ES2935060T3 - Procedimiento para la determinación de los agregados de proteínas utilizando la superficie FIDA - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método para detectar indicadores para detectar enfermedades (indicadores de enfermedades), proteínas mal plegadas en los agregados de las mismas que juegan un rol. La invención también se refiere a un método para cuantificar y/o caracterizar selectivamente dichos indicadores de enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la determinación de los agregados de proteínas utilizando la superficie FIDA
La invención se refiere a un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad, en los que desempeñan un papel los agregados de proteínas mal plegadas, al uso de un estándar para la cuantificación selectiva y/o caracterización de los indicadores de enfermedad en este procedimiento, a un procedimiento para la determinación de enfermedades que presentan agregados de proteínas mal plegadas, así como a un kit para el uso en tal procedimiento.
Los agregados patológicos de proteínas endógenas, tal como, por ejemplo, los oligómeros o las fibrillas, se producen en muchas enfermedades neurodegenerativas.
Las amiloidosis son enfermedades que están caracterizadas por depósitos extracelulares de proteínas insolubles y mal plegadas. Estos agregados están presentes por lo general en forma de fibras, las llamadas fibrillas beta. El término amiloide (= similar al almidón) se deriva de las similitudes espectrofotométricas de las fibrillas teñidas de Rojo Congo y el almidón. La etiología de la amiloidosis puede ser tanto hereditaria como también espontánea. Además, algunas amiloidosis ocurren como enfermedades secundarias.
En la enfermedad de Alzheimer (AD, demencia de Alzheimer, en latín = Morbus Alzheimer) se producen agregados de A-beta. Además de la enfermedad de Parkinson, la AD pertenece a un grupo heterogéneo de estados clínicos, cuyo criterio común en muchos casos (pero no exclusivamente) es la deposición extracelular, sistémica o local de una proteína específica en cada caso, en la mayoría de los casos en conformaciones ricas en hojas plegadas beta.
Sin embargo, los depósitos de péptidos beta amiloides (o fibrillas peptídicas) representan solo la etapa final de un proceso. Las principales características patológicas de la AD son la formación de placas seniles o amiloides, que consisten en el péptido A-beta y depósitos neurofibrilares adicionales de la proteína tau. La proteína precursora del péptido A-beta, APP, está localizada en la pared celular de las neuronas. Mediante degradación proteolítica y modificación posterior se originan fragmentos de A-beta de diferente longitud y tipo, como por ejemplo A-beta 1-40, A-beta 1-42 o pGluA-beta 3-42. Los péptidos monoméricos A-beta también se originan en el organismo sano durante toda la vida.
Según la hipótesis de la cascada amiloide de la década de 1990, los depósitos de A-beta en forma de placas son los desencadenantes de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, en los últimos años, diferentes estudios indican que especialmente los pequeños oligómeros A-beta, que se difunden libremente, poseen la mayor toxicidad entre todas las especies A-beta y son responsables de la formación y el progreso de la AD. Por lo tanto, los agregados del péptido A-beta están directamente relacionados con la patogénesis de AD y pueden usarse como biomarcadores de AD (Wang-Dietrich et al., J. Alzheimer's Disease 34, 2013, 985-994). Sin embargo, sería útil apoyar el diagnóstico mediante otro procedimiento de rutina, en particular para diferenciar otras enfermedades basadas en proteínas endógenas mal plegadas.
Los agregados de proteínas también se enumeran en los documentos WO 2005/018424 A1, WO 2008/070229 A2, DE 102006010647 A1, Bannach et al. (Plosone, mayo 2012, vol. 7, punto 5, e36620), WO 2010/003227 A1, DE 102011 057021 A1 y WO 2013/092952 A2 (publicado el 27/06/2013).
La amiloidosis AA es una enfermedad secundaria bastante rara en la enfermedad intestinal inflamatoria crónica, como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. En los pacientes predominantemente varones, se ven afectados el riñón, tracto gastrointestinal, bazo, hígado, páncreas y corazón (con una frecuencia decreciente). La amiloidosis AA se manifiesta dentro de los 10 a 20 años posteriores a la aparición de la enfermedad primaria. Los síntomas clínicos comprenden síntomas nefróticos, proteinuria o cardiomiopatía. La amiloidosis sistémica AA también afecta a las células nerviosas. Para la terapia de la amiloidosis AA se utilizan una serie de medicamentos, entre los que se incluyen alquilantes, metotrexato, bloqueadores del TNF-a, entre otros. En caso de insuficiencia renal terminal se puede realizar una diálisis o un trasplante de riñón. Pero, el principal objetivo terapéutico es inhibir la síntesis de la proteína precursora del amiloide A en suero.
La amiloidosis AL puede manifestarse sistémica o localmente limitada. La causa es una enfermedad de las células plasmáticas clonales. A este respecto se producen cadenas ligeras amiloidogénicas, que forman fibrillas y se depositan en el intersticio de diferentes órganos. Los más comúnmente afectados son el riñón, corazón, intestinos, hígado y sistema nervioso autónomo. También es típica la aparición de polineuropatía.
AApoAl es un componente proteico de la lipoproteína de alta densidad (HDL), cuya función natural es transportar el colesterol y los fosfolípidos insolubles en agua en la sangre. Una mutación en la región N-terminal confiere propiedades amiloidogénicas a AApoAI. La amiloidosis AApoAl hereditaria se manifiesta en una polineuropatía de los pies y las manos. El riñón, corazón, hígado (aumento de AP y y-GT), sistema nervioso periférico, piel, laringe y testículos también se ven afectados con menor frecuencia.
AApoAII es un componente proteico de la lipoproteína de alta densidad (HDL), cuya función natural es transportar el colesterol y los fosfolípidos insolubles en agua en la sangre. Una mutación del codón de parada del gen ApoAII confiere propiedades amiloidogénicas a AApoAII. La amiloidosis AApoAII hereditaria se manifiesta principalmente en el riñón y corazón.
La amiloidosis ATTR es la amiloidosis hereditaria más frecuente. Se hereda de forma autosómica dominante. El responsable es una mutación del gen de la transtiretina, una proteína transportadora que está asociada con la proteína de unión al ritinol y la tiroxina en el plasma. La mutación más común Val30Met confiere a la proteína propiedades amiloidogénicas y, por lo tanto, patógenas. En el curso de la amiloidosis ATTR, se producen depósitos de amiloide en el sistema nervioso periférico y autónomo. Los síntomas principales incluyen disfunción eréctil, malestar gastrointestinal, malabsorción y cardiomipatía restrictiva. Si no se trata, el pronóstico de la amiloidosis ATTR es malo. Además del tratamiento sintomático, como opción terapéutica solo queda un trasplante de hígado.
En la psiquiatría clínica, todas las enfermedades, incluida la esquizofrenia o la depresión, se diagnostican clínicamente en forma de entrevista utilizando un cuestionario y, si es necesario, mediante pruebas de movimiento o comportamiento. Debido a la falta de conocimiento de las bases biológicas de las enfermedades mentales, no están a disposición tests de diagnóstico basados en la sangre o el líquido cefalorraquídeo, como se utilizan en las enfermedades neurológicas, para respaldar el diagnóstico clínico.
Esta situación es particularmente insatisfactoria para la industria de investigación farmacéutica, ya que la ausencia de tests objetivos y claramente cuantificables en última instancia impide el monitoreo cuantitativo de terapias potencialmente efectivas.
Con el descubrimiento de genes de enfermedad causales como el DISC1, ahora es posible desarrollar un diagnóstico biológico por primera vez. DISC1 desarrolla agregados de proteínas submicroscópicas en el cerebro en un subconjunto de enfermedades mentales crónicas, como la esquizofrenia y la depresión recurrente. Con la ayuda de anticuerpos especialmente desarrollados, estos se pueden detectar en el cerebro post mortem.
El ELA es una enfermedad crónica del sistema nervioso central que progresa rápidamente. Esto afecta principalmente al control voluntario de los músculos esqueléticos. En el curso de la enfermedad se produce una degeneración de las neuronas motoras responsables del movimiento muscular. Esto conduce a un deterioro significativo hasta la pérdida total de los movimientos y reflejos corporales. La esperanza de vida media tras la aparición de los síntomas iniciales es de sólo tres años. Para la ELA se han descrito varias etiologías. La forma más común de ELA es de naturaleza esporádica. Pero también existen casos de ELA heredados de la familia. A este respecto, la mutación más frecuente es la superóxido dismutasa-1 (SOD1). Los datos recientes sugieren que la expansión de hexanucleótido del gen C9orf72 es la causa tanto de ELA, como también de la demencia frontotemporal.
El diagnóstico de ELA no se puede hacer hasta tarde en el curso de la enfermedad. El retraso en el diagnóstico asciende por lo general a un año después del inicio de los primeros síntomas. El diagnóstico de ELA actualmente comprende una evaluación clínica, un examen electrofisiológico (electromiografía) y un análisis neuropatológico (biopsia). Adicionalmente, se puede efectuar una función de líquido cefalorraquídeo y crear un hemograma diferencial. Por último, la ELA se debe diferenciar de otras enfermedades por diagnóstico diferencial.
Característica patológica de la ELA son, entre otras cosas, inclusiones citoplasmáticas de la proteína FUS. En la degeneración celular, estos agregados se liberan y, por lo tanto, pueden llegar a la periferia, donde son accesibles para el diagnóstico. Otras enfermedades neurodegenerativas también muestran depósitos de agregados de FUS, incluida la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), cuyos síntomas principales son cambios en la personalidad, el comportamiento social y las habilidades lingüísticas.
Una característica patológica alternativa de la ELA son los depósitos de la proteína SOD1 en las neuronas motoras. En la degeneración celular, estos agregados se liberan y, por lo tanto, pueden llegar a la periferia, donde son accesibles para el diagnóstico.
Una característica patológica alternativa de la ELA son las inclusiones citoplasmáticas de la proteína ubiquitinada TDP-43. En la degeneración celular, estos agregados se liberan y, por lo tanto, pueden llegar a la periferia, donde son accesibles para el diagnóstico.
Otras enfermedades neurodegenerativas también se asocian con depósitos de agregados de TDP-43, incluida la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), cuyos síntomas principales son cambios en la personalidad, el comportamiento social y las habilidades lingüísticas. Estudios recientes también ven una relación entre los depósitos de TDP-43 y la encefalopatía traumática crónica (ETC). El ETC afecta principalmente a atletas de alto rendimiento y soldados que sufren repetidamente traumatismos craneoencefálicos.
En la diabetes mellitus tipo II (DMT2) también juegan un papel las proteínas endógenas agregadas. Por ejemplo, así en el páncreas de los pacientes con DMT2 se encuentran placas que consisten principalmente en el polipéptido amiloide de los islotes (PPAI). PPAI es una hormona peptídica que se produce en las células beta del páncreas y se secreta junto con la insulina. Se especula que la agregación del PPAI está relacionada con la pérdida progresiva de las células beta de los islotes.
Hasta la fecha, no hay sistemas de detección ex vivo para oligómeros o agregados de PPAI en tejidos o líquidos corporales en uso rutinario.
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurológica degenerativa. Los síntomas principales comprenden rigidez muscular, movimiento lento, temblores musculares e inestabilidad postural. Además, se describen los síntomas concomitantes opcionales, tal como, por ejemplo, los trastornos mentales. En el curso de la enfermedad, se produce la muerte de las neuronas productoras de dopamina en la sustancia negra. Histopatológicamente, en el tejido cerebral de los pacientes con Parkinson se muestran inclusiones citoplasmáticas, los llamados cuerpos de Lewy, que consisten principalmente en a-sinucleína, ubiquitina y otros depósitos de proteínas.
