weichmetalloberfläche eingeht. Eine weitere funktionelle Gruppe ist gegenüber den zu immobilisierenden Liganden oder Biomolekülen reaktiv. Alle diese chemischen Gruppen und Reaktionen sind dem Fachmann geläufig. Einige Beispiele hierfür sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Reaktive chemische Gruppen

NHS bedeutet N-Hydroxysuccinimid

Die funktionellen Gruppen können vom Typ des zu immobilisierenden Biomoleküls abhängen. Beispielsweise enthalten alle Proteine an einem Ende eine Aminogruppe und am anderen Ende eine Carboxylatgruppe, und zwar neben sämtlichen übrigen funktionellen Gruppen, die durch die speziellen Aminosäuren der Sequenz bereitgestellt werden. Im Fall von Oligonucleotiden erfolgt die Synthese üblicherweise aus Einzelnucleotiden. Aufgrund dieser Tatsache kann eine einzelne Nucleotidmarkierung mit der erwünschten funktionellen Gruppe an irgendeiner Synthesestelle (üblicherweise am Beginn oder am Ende) hinzugefügt werden, wodurch das erhaltene Oligonucleotid markiert wird. Diese einzelnen Nucleotide können entweder chemisch oder enzymatisch mit einem beliebigen Typ von funktionellen Gruppen modifiziert werden, um die gewünschte Markierung bereitzustellen. Die chemische oder enzymatische Markierung kann auf DNA-Moleküle ausgedehnt werden, mit dem Unterschied, dass durch die Markierungsreaktion sämtliche Basen innerhalb des Zielmoleküls modifiziert werden. Wenn das angestrebte Ergebnis in der Markierung des DNA-Moleküls nur an einer Stelle besteht, bedient man sich am besten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die bereits mit der erwünschten funktionellen Gruppe modifiziert worden sind.
Nach der Immobilisierung des erwünschten Zielmoleküls und nach Durchführung der erwünschten biochemischen Anwendung kann das Molekül zurückgewonnen und die Oberfläche regeneriert werden. Dies kann durch ein als Elution bekanntes Verfahren vorgenommen werden. Ein sehr übliches Elutionsverfahren von spezifisch gebundenen Molekülen besteht in der Verwendung von konkurrierenden Molekülen, die das gebundene Molekül verdrängen. Um ein geeignetes Verdrängungsmittel auszuwählen, ist es wichtig, die Natur der spezifischen Wechselwirkung zu berücksichtigen. Liganden, die durch Wechselwirkung zwischen einem weichen Metall und einer weichen Base an Weichmetall-Dünnfilmen immobilisiert worden sind, können unter Verwendung von schwefelhaltigen konkurrierenden Molekülen zurückgewonnen werden, die die heterobifunktionellen Abstandshalter verdrängen. Beispielsweise lässt sich eine hohe Elutionsausbeute unter Verwendung einer konzentrierten Lösung von Thiodiglykol erreichen, und zwar aufgrund der großen Wasserlöslichkeit von Thiodiglykol und aufgrund seiner funktionellen Thioethergruppe. Das Substrat kann sodann erneut verwendet werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung von speziellen Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche zu interpretieren.
Beispiel 1
Immobilisierung eines biotinylierten Oligonucleotids an einer Platinoberfläche
Silicium-Chips mit Platin-Dünnfilmen wurden durch Elektronenstrahlbedampfung hergestellt. Vor der Verwendung werden diese Oberflächen mit einem Gemisch aus einer 13%igen RBS-35-Lösung (Pierce) und 33%igem Ethanol in entionisiertem Wasser gereinigt. Die Chips werden in dieser Lösung gewaschen, indem man sie 20 Minuten in ein Ultraschallbad von 50°C taucht. Daran schließt sich ein dreimaliges Spülen in entionisiertem Wasser unter 10-minütiger Behandlung in einem Ultraschallbad von 50°C an. Nach dem Spülen werden die Chips unter Stickstoff oder Argon trocken geblasen.
Bei diesem Beispiel handelte es sich beim heterobifunktionellen Abstandshalterarm um Succinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat. Dieses Molekül ist im Handel erhältlich (Pierce Chemical Co.) oder kann nach Literaturangaben synthetisiert werden (J. V. Staros, Biochemistry, Bd. 21 (17) (1982), S. 3950–3955). Bei diesem Molekül handelt es sich um ein Derivat von D-Biotin mit einem Gehalt an einem 6-Aminocapronsäure-Abstandshalterarm mit einer Länge von etwa 30,5 Å, der an die Valeriansäure-Seitenkette von Biotin gebunden ist und mit einem NHS-ester endet. Dieser NHS-ester reagiert mit Amingruppen in Proteinen und anderen Molekülen unter Bildung von stabilen amidgebundenen Derivaten. Die optimalen Reaktionsbedingungen liegen bei einem pH-Wert von 7–9. Aminhaltige Puffer, wie Trizma, die bei der Acylierungsreaktion konkurrieren können, sollten vermieden werden. Dieses Abstandshalterarm-Molekül ist unter wässrigen Reaktionsbedingungen unlöslich und muss vor der Zugabe zu der wässrigen gepufferten Reaktionslösung in organischen Lösungsmitteln gelöst werden. Eine Vorratslösung kann in einem der organischen Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt werden. Die Zugabe der wässrigen Lösung soll 10% des organischen Lösungsmittels nicht übersteigen, um eine Fällung zu vermeiden. Das Molverhältnis des Abstandshalterarm-Moleküls zu einem Protein soll 2–50:1 betragen, wobei höhere Werte zu höheren Einbauausbeuten führen.
