JP2681370B2

JP2681370B2 - 免疫測定法

Info

Publication number: JP2681370B2
Application number: JP63164779A
Authority: JP
Inventors: 榮治石川; 裕夫井村; 一和中尾
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-06-30
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1997-11-26
Anticipated expiration: 2012-11-26
Also published as: JPH0242359A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酵素などで標識した標識抗体と、担体に吸
着可能にせしめた抗体で、該抗体を吸着可能な担体の存
在下に、これらの抗体で抗原をサンドイッチするか、ま
たは、該抗体で抗原をサンドイッチ後に、該抗原抗体複
合体を担体に吸着させることを特徴とする免疫測定法に
関する。即ち、溶液状態で抗原抗体反応せしめることを
特徴とするサンドイッチ免疫測定法に関する。さらに本
発明は、上記測定法において、同一のエピトープを認識
する抗体で抗原をサンドイッチすることを特徴とするサ
ンドイッチ免疫測定法に関し、本法は、多量体となる抗
原、例えば、α−ANPの逆平行２量体であるβ−ANPなど
の特異的な測定に有効である。また、本発明は、β−心
房性ナトリウム利尿ポリペプチド（β−ANP）の免疫測
定法に関する。詳細には、同一のエピトープを認識する
抗α−ANP抗体でβ−ANPをサンドイッチすることを特徴
とする免疫測定法に関し、心、肺、泌尿器疾患の診断に
有用である。

従来の技術従来のサンドイッチ免疫測定法においては、酵素やラ
ジオアイソトープで標識した抗体と、担体に固定化した
固定化抗体とで、抗原がサンドイッチされる。

また、従来のサンドイッチ免疫測定法において同一の
エピトープを認識する抗体を用いる方法としては、同一
のモノクローナル抗体を用いてIFN−γを測定し、IFN−
γが多量体であることが示された例がある（Journal of
Interferon Research5:445−453（1985））。但し、、
この系においては、ラジオアイソトープ標識抗体と担体
に固定化された抗体が用いられている。即ち、同一のエ
ピトープを認識する遊離の溶液状態の抗体を用いて抗原
をサンドイッチする方法は、全く知られていなかった。

心房中で利尿作用、ナトリウム利尿作用、血管緊張低
下作用を有するポリペプチドが見出され、α−、β−、
γ−心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（α−ANP、β
−ANP、γ−ANP）と呼ばれている（Biochem.Biophys.Re
s.Commun.（以下BBRCと略記）118,131−139（1984）;Na
ture313,397−400（1985））。α−hANPは28アミノ酸残
基からなり（第１図参照）、Ｎ端から７番目のCys
［７］と23番目のCys［23］がジスルフィド結合してお
り、その間の配列がリング状構造をなしている。α−rA
NP（ラットα−ANP）は、α−hANP（ヒトα−ANP）では
Ｎ端から12番目の残基がMetであるのに対し、α−rANP
ではIleである点でのみ異なっている（BBRC117、839−8
65、1983）。β−hANPは、２分子のα−hANPがジスルフ
ィド結合した、いわゆるα−hANPの逆平行二量体である
（特開昭60−184098）。γ−hANPは126アミノ酸残基か
らなり、そのＣ端にα−hANP配列を有する。γ−hANPは
心房中に保存されているものであり、血液中でα−hANP
とＮペプチドに分割される（Hyper−tension８（suppl.
1）,I−151−155（1986））。α−hANPとβ−hANPは、
心臓、肺または泌尿器に疾患のある患者の血漿中で増加
することが示された（Journal of Clinical Investigat
ion,印刷中）。

α−ANPの測定法としては既に抗血清を用いたラジオ
イムノアッセイが確立されている（Science228、323−3
25、1985;Nature314、264−266、1985;BBRC124815−82
1、1984;BBRC124、663−668、1984;BBRC125、315−32
3、1984）。

また、α−hANPを認識するモノクローナル抗体として
は11A−A11が知られている。該抗体はラットのANPの一
種であるアトリオペプチンIIを抗原として得られたもの
で、そのエピトープはジスルフィド結合を含むCys
［７］−Ser［25］の間に存在し、即ちANPのリング構造
の一部であろうと考えられている。但し、該抗体の親和
性はMet［12、ヒト］とIle［12、ラット］間で差がな
く、rANPとhANPを認識する（Life Science,38,1991−19
97,1986）。

