ES2834484T3 - Método para la preselección de fármacos para enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas - Google Patents
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Abstract
Un método de ensayo para selección de un fármaco a fin de determinar la eficacia de un fármaco potencial en una proteína diana que se somete a cambios estructurales secundarios asociados con una enfermedad por plegamiento incorrecto de proteínas diana en un fluido corporal complejo, que comprende las etapas de: (a) conducir, en una celda de IR que comprende un elemento sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente infrarrojo y por lo menos un receptor para la proteína diana directamente injertado a por lo menos una superficie de dicho núcleo, en donde dicho por lo menos un receptor para la proteína diana consiste en anticuerpos capaces de unirse en forma específica y conformacional independiente a la proteína diana, un flujo de una muestra del fluido corporal complejo con proteína diana soluble, emitir un haz de IR a través de dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí; (b) conducir, en la misma celda de IR de la etapa (a), en donde los receptores para la proteína diana injertados a la superficie del núcleo se cargan con la proteína diana, un flujo de una disolución con fármaco potencial, emitir un haz de IR a través de dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí; y (c) analizar los espectros infrarrojos obtenidos para evaluar el efecto del fármaco potencial, determinando la distribución de la estructura secundaria de la proteína diana soluble en la muestra y después de la aplicación del fármaco potencial, en donde un desplazamiento ascendente o la desaparición de la banda de amida I para láminas β en el espectro de (b) en relación a la banda de amida I correspondiente en (a) es indicativo de la eficacia del fármaco potencial; en donde la proteína diana que se somete a transiciones conformacionales asociadas con enfermedad es la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para la preselección de fármacos para enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas
La invención da a conocer un método que ofrece información directa sobre la intervención de un fármaco potencial en la distribución de la estructura secundaria de la biomolécula diana, proteína Tau, es decir, la enfermedad de Alzheimer, vigilando un cambio estructural secundario por espectroscopia vibracional. El método se puede aplicar para pre-seleccionar fármacos candidatos que actúan sobre la proteína Tau. La intervención del fármaco se vigila libre de etiquetas en tiempo real y brinda información directa sobre la eficacia del fármaco potencial para prevenir especies de plegamiento patológico.
Antecedentes de la invención
El tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (AD) es un campo emergente que afecta a millones de seres humanos en todo el mundo. La progresión de la enfermedad se caracteriza por la formación de placas y ovillos en el cerebro, que se basan en procesos de agregación del péptido Ap y la proteína Tau. La agregación de proteínas es promovida por la transición estructural hacia especies de péptidos o proteínas enriquecidos con láminas p. El desarrollo de fármacos contra la enfermedad de Alzheimer es complejo. Muchos fármacos candidatos promisorios fracasaron en los ensayos clínicos (Emre, Int. J. Clinical Practice Supplement 127(junio):64-72 (2002); Imbimbo, J. Alzheimer's Disease: JAD 17(4):757-60 doi:10.3233/JAD-2009-1092 (2009); Cummings, Alzheimer's & Dementia 7(3):e13-44 doi:10.1016/j.jalz.2010.06.004 (2011); Greenberg et al., Alzheimer's & Dementia 9(1):39-49 doi:10.1016/j.jalz.2012.02.002 (2013); Cedernaes et al., Exp. Geront. 57(sept.):104-6 doi:10.1016/j.exger.2014.05.002 (2014)) y hasta ahora no hay ningún fármaco disponible en el mercado para curar estadios tempranos/intermedios de la enfermedad de Alzheimer ni estadios avanzados. En estos estadios en los que aparecen los síntomas clínicos, el cerebro ya está irreversiblemente dañado. Por lo tanto, un diagnóstico temprano antes de que aparezcan los síntomas clínicos es un pre-requisito. Dicha herramienta de diagnóstico se describe en el documento WO 2015121339. La solicitud de patente allí muestra que esta herramienta se puede usar para vigilar también la intervención de un fármaco en la distribución de la estructura secundaria y su capacidad de replegar las especies patológicas en formas inofensivas y vigilar de este modo su eficacia. Se emplean técnicas como resonancia de plasmones superficiales (SPR), ondas acústicas superficiales (SAW) o microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) para analizar interacciones proteína-ligando o proteína-fármaco. Por ende, estas técnicas ofrecen solamente información cinética pero no resolución espectral ni estructural; no pueden vigilar las distribuciones estructurales secundarias de las proteínas. Un planteamiento relacionado se refiere al uso de resonancia de plasmones superficiales de microconjuntos químicos de alto rendimiento (HT-CM-SPR), que es en principio un sistema de SPR inverso, dado que los fármacos potenciales se inmovilizan y la proteína diana se purga sobre la superficie (Pickhardt et al., Current Alzheimer Res. 12(9):814-28 (2015)). Este planteamiento se empleó exitosamente para identificar moléculas pequeñas que se unen a Tau monomérica (Pickhardt et al., Current Alzheimer Res. 12(9):814-28 (2015)), pero no se puede detectar un efecto sobre la estructura secundaria debido a la falta de resolución espectral y estructural. Otras técnicas como espectroscopia de absorción infrarroja con intensificación superficial (SEIRA) proporcionan resolución espectral, pero la reproducibilidad de las mediciones es muy problemática debido a la preparación de superficies de oro rugosas, y no proporciona una plataforma robusta para un análisis de proteínas-fármacos. La vanguardia en el diagnóstico clínico consiste en la tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía de resonancia magnética (MRT) para detectar agregados (acumulados de proteínas enriquecidas con láminas p) como placas en el cerebro humano. La disociación inducida por fármacos de dichos agregados que