Die Chips werden sodann 12 Stunden bei Raumtemperatur in eine 2 mM Lösung von Succinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat in DMF oder Ethanol getaucht. Anschließend werden die Chips 3-mal in DMF gewaschen, wonach eine Trocknung unter einem Stickstoffstrom folgt. Sie werden sofort für die Immobilisierungsstufe eingesetzt.
Die aktivierten Chips werden 30–60 Minuten bei Raumtemperatur oder mehrere Stunden bei 4°C in eine Lösung von 10 mg/ml des aminomarkierten Oligonucleotids in 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,2, getaucht. Anschließend werden die Chips 3-mal in Phosphatpuffer gewaschen, wonach eine Trocknung unter einem Stickstoffstrom folgt.
Beispiel 2
Immobilisierung von Antikörpern an einer Silberoberfläche
Silicium-Chips mit Silber-Dünnfilmen wurden durch Elektronenstrahl-Bedampfung hergestellt. Vor der Verwendung werden diese Oberflächen mit einem Gemisch aus einer 13%igen RBS-35-Lösung (Pierce) und 33%igem Ethanol in entionisiertem Wasser gereinigt. Die Chips werden in dieser Lösung gewaschen, indem man sie 20 Minuten in ein Ultraschallbad von 50°C taucht. Daran schließt sich ein dreimaliges Spülen in entionisiertem Wasser unter 10-minütiger Behandlung in einem Ultraschallbad von 50°C an. Nach dem Spülen werden die Chips unter Stickstoff oder Argon trocken geblasen.
Succinimidyl-6-[6-(((iodacetyl)-amino)-hexanoyl)-amino]-hexanoat ist ein heterobifunktioneller Abstandshalter, der einen NHS-ester an einem Ende enthält, der durch zwei Aminohexanoatgruppen von einer Iodacetylgruppe am anderen Ende getrennt ist. Dieses Molekül ist handelsüblich (Molecular Probes) oder kann nach Literaturangaben synthetisiert werden (M. Brinkley, Bioconjugate Chem., Bd. 3 (1992), S. 2–18). Der NHS-ester reagiert mit primären Aminen in verschiedenen Biomolekülen unter Bildung von stabilen Amidbindungen. Obgleich die Iodacetylgruppe hochgradig reaktiv gegenüber weichen Metallen ist, reagiert sie auch mit Sulfhydrylgruppen unter Bildung einer Thioetherbindung. Ferner ist bei Iodacetylgruppen zu bedenken, dass sie leicht unter Lichteinwirkung zu Iod abgebaut werden können, wodurch ihre Reaktivität verringert wird. Dieses Vernetzungsmittel ist hochgradig hydrophob, so dass es in einem organischen Lösungsmittel (DMSO oder DMF) gelöst werden muss, bevor es dem wässrigen Reaktionspuffer zugesetzt wird. Bei Konjugationen mit diesem Vernetzungsmittel sollten Pufferkomponenten mit einem Gehalt an Aminen (z. B. Tris, Glycin oder Imidazol) oder Sulfhydrylgruppen (z. B. Dithiothreit, 2-Mercaptoethanol oder Cystein) vermieden werden, da diese mit der angestrebten Vernetzungsreaktion konkurrieren.
Die Chips werden sodann 12 Stunden bei Raumtemperatur in eine Lösung mit einem Gehalt an 2 mM Succinimidyl-6-[6-(((iodacetyl)-amino)-hexanoyl)-amino]-hexanoat in DMSO getaucht. Anschließend werden die Chips 3-mal in DMSO gewaschen, wonach sie unter einem Stickstoffstrom getrocknet und sofort für die Immobilisierungsstufe eingesetzt werden.
Die aktivierten Chips werden 30–60 Minuten bei Raumtemperatur oder einige Stunden bei 4°C in eine 10 mg/ml-Lösung des Antikörpers in 50 mM Natriumborat, 5 mM EDTA, pH-Wert 8,3, getaucht. Sodann werden die Chips 3-mal in Boratpuffer gewaschen, wonach sich eine Trocknung unter einem Stickstoffstrom anschließt.
Beispiel 3
Gewinnung von Antikörpern, die an einer Silberoberfläche immobilisiert sind, unter Verwendung von Thiodiglykol als Verdrängungsmittel
Antikörper, die durch Wechselwirkungen zwischen einem weichen Metall und einer weichen Base an Silicium-Chips mit Silber-Dünnfilmen immobilisiert worden sind, können unter Verwendung von schwefelhaltigen konkurrierenden Molekülen zur Verdrängung der heterobifunktionellen Abstandshalter mit einer funktionellen Iodgruppe gewonnen werden.