血漿α−hANPの高感度なサンドイッチ酵素免疫測定法
が報告されており（特願昭62−218662）、その検出限界
は0.6ng/lである。これは、フロセミド投与後の血液量
減少状態における血漿α−hANPの測定さえも可能にし
た。しかし、この測定法はβ−hANPと交差反応性を示
す。また、血漿β−ANPの測定を可能にする特異的なβ
−ANPの免疫測定法は未だ報告されていない。本発明は
血漿中のβ−ANPの新規で特異的なサンドイッチ酵素免
疫測定法を提供するものである。

発明が解決しようとする課題従来の固相化抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法に
おいては、固相化抗体を用いるがゆえに、その抗原抗体
反応における立体障害などにより反応効率が低下する場
合がある。

また、同一のモノクローナル抗体を用いて多量体を測
定しようとする試みは成されているが、固定化抗体が用
いられており、本実施例で示されるとおり、固定化抗体
を用いると、本発明の測定法に較べて測定限界が高くな
ることがある。

α−ANPの測定に関しては、上記のように様々な報告
が成されており、これらの測定系がβ−ANPと交差反応
性を示すことが明らかにされている。しかしこれらはα
−ANPを測定しようとするものであり、β−ANPに特異的
な系ではなく、これまでβ−ANPに特異的な測定系は全
く知られていなかった。

課題を解決するための手段本発明は、酵素などで標識した標識抗体と担体に吸着
可能にせしめた溶液状態の抗体で、該抗体を吸着可能な
担体の存在下に、抗原をサンドイッチするか、または、
該抗体で抗原をサンドイッチ後に、該抗原抗体複合体を
担体に吸着させることを特徴とする免疫測定法に関し、
即ち、溶液状態で抗原抗体反応せしめることを特徴とす
るサンドイッチ免疫測定法に関する。本法は、溶液状態
で抗原抗体反応がなされるために、固相化抗体を用いた
場合の立体障害など、反応効率を低下させる因子を減少
させることができ、測定感度が向上される。この測定法
は、従来用いられていた固相化抗体の代わりに、担体に
吸着可能にせしめた遊離の抗体を使用するだけでよい。
よって、従来の固相化抗体を用いるサンドイッチ免疫測
定法によって測定されていた抗原は全て、本測定法によ
り測定できる。

本発明はまた、同一のエピトープを認識する、標識抗
体および担体に吸着可能にせしめた遊離の抗体を用いて
抗原をサンドイッチし、該抗原抗体複合体を担体に吸着
させる、または、担体の存在下にサンドイッチすること
を特徴とするサンドイッチ免疫測定法に関する。即ち、
本発明は、同一のエピトープを認識する抗体で、特定物
質の多量体（オリゴマーやポリマー）をサンドイッチす
ることを特徴とする。単量体は同一のエピトープを認識
する抗体ではサンドイッチされないため、同一のエピト
ープを認識する抗体を用いるサンドイッチ法では、多量
体を特異的に測定することが可能であり、単量体とは全
く交差反応性を示さない。

本発明に用いる抗体としては、特定の抗原を認識する
モノクローナル抗体および抗血清いずれでも使用でき
る。単量体である抗原を測定しようとする場合には、異
なるエピトープを認識する異なる抗体を使用すべきであ
る。同一のエピトープを認識する抗体を用いて、特定抗
原の多量体を測定しようとする場合には、その単量体を
認識する抗体を使用することができ、モノクローナル抗
体や抗血清などいずれでも使用できる。この測定系で
は、全く同一のモノクローナル抗体を用いるのが好まし
いが、同一のエピトープを認識する抗体、および、その
認識するエピトープに重なる部分がある抗体であればよ
い。即ち、この方法は多量体を測定しようとするもので
あり、単量体には同時に結合できない抗体を２種用いれ
ば多量体を特異的に測定することができる。よって、本
明細書において同一のエピトープを認識する抗体とは、
エピトープに重なる部分があり、同時に単量体には結合
できない抗体をも意味する。