aparece en estadios avanzados se puede vigilar. No obstante, las técnicas PET y MRT son muy costosas y consumen mucho tiempo, por lo que no pueden emplearse como método de selección masivo ni para preselección de fármacos candidatos. Otra desventaja en el caso de PET, es el uso de agentes de contraste, que también estresa a los pacientes. Sin embargo, estas técnicas proporcionan el análisis del efecto del fármaco in vivo en estadios avanzados de la enfermedad. La presente invención puede revelar el efecto del fármaco analizando fluidos corporales como se muestra aquí para líquido cefalorraquídeo (CSF). Además de las técnicas ya mencionadas, los inmunoensayos basados en fluorescencia son también un campo emergente, especialmente el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de distribución de intensidad de fluorescencia basado en la superficie (sFIDA). Sin embargo, en contraste, estos ensayos no se realizan libres de etiquetas como la invención, debido a la necesidad de anticuerpos etiquetados fluorescentes que pueden influir en la distribución de la estructura secundaria de la proteína diana (Hülsemann et al., J. Alzheimer's Disease: JAD, julio doi:10.3233/JAD-160253 (2016); Kühbach et al., Frontiers in Neuroscience 10:8 doi:10.3389/fnins.2016.00008 (2016)). Cabe señalar especialmente que ELISA y sFIDA no ofrecen información directa sobre la distribución de la estructura secundaria o los cambios en la distribución de la estructura secundaria por parte del fármaco. Pero esta información es crucial para el análisis del efecto de un fármaco, como por ejemplo en enfermedades neurodegenerativas. Los ensayos frecuentes como inmunotransferencias Western blot también requieren anticuerpos secundarios etiquetados y proporcionan información indirecta sobre el estado de agregación de la proteína basada en el peso molecular solamente. Debido al proceso de preparación del análisis Western blot, se pierde la estructura secundaria nativa de la proteína. Por lo tanto, ELISA, sFIDA o Western blot no son capaces de medir directamente la
intervención de un fármaco potencial sobre la distribución de la estructura secundaria de una proteína diana. La presente invención supera todas las limitaciones mencionadas y ofrece pruebas de la eficacia del fármaco in vitro. Describimos en la bibliografía información detallada sobre la química y la configuración general de las superficies (Güldenhaupt et al., FEBS Journal 275 (23):5910-18 doi:10.1111/j.1742-4658.2008.06720.x (2008); Pinkerneil et al., ChemPhysChem 13 (11): 2649-53 doi: 10.1002/cphc.201200358 (2012); Schartner et al., JACS 135 (10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013); Schartner et al., Chembiochem 15(17):2529-34 doi:10.1002/cbic.201402478 (2014); Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016); Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)) y en la solicitud de patente WO 2015121339.
Como ejemplo de un fármaco candidato, se usa el azul de metileno. Es un compuesto que se aplica en muchos campos científicos distintos (Ramsay et al., British J. Pharmacol. 152(6):946-51 doi:10.1038/sj.bjp.0707430 (2007); Evora, Texas Heart Institute Journal / de Texas Heart Institute of St. Luke's Episcopal Hospital, Texas Children's Hospital 43(1):103 doi:10.14503/THIJ-15-5629 (2016); Rey-Funes et al., Am. J. Physiol., Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, March, doi:10.1152/ajpregu.00266.2015 (2016)). La agregación de la proteína Tau se asocia con varias enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Huntington (HD) o enfermedad de Pick (PiD) (Wang y Mandelkow, Nature Rev. Neuroscience 17(1 ):5-21 doi:10.1038/nrn.2015.1 (2016); Lee et al., Annual Rev. of Neuroscience 24:1121-59 doi:10.1146/annurev.neuro.24.1.1121 (2001); Alzheimer, Allg. Z. Psychiatrie Psychisch-gerichtl. Med. 64:146-148 (1907)). Claude Wischik demostró en 1996 la inhibición selectiva de la agregación de la proteína Tau con azul de metileno (Wischik et al., PNAS 93(20): 11213-18 (1996)). En las últimas décadas se investigó en varios estudios y hoy en día se analiza en un ensayo clínico de fase III (Baddeley et al., J. Pharm. Exp. Therap. 352(1):110-18 doi:10.1124/jpet.114.219352 (2015) ; Harrington et al., J. Biol. Chem. 290(17):10862-75 doi:10.1074/jbc.M114.616029 (2015); M et al., J. Alzheimer's Disease 2:705-720. doi: 10.3233/JAD-142874 (2015); Simic et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006 (2016)). En 2013, se descubrió que la oxidación del residuo Cys era la razón mecánica para la inhibición de la agregación de Tau (Akoury et al., Angew. Chem. (Int. Ed. Engl.) 52(12):3511-15 doi:10.1002/anie.201208290 (2013)). Describimos aquí un método de selección que utiliza un sensor de ATR-FTIR que mide directamente y sin etiquetas el efecto de fármacos potenciales sobre la distribución de la estructura secundaria de proteínas diana relacionadas con enfermedad, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Un requerimiento para el ensayo es el cambio estructural secundario dentro de la proteína durante la progresión de la enfermedad. Muchas enfermedades neurodegenerativas satisfacen este requerimiento porque la progresión de la enfermedad a menudo se caracteriza por agregación de una proteína o péptido específico. Puesto que la causa más frecuente de demencia es la enfermedad de Alzheimer, investigamos la interacción del fármaco con los dos biomarcadores principales Tau y Ap1-42. En el caso de la proteína Tau, que está implicada en la formación de ovillos neurofibrilares en el cerebro de pacientes con AD, el azul de metileno es un fármaco promisorio que está siendo actualmente evaluado en un ensayo clínico de fase III (Wischik et al., PNAS 93(20):11213-18 (1996); Wischik et al., J. Alzheimer's Disease 2:705-720 doi: 10.3233/JAD-142874 (2015); Simic et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006. (2016) ). Demostramos el potencial de nuestro método de selección usando dos fármacos candidatos diferentes: azul de metileno y berberina. Se midió la intervención de azul de metileno en la distribución de la estructura secundaria de la proteína Tau humana extraída de CSF de pacientes con AD (Figura 3). El fármaco potencial berberina es un fármaco diana múltiple que originalmente proviene de la medicina tradicional china (Yao et al., Science China Life Sciences 58(9):854-59 doi:10.1007/s11427-013-4568-z (2015)). El uso amplio de berberina en aplicaciones médicas se resume bien en la revisión de Ahmed et al. (Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015)). Especialmente, en el tratamiento de AD, la berberina muestra efectos promisorios (Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015); Campisi et al., Phytotherapy Res. 25(6):816-20 doi:10.1002/ptr.3340 (2011); Zhu y Qian, BMC Neuroscience 7:78 doi: 10.1186/1471-2202-7-78 (2006); Lee et al., Korean J. Physiol. & Pharmacol. 