JP4772065B2 - 多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法 - Google Patents
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Description
(i)本発明の方法は、多量体−特異的抗体を要求しない。例えば、前記方法は、PrPSc−特異的抗体に依存的ではない。PrPSc及びPrPc間に交差反応性を有する抗体を、生試料内のPrPScを分別検出するための本発明に成功的に適用できる。
(ii)本発明は、PrPSc検出のために、従来利用してきた蛋白質分解酵素K(PK)処理を必要としない。本発明のMDS方法そのものは、PKを処理しなくても、十分PrPCからPrPScを区別できる能力を有する。
(iii)本発明は、血漿試料内の凝集型(特に、PrPSc)を免疫分析方法により検出できるようにする。血漿内のPrPScの成功的な検出に関して知られたことは、ほとんどない;及び、
(iv)本発明は、便利且つ迅速な方式により実施できて、これは、MDSの自動化を可能にする。
3F4及び3F4−バイオチン抗体をそれぞれSigma(US)及びAbcam Ltd(UK) から購入した。308及びMA1−750抗体をCayman Chemical Co.及びAffinity BioReagents Inc.(US)から購入した。T2−HRP及び1F5抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。牛及びハムスター組み換え(23−231)プリオン蛋白質をそれぞれPrionics AG.(スイス)及びAlicon AG(スイス)から購入した。マウス及びヒト組み換え(23-231)プリオン蛋白質をメリランド大学(US)及び動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。同じ年齢の正常及びスクレイピーハムスターの脳均質液をそれぞれSLC, Inc.(JP)及びボルディモア研究/教育財団から購入した。HRP接合抗マウスIgG及びエンハンス化学発光キットをAmersham Biosciences(UK)から購入した。PVDFメンブレインをBio-Rad Inc.(US)から購入した。StartingblockをPierce Biotechnology Inc.(US)から購入した。X−rayフィルムをFuji Inc.(JP)から購入した。化学発光HRP基質、スーパーシグナルウェストピコ(Supersignal West Pico)をPierce Biotechnology Inc.(US)から購入した。TMBをSigma(US)から購入した。脳均質液から精製されたマウスPrPScを動物衛生研究所(JP)から寄贈したもらった。トリプシンをFluka(US)から購入した。蛋白質分解酵素阻害剤カクテルをSigma(US)から購入した。
組み換え牛プリオン蛋白質0.2ng(PrP23-231、メリランド大学から入手)を、変性剤を使用せずにnative gel(12.5% SDS-PAGE)にローディングして、4℃で12時間以上電気泳動ゲルの蛋白質バンドをPVDFメンブレイン(Bio-Rad)に転移させた。前記PVDFブロットをTBS緩衝液内50%Startingblock(PIERCE)でブロッキングした。その後、6H4抗体(Prionics AG)を一次抗体として使用して、HRP結合−抗マウスIgG(Amersham)を二次抗体として使用した。X−rayフィルム(Fuji)に露出させて前記ブロットを検出するために、エンハンス化学発光(ECL)法を利用した。二量体、三量体、及びより大きい高分子量のバンドとして表れるプリオン多量体を検出した。
MA1−750抗体でコーティングされたプレートを製造した。MA1−750抗体(抗プリオン蛋白質、Affinity bioreagents, Inc.)30μgを200mM MOPS 10μgに懸濁させて、この懸濁液の100μl分画をImmuno module plates(Nunc-468667)の各ウェルに入れた後、4℃で一晩中反応した。前記プレートをPBSで洗浄し、PBSに溶かした卵白アルブミンにより室温で1時間ブロッキングした。
多量体型組み換え牛プリオン蛋白質を製造した。組み換え牛プリオン蛋白質3.1μgをカップリング緩衝液(5mMリン酸カリウム、75mM NaCl、pH 6.5)700μlに溶解して、これをEDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、Sigma E6383)溶液と室温で24時間反応した。
予め製造されたハムスタースクレイピー脳均質液(10重量%)を購入した。同じ年齢の正常脳均質液(10重量%)を、PBS及び均質機を利用して製造した。前記脳均質液をトリプシン(5mg/ml)で37℃で1時間分解して、前記トリプシン分解を蛋白質分解酵素阻害剤カクテルにより中止させた。前記試料を8M塩酸グアニジン(Sigma, Gdn-HCl)で処理し1.0Mにして、周囲温度で15分間反応させた。その後、前記試料を0.25M Gdn−HClにするために、TBST、2%トリトンX−100及び0.5%デオキシコール酸ナトリウムを添加して追加的に希釈した。前記試料を100℃で5〜10分間加熱した。前記試料が周囲温度に到達した後、前記試料をMDSに適用した。前記MDSセットに対し、プレート上にコーティングされたT2を捕獲抗体として利用し、T2−HRPを検出抗体として利用した。
血液試料を正常または散発性CJD患者から採取し、クエン酸ナトリウム、EDTA、及びヘパリンチューブ、好ましくは、ヘパリンに入れた。血漿を得るために、一般的な血漿収集過程を利用した。前記チューブを10〜15分間1000×g及び/または2800×gで遠心分離した。透明な上澄み液(血漿)を分離して、使用するまで−80℃で保管した。同じ年齢の正常及びスクレイピー感染ハムスター血漿を5匹以上のプール(pool)から得て、クエン酸ナトリウムチューブに入れた。血漿を上述のように得た。MDSに適用される血漿試料処理のために、血漿を塩酸グアニジンと混合し(Sigma, Gdn-HCl)、最終濃度1〜2Mにして、15〜60分間室温または37℃で反応させた。前記試料を界面活性剤、0,02%サルコシル(Sigma)、0.5%トリトンX−100(Samchun Chemical)、0.125%デオキシコール酸ナトリウム(sigma)、及び0.5%または1%zwittergent-16(Anaphase Inc.、米国)を含むTBSまたはPBS緩衝液で希釈し、室温で15分間、または15〜60分間37℃で反応させ、変性剤の最終濃度を0.125〜0.5Mに調節した。その後、前記試料を10〜15分間70℃で加熱し、室温に到達するように維持した。