Las tauopatías son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que están caracterizadas por una acumulación de la proteína tau en el cerebro. Mediante hiperfosforilación, la proteína tau asociada a microtúbulos se puede convertir en agregados insolubles, denominados haces neurofibrilares. Las tauopatías comprenden distintos cuadros clínicos como la enfermedad de Alzheimer, degeneración corticobasal, enfermedad de los granos argirófilos, enfermedad de Pick, DLFT-PTAM (anteriormente: FTDP-17, demencia frontotemporal y parkinsonismo del cromosoma 17), parálisis supranuclear progresiva, demencia de enredo neurofibrilar, tauopatía con inclusiones gliales y tauopatías inclasificables. Los estudios recientes también incluyen la encefalopatía traumática crónica entre las tauopatías. Algunas de las enfermedades arribas mencionadas, tal como, por ejemplo, el DLFT-PTAM son hereditarias. Pero, las causas de la mayoría de las tauopatías aún se desconocen.
La presentación clínica de las tauopatías es extremadamente variada y comprende trastornos del movimiento (Síndromes parkinsonianos atípicos sensibles a la levodopa, acinesia con "congelación", parálisis supranuclear hasta síndromes corticobasales), trastornos del comportamiento y del lenguaje y síntomas psiquiátricos como agresividad, estado psicótico y depresión.
La enfermedad de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa genética que afecta la coordinación muscular y conduce a una disminución de las capacidades cognitivas y problemas psiquiátricos. La enfermedad afecta tanto a hombres como también a mujeres y se debe a una mutación autosómica dominante en el gen de la huntingtina. La expansión de una repetición de triplete CAG conduce a una prolongación del tracto de poliglutamina en la proteína madurada, por lo que esta tiende cada vez más al pliegue incorrecto y la agregación.
La amiloidosis visceral familiar se basa en una mutación del gen de la lisozima que confiere propiedades amiloidogénicas a la proteína madurada. Los depósitos amiloides se encuentran sistémicamente en una pluralidad de órganos.
Los indicadores de enfermedades, es decir, indicadores para el reconocimiento de enfermedades, también llamados biomarcadores, siempre se han utilizado para diagnosticar enfermedades. Ejemplos conocidos de biomarcadores son, por ejemplo, el contenido de glucosa en la orina como indicación de diabetes mellitus o el contenido de HCG en la orina en los tests de embarazo.
El documento WO 2008/070229 A2 da a conocer un procedimiento para la detección de agregados patógenos de una proteína en una muestra.
S. HÜBINGER ET AL dan a conocer en "Detection of a-Synuclein Aggregates by Fluorescence Microscopy", REJUVENATION RESEARCH, Vol. 15, N.° 2, 1 de abril de 2012 (2012-04-01), páginas 213-216 un enfoque para cuantificar los agregados individuales de a-sinucleína como un posible biomarcador de la enfermedad de Parkinson.
El documento WO 2007/126473 A2 da a conocer procedimientos y, por consiguiente, sistemas in vitro para la generación de oligómeros estables y solubles de proteínas amiloides a pH fisiológico y temperatura fisiológica. El documento US 2008/220449 A1 da a conocer procedimientos, composiciones y sistemas para diagnosticar, estratificar o supervisar la progresión o regresión de la enfermedad de Alzheimer.
TOKUDA T ET AL dan a conocer en "Detection of elevated levels of alfa-synuclein oligomers in CSF from patients with Parkinson disease", NEUROLOGY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, PHILADELPHIA, US, Vol. 75, N.° 20, 1 de noviembre de 2010 (2010-11-01), páginas 1766-1772, que el contenido de oligómeros de a-sinucleína en el líquido cefalorraquídeo y la relación de los oligómeros a la a-sinucleína total pueden ser biomarcadores útiles para el diagnóstico y la detección temprana de la enfermedad de Parkinson.
FULL ET AL dan a conocer en "Relationships between the Sequence of a-Synuclein and its Membrane Affinity, Fibrillization Propensity, and Yeast Toxicity", JOURNAL OF MOLECULAR BIO, ACADEMIC PRESS, UNITED KINGDOM, Vol. 366, N.° 5, 9 de febrero de 2007 (2007-02-09), páginas 1510-1522, que la beta-sinucleína presenta una toxicidad media para la levadura y la gamma-sinucleína no es tóxica.
MICHAEL R. SIERKS ET AL dan a conocer en "CSF levels of oligomeric alpha-synuclein and beta-amyloid as biomarkers for neurodegenerative disease", INTEGRATIVE BIOLOGY, Vol. 3, N.° 12, 10 de noviembre de 2011 (2011-11-10), páginas 1188-1196, que la detección de especies específicas de agregados oligoméricos es prometedora como biomarcadores sensibles de enfermedades neurodegenerativas.
FUNKE ET AL revela en "Single particle detection of Abeta aggregates associated with Alzheimer's disease", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, Vol. 364, N.° 4, 24 de octubre de 2007 (2007-10-24), páginas 902-907 una clara distinción entre las personas con Alzheimer y los sujetos de control no dementes mediante el análisis del líquido cefalorraquídeo (LCR) por medio de muestreo confocal de los agregados de Abeta detectados en la superficie y el posterior análisis bidimensional de la distribución de la intensidad de la fluorescencia.
CHISPA ET AL dan a conocer en An Ultrasensitive Assay for Diagnosis of Alzheimer's Disease", REJUVENATION RESEARCH, Vol. 11, N.° 2, 1 de abril de 2008 (2008-04-01), páginas 315-318 un test ultrasensible para el diagnóstico precoz y no invasivo de la enfermedad de Alzheimer.
FUNKE ET AL dan a conocer en Single-Particle Detection System for Ab Aggregates: Adaptation of Surface-Fluorescence Intensity Distribution Analysis to Laser Scanning Microscopy", REJUVENATION RESEARCH, Vol. 13, N.° 2-3, 4 de diciembre de 2009 (2009-12-04), páginas 206-209, que la superficie FIDA también se puede llevar a cabo con un microscopio de escaneo láser y luego es muy adecuado para la caracterización de agregados AB
WANG-DIETRICHET ET AL dan a conocer en "The amyloid-beta oligomer count in cerebrorospinal fluid is a biomarker for Alzheimer 's disease", JOURNAL OF ALZHEIMER' S DISEASE, Vol. 34, 11 de enero de 2013 (2013-01-11), páginas 985-994, que el número de oligómeros Ap en los fluidos corporales es el biomarcador más directo y relevante de Alzheimer.
Pilar Infiesta ET AL dan a conocer en "Development of an assay to measure tau oligomer levels in AD", 42nd Annual Meeting of the Society-for-Neuroscience; New Orleans, L a , USA, 17 de octubre de 2012 (2012-10-17) la detección de agregados de tau en LCR.
Pedersen Jeppe T. ET AL dan a conocer en "Analysis of Protein Aggregation in Neurodegenerative Disease", Analytical Chemistry, Vol. 85, N.° 9, 7 de mayo de 2013 (2013-05-07), páginas 4215-4227 una visión general de las técnicas clave establecidas y nuevas para el análisis de la agregación de proteínas en etapas tempranas, medias y tardías, ordenadas o desordenadas, con énfasis en ejemplos del análisis de proteínas que son partícipes en enfermedades neurodegenerativas.
El documento US 2009/042211 A1 da a conocer un procedimiento para la detección selectiva de la presencia y/o la cantidad de depósitos de proteínas patológicos.
Takashi Kasai ET AL dan a conocer en "Usation of a multiple antigenic pptide as a calibration standard in the BAN50 single antibody sandwich ELISA for A[beta] oligomers", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 422, N.° 3, 1 de junio de 2012 (2012-06-01), páginas 375-380, que la curva estándar creada a partir de un 16mer MAP cubre el rango fisiológico de las señales obtenidas en el BAN50 SAS-ELISA a partir de muestras de líquido cefalorraquídeo humano, suero y plasma.
EL-AGNAF OMAR M A ET AL dan a conocer en "Detection of oligomeric forms of a-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease", FASEB JOURNAL" Vol. 20, N.° 3, 1 de marzo de 2006 (2006-03-01), páginas 419-425 nuevas posibilidades para el desarrollo de tests diagnósticos de Parkinson y enfermedades afines, así como para la experimentación de terapias para prevenir o revertir la agregación de alphasyn.
Para proporcionar atención médica a una población cada vez más grande y envejecida, es necesario identificar nuevos biomarcadores específicos que garanticen un diagnóstico seguro. Es necesaria una alta especificidad, en particular en enfermedades con síntomas y cuadros clínicos similares, para poder llevar a cabo aquí un tratamiento prometedor. Además, los indicadores de la enfermedad deben identificar a las personas en riesgo en una fase temprana de la enfermedad o lo antes posible en caso de recaída. Los biomarcadores deben estar presentes e identificares en biomateriales de fácil acceso y permitir una detección rápida. Como resultado, es posible rastrear no solo el curso de la enfermedad, sino también el efecto del tratamiento y la prevención. El objetivo de la presente invención era poner a disposición tales biomarcadores, en particular para enfermedades que presentan agregados de proteínas mal plegadas.
Otra tarea era poner a disposición un procedimiento rápido y seguro para su cuantificación y/o caracterización selectiva. En particular, los indicadores de enfermedad deben ser adecuados para el uso clínico rutinario. Esto significa que se pueden caracterizar en un preferiblemente test rápido y, dado el caso, por medio de estándares, de modo que se determinan valores comparables e independientes.
Además, se deben cumplir los requisitos mencionados anteriormente para los biomarcadores y se deben poner a disposición las posibilidades y herramientas correspondientes, mejoradas con respecto al estado de la técnica.
El diagnóstico de la amiloidosis AA comprende una evaluación de la presentación clínica. Pero, la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos es problemática. Preclínicamente, el diagnóstico solo es posible mediante la detección histológica del amiloide AA por medio de tinción de Rojo Congo. Pero para ello es necesaria una biopsia de aspiración de grasa. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales.
La amiloidosis AA está caracterizada por un pliegue incorrecto de la proteína precursora amiloide A en suero (AA). Por lo tanto, los agregados de AA podrían ser un biomarcador directo para la amiloidosis de AA. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que AA también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de AA monomérico, plegado normalmente.
El diagnóstico de la amiloidosis AL comprende una evaluación de la presentación clínica, que se puede mostrar de forma muy variable. Además, es problemática la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos. El estándar de oro es la detección histológica del amiloide AL por medio de tinción de Rojo Congo. Adicionalmente, se debe llevar a cabo la inmunohistoquímica. Pero para ello se requiere una biopsia compleja. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte de forma mínimamente invasiva los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales. La amiloidosis AL está caracterizada por un pliegue incorrecto de la proteína precursora de la cadena ligera IgG (AL). Por lo tanto, los agregados de AL podrían ser un biomarcador directo para la amiloidosis de AL. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que AL también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de AL monomérico, plegado normalmente.
El diagnóstico de la amiloidosis AApoAI comprende una evaluación de la presentación clínica. Pero, la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos es problemática. El estándar de oro es la detección histológica del amiloide AApoAI por medio de tinción de Rojo Congo. Pero para ello se requiere una biopsia compleja. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte de forma mínimamente invasiva los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales.
La amiloidosis AApoAI está caracterizada por un pliegue incorrecto del precursor de la apolipoproteína AI (AApoAI). Por lo tanto, los agregados de AApoAI podrían ser un biomarcador directo de la amiloidosis de AApoAI. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que AApoAI también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de AApoAI monomérico, plegado normalmente.
El diagnóstico de la amiloidosis AApoAIl comprende una evaluación de la presentación clínica. Pero, la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos es problemática. El estándar de oro es la detección histológica del amiloide AApoAIl por medio de tinción de Rojo Congo. Pero para ello se requiere una biopsia compleja. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte de forma mínimamente invasiva los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales.
La amiloidosis AApoAII está caracterizada por un pliegue incorrecto de la apolipoproteína All precursora (AApoAII). Por lo tanto, los agregados de AApoAIl podrían ser un biomarcador directo de la amiloidosis de AApoAIl. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que AApoAIl también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de AApoAIl monomérico, plegado normalmente.