本発明の測定法に用いられる抗体としては、モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマをマウス腹腔中で
増殖させ得られた腹水や抗血清をDEAE−セルロースカラ
ムやプロテインＡ−セファロースカラムに付すことによ
り得られる精製イムノグロブリン、さらにペプシンで消
化して得られるＦ（ab′）_２断片、また、さらに２−メ
ルカプトエチルアミンなどで還元して得られるFab′断
片などを用いることが可能である。IgからのFab′の調
製については、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ［J.
Immunoassay］、４、209〜327（1983）に詳細な説明が
あり、本発明においても、同様の手法を利用することが
できる。

本発明の測定法のサンドイッチに用いる抗体の一方
は、発光物質、螢光物質、ラジオアイソトープまたは酵
素による標識抗体とする。標識には発光物質、螢光物
質、ラジオアイソトープを用いることも可能であるが、
測定の安全性、簡便さ、施設などの点から、酵素による
標識が好ましい。抗体（精製イムノグロブリン、Ｆ（a
b′）_２断片、Fab′断片などを含む）は、架橋剤を介し
て酵素で標識する。抗体の標識酵素としては、アルカリ
性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが利用可能で
ある。また、架橋剤としては、N,N′−ｏ−フェニレン
ジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミ
ドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミド
エステル、4,4′−ジチオジピリジン、その他公知の架
橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗
体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて、既知
の方法に従って行なえばよい。

サンドイッチに用いる他方の、担体に結合可能にせし
めた遊離の抗体としては、適切なハプテンで標識した抗
体、抗原で標識した抗体、抗体で標識した抗体、アビジ
ンまたはビオチンで標識した抗体などが挙げられる。ハ
プテンや抗原で標識された場合には、それらを認識する
抗体で担体をコートし、抗体で標識した場合にはそれと
結合する抗原で、アビジンで標識した場合にはビオチン
で、ビオチンで標識した場合にはアビジンで、それぞれ
担体をコートすればよい。上記のハプテンのうちでは、
ジニトロフェニルなどが好ましい。該抗体と結合可能な
担体の存在下に、上記標識抗体および抗体と結合可能な
抗体と特定物質を反応せしめ、または、該反応後に抗原
抗体複合体を担体に吸着せしめ、該担体に結合した酵素
活性を測定することにより特定抗原またはその多量体を
特異的に測定することができる。

固定化に用いる担体としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができ
る。吸着は、通常、リン酸緩衝液中、pH6〜10、好まし
くは中性付近で室温下に一夜放置することにより行な
う。

実施例に示されるとおり、本測定法は、従来の固定化
抗体を用いるサンドイッチ法よりも感度が高い。

さらに本発明は、血液中のβ−心房性ナトリウム利尿
ポリペプチド（β−hANP、α−hANPの逆平行二量体）の
新規で特異的なサンドイッチ免疫測定法に関する。即
ち、本発明は、同一のエピトープを認識する抗α−ANP
抗体でβ−ANPをサンドイッチすることを特徴とする。
α−およびγ−ANPは単量体であるため同一のエピトー
プを認識する抗体ではサンドイッチされない。よって、
同一のエピトープを認識する抗体を用いるサンドイッチ
法では、β−ANPを特異的に測定することが可能であ
り、α−およびγ−ANPとは全く交差反応性を示さな
い。

本発明に用いる抗体としては、α−ANPを認識するモ
ノクローナル抗体を使用することができ、例えば前記の
11A−A11、α−hANPのリング構造部分を認識するKY−AN
P−Ｉ（特願昭62−218662）、およびα−ANPのＮ端部分
を認識するKY−ANP−II（特願昭63−47280）などが挙げ
られるが、これらに限定されるものではなく、例えばα
−ANPのＣ末端を認識するものなど、α−ANP（α−rAN
P、α−hANPを含む）を認識するものであれば何れも使
用可能である。また、α−ANPを認識する抗血清を用い
ることも当然可能である。本発明の測定系では、全く同
一のモノクローナル抗α−ANP抗体を用いるのが好まし
いが、同一のエピトープを認識する抗体、および、その
認識するエピトープに重なる部分がある抗体であればよ
い。即ち、本発明の方法は多量体を測定しようとするも
のであり、単量体には同時に結合できない抗体を２種用
いれば多量体を特異的に測定できる。よって、本明細書
において同一のエピトープを認識する抗α−ANP抗体と
は、エピトープに重なる部分があり、同時にα−ANPに
は結合できない抗体をも意味する。