16(2):79-89 doi:10.4196/kjpp.2012.16.2.79 (2012)). La berberina exhibe un efecto positivo sobre la función de la memoria en modelos de rata (Lee et al., Korean J. Physiol. & Pharmacol. 16(2):79-89 doi:10.4196/kjpp.2012.16.2.79 (2012); Zhu y Qian, BMC Neuroscience 7:78 doi:10.1186/1471-2202-7-78 (2006); Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015)). Debido al amplio espectro del tratamiento con berberina, existen muchas vías y receptores que podrían cumplir una función crucial (Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002. (2015)). El mecanismo molecular en el efecto de la memoria que podría ser importante en el tratamiento de AD no se entiende por completo hasta el momento. Empleando nuestra invención, pudimos revelar una intervención de la berberina en la distribución de la estructura secundaria de AP1-42. Encontramos que la berberina desacelera la fibrilación autoinducida de Ap1-42 en altas concentraciones y puede por lo tanto ser un fármaco candidato interesante para mayor investigación. Los dos ejemplos muestran que el sensor ATR-FTIR se puede emplear como un ensayo de detección in-vitro universal para preseleccionar fármacos potenciales para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, especialmente enfermedad de Alzheimer.
Breve descripción de la invención
La presente invención da a conocer un ensayo de selección que utiliza un elemento sensor infrarrojo para el análisis directo de fármacos potenciales que inducen un cambio estructural secundario en la proteína diana Tau que se correlaciona con la eficacia del fármaco. Se basa en una superficie de germanio químicamente modificada (por ejemplo silanos o tioles), que termina con anticuerpos covalentemente acoplados. El principio es universal, por lo tanto se puede aplicar cualquier anticuerpo de captura contra la proteína Tau y además también cualquier fármaco potencial (anticuerpo terapéutico de moléculas pequeñas) puede ser en principio detectado con el ensayo desarrollado. Las proteínas diana pueden o bien inmovilizarse de muestras purificadas o extraerse de un fluido complejo como CSF humano. El análisis del fármaco potencial se realiza en tiempo real, libre de etiquetas, y proporciona evidencia de la eficacia in vitro. La invención proporciona por lo tanto
(1) un ensayo de detección de fármacos para determinar la eficacia de un fármaco potencial en una proteína diana que se somete a cambios estructurales secundarios en una especie patológica en una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas (en lo sucesivo también denominado "enfermedad con plegamiento incorrecto de proteínas"), que comprende las etapas de:
(a) conducir, en una celda de IR que comprende un elemento sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interno con un núcleo de un material transparente infrarrojo y por lo menos un receptor para la proteína diana directamente injertado a por lo menos una superficie de dicho núcleo, un flujo de una muestra con proteína diana soluble, emitir un haz de IR a través de dicha primera celda IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí;
(b) conducir, en la misma celda de IR de la etapa (a), en donde los receptores para la proteína diana, que están injertados a la superficie del núcleo, se cargan con la proteína diana, un flujo de una disolución con fármaco potencial, emitir un haz de IR a través de dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí; y
(c) analizar los espectros infrarrojos obtenidos para evaluar el efecto del fármaco potencial determinando la distribución de la estructura secundaria de la proteína diana soluble en la muestra y después de la aplicación del fármaco potencial, en donde el desplazamiento ascendente o la desaparición de la banda de amida I en el espectro de (b) en relación a (a) es indicativo de la eficacia del fármaco potencial, en donde la proteína diana que se somete a transiciones conformaciones asociadas con la enfermedad es la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer, y
(2) el uso de un elemento sensor infrarrojo como se definió anteriormente en (1) para el análisis directo de la interacción entre un fármaco potencial y la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer. Breve descripción de las figuras
Figura 1: Resumen gráfico que muestra el principio general del método inventado.
Figura 2: (A) Unión del anticuerpo de Tau-5 vía química de silano y lavado final con tampón PBS. (B) El anticuerpo captura específicamente la proteína Tau de CSF humano, que permanece lo suficientemente estable después de lavar la superficie con tampón PBS.
Figura 3: La proteína Tau se inmovilizó en germanio terminado con anticuerpo. La amida I de la proteína Tau representa una gran cantidad de láminas p que resulta en una absorbancia máxima a 1640 cm-1 (negro). La adición del fármaco potencial azul de metileno desplazó la banda de amida I hacia 1653 cm-1, indicando un cambio estructural importante a una distribución de la estructura secundaria dominada por la hélice a (gris). Figura 4: Los espectros diferenciales entre los dos espectros que se exhiben en la Figura 3 muestran principalmente una reducción de la lámina p y un incremento de la hélice a por adición de azul de metileno (50 pM). Esto demuestra que la intervención del fármaco en la distribución de la estructura secundaria se puede vigilar mediante la invención de manera muy precisa.
Figura 5: Desplazamiento estructural de la banda de amida I de la proteína Tau de CSF con (negro) y sin la presencia de azul de metileno (gris) dependiente del tiempo.