El diagnóstico de la amiloidosis ATTR comprende una evaluación de la presentación clínica. Pero, la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos es problemática. Además, el momento del primer síntoma, el curso de la enfermedad y el fenotipo son diferentes regionalmente. El estándar de oro es la detección histológica del amiloide ATTR por medio de tinción de Rojo Congo. Pero para ello se requiere una biopsia compleja. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales.
La amiloidosis ATTR está caracterizada por un pliegue incorrecto de la proteína precursora de la transtiretina (TTR). Por lo tanto, los agregados de ATTR podrían ser un biomarcador directo para la amiloidosis de ATTR. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que ATTR también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de ATTR monomérico, plegado normalmente.
Actualmente, la psicosis esquizofrénica no se puede diagnosticar hasta tres o cinco años después de que aparezcan los primeros síntomas. Un diagnóstico basado en la detección de un biomarcador no se ha utilizado de forma rutinaria para enfermedades mentales crónicas como la esquizofrenia. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. Los estudios recientes ven una relación entre las enfermedades mentales crónicas, como la esquizofrenia o la depresión recurrente, y la proteína DISC1 agregada (disrupted-in-schizophrenia-1). Estos agregados DISC1 podrían ser un biomarcador directo de la esquizofrenia, la depresión recurrente y otras DISC1opatías. Sin embargo, la detección diagnóstica plantea un desafío técnico, ya que DISC1 también se produce en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de DISC1 monomérico, plegado normalmente.
Un diagnóstico basado en la detección de un biomarcador no está actualmente en uso rutinario tanto para ELA como también para DLFT. Tampoco existe en el momento actual una terapia causal. Sólo se utilizan terapias neuroprotectoras y sintomáticas. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. En la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), se han descrito depósitos citoplásmicos de la proteína de unión al ARN FUS (Fused in Sarcoma). Estos agregados FUS podrían ser un biomarcador directo de los cuadros clínicos descritos. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que FUS también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de FUS monomérico, plegado normalmente.
En la actualidad, el nivel de azúcar en la sangre se considera un biomarcador generalmente reconocido para DMT2, por lo que se puede logar un diagnóstico seguro para los pacientes. Si el nivel de azúcar en la sangre se regula con la ayuda de la insulina, ya no es posible detectar DMT2. Esto tiene una importancia particular para el análisis de las bolsas de sangre que se utilizan para las transfusiones, ya que pueden representar un peligro potencial para los receptores. También para un desarrollo terapéutico causal de DMT2, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Desde hace algunos años se ha informado de una relación entre la diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) y la demencia de Alzheimer (AD). Según los estudios, alrededor del 80% de los pacientes con Ad tienen DMT2 o presentan niveles más altos de glucosa en la sangre. Además, los ratones DMT2 y AD muestran anomalías conductuales, cognitivas y vasculares similares. Ambas enfermedades presentan características patológicas similares: la formación de placas amiloides en el páncreas (DMT2) o en el cerebro (AD) como resultado del pliegue de proteínas y la posterior formación de fibrillas del péptido PPAI o AH En particular, se considera que los agregados pequeños son los principales responsables de la formación y el progreso de DMT2 y AD. Por lo tanto, los agregados PPAI podrían ser un biomarcador directo de DMT2. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que IAPP también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de IAPP monomérico, plegado normalmente. Un diagnóstico basado en la detección de un biomarcador no está actualmente en uso rutinario para ELA.
Tampoco existe en el momento actual una terapia causal. Sólo se utilizan terapias neuroprotectoras y sintomáticas. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es bien la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. En la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) se han descrito depósitos de la superóxido dismutasa 1 (SOD1). Estos agregados de SOD1 podrían ser un biomarcador directo para ELA. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que SOD1 también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de SOD1 monomérico, plegado normalmente.
El diagnóstico de la enfermedad de Parkinson se lleva a cabo mediante el llamada test de levadopa. A este respecto, al paciente se le administra levadopa en combinación con un inhibidor de la descarboxilasa. Si este tratamiento conduce a una mejora significativa en los síntomas, con muy alta probabilidad se puede diagnosticar la enfermedad de Parkinson.
Sin embargo, un diagnóstico basado en una detección mínimamente invasiva de un biomarcador en los líquidos corporales no está todavía en uso rutinario para la enfermedad de Parkinson. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es bien la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. La enfermedad de Parkinson está caracterizada por la acumulación patológica de alfa-sinucleína agregada. Estos agregados de a-sinucleína podrían ser un biomarcador directo de la enfermedad de Parkinson y otras a-sinucleopatías. Sin embargo, la detección diagnóstica plantea un desafío técnico, ya que la a-sinucleína también se produce en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de a-sinucleína monomérica, plegada normalmente.
El fenotipo neuropatológico de las distintas tauopatías se identifica post mortem. Una dificultad es la superposición significativa de distintos cambios neuropatológicos. Además, diversas patologías a menudo están presentes en combinación, lo que subraya la necesidad de la investigación de biomarcadores. Un diagnóstico basado en la detección de un biomarcador no está actualmente en uso rutinario para las tauopatías. Tampoco existe en el momento actual una terapia causal. Sólo se utilizan terapias neuroprotectoras y sintomáticas. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es bien la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. Las tauopatías están caracterizadas por depósitos patológicos de la proteína tau. Estos agregados de tau podrían ser un biomarcador directo de los distintos cuadros clínicos. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que la proteína tau también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de la proteína tau monomérica, plegada normalmente.
Un diagnóstico basado en la detección de un biomarcador no está actualmente en uso rutinario tanto para ELA como también para DLFT y ETC. Tampoco existe en el momento actual una terapia causal. Sólo se utilizan terapias neuroprotectoras y sintomáticas. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a los casos genéticos, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. En la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), se han descrito depósitos de la proteína de unión a ADN de TAR 43 (TDP-43). Estos agregados TDP-43 podrían ser un biomarcador directo de los cuadros clínicos descritos. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que TDP-43 también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de TDP-43 monomérico, plegado normalmente.
Si se sospecha de la enfermedad de Huntington, se puede llevar a cabo un test genético, que con seguridad puede constatar la enfermedad. Sin embargo, un diagnóstico basado en una detección mínimamente invasiva de un biomarcador en los líquidos corporales no está todavía en uso rutinario para la enfermedad de Huntington. A este respecto, para un desarrollo terapéutico, la identificación y estandarización de un biomarcador en el curso temprano o incluso presintomático de la enfermedad es de importancia inmensa y probablemente decisiva. Esto también se aplica a la enfermedad de Huntington genética, ya que aquí también se puede seguir el curso de la enfermedad y la terapia.
Una característica de una variedad de enfermedades del sistema nervioso central es la aparición de proteínas agregadas mal plegadas en el curso de la enfermedad. La enfermedad de Huntington está caracterizada por la acumulación patológica de huntingtina agregada. Estos agregados de huntingtina podrían ser un biomarcador directo de la enfermedad de Huntington. Sin embargo, la detección diagnóstica plantea un desafío técnico, ya que la huntingtina también se produce en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de la huntingtina monomérica, plegada normalmente.
El diagnóstico de la amiloidosis ALys comprende una evaluación de la presentación clínica. Pero, la delimitación del diagnóstico diferencial con respecto a muchos otros cuadros clínicos es problemática. El estándar de oro es la detección histológica del amiloide ALys mediante tinción de Rojo Congo e inmunohistoquímica. Pero para ello se requiere una biopsia compleja. Actualmente no se ha establecido un diagnóstico rutinario que detecte de forma mínimamente invasiva los agregados de proteínas amiloides como biomarcadores en los líquidos corporales.
La amiloidosis visceral familiar está caracterizada por un pliegue incorrecto del precursor de la proteína lisozima (ALys). Por lo tanto, los agregados de ALys podrían ser un biomarcador directo de la amiloidosis de ALys. Sin embargo, la evidencia diagnóstica representa un desafío técnico, ya que la lisozima también se produce de forma ubicua en el organismo sano. Por lo tanto, el procedimiento debe ser insensible a un alto exceso de ALys monomérico, plegado normalmente.
El objetivo de la presente invención era también proporcionar un procedimiento de rutina para la determinación cuantitativa de indicadores de enfermedad, en particular de varios indicadores de enfermedad uno al lado del otro en la misma muestra. Además, el procedimiento debería ofrecer la posibilidad de analizar la muestra con solo unas pocas o preferiblemente sin etapas de procesamiento.
Una pluralidad de enfermedades neurodegenerativas y amiloidosis está caracterizada por la aparición simultánea de distintas especies de proteínas agregadas. Un ejemplo es la demencia de Alzheimer, en la que se observan tanto depósitos de beta amiloide como de tau (Jucker and Walker, Annals of neurology 70, 532­ 540, 2011; Spillantini and Goedert, Lancet neurology 12, 609-622, 2013; que están incluidos en referencia). En la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), la tau y TDP-43 coexisten como agregados de proteínas patológicas (Mackenzie et al., Acta neuropathologica 119, 1-4, 2010). La patología TDP-43 también se manifiesta en la esclerosis lateral amiotrófica y la encefalopatía traumática crónica (Blennow et al., Neuron 76, 886-899, 2012; Blokhuis et al., Acta neuropathologica 125, 777-794, 2013; que están incluidas en referencia). El procedimiento debe garantizar una especificidad suficiente para examinar diferentes tipos de agregados uno al lado del otro y/o simultáneamente. Por lo tanto, también era objetivo de la invención ofrecer un procedimiento con una alta especificidad al mismo tiempo para el examen de diferentes tipos de agregados y, por lo tanto, excluir perturbaciones del examen de un tipo de agregado por un segundo tipo de agregado. También se pueden estudiar formas mixtas de agregados, que consisten en distintos monómeros de proteína.
Los agregados de proteínas descritos hasta ahora de las enfermedades mencionadas anteriormente representan solo una característica patológica principal del cuadro clínico respectivo. Su uso como biomarcador no está garantizado.
Este objetivo se consigue mediante un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad según la reivindicación 1.
Según la invención, el procedimiento está caracterizada porque la muestra se examina después del examen de un primer tipo de agregado en busca de al menos otro, por ejemplo, segundo tipo de agregado diferente de proteínas endógenas mal plegadas sin preparación y/o tratamiento ulterior.
En una realización, el procedimiento está caracterizado porque la muestra se examina en busca de al menos dos tipos de agregado diferentes en una etapa del procedimiento.
En otra realización, el procedimiento está caracterizado porque la muestra se examina en busca de al menos dos tipos de agregado diferentes en el mismo sustrato. Según la invención, el procedimiento está caracterizado porque el tipo de agregado de las propias proteínas endógenas mal plegadas se selecciona del grupo que consiste en agregados de a-sinucleína y agregados de tau.
Según la invención, el procedimiento está caracterizado porque la detección en la etapa c) se realiza por medio de un procedimiento con señal resuelto localmente, preferiblemente procedimiento sFIDA.
Según la invención, el procedimiento está caracterizado porque antes de la etapa a) se realiza una inmovilización de moléculas de captura sobre el sustrato.
En otra realización, el procedimiento está caracterizado porque las moléculas de captura y/o la sonda están caracterizadas con colorantes fluorescentes.
En otra realización, el procedimiento está caracterizado porque las moléculas de captura y/o las sondas presentan anticuerpos específicos contra un epítopo de las proteínas que forman los agregados.
En otra realización, el procedimiento está caracterizado porque se utiliza un estándar interno o externo. El objeto de la invención es también el uso de un estándar para la cuantificación y/o caracterización selectiva de los indicadores de la enfermedad en un procedimiento como el descrito anteriormente, donde el estándar es un dendrímero, que contiene una molécula de andamio central y epítopo de las proteínas agregados de asinucleína o agregados de tau según la SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11, donde tanto estándares que están constituidas a partir de las mismas secuencias de monómeros como también aquellos que están constituidas a partir de diferentes secuencias de monómeros.