上記のモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉを産生するハ
イブリドーマKY−ANP−Ｉは1987年８月20日から英国Por
ton Down.Salisbury.SP4 OJG.のPHLS Centre for Appli
ed Microbiology ＆ Research、European Collection o
f Animal Cell Cultures（ECACC）に受託番号87082001
としてブダペスト条約に基づき寄託されている。モノク
ローナル抗体KY−ANP−IIを産生するハイブリドーマKY
−ANP−IIは1988年２月２日から茨城県つくば市東１丁
目１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所にMouse
hybridoma KY−ANP−II、微工研条寄第1695号（FERM B
P−1695）としてブダペスト条約に基づき寄託されてい
る。

11A−A11およびKY−ANP−IIは、ヒトおよびラットの
α−ANP（α−rANPおよびα−hANP）と結合するので、
これらのモノクローナル抗体を本発明に適用すれば、β
−rANPおよびβ−hANPの測定が可能である。KY−ANP−
Ｉはα−hANPを特異的に認識するため、β−hANPの特異
的な測定に適している。即ち、用いるモノクローナル抗
体の選択により、ヒトおよびラットのみならず、すべて
のタイプのβ−ANPの測定が可能である。

本発明の測定法のサンドイッチに用いる抗α−ANP抗
体の一方は、発光物質、螢光物質、ラジオアイソトープ
または酵素による標識抗体とする。標識には発光物質、
螢光物質、ラジオアイソトープを用いることも可能であ
るが、測定の安全性、簡便さ、施設などの点から、酵素
による標識が好ましい。抗体（精製イムノグロブリン、
Ｆ（ab′）_２断片、Fab′断片などを含む）は、架橋剤
を介して酵素で標識する。抗体の標識酵素としては、ア
ルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが利用
可能であるが、本発明においては、特にホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（西洋わさびペルオキシダーゼ）
が好ましく用いられる。また、架橋剤としては、N,N′
−ｏ−フェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステ
ル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエ
ステル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ
−スクシンイミドエステル、4,4′−ジチオジピリジ
ン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架
橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の
性質に応じて、既知の方法に従って行なえばよい。

サンドイッチに用いる他方の、担体に結合可能にせし
めた抗α−ANP抗体としては、次式で示される官能基：式中R₁およびR₂は、NO₂、CH₃O、C₆H₅、Ｆ、Cl、Br、Ｉ
またはＨ、ＹはCO、OCO、SO₂または単結合を表わす。

などの適切なハプテンで標識した抗体、抗原で標識した
抗体、抗体で標識した抗体、アビジンまたはビオチンで
標識した抗体などが挙げられる。ハプテンや抗原で標識
された場合には、それらを認識する抗体で担体をコート
し、抗体で標識した場合にはそれと結合する抗原で、ア
ビジンで標識した場合にはビオチンで、ビオチンで標識
した場合にはアビジンで、それぞれ担体をコートすれば
よい。上記のハプテンのうちでは、ジニトロフェニルが
最も好ましい。該抗体と結合可能な担体の存在下に、上
記標識抗体および担体と結合可能な抗体とβ−ANPを反
応せしめ、担体に結合した酵素活性を測定することによ
りβ−ANPを測定することができる。

また、サンドイッチに用いる他方の抗α−ANP抗体と
しては、当然、従来からよく用いられている、担体に固
定化した、固定化抗α−ANP抗体を用いることもでき
る。即ち、酵素などで標識した抗α−ANP抗体と固定化
抗α−ANP抗体でβ−ANPをサンドイッチして、担体に結
合して酵素活性を測定することによりβ−ANPを測定す
ることができる。

本発明においては、前者の測定法の検出限界は後者の
ものの1/3〜1/10程度であり、感度が高かった。

固定化に用いる担体としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができ
る。吸着は、通常、リン酸緩衝液中、pH6〜10、好まし
くは中性付近の室温下に一夜放置することにより行な
う。