Figura 6: La proteína Ap1-42 se inmovilizó en una superficie de germanio terminada en anticuerpo (A8978). El espectro gris claro (derecha) muestra una amplia distribución de las diferentes estructuras secundarias con una absorbancia máxima a 1634 cm-1 característica para Ap1-42 fibrilizada. Asimismo, la amida I del intermedio del proceso de plegamiento (línea de puntos gris) se muestra después de 160 min. La adición del fármaco potencial berberina (100 pM) resulta en una distribución secundaria importante diferente dominada ahora por una isoforma a-helicoidal o principalmente monomérica de Ap1-42 a 1659 cm-1 (espectro negro,
izquierda), sin embargo con un borde significativo a 1634 cirr1. El espectro gris oscuro de puntos muestra la banda de amida I como intermedio del proceso de plegamiento después de 160 min.
Figura 7: Comparación de la distribución de la estructura secundaria de Ap1-42 (negro) después de la incubación con azul de metileno (gris claro), berberina (gris), y sin la intervención de ningún fármaco (negro). Como ya se observó en la Figura 6, la berberina desplaza la distribución principalmente hacia la hélice a, mientras que el azul de metileno induce la formación de láminas p y fibrillas. Este hallazgo es concordante con la bibliografía (Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411 k (2007). Esto demuestra que se pueden resolver distintas intervenciones en la distribución de la estructura secundaria con distintos fármacos.
Figura 8: El fármaco potencial berberina (100 pM) no cambió la distribución de la estructura secundaria de la proteína Tau (extraída de CSF) a diferencia del azul de metileno, como se muestra en la Figura 3. Este hallazgo demuestra que se pueden resolver diferentes intervenciones de diferentes fármacos en la misma proteína diana.
Descripción detallada de la invención
La invención describe un método para la preselección de fármacos potenciales contra la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer. El método comprende las etapas de:
(a) conducir, en una celda de IR que comprende un elemento sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interno con un núcleo de un material transparente infrarrojo y por lo menos un receptor para el biomarcador candidato directamente injertado a por lo menos una superficie de dicho núcleo, un flujo de una muestra con proteína biomarcadora candidata soluble, emitir un haz de IR por dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí;
(b) conducir, en la misma celda de IR de la etapa (a), en donde los receptores para el biomarcador candidato, que están injertados a la superficie del núcleo, se cargan con la proteína biomarcadora candidata, un flujo de una disolución con fármaco potencial, emitir un haz de IR por dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí; y
(c) analizar los espectros infrarrojos obtenidos para evaluar el efecto del fármaco potencial, determinando la distribución de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata soluble en la muestra y después de la aplicación del fármaco potencial, en donde un desplazamiento ascendente o desaparición de la banda de amida I en el espectro de (b) en relación a (a) es indicativo de la eficacia del fármaco potencial.
De acuerdo con la invención, el material transparente infrarrojo de la celda de IR se selecciona entre arseniuro de galio, silicio, germanio, seleniuro de zinc y diamante, y preferiblemente es germanio. Además, la proteína biomarcadora candidata se somete a transiciones conformaciones asociadas con la enfermedad y es la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer. Asimismo, la muestra con la proteína biomarcadora candidata puede ser una muestra purificada del biomarcador o puede ser un fluido corporal complejo que comprende el biomarcador que incluye CSF humano.
Se prefiere que dicho elemento sensor infrarrojo comprenda un elemento de reflexión interna de germanio que tenga forma de trapezoide o paralelogramo y que sea transparente en el infrarrojo con suficiente relación señal a ruido para detectar la banda de amida I más allá de la absorbancia de fondo grande, y que por lo menos un receptor para la proteína biomarcadora consista en anticuerpos capaces de unirse en forma específica y conformacional independiente a la proteína biomarcadora, y que se injerte directamente a por lo menos una superficie, preferiblemente a por lo menos dos o tres superficies de dicho elemento de reflexión interna de germanio, por silanización con enlazadores de silano cortos o por tiolación con enlazadores de tiol cortos, sometiendo a reacción grupos amina libremente accesibles de dicho por lo menos un receptor con grupos reactivos amina en los enlazadores silano/tiol cortos, y bloqueando los grupos reactivos amina restantes en los enlazadores silano/tiol cortos con una sustancia bloqueante que no reaccione en forma cruzada con la proteína biomarcadora.
De acuerdo con la invención, se prefiere particularmente que el elemento de reflexión interna sea un monocristal de germanio, preferiblemente un monocristal de germanio con corte trapezoide. Se prefiere además que el cristal de germanio permita una, más de una o más de tres reflexiones de luz infrarroja a través del elemento de reflexión, particularmente se prefieren más de cinco u once o más de veinte reflexiones (se prefieren 25 reflexiones con 13 reflexiones sensadas activamente). Incluso más, se prefiere particularmente que el elemento de reflexión interna sea adecuado para análisis paralelo por otro método óptico, incluida la detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Finalmente, es crucial que la sustancia bloqueante no reaccione en forma cruzada con la proteína biomarcadora, que se selecciona entre caseína, etanolamina, L-lisina, polietilenglicoles, albúminas y sus derivados.