抗体がコーティングされたプレートを下記従来の方法により用意した。308(Cayman)のエピトープは、KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG(106-126)、3F4(Sigma)のエピトープは、MKHM(109-112)であって、お互いオーバーラップされている。コントロールELISAを利用して、ヒト血漿内の総プリオン蛋白質を検出するために、濃度1〜5μl/mlのコーティング緩衝液(BupH Carbonate-Bicarbonate; PIERCE)を利用して、308、3F4、または308及び3F4の組み合わせを、96−ウェルポリスチレンマイクロプレート(NUNC)上にコーティングした。前記プレートを4℃で一晩中保管し、次いで、室温で30〜60分間TBSまたはPBS(pH 7.4)内で、Startingblock(PIERCE)またはBlock Ace(Serotec)でブロッキングした。
牛及びマウス組み換えプリオン蛋白質のPrPScを検出するために、MA1−750抗体を捕獲抗体として利用し、T2−HRPを検出抗体として利用した。ヒト組み換えプリオン蛋白質内のPrPScを検出するために、308及び3F4−バイオチン抗体を、それぞれ捕獲抗体及び検出抗体として利用した。
スクレイピーマウス脳から精製されたPrPSc(プリオンの多量体型)を100%牛血漿にスパイクして、前記MDSプロトコールによりMDSを実施した。簡単に説明すると、1.25、0.42、0.14、0.05、0.02、及び0%精製されたPrPScを100%牛血漿に添加して、約3.125、1.04、0.35、0.12、0.04、0.01、及び0μg/mlのPrPScを得た。スパイクされた血漿100μlを、37℃で1時間MA1−750のコーティングされたプレート上で反応させた。前記プレートをTBSTで4回洗浄した後、T2−HRP検出抗体を添加し、次いで周囲温度で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで4回洗浄し、信号を示すようにするためにTMBを30分間添加した。停止溶液(1N H2SO4の50μl)を添加した後、前記プレートを450nmで測定した。
本実験の目的は、濃縮後の牛血漿内のプリオン多量体を検出するためのものである。牛血漿をAmino遠心分離濃縮機を利用して、200、400、及び500%まで濃縮した。前記濃縮された試料を、前記プロトコールにしたがってコントロールELISA及びMDSにより分析した。MA1−750及びT2−HRPの一セットをMDSのために利用して、1F5及びT2−HRPの一セットをコントロールELISAのために利用した。
308抗体を捕獲抗体として、3F4−バイオチンを検出抗体として利用した。血漿試料を308(Cayman)でコーティングされたプレート上に分株して、37℃で60分間またはそれ以上の時間反応させた。その後、前記プレートを0.05% Tween 20(Sigma)を含むTBSで4回洗浄した。検出抗体の3F4−バイオチンを1〜5μg/ml濃度で各ウェルに添加し、次いで37℃で1時間反応した。前記プレートを再び洗浄し、上記のようにストレプトアビジン/バイオチン/HRP検出システムを利用して多量体を検出した。HRPを利用したため、多いHRP基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法における変化を検出することができる。
3μg/mlまたは5μg/ml(150μl)の308抗体を利用して、308コーティングプレートを用意した。3μg/ml(150μl)の3F4抗体を利用して、3F4−コーティングプレートを作った。2.5μg/mlの308及び1.5μg/mlの3F4、または3μg/mlの308及び1μg/mlの3F4 150μlを利用して、308/3F4カクテル−コーティングプレートを作った。全てのプレートを25%Block Ace(Serotec)でブロッキングして、PBS 300μlで洗浄した。
プラスミノゲンは、プリオン蛋白質、特にPrPScに結合すると知られている。血漿は、プリオン蛋白質(2〜20ng/ml)と比較してみる時、相対的に高濃度のプラスミノゲン(300μg/ml)を含む。プリオンは、血漿または他の生試料において、プラスミノゲンと複合体として存在できる。PMCAにプラスミノゲンの添加は、PrPScの増幅を抑制して、これは、プラスミノゲンが血漿のPrPSc(多量体)検出を妨害できることを示す。したがって、MDSを、ヒト血漿にスパイクされたヒト組み換えプリオン蛋白質を利用して実施した。
実施例VIIIに詳述したように、スクレイピーマウス脳から精製されたPrPScを100%牛血漿にスパイクして、前記MDSプロトコールにしたがってMDSを実施した。簡単に説明すると、0.0083、0.0028、0.0009、0.0003、及び0%精製されたPrPScを100%牛血漿に添加し、約0.0033、0.0011、0.0004、0.0001、及び0μg/mlのPrPScを得た。スパイクされた血漿100μlを37℃で1時間、4E10コーティングプレート上で反応させた。4E10抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。TBSTで前記プレートを4回洗浄した後、4E10−HRP検出抗体を添加して、次いで周囲温度で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで4回洗浄し、化学発光基質(Femto, Pierce)を添加した。前記プレートをケミルミノメーター(chemiluminometer)で測定した。
Claims (28)
- (a)単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を捕獲する、多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に生試料を接触させるステップであって、前記多量体形成ポリペプチドは、Aβペプチド、β−アミロイド、tau蛋白質、プリオン、α−シヌクレイン、Ig軽鎖、血清アミロイドA、トランスチレチン、シスタチンC、β 2 −マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキサイドディスムターゼ、セルピン、及びアミリンから構成された群から選択されたものであるステップと、
(b)前記ステップ(a)のエピトープと同一ではなく、オーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を接触させるステップであって、前記捕獲抗体及び検出抗体が認識するエピトープは、前記多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列であるステップと、