本発明においては、α−hANPのMet［12］残基を含む
リング構造のＮ端側半分を認識するモノクローナル抗体
KY−ANP−Ｉが用いられた。β−hANPは、精製抗（ジニ
トロフェニル化牛血清アルブミン）IgGでコートされた
ポリスチレンボールの存在下に、ジニトロフェニル化抗
α−hANP Fab′とペルオキシダーゼ標識抗α−hANP F
ab′と反応させ、ポリスチレンボールに結合したペルオ
キシダーゼ活性を螢光法で測定した。この測定法はβ−
hANPに特異的で、α−hANPおよびγ−hANPに交差反応性
を示さない。この系におけるβ−hANPの検出限界は、60
fg（10amol）であり、30μｌの血漿を用いる場合には2n
g（0.33pmol）/lであった。この値は、β−hANPを抗α
−hANP IgG₁でコートしたポリスチレンボールとペルオ
キシダーゼ標識α−hANP Fab′と反応させる従来のサ
ンドイッチ酵素免疫測定法と比べてかなり低いものであ
った。

また、本発明には、上記と全く同様にして、KY−ANP
−IIも適用できることが示された。

実施例Ｎ−エチルマレイミド処理牛血清アルブミン牛血清アルブミン（100mg,fraction V、Armour Pharm
aceutical CO.,Kankakee,Illinois）を2mlの0.1mol/lの
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、100mmol/l
のＮ−エチルマレイミドを含む2mlの0.1mol/lリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH6.0）と共に、30℃で30分間インキ
ュベートする。その反応溶液を、0.1mol/lのリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.0）に対して４℃で一夜透析する。
牛血清アルブミンの量は、280nmにおける吸光度から求
めた。

測定用緩衝液Ａ測定に使用された緩衝液Ａは、上記の1g/l N−エチル
マレイミド処理牛血清アルブミン、0.3mol/l塩化ナトリ
ウム、0.2mmol/lシステイン、1mmol/l EDTAおよび百万K
IU/1のアブロチニン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mi
ssouri）を含む10mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）である。

抗α−hANP IgG₁ モノクローナル抗α−hANP IgG₁として、KY−ANP−
Ｉが用いられた。IgG₁は、プロテインＡ−セファロース
CL−4B（Pharmacia Fine Chemicals AB、Uppsala,Swede
n）を用いて調製した。得られたIgG₁を酢酸ナトリウム
緩衝液（pH4.2,0.1mol/l）1mlに対して５℃で透析す
る。透析したIgG₁溶液に、0.05ml（容量1/20）の塩化ナ
トリウム水溶液（2mol/l）を加える。この溶液に、ブタ
胃粘膜由来のペプシン（0.2mg/10mg IgG）を加え、溶解
する。混合物を37℃で15〜24時間反応させる。次いで、
水酸化ナトリウム水溶液（1mol/l）でpH8に調整し、セ
ファデックスＧ−150のカラム（1.0〜1.5mlに対して1.5
x 45cm,2.0〜2.5mlに対して2.0x45cm）にかけ、ホウ酸
ナトリウム緩衝液（pH8.0、0.1mol/l）で溶出し、Ｆ（a
b′）_２を得る。

Ｆ（ab′）_２をリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0,0.1m
ol/l）0.45mlに溶解する。これに用時調製した5mmol/l
のEDTAを含む２−メルカプトエチルアミン／リン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.0,0.1mol/l）0.05mlを加え、37℃で
1.5時間反応させる。次いで、反応混合物をセファデッ
クスＧ−25のカラム（1x30cm）にかけ、リン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.0,0.1mol/l;5mmol/lのEDTA含有）で溶出
し、Fab′を得る（ジャーナル・オブ・イムノアッセイ
［J.Immunoassay］、４、209〜327（1983）参照）。

ジニトロフェニル化抗α−hANP IgG₁とFab′ i.メルカプトスクシニル化抗α−hANP IgG₁およびＦ
（ab′）_２Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（半井化学）
を用いて抗α−hANP IgG₁およびＦ（ab′）_２にチオー
ル基を導入した。IgG₁およびＦ（ab′）_２に導入された
チオール基の平均は、それぞれ、9.9および8.9であっ
た。

ii.マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン 5.5mmol/lジニトロフェニル−Ｌ−リジン塩酸塩（東
京化成工業）を含む0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）0.9mlを5mmol/l 6−マレイミドヘキサン酸・
Ｎ−スクシンイミドエステルを含む0.1mlのN,N−ジメチ
ルホルムアミドと共に30℃で30分間インキュベートし
た。

iii.ジニトロフェニル化抗α−hANP IgG₁、Ｆ（ab′）_２およびFab′0.4mgの上記メルカプ
トスクシニル化抗α−hANP IgG₁またはＦ（ab′）
_２を、5mmol/l EDTAを含む0.2mlの0.1mol/lリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.0）に溶解し、0.5mlの上記マレイミ
ド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン溶液と、30℃で30分
間飯能させた。反応液を、0.1mol/lリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.0）を用いるセファデックスＧ−25カラム
（1.0×30cm）によるゲル濾過に付した。IgG₁およびＦ
（ab′）_２に導入されたジニトロフェニル基の平均数
は、それぞれ、6.4および8.6であった。