Los enlazadores de silano y tiol para el injerto incluyen enlazadores de silano y tiol homogéneos, mezclas de enlazadores de silano y mezclas de enlazadores de tiol, y tienen una longitud de cadena del enlazador eficaz (número combinado de átomos de carbono y heteroátomos) de no más de 20 átomos o no más de 15 átomos, preferiblemente
los enlazadores de silano tienen una de las siguientes fórmulas:
(i) X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
(ii) X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z o
(iii) X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
y los enlazadores de tiol tienen la siguiente fórmula:
(iv) WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
en donde W es H o R1S-, X en cada caso se selecciona en forma independiente entre halógeno y alcoxi C1-6, n es un número entero entre 1 y 10, n' es un número entero entre 1 y 5; R1 en cada caso se selecciona en forma independiente de alquilo C1-6, Y se selecciona de un enlace químico, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- y -SO2NR2-(en donde R2 es H o alquilo C1-6), y Z es un grupo reactivo amina que incluye -CO2K-SO3H y sus derivados de éster. El halógeno dentro de la presente invención incluye un átomo de flúor, cloro, bromo y yodo. Alquilo C1-6 y alcoxi C1-6 incluyen grupos alquilo o alcoxi lineales, ramificados o cíclicos que tienen 1 a 6 átomos de carbono que pueden estar saturados o insaturados. En el caso de grupos alquilo y alcoxi cíclicos, esto se refiere a aquellos que tienen 3 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo C1-6 y alcoxi C1-6 adecuados incluyen, entre otros, metilo y metoxi, etilo y etoxi, n-propilo y npropoxi, isopropilo e iso-propoxi, ciclopropilo y ciclopropoxi, n-butilo y n-butoxi, terc-butilo y terc-butoxi, ciclobutilo y ciclobutoxi, n-pentilo y n-pentoxi, ciclopentilo y ciclopentoxi, n-hexilo y n-hexoxi, ciclohexilo y ciclohexoxi, etc. El grupo reactivo de amina Z incluye todos los tipos de grupos funcionales que son reactivos con un grupo amino libre. Entre estos, -CO2H, -SO3H y sus derivados de éster (incluidos ésteres activos), se prefieren particularmente.
Los elementos estructurales -(CH2)n- y -(CH2V- en las fórmulas anteriores pueden también contener uno o más dobles y/o triples enlaces y pueden sustituirse con uno o más átomos de halógeno tales como flúor, o con deuterio.
Cuando el elemento sensor infrarrojo es obtenible por silanización, entonces se prefiere que en los enlazadores de las fórmulas (i) a (iii) anteriores, X se seleccione en forma independiente entre grupos alcoxi C1-6, preferiblemente entre grupos metoxi y etoxi, Y sea -NHCO-, Z sea -CO2H o su derivado de éster, y n sea un número entero entre 1 y 5, y n' sea un número entero entre 1 y 3, preferiblemente n sea 3 y n' sea 2. Cuando el elemento sensor infrarrojo es obtenible por tiolación, se prefiere entonces que en el enlazador de fórmula (iv) anterior W sea H, Y sea un enlace químico, Z sea -CO2H o su derivado de éster, y n sea un número entero entre 1 y 8, y n' sea un número entero entre 1 y 5, preferiblemente n sea 8 y n' sea 4.
La proteína biomarcadora es una proteína Tau y la unión del receptor a la proteína Tau es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo accesible para todas las variantes de Tau (regiones fosforiladas, truncadas, de 3 a 4 repeticiones, etc., isoformas), incluido el anticuerpo Tau-5. En el método de la invención, la concentración del fármaco potencial en la disolución está o bien debajo del límite de detección de la determinación IR o se puede sustraer fácilmente por espectros de referencia del fármaco potencial.
La presente invención se basa en la detección de cambios estructurales secundarios inducidos por el fármaco potencial mediante espectroscopia vibracional. La invención emplea en principio la misma configuración experimental que nuestra solicitud de patente anterior WO 2015121339. En lugar de un espectrofotómetro de 70V (Bruker), empleamos un espectrofotómetro de 80V FTIR (Bruker) para mejorar la relación de señal a ruido de las mediciones. Como el elemento de reflexión interna se modificó el cristal de germanio con NHS-silanos, que funcionan como anclajes para el acoplamiento covalente de los anticuerpos deseados. Después de bloquear la superficie con caseína, la superficie está lista para capturar la proteína diana (Tau). La proteína Tau se extrajo directamente de CSF humano. Esta es una gran ventaja, ya que no se requieren proteínas purificadas y no es necesario ningún pre-tratamiento del CSF, lo que hace que el ensayo sea fácilmente accesible para la aplicación en consultorios o laboratorios clínicos. La proteína diana se analizó en presencia del fármaco potencial, y se vigiló el efecto por el cambio en la banda de amida I. Como se muestra para la proteína Tau, el efecto del fármaco potencial azul de metileno se vigiló directamente (Figura 3). El cambo de la distribución estructural secundaria se caracteriza por el desplazamiento inducido por el fármaco
de la banda de amida I de 1640 cirr1 (sin tratar) a 1653 cirr1 (tratada). El efecto se torna incluso más obvio en el espectro de diferencia doble (Figura 4), que muestra claramente una banda negativa a 1625 cmr1, indicativa de la desaparición de lámina p y una banda positiva a 1655 cirr1, típica de una hélice a. En un control sin fármaco, la máxima absorbancia de la banda de amida I de la proteína Tau permanece estable (Figura 5). Por lo tanto, para la pre-selección de fármacos candidatos en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, la invención proporciona una plataforma ideal. Otro ejemplo es el estudio del segundo biomarcador importante Ap1-42. Dado que el sensor desarrollado es universal, el anticuerpo A8978 contra el epítopo 13-28 de Ap1-42 podría aplicarse al análisis del fármaco potencial berberina. Para vigilar un efecto potencial de la berberina, la superficie se cargó con Ap1-42 sintética. Sin ninguna incubación, el proceso de fibrilación autoinducido en altas concentraciones conduce a una amplia distribución de la estructura secundaria de Ap1-42 dominada por la lámina p (Figura 6, gris claro). La adición de berberina desplaza la máxima de amida I de la distribución estructural secundaria amplia de 1634 a 1659 cm-1, indicando principalmente especies a-helicoidales o monoméricas (Figura 6, negro). Por consiguiente, la berberina parece desacelerar el proceso de fibrilación autoinducido. Puede ser una diana interesante para posteriores investigaciones. En conclusión, el método ofrece información directa libre de etiquetas sobre la intervención de la distribución de la estructura secundaria de la proteína diana por un fármaco candidato, como se demuestra para Tau y Ap1-42. Resuelve la intervención diferente del fármaco en la misma proteína diana. Este planteamiento universal puede en principio transferirse a cualquier proteína y molécula pequeña (fármaco potencial) y por lo tanto tiene un muy alto potencial para aplicaciones farmacéuticas.