Tales moléculas estándar se pueden utilizar para la inactivación de los respectivos agregados de proteínas, por ejemplo, mediante la unión o destrucción de los agregados de proteínas, o profilácticamente para evitar la formación de los agregados de proteínas, lo que, sin embargo, no es objeto de la presente invención. Además, el objeto de la invención es un procedimiento para determinar enfermedades que presentan agregados de proteínas mal plegadas, que comprende las siguientes etapas:
i) determinación cuantitativa ex vivo de indicadores de enfermedad determinados en el procedimiento según la invención;
ii) comparación de estos datos con los valores normalizados;
iii) constatación de una cantidad significativamente diferente de indicadores de la enfermedad en esta comparación;
iv) asignación de la desviación a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías y/o demencia de Alzheimer.
En el sentido de la invención, bajo el término "tipo de agregado" se debe entender un agregado de una composición determinada y definida de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa, un tipo de agregado se compone (constituye) de los mismos péptidos (monómeros), es decir, de péptidos de la misma secuencia de aminoácidos o de diferentes homólogos uno y el mismo péptido. En otra alternativa, un tipo de agregado se compone, constituye de diferentes péptidos (monómeros), es decir, de péptidos de diferente secuencia de aminoácidos o de homólogos de los diferentes péptidos. En una muestra también pueden estar presentes ambas alternativas.
En una realización de la presente invención, la "determinación cualitativa de indicadores de enfermedad" significa la identificación de biomarcadores nuevos y específicos. En otras palabras, los indicadores de la enfermedad se identifican y redefinen. Según la invención, los indicadores de la enfermedad se definen por la presencia, dado el caso en una concentración determinada y/o ausencia, respectivamente, de uno o varios agregados de proteínas endógenas mal plegadas.
En otra realización, la "determinación cualitativa de los indicadores de la enfermedad" significa la verificación o determinación de la presencia y/o ausencia de estos biomarcadores.
En el sentido de la presente invención, la "determinación cuantitativa de indicadores de la enfermedad" en una primera alternativa significa la determinación de la concentración de los biomarcadores. En una segunda alternativa se determina la composición, tamaño y/o forma de los biomarcadores. También se pueden llevar a cabo ambas alternativas, preferentemente al mismo tiempo, en una etapa del procedimiento).
La determinación cuantitativa de los indicadores de la enfermedad es equivalente a la cuantificación y/o caracterización selectiva de los tipos de agregados como biomarcadores. Una vez definidas las características de un indicador de enfermedad, se realiza su determinación cuantitativa, es decir, su cuantificación selectiva: es decir, la determinación de la concentración que contiene la información sobre la presencia o la ausencia; y/o su caracterización: es decir, la determinación de la composición, tamaño y/o forma.
Según la invención, se examina una muestra en busca de al menos dos tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos tres tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos cuatro tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos cinco tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos seis tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos siete tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos ocho tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos nueve tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos diez tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas. En una alternativa de la presente invención se examina una muestra en busca de al menos 11, 12 ,13 ,14 ,15 o más tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas.
En una realización de la presente invención, los agregados son de péptidos o monómeros de la SEQ ID NO: 10 u 11:
SEQ ID NO: 10; agregados de tau: SEQ ID NO: 11.
No obstante, también pueden estar presentes agregados mixtos, constituidos a partir de al menos dos diferentes proteínas, monómeros, las llamadas formas mixtas de agregados.
El término "examinar el tipo de agregado de proteínas endógenas mal plegadas" o sinónimos tal como, por ejemplo, "examen" de los mismos significa en el sentido de la invención la determinación cualitativa y/o cuantitativa (análisis) del tipo de agregado respectivo. En la determinación cualitativa se determina la presencia o la ausencia, mientras que en la determinación cuantitativa se determina la concentración, composición, tamaño y/o forma.
Según la invención, el término "sin preparación y/o tratamiento ulterior" de la muestra para el examen en busca de un segundo tipo de agregado significa en una alternativa que entre dos exámenes en busca de diferentes tipos de agregado no tiene lugar una preparación y/o tratamiento de la muestra. En otra alternativa, no tienen lugar reacciones químicas en la muestra tras el examen de un primer o de otro tipo de agregado. Preferiblemente, el primer y segundo y, dado el caso, cualquier otro examen posterior se realiza en una parte alícuota de la muestra. La muestra experimenta, dado el caso, solo efectos físicos o mecánicos, tal como, por ejemplo, cambio de temperatura o pipeteo. En otra alternativa adicional, la muestra no experimenta ningún efecto físico o mecánico. En otra alternativa adicional, la muestra para el examen de un segundo tipo de agregado tiene la misma composición química que la muestra para el examen del primer tipo de agregado, pero los mismos compuestos pueden estar presentes en concentraciones modificadas. Además, la muestra para el examen de un segundo tipo de agregado contiene, en su caso, las moléculas de captura, sondas y/o estándares para el examen del primer tipo de agregado, así como, en su caso, los compuestos correspondientes del agregado, molécula de captura y/o sonda. En otra alternativa adicional, las sondas se añaden para el examen en busca de un segundo tipo de agregado solo después del examen en busca del primer tipo de agregado, de modo que como única reacción química está el enlace de la sonda específica para el segundo tipo de agregado a este agregado, si está contenida en la muestra.
De forma análoga, el hecho descrito anteriormente es válido para el examen de un tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo y/o cualquier otro tipo de agregado.
Según la invención, los biomarcadores, también denominados indicadores de enfermedad, son parámetros en cumplimiento con la definición del NIH, con los que se puede medir objetivamente una propiedad para utilizarlos como indicador de procesos biológicos, patógenos normales o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Los inhibidores de la enfermedad determinados y usados según la invención se deben caracterizar cualitativa y cuantitativamente con procedimientos físicos y/o químicos. Los agregados en el sentido de la presente invención son
- partículas que consisten en varios componentes preferiblemente iguales, que no están unidos entre sí covalentemente y/o
- acumulaciones no covalentes de varios monómeros, y
- hetero-agregados, "co-agregados", es decir, agregados de diferentes monómeros.
Para el procedimiento según la invención se usan muestras del cuerpo humano o animal y no se devuelven a este de nuevo.
En una alternativa del procedimiento, para la determinación, en particular para la determinación cualitativa de los indicadores de la enfermedad, las muestras con los biomarcadores potenciales se comparan con las muestras de individuos sanos y/o enfermos diagnosticados. Este diagnóstico se basa, por ejemplo, en un dictamen de la presentación clínica o en la evaluación de otros procedimientos de diagnóstico. Al comparar la cantidad de agregados detectados, es posible hacer una declaración sobre su idoneidad como biomarcadores.
En una alternativa se trata de indicadores de enfermedad adecuados para el uso clínico rutinario. Según la invención, los biomarcadores son adecuados para el uso clínico rutinario siempre que existan pruebas científicas demostrables y reproducibles, en particular sobre la base de métodos físicos y/o químicos.
Como sustrato se selecciona según la invención un material que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible, en particular con respecto a los agregados de proteínas mal plegadas.
En una realización de la presente invención se elige un sustrato de vidrio.
El sustrato se puede recubrir con sustancias hidrófilas, preferentemente poli-D-lisina, polietilenglicol (PEG), preferiblemente polietilenglicol heterobiofuncional (NHS-PEG-COOH) o dextrano, en particular dextrano, preferiblemente carboximetil-dextrano (CMD).
En una realización de la presente invención, la superficie de vidrio se hidroxila y a continuación se activa con grupos amino.
Para preparar el sustrato para el recubrimiento, se pueden llevar a cabo una o varias de las siguientes etapas: - lavado de un sustrato de vidrio o un soporte de vidrio en un baño de ultrasonidos o un limpiador de plasma, alternativamente incubar en 5 M de NaOH durante al menos 3 horas,
- enjuague con agua y secado subsiguiente bajo nitrógeno,
- inmersión en una solución de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3:1 para la activación de los grupos hidroxilo,
- enjuague con agua hasta un pH neutro, a continuación con etanol y secado bajo atmósfera de nitrógeno, - inmersión en una solución de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (1 - 7%) en tolueno seco o una solución de etanolamina,
- enjuague con acetona o DMSO y agua y seque bajo atmósfera de nitrógeno.
Para el recubrimiento con dextrano, preferiblemente carboximetil-dextrano (CMD), el sustrato se incuba con una solución acuosa de CMD (a una concentración de 10 mg/ml o 20 mg/ml) y, dado el caso, N-etil-N-(3-dimetilaminpropil) carbodiimida (EDC), (200 mM) y N-hidroxisuccinimida (NHS), (50 mM) y a continuación se lava.
El carboximetil-dextrano se une covalentemente a la superficie de vidrio en una variante que se ha hidroxilado primero y luego se ha activado con grupos amina, tal como se describió anteriormente.
Como sustrato también se pueden utilizar placas de microtitulación, preferiblemente con fondo de vidrio. Dado que en el uso de marcos de poliestireno no es posible el uso de ácido sulfúrico concentrado, la activación de la superficie de vidrio se realiza en una variante de realización de la invención de forma análoga a Janissen et al. (Colloids Surf B Biointerfaces, 2009, 71(2), 200-207).
En una realización de la presente invención, la superficie de vidrio se incuba con sosa cáustica (5 M) durante 15 minutos a temperatura ambiente, se enjuaga tres veces con agua, se mezcla con ácido clorhídrico y se vuelve a incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados con agua y dos lavados con etanol, el sustrato (superficie de vidrio) se seca bajo atmósfera de nitrógeno.
Para generar grupos amino en la superficie del vidrio, se incuba con etanolamina (5,6 M) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, el sustrato se enjuaga tres veces con DMSO, dos veces con etanol y se seca bajo atmósfera de nitrógeno.
El polietilenglicol heterobiofuncional (NHS-PEG-COOH, MW 3.400 Da) se disuelve a 50 mM en DMSO a 70 °C durante 1 min, se enfría a temperatura ambiente y se ajusta a 2% de trietilamina. Con esta solución se incuba al menos una hora a temperatura ambiente. La solución se retira de ello, y la superficie del vidrio se lava tres veces con agua.
Para activar el revestimiento de PEG, se disuelven NHS y EDC a respectivamente 100 mM en tampón MES (0,1 M, pH 5) y se mezclan en una proporción de 1:1 a concentraciones finales de respectivamente 50 mM. Con esta solución, el sustrato se incuba durante 30-60 minutos. Después de retirar la solución, se lava tres veces con tampón MES (0,1 M, pH 5).
El anticuerpo de captura se diluye a 30 ng/|jl en PBS y, por lo tanto, se incuba el sustrato durante 1-3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se retira la solución y se lava tres veces con PBST, luego tres veces con PBS.
El 3% de BSA se centrifugó previamente a 100.000 g (1 hora a 4°C). Con el sobrenadante se incuba el subtipo durante una hora a temperatura ambiente. La solución de BSA se retira y se lava tres veces con PBST.
La muestra (por ejemplo, agregados de proteína recombinante y muestra natural del paciente) se diluye y se aplica en PBS, si es necesario. El sustrato con muestra se centrifuga a 1.000 g durante una hora a 4 °C en un rotor oscilante. Se retira el sobrenadante y se lava la superficie del vidrio tres veces con PBST y tres veces con PBS.
Como sondas de detección se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia. Estos se diluyen a 1-2 ng/|jl en PBS y se mezclan con 1,5% de BSA. Las preparaciones se centrifugan a 100.000 g durante una hora a 4 °C. El sobrenadante se aplica a la substancia y se incuba durante 1-2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se retira la solución y se lava cinco veces con PBST y cinco veces con PBS.
Según la invención, sobre el sustrato se inmovilizan moléculas de captura para capturar y fijar los agregados de proteínas endógenas mal plegadas.