(c)多量体型検出抗体複合体を検出するステップと、
を含む生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法。 - 前記多量体形成ポリペプチドは、プリオン蛋白質であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記単量体型は、PrPCであり、多量体型は、PrPSCであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びFRET標識であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記生試料は、脳均質液または血漿であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として脳均質液を利用する場合、前記ステップ(a)の前にトリプシンで前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記方法は、前記ステップ(a)の前に、蛋白質変性剤で前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記ステップ(a)の前に、前記生試料を加熱するステップをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、前記生試料はサルコシル界面活性剤を含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、蛋白質分解酵素処理ステップを含まないことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、前記ステップ(a)の前に、プラスミノゲン抑制剤で前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記プラスミノゲン抑制剤は、オメガ−アミノカルボキシル酸、L−リジン及びこれの誘導体、双性イオン(zwitterions)、ベンジルアミン、ベンズアミジン、L−アルギニン及びこれの誘導体から構成された群から選択されることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号1のアミノ酸109−112、106−126、132−147または135−140からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記生試料は、牛脳均質液であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、牛プリオン配列で記載された配列番号2のアミノ酸145−150または142−157からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記生試料は、人間血漿であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号1のアミノ酸109−112または106−126からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項15に記載の方法。
- (a)Aβペプチド、β−アミロイド、tau蛋白質、プリオン、α−シヌクレイン、Ig軽鎖、血清アミロイドA、トランスチレチン、シスタチンC、β 2 −マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキサイドディスムターゼ、セルピン、及びアミリンから構成された群から選択された多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体、及び(b)前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一ではなく、オーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体を含み、前記捕獲抗体及び前記検出抗体が認識するエピトープは、前記多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列である、請求項1乃至17の何れか一つの項に記載の方法を実施するための、生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出するためのキット。
- 前記多量体形成ポリペプチドは、プリオン蛋白質であることを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記単量体型は、PrPCであり、多量体型は、PrPSCであることを特徴とする請求項19に記載のキット。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びFRET標識であることを特徴とする請求項22に記載のキット。
- 前記生試料は、脳均質液または血漿であることを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記キットは、トリプシン、蛋白質変性剤、界面活性剤またはこれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項18に記載のキット。
- 前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号1のアミノ酸109−112、106−126、132−147または135−140からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記生試料は、牛脳均質液であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、牛プリオン配列で記載された配列番号2のアミノ酸145−150または142−157からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項26に記載のキット。
- 前記生試料は、人間血漿であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号1のアミノ酸109−112または106−126からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項26に記載のキット。
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