La invención se describe además en los siguientes Ejemplos, que sin embargo no deben interpretarse como limitativos de la solicitud.
Ejemplos
Materiales y métodos: El mismo diseño experimental que se utilizó en la solicitud de patente previa WO 2015121339 del solicitante.
Muestreo y pretratamiento: Se extrajo CSF por punción lumbar y se dividió en alícuotas en el hospital universitario Essen, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido, se envió y conservó a -80 °C. Las muestras no se pre-trataron antes de la medición, solamente se descongelaron a 37 °C durante 30 s y se mantuvieron en hielo hasta su uso.
Disolución salina tamponada con fosfato (tampón PBS): cloruro de sodio 137 mM (NaCl), cloruro de potasio 2,7 mM (KCl), fosfato total 12 mM (en la forma de Na2HPO4 y NaH2PO4), pH 7,4.
Disolución en bloque de caseína: hidróxido sódico 200 mM (NaOH), 1 % (p/v) caseína de leche bovina (en polvo), pH ajustado con H3PO4 hasta 7,4.
Disolución de silanización: El NHS-silano 2,5-dioxopirrolidin-1-il éster de ácido (N-(4,4,4-trietoxisilanobutil)succinámico) utilizado se sintetizó y caracterizó como se describe (Schartner et al., JACS 135(10):4079-4087 (2013).
Anticuerpo: Para el análisis de AP1-42, se empleó el anticuerpo A8978 (lote núm: 061M4773, Sigma Aldrich). En el caso de la proteína Tau, se usó el anticuerpo Tau-5 (AHB0042, Thermo Fisher Scientific). AP1-42: Se adquirió el péptido Ap humano de Sigma-Aldrich (A9810, fragmento de proteína amiloide-beta 1-42).
Fármacos potenciales: Se adquirieron azul de metileno (hidrocloruro de metiltionina, lote núm: 66720) y cloruro de berberina (lote núm: B3251) por Sigma Aldrich.
Toma de la medición: El procedimiento general es idéntico al de la solicitud de patente WO 2015121339. Se efectuaron mediciones de IR en un espectrómetro Vertex 80V (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemania) con un detector de mercurio-cadmio-telurio (MCT) enfriado en nitrógeno líquido. Se registraron interferogramas de los dos lados en un movimiento hacia adelante/atrás del interferómetro a una tasa de datos de 80 kHz con una resolución espectral de 2 cm'1, apodización Blackman-Harris de 3 términos, corrección de fases Mertz y 4 veces relleno de ceros. Los espectros de referencia se registraron como un promedio de 1000, espectros de muestra de 200 interferogramas. El registro de espectros de canales individuales de referencia del sensor blanco, sensor con 2-propanol, la superficie silanizada, los tampones, la superficie recubierta con anticuerpo o caseína en estados de equilibrio posibilitaron la espectroscopia con diferencia de alta sensibilidad basada en la ley de Lambert-Beer (E=-logaritmo(I/Iü). La absorbancia del cambio de estado es el logaritmo decádico negativo de la relación de intensidad antes y después del cambio.
Proteína Tau tratada con azul de metileno: El anticuerpo Tau (Tau-5) de Thermo Fisher Scientific se acopló en forma covalente a la superficie de germanio como lo describieron Nabers et al para otros anticuerpos. (Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)). Después de bloquear la superficie terminada con el anticuerpo Tau se incubó con 100 pl de CSF humano hasta que se inmovilizó exitosamente la proteína Tau (aproximadamente 60 min). En la etapa siguiente, se purgaron 2 ml de una disolución de azul de metileno 50 pM (PBS, pH 7,4) sobre la superficie hasta que se equilibró el sistema (1 ml) y luego se circuló durante 60 min. El efecto de tau sobre la estructura secundaria se vigiló directamente por la posición de la banda y la forma de la amida I.
Péptido Ap tratado con berberina: Se empleó el anticuerpo A8979 (Sigma Aldrich) para capturar el péptido Ap (Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). El péptido Ap (Ap1-42, sintético, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se monomerizó por incubación con hexafluoro-2-propanol como se describe en otra parte (Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)). Para el análisis, se circularon 100 pg de Ap1-42 sobre el sensor terminado con anticuerpo durante 1 h para asegurar que el fármaco no interfiriera con el proceso de inmovilización. En los experimentos control, la inmovilización de Ap1-42 se vigiló otras 17 h (total 18 h) en presencia del fármaco potencial, para seguir el proceso de fibrilación autoinducida (Figura 6, espectro gris claro). Para analizar el efecto del fármaco potencial berberina, se usó el mismo protocolo que en el experimento control. La única diferencia fue la adición de berberina 100 pM después de 1 h de inmovilización de Ap1-42 (PBS, pH 7,4) equilibrando con 1,5 ml de disolución de berberina 100 pM y posteriormente la circulación del sistema en presencia de berberina 100 pM (Figura 6, espectro negro). El efecto sobre la estructura secundaria de Ap1-42 se vigiló directamente por la posición de la banda y la forma de la amida I. Los correspondientes espectros de puntos muestran intermedios de los procesos de plegamiento para cada experimento después de un tiempo total de 160 min.
Pretratamiento de los espectros: Para sustracción escalonada de un espectro de referencia, se eliminó vapor de agua. Los espectros se corrigieron en la línea de base, se efectuó un promedio gradual como se describe (Schartner et al., Chembiochem 15(17):2529-34 doi:10.1002/cbic.201402478 (2014)) y se normalizó a la misma intensidad de señal de la amida I en la región 1730 hasta 1590 cirr1 dependiendo de la estructura secundaria observada.