ジニトロフェニル化抗α−hANP Ｆ（ab′）_２を還元
してFab′を得た。そのFab′（0.3mg）を5mmol/l EDTA
を含む0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）0.1ml
に溶解し、上記マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リ
ジン溶液0.4mlと30℃で30分間反応させた。反応溶液
を、0.1mol/lリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて、Ultroge
l AcA（LKB,Stokholm,Sweden）のカラム（1.0×30cm）
によるゲル濾過に付した。Fab′に導入されたジニトロ
フェニル基の平均数は5.3であった。

ジニトロフェニル化牛血清アルブミン−セファロース4B 上記のジニトロフェニル化抗α−hANP IgG₁の調製と
同様にして、牛血清アルブミン（20mg,fraction V,Armo
ur Pharmaceutical Co.）にジニトロフェニル基を導入
した。牛血清アルブミン１分子当りに導入されたジニト
ロフェニル基の平均数は5.5であった。そのジニトロフ
ェニル化牛血清アルブミン（10mg）をシアン化臭素活性
化セファロース4B（1g、Pharmacia Fine Chemicals A
B）に結合させた。

抗（ジニトロフェニル化牛血清アルブミン）IgGの精製ウサギ抗ジニトロフェニル化牛血清アルブミン抗血清
（ICN Immuno Biologicals,Lisle,Illinois）から、Jou
rnal of Immunoassay ４,209−327（1983）の記載の方
法に従って、IgGを調製した。そのIgG27mgを、1g/lアジ
化ナトリウムを含有する4mlの0.1mol/lリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.0）に溶解し、ジニトロフェニル化牛血
清アルブミン−セファロース4Bのカラム（0.55×1.7c
m）に、同緩衝液を流速1ml/hで用いてアプライする。特
異IgGは、3.2mmol/l塩酸（pH2.5）により流速60ml/hで
溶出した。溶出物に、1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）を直ちに加えて中和した。精製IgGの量は2.3m
gであった。

IgG・コート・ポリスチレンボールポリスチレンボール（3.2mm,Precision Plastic Ball
Co.）50個を0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）1mlに入れ、精製抗（ジニトロフェニル化牛血清アル
ブミン）IgG（0.1g/l）またはモノクローナル抗α−hAN
P IgG₁（0.1g/l）を加え、室温で一夜放置する。この
ポリスチレンボールを0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）で洗浄後、さらに0.1g/l牛血清アルブミン、
0.1mol/l塩化ナトリウム、1g/lアジ化ナトリウムを含む
10mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で洗浄し、
冷蔵庫中で保存する。

ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗α−hANP Fa
b′ モノクローナル抗α−hANP Fab′（KY−ANP−Ｉ）
を、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエ
ステルを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識し
た。

西洋わさび・ペルオキシダーゼ2mg（50nmol）をリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.0、0.1mol/l）0.3mlに溶か
し、これに６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイ
ミドエステル0.31mg（1000nmol）およびN,N−ジメチル
ホルムアミド0.03mlからなる溶液を加え、30℃でかきま
ぜながら0.5〜１時間反応させる。次いで、上清液をセ
ファデックスＧ−25のカラム（1.0x45cm）に通して、リ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0、0.1mol/l）で、流速30
〜40ml/h、各フラクションの容量を0.5〜1.0mlとして溶
出する。底部にファインメッシュフィルターを有するセ
ファデックスＧ−50（fine,Pharmacia）のカラム（1.0
×6.4cm,5ml）を上記緩衝液で平衡させ、試験管中で100
×ｇで２分間遠心する。そのカラムに上記反応物（0.5m
l）を付し、同様に遠心する。得られたフラクションを
マイクロコンセントレイター（CENTRICON−30、Amicon
Corp）中で、４℃、2000×ｇで遠心することにより濃縮
する。