Según la invención, como moléculas de captura se emplean anticuerpos de las proteínas endógenas que se agregan. Los anticuerpos se unen específicamente a un epítopo de las proteínas endógenas que se agregan. En una alternativa, las moléculas de captura están unidas covalentemente al sustrato.
En otra alternativa, las moléculas de captura están unidas covalentemente con el recubrimiento, preferiblemente capa de dextrano.
En una realización de la presente invención, las moléculas de captura (anticuerpos) se inmovilizan sobre el sustrato, dado el caso después de una activación del soporte recubierto con CMD mediante una mezcla de EdC/NHS (200 o 50 mM).
Los grupos terminales de carboxilato restantes a los que no se hayan unido moléculas de captura se pueden desactivar.
Para la desactivación de estos grupos terminales de carboxilato en el espaciador CMD se utiliza etanolamina en DMSO. Antes de la aplicación de las muestras, los sustratos o soportes se enjuagan con PBS.
La muestra a medir se incuba sobre el sustrato así preparado.
Según la invención, los agregados están marcados por sondas que están caracterizadas para una detección posterior.
En una realización, las moléculas de captura y/o la sonda están marcadas con colorantes fluorescentes. En una alternativa, las moléculas de captura y/o las sondas contienen anticuerpos específicos contra un epítopo de las proteínas que forman los agregados.
En una variante de la presente invención, los anticuerpos se utilizan como sondas. Las moléculas de captura y las sondas pueden ser idénticas.
En una realización de la presente invención se diferencian moléculas de captura y sondas. Así, por ejemplo, se pueden utilizar diferentes anticuerpos como moléculas de captura y sondas.
Según la invención, se utilizan al menos 2 o varias moléculas de captura y/ o sondas diferentes que contienen o son anticuerpos diferentes y, dado el caso, también tienen diferentes marcas de colorante.
Pero, como moléculas de captura también se pueden emplear diferentes moléculas, tal como, por ejemplo, diferentes anticuerpos o moléculas que contienen anticuerpos.
Del mismo modo, como sondas se pueden emplear varias moléculas diferentes, tal como, por ejemplo, diferentes anticuerpos que contienen o están presentes.
Para el control de calidad posterior de la superficie, por ejemplo, la uniformidad del recubrimiento con moléculas de captura, se pueden utilizar moléculas de captura, caracterizadas con colorantes fluorescentes. Para ello se utiliza preferiblemente un colorante que no interfiere con la detección. De este modo es posible un control posterior de la estructura y una normalización de los resultados de medición.
Para la detección, las sondas están caracterizadas de modo que emiten una señal detectable ópticamente, seleccionada del grupo que consiste en emisión de fluorescencia, bioluminiscencia y quimioluminiscencia, así como absorción.
En una alternativa, las sondas están caracterizadas con colorantes. En este caso se trata preferiblemente de colorantes fluorescentes.
En una realización de la presente invención se emplean al menos 2, 3, 4, 5, 6 o más sondas diferentes. Las sondas pueden diferir tanto con vistas a su enlace específico a los agregados, como también con vistas a su diferente caracterización, por ejemplo, mediante colorantes fluorescentes.
También se pueden combinar entre sí sondas que son adecuadas para usar FRET (Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) como detección.
El uso de varias sondas diferentes, que están caracterizadas por diferentes colorantes fluorescentes, aumenta la especificidad de la señal de correlación obtenida durante la medición. Adicionalmente, de este modo también hace posible la ocultación de monómeros, es decir, moléculas no agregadas. La detección de monómeros se puede excluir, en particular, si la sonda y la molécula de captura son idénticas, o ambas detectan un epítopo superpuesto.
Como muestra a analizar se pueden utilizar líquidos o tejidos endógenos. En una realización de la presente invención, la muestra se selecciona a partir de líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa y/o material de biopsia . Las muestras pueden pasar por diferentes etapas de preparación conocidas por el experto en la materia.
La ventaja de la presente invención es la posibilidad de determinar agregados en muestras no tratadas, preferiblemente lCr .
En una variante de la presente invención se utilizan estándares internos o externos.
Tales estándares contienen o son un polímero, constituido por secuencias de monómeros, al menos según la SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 11, donde estos polímeros no se agregan y las proteínas endógenas son aquellas que se agregan.
Según la invención, se excluye una detección de monómeros de proteínas endógenas, en tanto que se usan tres sondas diferentes o tres sondas marcadas de forma diferente en el sistema de test, que se unen a un epítopo similar o igual. De forma alternativa o adicional, la detección de monómeros se puede excluir en tanto que no se evalúan las señales con una intensidad más baja a través de un corte de intensidad. Dado que los agregados más grandes poseen varios puntos de enlace para las dos sondas con colorantes marcados diferentes, se puede excluir una detección de monómeros alternativa o adicionalmente mediante correlación cruzada de estas señales.
La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo u otros tipos de imágenes de superficie. La detección se realiza preferiblemente con microscopía de fluorescencia confocal, espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS), en particular en combinación con la correlación cruzada y el ensayo de escaneo láser inmunosolvente de una sola partícula y/o el microscopio de escaneo láser (LSM). Alternativamente, la detección se realiza mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM).
La detección se lleva a cabo en una alternativa de la presente invención con un microscopio de escaneo láser confocal.
En una realización de la presente invención se utiliza para ello un enfoque láser, como por ejemplo en la microscopía de escaneo láser, o un FCS (sistema de espectroscopia de correlación de fluorescencia), así como las correspondientes variantes de superresolución como por ejemplo STED o SIM. Alternativamente, la detección puede realizarse mediante un microscopio TIRF, así como las correspondientes variantes de superresolución, tal como, por ejemplo, STORM, dSTORM.
En consecuencia, en la realización de la invención se excluyen procedimientos que se basan en una señal no resuelta localmente, como ELISA o ELISA tipo sándwich.
En la detección es ventajosa una alta resolución espacial. En una realización del procedimiento según la invención se recogen a este respecto tantos puntos de datos que permite la detección de un agregado ante una señal de fondo, que se causa, por ejemplo, por ruido específico del aparato, otras señales no específicas o sondas unidas de forma no específica. De esta manera, se leen tantos valores (valores de readout) como eventos resueltos localmente, tal como, por ejemplo, píxeles. A través de la resolución espacial, cada evento se determina en el contexto respectivo y, por lo tanto, representa una ventaja sobre el procedimiento ELISA con solo un valor de readout, pocos valores de readout y/o sin señal resuelta localmente.
En una alternativa, en el procedimiento según la invención se emplean varias sondas diferentes. De este modo se multiplica la información, es decir, los valores leídos, ya que para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se obtiene una información separada en función de la respectiva sonda que suministra la señal. De este modo, se incrementa la especificidad de la señal para cada evento. De este modo, para cada agregado detectado también se puede determinar su composición, es decir, el tipo de agregado, es decir, la composición de monómeros o mezclas de los mismos.
A este respecto, el número de diferentes sondas está limitado solo por la interferencia de los colorantes fluorescentes que se utilizarán. Así se pueden utilizar 2, 3, 4 o varias combinaciones diferentes de colorante de sonda.
Esencial para la evaluación según el procedimiento descrito anteriormente, si se utiliza más de una sonda, es la información resuelta local y temporalmente
. A este respecto, se puede tratar, por ejemplo, del tipo y/o intensidad de la fluorescencia. Al evaluar estos datos para todas las sondas utilizadas y detectadas se determina según la invención el número de los agregados, su forma, tamaño y/o su composición. A este respecto, la información sobre el tamaño de los oligómeros se puede obtener directa o indirectamente, dependiendo de si las partículas son más pequeñas o más grandes que la resolución temporal o local de los procedimientos de imagen utilizados, en una realización se pueden usar algoritmos para la minimización del fondo y/o se pueden aplicar valores umbral de intensidad. Como colorante fluorescente se pueden emplear los colorantes conocidos por el experto en la materia. Alternativamente, se pueden utilizar GFP (proteína de fluorescencia verde), conjugados y/o proteínas de fusión de los mismos, así como puntos cuánticos.
Debido al uso de estándares internos o externos, los resultados de test son objetivamente comparables entre sí y, por lo tanto, significativos.
En una realización de la presente invención se emplea un estándar interno o externo para la cuantificación de agregados.
En cumplimiento con el análisis de la distribución de la intensidad de fluorescencia (análisis de distribución de intensidad de fluorescencia FIDA), el procedimiento según la invención es un llamado FIDA de superficie (Surface-FIDA, sFIDA). La detección se realiza mediante microscopía de fluorescencia confocal, espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS), microscopio de escaneo láser (LSM) y/o microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), preferiblemente LSM y/o microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM).
En una realización de la invención se reproducen por pocillo hasta 50 fotogramas individuales (1000x1000 píxeles, 114 nm/pixel) por canal de fluorescencia con una cámara CCD de alta sensibilidad.
Las señales de fondo en los datos de imagen se limpian mediante un valor umbral de intensidad. Se determina el número medio de píxeles con valores de escala de grises por encima del umbral (sFIDA-readout). Si se utilizan varias sondas de detección, solo se evalúan los eventos colocados en todos los canales de fluorescencia.
El procedimiento sFIDA se describió en Bannach et al. (2012. Detection of prion protein particles in blood plasma of scrapie infected sheep. PloS one 7, e36620) y Wang-Dietrichet al. (2013. The amyloid-beta oligomer count in cerebrospinal fluid is a biomarker for Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's disease 34, 985-994), que se incluyen bajo referencia.
Mediante la selección de las moléculas de captura y de sonda, se puede determinar qué tamaño deben poseer los oligómeros para poder contribuir a la detección (señal). Por ejemplo, se pueden detectar monómeros, dímeros, trímeros, etc. Sin embargo, también se pueden emplear moléculas de captura y de sonda, que como la unidad detectable más pequeña son, por ejemplo, dímeros u otros polímeros.
Con el procedimiento según la invención también es posible adicionalmente el análisis exacto de pequeños agregados libremente difusibles. Debido a su tamaño, que se sitúa por debajo de su resolución para los microscopios de luz, pequeños oligómeros podrían ser difíciles de distinguir de la fluorescencia de fondo (causada, por ejemplo, por anticuerpos no unidos).
Además de la sensibilidad extremadamente alta, el procedimiento según la invención también muestra una linealidad con respecto al número de los grupos en una amplia gama.
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración: :
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen AA (por ejemplo, anticuerpos anti-AA). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de AA potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de AA) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-AA ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen AA se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-AA ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de AA. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de a A . Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se emplean como molécula de captura y/o sonda anticuerpos AA, preferentemente amiloide A antiserum antibody clone 115, mc1 y/o 291. En una alternativa, como molécula de captura y/o sonda (marcada con AF488) se utiliza: EPR 4134.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser o, por ejemplo, TIRFM) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio T I R f ) . Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen AL (por ejemplo, anticuerpos anticuerpos anti-AL). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de AL potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de AL) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-AL ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen AL se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-AL ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de AL.
Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de a L. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de cadena ligera antilambda EPR5367, HP6054 y/o 2G9. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda (marcada AF488): EPR 5367.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen AApoAI (por ejemplo, anticuerpos anti-AApoAI). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de AApoAI potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de AApoAI) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-AApoAI ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen AApoAI se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-AApoAI ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómero de AApoAI. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de AApoAI. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de antiapolipoproteína Al 12C8, 1409 y/o G2. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda (marcada AF488): EPR 1368Y.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de unión no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen AApoAII (por ejemplo, anticuerpos anti-AApoAII). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de AApoAII potencialmente contenidas en la muestra a (por ejemplo, agregados de AApoAII) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-AApoAII ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen AApoAII se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-AApoAII ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de AApoAII. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de AApoAII. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de antiapolipoproteína AII 4F3, EPR2913 y/o EP2912.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen ATTR (por ejemplo, anticuerpos anti-ATTR). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de ATTR potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de ATTR) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-ATTR ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen ATTR se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-ATTR ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de ATTR. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de ATTR. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-prealbúmina EP2929Y, EPR3119 y/o 10E1.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen DISC1 (por ejemplo, anticuerpos anti-DISC1). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de DISC1 potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de DISC1) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-DISC1 ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen DISC1 se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-DISC1 ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros DISC1. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de DISC1.
Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-DISC1 14F2, 2C7 y/o FFD5. En una alternativa se utilizan Anti-DISC1-AK 14F2 como anticuerpo de captura y 14F2-AF633 como sonda de detección.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen FUS (por ejemplo, anticuerpos anti-FUS). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de FUS potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de FUS) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-FUS ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen FUS se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-FUS ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros FUS.
Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros FUS. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-TLS/FUS EPR5812, EPR5813 y/o CL0190.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen IAPP (por ejemplo, anticuerpos anti-IAPP). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de IAPP potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de IAPP) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-IAPP ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen IAPP se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-IAPP ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de IAPP.
Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de IAPP. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa, se utiliza como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-amilina R10/99.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su
composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen SOD1 (por ejemplo, anticuerpos anti-SOD1). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de SOD1 potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de SOD1) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-SOD1 ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen SOD1 se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-SOD1 ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros SOD1. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de SOD1.
Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-superóxido dismutasa 12F5, 71G8 y/o EPR1726. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda (marcada AF488): EPR 1726.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo,
señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
En una realización, la tarea se resuelve mediante el siguiente procedimiento, los llamados ensayos sFIDA: 1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen a-sinucleína (por ejemplo, anticuerpos anti-asinucleína). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de a-sinucleína potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de asinucleína) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo antia-sinucleína ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen a-sinucleína se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-a-sinucleína ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de a-sinucleína. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de a-sinucleína. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-a-sinucleína 2B2A11, 3H2897 y/o 211. En una alternativa, se utilizan como anticuerpos aSyn-AB 2B2A11 y como sonda de detección los anti-aSyn-ABs 3H2897-AF633 y 211-AF488 marcados con fluorescencia.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
En una realización, la tarea se resuelve mediante el siguiente procedimiento, llamado ensayo sFIDA:
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen tau (por ejemplo, anticuerpos anti-tau). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de tau potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de tau) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-tau ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen tau se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-tau ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de tau. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de tau. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-tau E178, Tau46 y/o Tau5. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda anti-tau 6E10/Atto488 y/o Nab228.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen TDP-43 (por ejemplo, anticuerpos anti-TDP-43). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de TDP-43 potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de TDP-43) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-TDP-43 ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen TDP-43 se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-TDP-43 ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros TDP-43. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (de la etapa 1) o ambas reconocen un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de TDP-43. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo anti-TARDBP EPR5810, 3H8 y/o K1B8. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda (marcada AF488): EPR 5810.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen huntingtina (por ejemplo, anticuerpos anti-huntingtina). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura. 2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de huntingtina potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, agregados de huntingtina) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-huntingtinaligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen huntingtina se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-huntingtina ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de huntingtina. Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (del paso 1) o ambas detectan un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de huntingtina. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo de anti-huntingtina EP867Y, D7F7 y/o HIP-1.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas unidas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
A continuación se describe un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad. Esto no es según la invención y solo sirve para la ilustración::
1. Una superficie (preferiblemente de vidrio) se trata previamente, de modo que posee una capacidad de enlace no específica lo más baja posible (por ejemplo, recubierta covalentemente con una capa de dextrano o polietilenglicol por modificación química). A continuación, se unen (preferentemente covalentemente) moléculas de captura para partículas que contienen ALys (por ejemplo, anticuerpos anti-ALys). Las moléculas de captura pueden ser todas idénticas o ser mezclas de distintas moléculas de captura.
2. En la superficie preparada de esta manera, luego se aplica la muestra a analizar (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia) con o sin etapas de preparación previas. Las sustancias no específicas se pueden eliminar mediante etapas de lavado.
3. Las partículas de ALys potencialmente contenidas en la muestra (por ejemplo, los agregados de ALys) se marcan con una sonda que sirve para la detección adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-ALys ligado a un colorante fluorescente). Los colorantes fluorescentes preferidos podrían ser, entre otros, también puntos cuánticos. Preferentemente, las partículas que contienen Alys se marcan con al menos otra sonda (por ejemplo, un anticuerpo anti-ALys ligado a un colorante fluorescente). El uso de varias sondas diferentes que están acopladas a diferentes colorantes fluorescentes aumenta, por un lado, la especificidad de la señal de correlación obtenida al final, por otro lado, esto también permite la ocultación de monómeros de ALys.
Especialmente si una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura (del paso 1) o ambas detectan un epítopo superpuesto, se puede excluir la detección de monómeros de ALys. Para aumentar la especificidad se puede utilizar como sonda de detección adicional el colorante específico de amiloide tioflavina T.
En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda clon de anticuerpo anti-lisozima BGN/06/961 y/o BGN/0696/2B10. En una alternativa se utilizan como molécula de captura y/o sonda (marcada AF488): EPR 2994.
4. Los pasos 2 y 3 también se pueden intercambiar. Mediante las etapas de lavado adecuadas se eliminan el exceso de sondas.
5. La detección de los agregados marcados se realiza mediante escaneo (por ejemplo, mediante un enfoque láser, tal como, por ejemplo, se utiliza en la microscopía de escaneo láser) o mediante otros tipos de imágenes de superficie (por ejemplo, mediante un microscopio TIRF). Cuanto mayor sea la resolución temporal y local, tantos más puntos de datos se originarán, que permiten respectivamente la detección de un agregado ante una señal de fondo (por ejemplo, a través del ruido específico del dispositivo, señales no específicas, sondas no específicas). De esta manera, no solo se crea un valor de readout (como sería el caso en un ELISA), sino que están presentes tantos valores de readout como eventos resueltos temporal y localmente (por ejemplo, píxeles). Mediante el uso de varias sondas diferentes (véase la etapa 3), esta información se multiplica y para cada punto, para cada agregado o para cada evento de detección se puede obtener por separado la información que la sonda proporciona señales allí. Así, la especificidad de la señal se puede aumentar para cada evento.
6. Para la evaluación se utilizan el tiempo y la información resuelta localmente (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) de todas las sondas utilizadas y detectadas, para determinar, por ejemplo, el número de los agregados, su tamaño y su composición. A este respecto, por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos de minimización de fondo y/o también se pueden emplear valores umbral de intensidad para la evaluación posterior.
7. Para que los resultados del test sean comparables entre sí (a través de distancias, tiempos y experimentadores), se pueden utilizar estándares (internos y/o externos).
Según la invención, el objeto de la presente invención es un procedimiento para la cuantificación y/o caracterización selectiva de agregados del tipo agregados de a-sinucleína y agregados de tau.
Según la invención es un procedimiento para la cuantificación selectiva de agregados del tipo de agregados de a-sinucleína en líquidos corporales como biomarcadores para la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías, donde adicionalmente se investiga otro tipo de agregado, a saber, agregados de tau.
Según la invención, el objeto de la presente invención es un procedimiento para la cuantificación y/o caracterización selectiva de agregados mixtos del tipo de agregados de a-sinucleína con agregados de tau en líquidos corporales como biomarcadores para la enfermedad de Parkinson y otras sinucleopatías.
Según la invención es un procedimiento para la cuantificación y/o caracterización selectiva de agregados del tipo de agregados de tau en líquidos corporales como biomarcadores para tauopatías, donde adicionalmente se investiga otro tipo de agregado, a saber, agregados de a-sinucleína.
Según la invención, el objeto de la presente invención es un procedimiento para la cuantificación y/o caracterización selectiva de agregados mixtos del tipo de agregados de tau con agregados de a-sinucleína en líquidos corporales como biomarcadores para tauopatías.
Según la invención es un procedimiento para la cuantificación y/o caracterización selectiva de agregados deasinucleína y agregados de tau, en fluidos corporales como biomarcadores para la demencia de Alzheimer. El objeto de la presente invención es, además, el uso de un estándar para la cuantificación y/o caracterización selectiva de los indicadores de la enfermedad en un procedimiento según la invención, donde el estándar es un dendrímero, que contiene una molécula de andamio central y epítopo de las proteínas agregados de asinucleína o agregados de tau según la SEQ ID NO: 10 o SEQ iD NO: 11, donde tanto estándares que están constituidas a partir de las mismas secuencias de monómeros como también aquellos que están constituidas a partir de diferentes secuencias de monómeros.
Como estándar en el sentido de la presente invención se designa un valor de referencia fijo universalmente válido y aceptado que sirve para comparar y determinar propiedades y/o cantidad, en particular para determinar el tamaño y la cantidad de agregados (patógenos) de proteínas endógenas (mal plegadas). El estándar en el sentido de la presente invención se puede utilizar para la calibración de aparatos y/o mediciones.
Es esencial para los estándares que los estándares no se agreguen, preferiblemente mediante el uso de secuencias de epítopos que no se agreguen, ya que el subconjunto correspondiente de proteínas endógenas no es responsable de la agregación, o que no se agreguen mediante el bloqueo de los grupos responsables de la agregación.
En este sentido, el término "secuencia de epítopos" describe aquí un área parcial, un fragmento de las proteínas individuales (monómeros) que forman agregados de proteínas mal plegadas.
En una realización, el área parcial es un epítopo según una de las SEQ ID NO: 10 u 11.
Una secuencia de epítopos seleccionada de esta manera se incorpora en el número deseado durante la formación de los estándares según la invención y/o se enlaza según la invención.
Los estándares según la invención son polímeros que están constituidos a partir de los epítopos descritos anteriormente, eventualmente que contienen otros elementos.
La molécula estándar según la invención es un polímero de los epítopos definidos anteriormente. El oligómero en el sentido de la invención es un polímero formado por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 secuencias de monómeros o múltiplos de los mismos, preferiblemente 2-16, 4-16, 8-16, especialmente preferiblemente 8 o 16 o múltiplos de los mismos.
En una alternativa de la presente invención, los estándares son solubles en agua.
En una alternativa de la presente invención, los estándares según la invención están constituidos a partir de la misma secuencia de epítopos.
En una alternativa de la presente invención, los estándares según la invención están constituidos a partir de diferentes secuencias de epítopos.
Es esencial para las secuencias usadas según la invención su propiedad de no agregarse (o solo de forma controlada según las condiciones) y/o su actividad como epítopo.
Los estándares tienen en una alternativa ventajosamente una mayor solubilidad en agua como agregados patógenos u oligómeros de proteínas endógenas.
En una realización de la presente invención, los estándares poseen un número bien definido de epítopos que están unidos covalentemente entre sí (directamente o a través de aminoácidos, espaciadores y/o grupos funcionales) para el enlace de los correspondientes socios de enlace.
En este sentido, con referencia a los estándares, los socios de enlace se seleccionan del grupo compuesto de: anticuerpos, Nanobody y Affibody. Los socios de enlace son, además, todas las moléculas que poseen una especificidad de unión suficiente para el agregado a detectar, por ejemplo, colorantes (tioflavinaT, Rojo Congo, etc.).
Una molécula estándar según la invención puede contener epítopos para al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más socios de enlace distintos.
Los epítopos característicos de distintos socios de enlace se pueden incorporar en los estándares según la invención dado que se usan secuencias de monómeros que son idénticas a diferentes áreas de una o diferentes proteínas (que forman agregados de proteínas mal plegadas), o presentan al menos una homología del 50% para ellas, pero poseen la actividad del epítopo correspondiente.