Ejemplo 1: el azul de metileno "cura" la enfermedad de Alzheimer in vitro
Para vigilar el efecto del fármaco azul de metileno se empleó el método inventado. Previamente inventamos un sensor inmuno-ATR, que diferencia AD con una precisión del 90 % en base a CSF y 84 % en base a plasma sanguíneo (Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). Primero, empleamos química de silano para modificar la superficie de germanio (Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)). En segundo lugar, se inmovilizó en forma covalente el anticuerpo monoclonal IgG1, Tau-5 en la superficie de germanio. La inmovilización se completó después de 2 horas, como se presenta en la Figura 2A, alcanzando una absorbancia de 5 mOD. Después de lavar la superficie con tampón de unión 1, el anticuerpo permanece estable (Figura 2A). Para obtener una superficie altamente específica, la saturación con caseína es crucial (Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)). Finalmente, se purga una muestra compleja tal como líquido cefalorraquídeo (CSF) sobre el sensor. La cinética de unión monoexponencial resultante de la proteína Tau se presenta en la Figura 2B. Con la fracción de Tau inmovilizada es ahora posible analizar el efecto del fármaco potencial azul de metileno. Se purgó una disolución 50 pM de azul de metileno sobre la superficie y después de equilibrar se hizo circular el sistema. El sensor inmuno-ATR-FTIR anteriormente mencionado (WO 2015121339) para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer usa para el diagnóstico un clasificador de umbral simple con un valor a 1643 cirr1 para AD y diferenciación del control de la enfermedad, que puede también transferirse a la proteína Tau (datos no publicados, solicitud de patente en preparación). El espectro negro en la Figura 3 muestra una máxima de la amida I de 1640 cm-1, lo que indica una cantidad mayor de isoformas enriquecidas con láminas p relacionadas con la enfermedad, que se diagnosticaría como enfermedad por nuestro sensor inmuno-IR (Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016). Tras la incubación con azul de metileno, se observó un desplazamiento significativo a números de onda más altos al cabo de 1 h (Figura 3, espectro gris), por lo tanto, el fármaco potencial azul de metileno indujo un cambio de la estructura secundaria a una conformación patológica o a-helicoidal. Esto no concuerda con los estudios in vivo del grupo de Claude Wischik, que demostraron la reducción de ovillos asociados a Tau en cerebro humano (Simio et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006 (2016); Wischik et al., PNAS 93(20): 11213-18 (1996)). El paciente sería ahora diagnosticado como sano por el sensor inmuno-ATR-FTIR que desarrollamos (Figura 3, espectro gris) (Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). Por consiguiente, el planteamiento presentado tiene un muy alto potencial como herramienta de pre-selección para la selección de fármacos candidatos contra AD y también contra otras enfermedades neurodegenerativas. Al sustraer el estado tratado con fármaco menos el estado no tratado, el cambio estructural secundarios se torna incluso más obvio, como lo indican la banda negativa a 1625 cm'1 y la banda positiva a 1655 cm'1 (Figura 4). Para probar que los cambios realmente son causados por azul de metileno, se realizó un control sin metileno
(Figura 5). La máxima de la amida I es estable y solamente difiere en aproximadamente ±1 números de onda sin la incubación del fármaco (Figura 5, línea gris), mientras que con la presencia del fármaco se observa un claro desplazamiento ascendente de los números de onda (Figura 5, línea negra).
Ejemplo de referencia 2: la berberina desacelera la agregación de la proteína AP1-42
La segunda proteína marcadora importante para la enfermedad de Alzheimer es AP1-42. Analizamos el proceso de fibrilación con el método descrito. Se monomerizó AP1-42 sintético con hexafluoro-2-propanol. Una disolución de AP1-42 monomerizado se purgó sobre el sensor y se inmovilizó específicamente con anticuerpo A8979 (Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):234-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)). La fibrilación espontánea se vigiló durante 18 h resultando en una máxima de la amida I de 1634 cm-1 (Figura 6, espectro gris claro). El mismo experimento se realizó en presencia de berberina 100 pM exhibiendo un desplazamiento de 25 cm-1 de la máxima de la amida I a 1659 cm-1 (Figura 6, espectro negro). Esto indica que la berberina desacelera directamente el proceso de agregación de AP1-42. Se observa una pequeña cantidad de isoformas enriquecidas con láminas p como borde a 1634 cm-1, pero la conformación dominante es AP1-42 monomérico. Esto sugiere una interacción directa de berberina y AP1-42 que podría aplicarse como fármaco para prevenir el proceso inicial de AD y por lo tanto podría ser útil para demorar la progresión de la enfermedad.
Ejemplo de referencia 3: el azul de metileno afecta también la proteína AP1-42
Se investigó también el efecto del azul de metileno sobre AP1-42 bajo las mismas condiciones que para berberina. El espectro obtenido muestra claramente una fibrilla (Figura 7, espectro gris claro), que concuerda con la bibliografía (Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411k (2007)). El efecto se analiza para prevenir la formación de oligómeros tóxicos y por lo tanto podría tener un potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411 k (2007)). Esto demuestra que el método funciona de manera muy eficiente y proporciona información directa acerca del mecanismo molecular del fármaco.
Ejemplo 4: la berberina no afecta la proteína Tau
Asimismo, estudiamos el efecto de la berberina sobre la proteína Tau (de CSF) bajo las mismas condiciones que para azul de metileno (Figura 8). La banda de amida y su máxima no se ven afectadas por el tratamiento con berberina, lo que indica que la berberina no tiene un efecto importante sobre la proteína Tau en comparación con el azul de metileno (Figura 3 y Figura 8).