このようにして調製したマレイミド・ペルオキシダー
ゼ結合物1.8mg（45nmol）をリン酸ナトリウム緩衝液（p
H6.0、0.1mol/l）に溶かし、これに、Fab′約2.0mg（43
nmol）を5mmol/lのEDTAを含有するリン酸ナトリウム緩
衝液（pH6.0、0.1mol/l）0.2〜0.4mlに溶かした溶液を
加え、４℃で20時間または30℃で１時間反応させる。反
応混合物中のマレイミド−ペルオキシダーゼ結合物およ
びFab′の最終濃度を50〜100μmol/lとする。この反応
混合物をウルトロゲル・AcA44のカラム（1.5x45cm）に
通し、リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5、0.1mol/l）で
溶出する。流速は0.3〜0.5ml/minとし各フラクション約
1.0mlとする。こうして目的の抗α−hANP Fab′−ペル
オキシダーゼ標識体を得た（ジャーナル・オブ・イムノ
アッセイ［J.Immunoassay］４、209〜327（1983）参
照）。

血漿サンプル健常人の肘前静脈から午前９〜10時に血液を採取し
た。冷却したプラスチックシリンジ中の血液を、１％容
量の１億カリクレイン不活性化単位/lアプロチニン（Si
gma）、0.1mol/l EDTAおよび0.1mol/l N−エチルマレイ
ミドを含む冷却シリコンガラスチューブに移し、500×
ｇで10分間遠心して血漿を分離した。その血漿を、４％
容量の4mol/l塩化ナトリウムと混合し、−20℃で保存し
た。

サンドイッチ酵素免疫測定法（１）１ステップ法標準β−hANPまたは血漿サンプルに前記緩衝液Ａを加
えて最終容量を0.1mlとした。これを、0.05mlの緩衝液
Ａに溶解した100fmolジニトロフェニル化抗α−hANP F
ab′（またはIgG₁）と100fmolペルオキシダーゼ標識抗
α−hANP Fab′および精製ウサギ抗（ジニトロフェニ
ル化牛血清アルブミン）IgGでコートしたポリスチレン
ボール２個と、４℃で24時間反応させた。溶液を除去し
た後、0.1mol/lの塩化ナトリウムを含む10mmol/lリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.0）2mlを添加除去することによ
りポリスチレンボールを２回洗浄した。結合したペルオ
キシダーゼ活性は、基質として３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸を用いて、30℃で60分間測定し
た。螢光強度は、50mmol/l硫酸中の0.2mg/lキニンと比
較して、励起に320nm、発光に405nmを用い、島津スペク
トロフルオロフォトメーター（RF−510、島津製作所）
で測定した。

（２）２ステップ法モノクローナル抗α−hANP IgG₁でコートした１個の
ポリスチレンボールを、0.15mlの緩衝液Ａ中のβ−hANP
と反応させた。反応溶液を除去した後、そのポリスチレ
ンボールを上記の方法で２回洗浄し、0.15mlの緩衝液Ａ
中で100fmolペルオキシダーゼ標識抗α−hANP Fab′と
４℃で24時間反応させた。結合したペルオキシダーゼ活
性は、上記と同様にして測定した。

検出限界 β−hANPの検出限界は、β−hANPの非存在下で非特異
的に結合したペルオキシダーゼ活性（バックグラウン
ド）よりも明らかに大きなペルオキシダーゼ活性をもた
らしたβ−hANPの最小量で表わした。バックグラウンド
との差異はｔ検出（P0.01,n＝５）で確認した。

特異性 α−hANPは単一ポリペプチドであり、γ−hANPはその
Ｃ末端にα−hANP配列を有する単一ポリペプチドである
のに対して、β−hANPは２つの同一ポリペプチドからな
るα−hANPの逆並行二量体である。このような構造の違
いから予測される通り、ジニトロフェニル化抗α−hANP
Fab′（またはIgG₁）およびペルオキシダーゼ標識抗
α−hANP Fab′を用いる本発明のβ−hANPのサンドイ
ッチ酵素免疫測定法では、α−hANPおよびγ−hANPに対
する交差反応性は全く見られなかった。