En una realización de la presente invención, las moléculas estándar contienen los llamados espaciadores. Por un espaciador se debe entender una molécula que está incorporada en la molécula estándar a través de enlaces covalentes y posee determinadas propiedades físicas y/o químicas, a través de las cuales se modifican las propiedades de la molécula estándar. En una realización de los estándares según la invención se emplean espaciadores hidrófilos o hidrófobos, preferentemente hidrófilos. Los espaciadores hidrofílicos se seleccionan del grupo de moléculas formadas a partir de polietilenglicol, azúcar, glicerol, polililisina o beta-alanina.
Los estándares según la invención contienen (otros) grupos funcionales en una alternativa de la presente invención.
Por grupos funcionales se deben entender las moléculas que están unidas covalentemente a las moléculas estándar. En una variante, los grupos funcionales contienen grupos de biotina. Esto permite un fuerte enlace covalente a la estreptavidina. Las moléculas estándar que contienen grupos de biotina se pueden unir así a moléculas que contienen grupos de estreptavidina. Si las moléculas estándar según la invención contienen grupos de biotina y/o estreptavidina, se pueden ensamblar estándares más grandes o se pueden unir varias moléculas estándar, dado el caso diferentes, a un andamio.
En otra alternativa de la presente invención, las moléculas estándar contienen colorantes para la determinación espectrofotométrica y/o aminoácidos aromáticos. Los aminoácidos aromáticos son, por ejemplo, triptófano, tirosina, fenilalanina o histidina, o se seleccionan de este grupo. La incorporación de triptófano permite una determinación espectrofotométrica de la concentración de los estándares en la solución.
Según la invención, los estándares están constituidos como dendrímeros. Los dendrímeros según la invención están constituidos a partir de las secuencias de monómeros a utilizar según la invención descritas anteriormente y pueden contener una molécula de andamio central. La molécula de andamio es preferiblemente un monómero de estreptavidina, de manera especialmente preferible un polímero, en particular un tetrámero.
Los dendrímeros según la invención pueden contener cualquiera de las características de las normas descritas anteriormente o cualquier combinación de las mismas.
En una alternativa de la presente invención se trata de:
- dendrímeros que contienen un número bien definido de epítopos para el enlace covalente de socios de enlace, dendrímeros caracterizados porque posee una mayor solubilidad en agua que los agregados patógenos de proteínas endógenas,
- dendrímeros que contienen grupos funcionales,
- dendrímeros que contienen al menos una molécula espaciadora y/o
- dendrímeros que contienen colorantes para la determinación espectrofotométrica y/o aminoácidos aromáticos. Según la invención, los dendrímeros tienen una simetría radial.
En una variante se produce la ramificación de la primera generación del dendrímero sobre lisina, en particular tres aminoácidos de lisina.
En otra alternativa de la presente invención, en los estándares, en particular los dendrímeros, los epítopos, no están enlazados entre sí o con otros elementos de los estándares, como aminoácidos, espaciadores y/o grupos funcionales y/u otros elementos descritos anteriormente, en particular están enlazados covalentemente, no a través de un enlace a un átomo de azufre, no a través de un enlace de tioéter y/o no a través de cisteína (en su caso, por medio del puente de disulfuro por cisteína). Del mismo modo, en otra variante, los epítopos y un espaciador unido a ellos en el espaciador no están vinculados entre sí a través de un enlace a un átomo de azufre, no a través de un enlace de tioéter y/o no a través de cisteína o con otros elementos de los estándares, como aminoácidos, otros espaciadores y/o grupos funcionales y/u otros elementos descritos anteriormente, en particular unidos covalentemente.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un kit para el uso en un procedimiento según la invención, que contiene:
5 - estándar según la invención,
- sonda,
- moléculas de captura, sustrato y sondas según la invención,
- soluciones,
- tampones,
0
donde la enfermedad se selecciona del grupo compuesto por tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías, y/o demencia de Alzheimer.
Los compuestos y/o componentes del kit de la presente invención pueden estar embalados en recipientes, 5 dado el caso, con/en tampones y/o solución. Alternativamente, algunos componentes pueden estar empaquetados en el mismo contenedor. Adicionalmente a ello o alternativamente a ello, uno o varios de los componentes podrían estar absorbidos en un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una placa de vidrio, un chip o una membrana de nylon o en la cavidad de una placa de microtítulo.
0 Además, el kit puede contener instrucciones para el uso del kit para cualquiera de las formas de realización. Todas las etapas del procedimiento después de la toma de la muestra se llevan a cabo ex vivo (in vitro), es decir, fuera del cuerpo humano o animal. Los tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas se encuentran en la siguiente enfermedad y se pueden usar como biomarcadores o como parte de un biomarcador: 5 Tabla A, líneas 1-15
Tabla A:
Figure imgf000029_0001
En una realización de la presente invención, un biomarcador de la tabla A también se debe usar como indicador 0 de enfermedad para una enfermedad de la tabla A diferente de la especificada en la misma línea del biomarcador en la tabla.
Por ejemplo, los agregados de tau también pueden servir como biomarcadores para la demencia de Alzheimer o, como se muestra en la tabla, los agregados de DISC1, agregados de FUS, agregados de a-sinucleína, agregados de tau o los agregados de TDP-43 para varias enfermedades.
Por ejemplo, los grupos mixtos, por ejemplo de tau y a-sinucleína, también pueden servir como biomarcadores para, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson. Todos los demás grupos mixtos también se pueden utilizar como biomarcadores.
Por lo tanto, no solo es posible el diagnóstico de combinaciones de enfermedades, sino que de estos resultados también se pueden excluir otras enfermedades. De este modo igualmente se permite un diagnóstico más preciso.
El objeto de la presente invención es un procedimiento para determinar enfermedades que presentan agregados de proteínas mal plegadas, que comprende las siguientes etapas:
i) determinación cuantitativa ex vivo, tal como se ha descrito anteriormente, de los indicadores de la enfermedad;
ii) comparación de estos datos con los valores normalizados;
iii) constatación de una cantidad significativamente diferente de indicadores de la enfermedad en esta comparación;
iv) asignación de la desviación a una enfermedad seleccionada del grupo compuesto de tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías y/ o demencia de Alzheimer.
Sobre el sustrato empleado se pueden inmovilizar moléculas de captura específicas en al menos dos zonas definidas con precisión, que se unen a diferentes agregados de proteínas endógenas. En una alternativa se inmovilizan 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o varias moléculas de captura específicas diferentes en zonas exactamente definidas del sustrato. Según el enlace y la posterior detección de los agregados, entonces es posible un diagnóstico diferencial.
En una alternativa, por pocillo se pueden aplicar (puntear) 16 o varias moléculas de captura diferentes a subregiones definidas. Por lo tanto, se pueden identificar diferentes tipos de agregados e incluso agregados heterogéneos de diferentes monómeros en una única muestra. Por lo tanto, son suficientes pequeñas cantidades de líquidos corporales. Además, la posición de trama ya puede servir para la identificación de los agregados.
En una alternativa, se puede inmovilizar una mezcla de diferentes anticuerpos de captura en un único sustrato (pocillo), o mediante un procedimiento de "punteado" en diferentes posiciones dentro de una única superficie, por ejemplo, en el fondo de un pocillo de microplaca, se pueden aplicar diferentes moléculas de captura (por ejemplo, anticuerpos), que se unen, por ejemplo, específicamente a una o más de las sondas o se unen específicamente a una o más de las proteínas agregadas. Mediante el uso de distintas sondas, que portan respectivamente un fluoróforo diferente, así se pueden analizar distintas especies de agregados casi simultáneamente en una única parte alícuota de muestra.
También se pueden identificar así formas mixtas de agregado, que consisten en diferentes monómeros de proteínas.
Por lo tanto, no solo es posible el diagnóstico de combinaciones de enfermedades, sino que de estos resultados también se pueden excluir otras enfermedades. De este modo igualmente se permite un diagnóstico más preciso.
Una ventaja del procedimiento según la invención es la posibilidad, por medio de una única muestra de paciente, que comprende una pluralidad de entidades que se acompañan de agregados de proteínas, de investigar todos los tipos de agregados posibles, que se basan en proteínas endógenas mal plegadas. Otra ventaja es la posibilidad de examinar los agregados de proteínas directamente, ex vivo en muestras, como sangre y muestras de líquido cefalorraquídeo u orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia, en particular sangre y muestras de líquido cefalorraquídeo, inmediatamente en busca de tipos de agregados. Mediante el procedimiento según la invención se pueden determinar cualitativa y/o cuantitativamente nuevos indicadores de enfermedad. Por lo tanto, también son objeto de la invención indicadores de enfermedad, biomarcadores, caracterizados por la presencia de un tipo de agregado de proteínas endógenas mal plegadas, que se examinan según la invención y, dado el caso, la presencia y/o ausencia de al menos otro tipo de agregado.
Mediante el procedimiento según la invención y los nuevos biomarcadores, una de las enfermedades se puede identificar sobre la base de agregados de proteínas mal plegadas (como se ha mencionado anteriormente) y diferenciarse inequívocamente de las otras enfermedades del grupo, dado el caso con síntomas similares o coincidentes.
Ejemplos
Según la invención es solo el examen de tau y/o a-sinucleína. Los ejemplos que no se refieren al examen de tau y/o a-sinucleína no son según la invención y sirven únicamente para la ilustración.
1. Material y método
Como portamuestras se utilizaron en el ensayo placas multipocillos con un fondo de cristal de 170 |jm de espesor (SensoPlate Plus 384 Greiner Bio One, Kremsmünster, Austria). Todos los reactivos y soluciones utilizados se obtuvieron en el más alto grado de pureza y se esterilizaron sin partículas antes de su uso. En la primera etapa, cada cámara de muestra (pocillo) se llenó con 100 j l de soda cáustica (5 M), se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente, se enjuagó tres veces con agua, se mezcló 100 j l de ácido clorhídrico y se incubó de nuevo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados con agua y dos lavados con etanol, los pocillos se secaron bajo atmósfera de nitrógeno.
Para la generación de grupos amino sobre la superficie de vidrio se añadieron respectivamente 20 j l de etanolamina (5,6 M) a los pocillos y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Los pocillos se enjuagaron tres veces con DMSO, dos veces con etanol y se secaron bajo atmósfera de nitrógeno.
El polietilenglicol heterobiofuncional (NHS-PEG-COOH, MW 3.400 Da) se disolvieron a 50 mM en DMSO a 70 °C durante 1 min, se enfría a temperatura ambiente y se ajusta a 2% de trietilamina. A partir de esta solución, se añadieron 15 j l a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante al menos una hora. La solución se retiró de los pocillos, y los pocillos se lavan tres veces con agua.
Para activar el recubrimiento de PEG se disolvieron NHS y EDC (carbodiimida) a 100 mM cada uno en tampón MES (0,1 M, pH 5, MES: ácido 2-N-morfolinoetanosulfónico) y se mezcló en una proporción de 1:1 formando concentraciones finales de 50 mM respectivamente. Cada 30 j l de esta solución se llenó en los pocillos y se incubó durante 30-60 minutos. Después de retirar la solución, los pocillos se lavaron tres veces con tampón MES (0,1 M, pH 5).
El anticuerpo de captura se diluyó a 30 ng/jl en PBS. De estos, 15 j l se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1-3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se retiró la solución y se lavó tres veces con PBST (PBS con Tween 20), a continuación, tres veces con PBS.
El 3% de BSA se centrifugó previamente a 100.000 g (1 hora a 4°C). Cada 50 j l del sobrenadante se llenó en los pocillos y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La solución de BSA se retiró y se lavó tres veces con PBST.
La muestra (por ejemplo, agregados de proteína recombinante y muestra natural del paciente) se diluyó en PBS, si es necesario, y se añadió 15 j l respectivamente a los pocillos. La placa multipocillo se centrifugó a 1.000 g durante una hora a 4 °C en un rotor oscilante. El sobrenadante se retiró y los pocillos se lavaron tres veces con PBST y tres veces con PBS.