Claims (11)
1. Un método de ensayo para selección de un fármaco a fin de determinar la eficacia de un fármaco potencial en una proteína diana que se somete a cambios estructurales secundarios asociados con una enfermedad por plegamiento incorrecto de proteínas diana en un fluido corporal complejo, que comprende las etapas de:
(a) conducir, en una celda de IR que comprende un elemento sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente infrarrojo y por lo menos un receptor para la proteína diana directamente injertado a por lo menos una superficie de dicho núcleo, en donde dicho por lo menos un receptor para la proteína diana consiste en anticuerpos capaces de unirse en forma específica y conformacional independiente a la proteína diana, un flujo de una muestra del fluido corporal complejo con proteína diana soluble, emitir un haz de IR a través de dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí;
(b) conducir, en la misma celda de IR de la etapa (a), en donde los receptores para la proteína diana injertados a la superficie del núcleo se cargan con la proteína diana, un flujo de una disolución con fármaco potencial, emitir un haz de IR a través de dicha celda de IR y obtener un espectro infrarrojo a partir de allí; y
(c) analizar los espectros infrarrojos obtenidos para evaluar el efecto del fármaco potencial, determinando la distribución de la estructura secundaria de la proteína diana soluble en la muestra y después de la aplicación del fármaco potencial, en donde un desplazamiento ascendente o la desaparición de la banda de amida I para láminas p en el espectro de (b) en relación a la banda de amida I correspondiente en (a) es indicativo de la eficacia del fármaco potencial;
en donde la proteína diana que se somete a transiciones conformacionales asociadas con enfermedad es la proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
(i) el material transparente infrarrojo de la celda de IR se selecciona en forma independiente entre arseniuro de galio, silicio, germanio, seleniuro de zinc y diamante, y preferiblemente es germanio; y/o
(ii) la muestra del fluido corporal complejo con la proteína diana es CSF humano o sangre.
3. El método según la reivindicación 1, en donde el elemento sensor infrarrojo comprende un elemento de reflexión interna de germanio con forma de trapezoide o paralelogramo, en donde los anticuerpos se injertan directamente a por lo menos una superficie de dicho elemento de reflexión de germanio interna por silanización con enlazadores de silano cortos o por tiolación con enlazadores de tiol cortos, sometiendo a reacción grupos amina libremente accesibles de los anticuerpos con grupos reactivos amina en los enlazadores de silano/tiol cortos, y bloqueando los grupos reactivos amina restantes en los enlazadores de silano/tiol cortos con una sustancia bloqueante que no reacciona en forma cruzada con la proteína diana.
4. El método según la reivindicación 3, en donde el elemento de reflexión interna
(i) es un monocristal de germanio, preferiblemente es un monocristal de germanio con corte trapezoide; y/o
(ii) proporciona más de un pasaje de luz infrarroja a través del elemento de reflexión; y/o
(iii) es además adecuado para el análisis paralelo por otro método óptico que incluye detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda; y/o
(iv) la sustancia bloqueante que no reacciona en forma cruzada con la proteína diana se selecciona entre caseína, etanolamina, L-lisina, polietilenglicoles, albúminas y sus derivados.
5. El método según la reivindicación 3 o 4, en donde los enlazadores de silano y tiol incluyen enlazadores de silano y tiol homogéneos, mezclas de enlazadores de silano y mezclas de enlazadores de tiol, y tienen una longitud de cadena de los enlazadores eficaz (número combinado de átomos de carbono y heteroátomos) de no más de 20 átomos o no más de 15 átomos, preferiblemente
los enlazadores de silano tiene una de las siguientes fórmulas:
(i) X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
(ii) X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z o
(iii) X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
y los enlazadores de tiol tienen la siguiente fórmula:
(iv) WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
en donde W es H o R1S-, X en cada caso se selecciona en forma independiente entre halógeno y alcoxi C1-6, n es un número entero entre 1 y 10, n' es un número entero entre 1 y 5; R1 en cada caso se selecciona en forma independiente entre alquilo C1-6, Y se selecciona entre un enlace químico, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- y -SO2NR2-(en donde R2 es H o alquilo C1-6), y Z es un grupo reactivo amina, como -CO2H, -SO3H y sus derivados de éster.
6. El método según la reivindicación 5, en donde el elemento sensor infrarrojo es obtenible por
(i) silanización y en los enlazadores de las fórmulas (i) a (iii) X se selecciona en forma independiente entre grupos alcoxi C1-6 , preferiblemente entre grupos metoxi y etoxi, Y es -NHCO-, Z es -CO2H o su derivado de éster, y n es un número entero entre 1 y 5, y n' es un número entero entre 1 y 3, preferiblemente n es 3 y n' es 2; o
(ii) tiolación y en los enlazadores de fórmula (iv) W es H, Y es un enlace químico, Z es -CO2H o su derivado de éster y n es un número entero entre 1 y 8, y n' es un número entero entre 1 y 5, preferiblemente n es 8 y n' es 4.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde
el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo accesible para todas las variantes Tau (regiones de 3 a 4 repeticiones fosforiladas, truncadas, e isoformas), incluido el anticuerpo Tau-5.
8. El método según la reivindicación 1, en donde, si el fármaco potencial posee bandas amida, como anticuerpos, el método comprende además sustraer un espectro de referencia del fármaco potencial para detectar el desplazamiento de la banda de amida I de la proteína diana.
9. Uso de un elemento sensor infrarrojo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el análisis directo de la interacción entre un fármaco potencial y una proteína Tau asociada con la enfermedad de Alzheimer.
10. El uso según la reivindicación 9, en donde el análisis de la estructura secundaria o el cambio estructural de la proteína diana tras el tratamiento con el fármaco potencial ofrece información directa sobre la eficacia del fármaco hacia la proteína Tau.
11. El uso según la reivindicación 10, que es para la pre-selección de fármacos candidatos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
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