血漿の干渉ジニトロフェニル化抗α−hANP Fab′およびペルオ
キシダーゼ標識抗α−hANP Fab′を用いる本発明のβ
−hANPのサンドイッチ酵素免疫測定法における、１〜30
μｌの血漿に添加されたβ−hANPの希釈曲線は血漿非存
在下のβ−hANPの標準曲線と平行であった（第２図）。
また、30μｌの血漿に10〜1000ng/lのβ−hANPを添加し
た場合のβ−hANPの回収率は、87〜106％であった。

α−およびγ−hANPの干渉 100fmolのジニトロフェニル化抗α−hANP Fab′およ
び100fmolのペルオキシダーゼ標識抗α−hANP Fab′を
用いる本発明のβ−hANPのサンドイッチ酵素免疫測定法
においては、β−hANPの標準曲線は、血漿中のhANPの主
要構成成分であるα−hANPを100fmolまで添加しても影
響を受けなかった（第４図参照）。γ−hANPはそのＣ末
端にα−hANP配列を有する構造であるため、同様に、10
0fmolまでは影響を与えないものと推定できる。

血漿β−hANPの測定範囲ジニトロフェニル化抗α−hANP Fab′およびペルオ
キシダーゼ標識抗α−hANP Fab′を用いる本発明のβ
−hANPのサンドイッチ酵素免疫測定法においては、β−
hANPの検出限界は、60fg（10amol）/tubeであり、30μ
ｌの血漿を用いた場合には、2ng（0.33pmol）/lであっ
た（第２図）。希釈しない30μｌの血漿を用いた場合に
測定し得る血漿β−hANPの最大量は、２μg/lであっ
た。ジニトロフェニル化抗α−hANP Fab′の替わりに
ジニトロフェニル化抗α−hANP IgG₁を用いた場合に
は、β−hANPの検出限界はやや高くなった。２ステップ
によるサンドイッチ酵素免疫測定法におけるβ−hANPの
検出限界は、約３倍高くなった（0.18pg、30μｌの血漿
を用いた場合には6ng/l、第３図参照）。

KY−ANP−IIの適用上記と全く同様にして、モノクローナル抗α−ANP抗
体KY−ANP−IIを用いて、β−hANPを測定した。その結
果を第５図に示すが、明らかにKY−ANP−IIも本発明に
適用することができる。KY−ANP−IIを用いた場合に
も、従来の２ステップ法に較べて、１ステップ法の検出
限界は約10倍程低く、感度が高かった。

発明の効果本発明の測定法によれば、従来のサンドイッチ法より
も高感度な測定が可能である。また、本発明は初めてβ
−ANPの特異的な測定を可能にするものであり、心臓、
肺、泌尿器疾患の診断に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はα−hANPのアミノ酸配列を示す。第２図は、１
ステップ法によるβ−hANPの標準曲線を示す。第３図
は、２ステップ法によるβ−hANPの標準曲線を示す。第
４図は、１ステップ法におけるα−hANPの干渉を示す。
第５図は本発明の測定法にKY−ANP−IIを適用した場合
の標準曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−177264（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−294094（ＪＰ，Ａ) 特表昭60−500731（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】標識抗体および担体に吸着可能にせしめた
抗体で抗原をサンドイッチすることを特徴とする免疫測
定法であって、該抗体がハイブリドーマKY−ANP−Ｉ（E
CACC87082001）により産生される抗α−ANP抗体KY−ANP
−Ｉであり、該抗原がβ−ANPである免疫測定法。
【請求項２】担体の存在下に該サンドイッチを行うこと
を特徴とする請求項１に記載の測定法。
【請求項３】該サンドイッチの後に抗原抗体複合体を担
体に吸着させることを特徴とする請求項１に記載の測定
法。
【請求項４】該標識が酵素でなされることを特徴とする
請求項１〜３のいずれかに記載の測定法。
【請求項５】抗ジニトロフェニル抗体でコートした担体
およびジニトロフェニル化することにより担体に吸着可
能にせしめた抗体KY−ANP−Ｉを用いることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれかに記載の測定法。
【請求項６】同一のエピトープを認識する、担体に固定
化した抗α−ANP抗体と標識抗α−ANP抗体でβ−ANPを
サンドイッチすることを特徴とするβ−ANPの免疫測定
法。
【請求項７】該抗体がモノクローナル抗体であることを
特徴とする請求項６に記載の測定法。
【請求項８】該標識が酵素でなされることを特徴とする
請求項６に記載の測定法。