Como sondas de detección se utilizaron anticuerpos marcados con fluorescencia. Estos se diluyen a 1-2 ng/jl en PBS y se mezclan con 1,5% de BSA. Las composiciones se centrifugaron a 100.000 g durante una hora a 4 °C. Cada 15 j l del sobrenadante se llenó en los pocillos y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se retiró la solución y se lavó cinco veces con PBST y cinco veces con PBS.
La fluorescencia superficial se visualizó por medio de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM). Alternativamente, las partículas de proteínas se pueden visualizar a nivel de la superficie del vidrio con escaneo láser confocal. Por pocillo se reprodujeron hasta 50 fotogramas (1000x1000 píxeles, 114 nm/pixel) por canal de fluorescencia con una cámara CCD de alta sensibilidad.
Las señales de fondo en los datos de imagen se limpiaron mediante un valor umbral de intensidad. Se determinó el número medio de píxeles con valores de escala de grises por encima del umbral (sFIDA-readout). Si se utilizaron varias sondas de detección, solo se evaluaron los eventos colocados en todos los canales de fluorescencia.
2. Protocolo sFIDA
2.1. Pretratamiento
• 15 min NaOH (5M) 100 jl/pocillo
• 3x H2O
• 15 min HCl (1M) 100 pl/pociMo
• 3x H2O
• Enjuague 2x EtOH
• Secar con N2
2.2. Activación del vidrio (grupos amino)
•20 |jl/pocillo de etanolamina (5,6 M) ® incubación durante la noche a temperatura ambiente o más de 4 °C
• 3x DMSO
• 2x EtOH
• Secar con N2
2.3. Espaciador NHS-PEG-COOH
• Disolver 17 mg de PEG en 100 pl de DMSO a 70 °C (corto), dejar enfriar, 2 pl de trietilamina (TEA)
Figure imgf000032_0001
incubación: por lo menos 1 h
2.4. Activación de PEG con NHS/EDC (50mM)
• Diluir 5,8 mg de NHS y 9,6 mg de EDC en 500 pl de MES (0,1 M), mezclar 1:1 directamente antes de la aplicación.
• 30 pl/pocillo incubación: 30 min - máx. 1 h
• Rápidamente 3x MES (0,1 M)
2.5. Captura
• Diluir los anticuerpos de captura en PBS (30ng/pl)
• 15 pl/pocillo -> incubación: 1-3 h RT o superior 4°C
• 3x PBST, 3x PBS
2.6. Bloqueo
• 3% BSA 1 h a 100.000 x g, 4 °C (rotor TLA-45)
Figure imgf000032_0002
incubación 1 h
Día 2 2.7. Objetivo
• Objetivo de 15 pl, diluido en PBS
• Incubación 1h cf, 1000g, 25°C,
• HH: 3x 0.2% SDS/PBS; 5x PBST; 5x PBS
• Plasma y agregados recombinantes: 3x PBST; 3x PBS
2.8. Anticuerpo de detección
*1-2 ng/pl en 1,5% de BSA con PBS después de 100.000 x g, 4°C (rotor TLA-45)
• cada 15 pl de sobrenadante/pocillo incubación >=1-2h, RT
• 5xPBST
• 5x PBS
(para las etapas de lavado se utilizaron en cada caso 100 pl de la solución correspondiente)
3. Uso con agregados de proteína recombinante
En primer lugar, se demostró la viabilidad básica del ensayo sFIDA para la detección de distintas especies de agregados. A modo de ejemplo se prepararon agregados de distintas proteínas (AapoAl, AL, SOD1, ALys, AA, TDP-43)
y se examinaron las series de dilución correspondientes en el ensayo sFIDA. A este respecto se usó como anticuerpo de captura y de detección en cada caso el mismo anticuerpo dirigido contra la respectiva proteína. La sonda de detección fue marcada respectivamente con Alexafluor 488. Todos los agregados se pueden detectar en función de la concentración hasta en el rango picomolar por medio de sFIDA.
Fig. 1A-F: sFIDA de distintos agregados de proteínas. Los agregados de proteínas se diluyeron en tampones de PBS en las concentraciones indicadas y se analizaron en el ensayo sFIDA. Como control reactivo se utilizó tampón de PBS. A) ApoAl sonda de captura y de detección (marcada AF488): EPR 1368Y B) AL, sonda de captura y de detección (marcada AF488): EPR 5367 C) SOD1, sonda de captura y de detección (marcada AF488): EPR 1726 D) ALys, sonda de captura y de detección (marcada AF488): EPR 2994 (2) E) Aa , sonda de captura y detección (marcada AF488): EPR 4134 F) TDP-43, sonda de captura y detección (marcada AF488): EPR 5810
4. Aplicación en muestras nativas
Para demostrar a modo de ejemplo que se pueden detectar agregados de proteínas en muestras de sangre y líquido cefalorraquídeo (muestras de LCR) u orina, saliva, membrana mucosa, material de biopsia, se diluyeron los agregados de proteínas (a- sinucleína y DISC1) en LCR y se analizaron por medio de sFIDA. Para la detección de a-sinucleína se utilizaron como anticuerpos anti-aSyn-AB 2B2A11 y como sonda de detección los anti-aSyn-ABs 3H2897- AF633 y 211-AF488 marcados con fluorescencia. Para la detección de agregados de DISC1, se utilizó anti-DISC1-AK 14F2 como anticuerpo de captura y 14F2-AF633 como sonda de detección. Tanto la sinucleína como también los agregados de DISC1 se pueden detectar en función de la concentración hasta en el rango picomolar por medio de sFIDA (véanse las figuras 2A y B).
Para estudiar las bases moleculares de la esquizofrenia, se desarrolló un modelo de rata en el laboratorio de Carsten Korth, que expresa mejor la proteína DISC1. Para verificar si esta proteína está presente de forma nativa en los agregados, se analizaron muestras de LCR de un animal transgénico por medio de sFIDA. En comparación con dos animales de control, la muestra transgénica mostró un título significativamente mayor de agregados DISC1 (Figura 2A, muestras WT1, WT2, Tg).
Figura 2: detección de sFIDA de agregados de proteínas en LCR. Agregados de proteína recombinante se diluyeron en LCR humano y se examinaron en un ensayo sFIDA. A) Prueba de DISC1. Como anticuerpo de captura y sonda de detección (marcada con AF633) se utilizó mAB 14F2. Además de los agregados de DISC1 recombinantes (10pg- 10ng), las muestras de LCR de ratas (WT1, WT2, Tg) se sometieron a análisis sFIDA. B) Detección de sinucleína por medio de 2D sFIDA. Como anticuerpo de captura se empleó el anti-aSyn-AB 2B2A11 y como sonda de detección se emplearon los anti-aSyn-ABs 3H2897-AF633 y 211-AF488 marcados con fluorescencia. Solo se tuvieron en cuenta las señales colocalizadas en ambos canales de color por encima de un valor umbral.
5. Aplicación de diagnóstico diferencial de sFIDA
Se distribuyó una muestra entre diferentes cámaras de reacción (pocillos) que están recubiertas con los distintos anticuerpos de captura. Alternativamente, una mezcla de distintos anticuerpos de captura se puede inmovilizar en un único pocillo, o se pueden aplicar diferentes anticuerpos de captura a través de un procedimiento de "punteado" en distintas posiciones dentro de una única superficie, por ejemplo, en el fondo de un pocillo de placa de microtítulo.
Mediante el uso de distintas sondas, que portan respectivamente un fluoróforo diferente, así se analizaron distintas especies de agregados casi simultáneamente en una única parte alícuota de muestra.
En este ejemplo de realización se demostró que un ensayo de sFIDA específico de ALys (anticuerpo antilisozima como sonda y captor) no reacciona de forma cruzada con otros agregados de proteínas en un amplio rango de concentración (fig. 3). Los anticuerpos anti-lisozima como sonda y captor interactúan solo con los agregados del tipo ALys.
En otro ejemplo, se demostró que la presencia de otras proteínas no tiene ningún efecto negativo sobre la detectabilidad de los agregados de beta amiloides. Para ello se sometió a un análisis sFIDA una mezcla de agregados de beta-amiloides y agregados de tau.
Fig. 3. Análisis de especificidad. En un ensayo sFIDA específico de ALys con anticuerpo de captura monoclonal EPR2994(2) y sonda de detección EPR2994(2)-AF488, además de una dilución de agregados de ALys recombinantes, se probaron otros agregados de proteínas (Tau, TDP-43, SOD1, AA, AL, sinucleína, ApoAl) para la reactividad cruzada.
Figura 4: SFIDA específico de Abeta en presencia de proteína tau. Los agregados de proteína de Abeta se

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de indicadores de enfermedad, caracterizado porque se examina una muestra para al menos dos tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas, donde los al menos dos tipos de agregados de proteínas endógenas mal plegadas se seleccionan del grupo que consiste en agregados de tau y agregados de a-sinucleína y agregados mixtos de tau y a-sinucleína, que comprende las siguientes etapas:
antes de la etapa a) inmovilización de moléculas de captura sobre un sustrato, donde las moléculas de captura presentan anticuerpos específicos contra un epítopo de las proteínas que forman los agregados, a) aplicación de la muestra a examinar al sustrato, donde como muestra a examinar se utilizan líquidos o tejidos endógenos ex vivo y donde la muestra se examina en busca de al menos dos tipos de agregados diferentes de proteínas endógenas mal plegadas sin preparación y/o tratamiento ulterior; b) adición de sondas características para la detección, que marcan mediante enlace específico al respectivo agregado a este, donde como sondas se usan anticuerpos, donde se utilizan al menos 2 sondas diferentes, que se diferencian tanto en cuanto a su enlace específico a los agregados como también en cuanto a su caracterización diferente, y
c) detección de los agregados marcados, donde la detección en la etapa c) se realiza por medio de un procedimiento con señal resuelta localmente,
donde
- la etapa b) se puede llevar a cabo antes de la etapa a),
y
- la enfermedad es selecciona del grupo que consiste en:
tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías y/o demencia de Alzheimer, donde se excluye una detección de monómeros, en tanto que una de las sondas de detección es idéntica a la molécula de captura o ambas reconocen un epítopo superpuesto,
y/o en tanto que las señales con una baja intensidad no se evalúan mediante un corte de intensidad (cut-off), y/o mediante la correlación cruzada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se examina en busca de al menos dos tipos de agregados diferentes en una etapa del procedimiento.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se examina en busca de al menos dos tipos de agregados diferentes sobre el mismo sustrato.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se realiza en la etapa c) por medio del procedimiento sFIDA.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las moléculas de captura y/o la sonda están caracterizadas con colorantes fluorescentes.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las moléculas de captura y/o las sondas presentan anticuerpos específicos contra un epítopo de las proteínas que forman los agregados.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza un estándar interno o externo.
8. Uso de un estándar para la cuantificación y/o caracterización selectiva de los indicadores de la enfermedad en un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el estándar es un dendrímero, que contiene una molécula de andamio central y epítopo de las proteínas agregados de a-sinucleína o agregados de tau según la SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11, donde tanto estándares que están constituidas a partir de las mismas secuencias de monómeros como también aquellos que están constituidas a partir de diferentes secuencias de monómeros.
9. Procedimiento para determinar enfermedades que presentan agregados de proteínas mal plegadas, que comprende las siguientes etapas:
i) determinación cuantitativa ex vivo según la reivindicación 1 de los indicadores de la enfermedad; ii) comparación de estos datos con los valores normalizados;
iii) constatación de una cantidad significativamente diferente de indicadores de la enfermedad en esta comparación;
iv) asignación de la desviación a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías y/o demencia de Alzheimer.
10. Kit para el uso en un procedimiento según la reivindicación 9 que contiene:
- estándar según la reivindicación 8,
- sonda,
- moléculas de captura, sustrato y sondas según la reivindicación 1,
- soluciones,
- tampón,
donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tauopatías, enfermedad de Parkinson y otras sinucleopatías, y/o demencia de Alzheimer.
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