Um ein geeignetes Verdrängungsmittel auszuwählen, ist es wichtig, die Natur der spezifischen Wechselwirkung zu berücksichtigen. In diesem Fall erfordert die Iod-Silber-Wechselwirkung, gemäß dem HSAB-Prinzip eine weiche Base, die um die Bindung am immobilisierten Silber (als weiche Säure) konkurrieren kann. Da sich die Iodgruppe im Abstandshalter befindet, die dem Molekül die Natur einer weichen Base verleiht, bestand die Strategie darin, nach anderen Molekülen mit einer funktionellen Gruppe einer weichen Base zu suchen.
Thiodiglykol ist aufgrund seiner hohen Wasserlöslichkeit und aufgrund seiner funktionellen Thioethergruppe ein perfekter Kandidat. Eine hohe Elutionsausbeute lässt sich durch Eintauchen des Silber-Chips mit dem immobilisierten Antikörper von Beispiel 2 in eine 1 M Lösung von Thiodiglykol in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur für eine Eintauchzeit von 1 Stunde erreichen. Das Substrat kann sodann wiederverwendet werden, indem man es 20 Minuten bei 50°C mit einer 50:50-Lösung von entionisiertem Wasser/Ethanol in einem Ultraschallbad wäscht, worauf eine 30-minütige Behandlung bei 100°C in einem Trockenschrank unter einem partiellen Vakuum folgt, um das relativ flüchtige Thiodiglykol auszutreiben.

Claims

Ligandenbindende feste Oberfläche, umfassend: a) einen festen Weichmetallträger und b) einen heterobifunktionellen Abstandshalter mit mindestens zwei funktionellen Gruppen, wobei die funktionellen Gruppen eine weiche Base umfassen und der Abstandshalter durch Chemi- oder Physisorption am festen Weichmetallträger über eine Bindung aus weichem Metall und weicher Base angebracht ist, wobei die weiche Base aus Biotinamid und Iodacetyl ausgewählt ist.
Feste Oberfläche nach Anspruch 1, wobei der feste Weichmetallträger aus mit Silber, Kupfer, Gold, Platin(II), Quecksilber, Quecksilber(II), Thallium, Kadmium(II), Platin(IV) und Palladium(II) bedeckten Oberflächen ausgewählt ist.
Feste Oberfläche nach Anspruch 1, wobei der heterobifunktionelle Abstandshalter einen Kohlenwasserstoff mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis 40 Kohlenstoffatomen umfasst.
Feste Oberfläche nach Anspruch 1, wobei es sich beim heterobifunktionellen Abstandshalter um Succinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat handelt.
Feste Oberfläche nach Anspruch 1, wobei es sich beim heterobifunktionellen Abstandshalter um Succinimidyl-6-[6-(((iodacetyl)-amino)-hexanoyl)-amino]-hexanoat handelt.
Verfahren zur Herstellung einer festen Ligandenbindungsoberfläche, umfassend: a) Auswählen eines festen Weichmetallträgers; und b) Immobilisieren eines heterobifunktionellen Abstandshalters an dem festen Träger über eine Bindung zwischen weichem Metall und weicher Base, wobei der Abstandshalter mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist, wobei die funktionellen Gruppen eine weiche Base umfassen, wobei die weiche Base aus Biotinamid und Iodacetyl ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der feste Weichmetallträger aus mit Silber, Kupfer, Gold, Platin(II), Quecksilber, Quecksilber(II), Thallium, Kadmium(II), Platin(IV) und Palladium(II) bedeckten Oberflächen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der heterobifunktionelle Abstandshalter einen Kohlenwasserstoff mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis 40 Kohlenstoffatomen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich beim heterobifunktionellen Abstandshalter um Succinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich beim heterobifunktionellen Abstandshalter um Succinimidyl-6-[6-(((iodacetyl)-amino)-hexanoyl)-amino]-hexanoat handelt.
Testsystem, umfassend eine Mehrzahl von Oberflächen nach Anspruch 1.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines biologischen Moleküls, umfassend die Exposition einer Probe mit einem Gehalt an biologischen Molekülen mit einer festen Oberfläche nach Anspruch 1, wobei der heterobifunktionelle Abstandshalter einen Liganden zur Bindung an die biologischen Moleküle umfasst.
Verfahren zur Gewinnung von Liganden, die durch einen iodhaltigen heterobifunktionellen Abstandshalter immobilisiert sind, der durch Chemi- oder Physisorption an einem silberhaltigen Träger über eine Bindung zwischen einem weichen Metall und einer weichen Base angebracht ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Kontaktieren des silberhaltigen Trägers mit einer Thiodiglykollösung, wobei an dem Träger ein Ligand durch einen iodhaltigen heterobifunktionellen Abstandshalter immobilisiert ist; b) Einwirken von Ultraschallenergie auf den silberhaltigen Träger in Kontakt mit der Thiodiglykollösung; und c) Gewinnen der Liganden aus der Thiodiglykollösung.