JPS62294094A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の詳細な説明 ＬｌＬへ吐１１艷 本発明は、モノクローナル抗体、詳しくはラット心房性
ナトリウム利尿ホルモン（Ｒａｔ　ａｔｒｉａｌｎａｔ
ｒｉＵｒＯｔｉｃ　ｐｏ＋ｙｐｅｐｔｖｅ　：　ｒ　Ａ
　Ｎ　Ｐ　）に結合性を有する点で有用な新しいモノク
ローナル抗体に関する。

従　　来　　の　　技　　術 哺乳動物の心房性特異顆粒内にはナトリウム利尿因子が
存在することが知られており、最近ラット及びヒトの心
房から、上記因子が心房性ナトリウム利尿ペプチド（Ａ
ＮＰ）として精製され、また該ペプチドの構造決定もな
された〔病態生理、Ｖｏｌ、４．Ｎｏ、６．Ｅｌ　４３
５　（１９８５））。

該ＡＮＰはナトリウム利尿作用と共に、麻酔ラットにお
ける降圧作用、血管平滑筋拡張作用等の各種生理作用を
有し、例えば本態性高面圧症、浮腫性疾患、心不全、腎
不全等の各梯病態と関連すると考えられているが、ＡＮ
Ｐと上記各□種病態との関連については尚不明な点があ
り、之等を解明するためには、ＡＮＰの研究、特にその
代謝経路、分泌喋構、ＡＮＰレセプター研究等のＡＮＰ
システムの内分泌学的性質の解明を行なうことが必要で
あり、そのための最も有効な手段のひとつで・ある例え
ばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）Ｗの免疫学的手法に
必須のＡＮＰに特異的な抗体の確立が斯界で重視されて
いる。

上記ＡＮＰ研究に必須のＡＮＰ抗体としては、前記文献
に、ヒトＡＮＰからなる免疫抗原（α−ｈＡＮＰ−ヂロ
グロプリン）を、家兎に免疫して得た抗α−ｈＡＮＰ抗
血清が報告されている。該抗血清は、ｈＡＮｉ）（α−
１β−１γ−ｈＡＮＰ）を認識すると共に、ｒＡＮＰと
も約４０％の交差活性を示すと報告されている。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、斯界で要望されている、ＡＮＰの測定系乃至
組織化学的知見を得るための、該ＡＮＰに特異的な新し
いモノクローナル抗体を提供することをその目的とする
。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、ラット心房性ナトリウム利尿ホルモン
（ｒＡＮＰ）に結合性を有することを１５徴とするモノ
クローナル抗体が提供される。

本発明のモノクローナル抗体は、ＡＮＰに対する特異性
が高く、その利用によりＡＮＰの精製単離ができること
は勿論のこと、該△ＮＰ測定系の確立及び組織化学的知
見を（ｑることかでき、またこれにより八ＮＰと各種病
態との関連の解明、惹いては之等病ｆぶの診断、２等病
態に対する治療薬の研究開発等を行なうことができ、之
等の点で非常に有用である。

以下、本発明モノクローナル抗体につき、これをその製
造法より詳述する。

本発明抗体は、ｒＡＮＰを免疫抗原として利用し、例え
ば該免疫抗原で免疫した桶乳肋物の形質細胞（免疫細胞
）を、哺乳動物の形質細胞ｒｆＩ細胞と融合させてハイ
ブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作成し、これよ
り上記ｒＡＮＰを認識する抗体を産生づるクローンを選
択し、該クローンより採取することができる。

」−開方法において、免疫抗原としてのｒＡＮＰとして
は、公知の各種のもの、例えば前記文献等に記述のもの
やこの記述の方法に準じて１ｑられるｒＡＮＰを含有す
る抽出物乃至精製品及び合成脅品等のいずれをも使用で
きる。

また上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物と
しては、特に限定されないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく
、一般には、マウス、ラット等が有利に使用される。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、皮肉もしくは腹腔内注射等により投与する
ことにより行なわれる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、動物に２〜
１４日毎に数回投与し、総投与量が約１５０〜３００μ
ｇ／マウス程度になるようにするのが好ましい。免疫細
胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した牌細胞
を使用するのが好ましい。

また上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺
乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々の細
胞株、例えばｒｌ　３　（１１３−Ｘ６３−ＡｒＪ　８
−６５３）（Ｎａｔｕｒｅ、２５６．４９５−４９７　
（１９７５）　）、Ｉ）　３−ＬＪＩ　（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　ｌｙｊｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　　ｌ　ｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ。

８１．１−７　　（１９７８））、Ｎ５−１　　（Ｅｕ
ｒ。

Ｊ、［ｍｕｎｏｌ、、６，５１１−５１９　（１９７６
））、ＭＰＣ−１１（Ｃｅ１１．８，４０５−４１５（
１９７６））、５Ｐ２１０　　（Ｎａｔｕｒｅ、２７６
゜２６９−２７０　　（１９７８））、ＦＯ（Ｊ。

ＩｍｍｕｎｏｌｌＭｅｔｈ、、　　３５．　１−２１　
　（１９８０）　　）、Ｘ６３．６．５．３．　　（Ｊ
、　　ＩｎｕＩｌｕｎｏｌ、、１　２３゜１５４８−１
５５０　　＜１９７９＞）、５１９４（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、、１４８．３１３−３２３（１９７８））等や、
ラットにおけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３
１−１３３　（１９７９））等の骨髄腫細胞等が使用さ
れる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、基本的
には公知の方法に従い行ない１りる。該方法としては、
例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）らの方法
（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｏｙ、Ｖｏ
ｌ、　７３゜ｐｐ３（１９８１））等を例示できる。よ
り具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤の存在
下に通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤として
は、通常用いられるもの、例えばポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）　、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞と形質細胞１［ｊ［ｌ］１との使用比は、通常
の方法と変りがな（、例えば形質細胞腫細胞に対し、免
疫細胞を約１〜１０倍程度用いればよい。上記融合時の
培地としては上記形質細胞腫細胞株の増殖に使用され１
ｑる通常のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥ
Ｍ培地、その他この種の細胞培養に一般に使用される各
種培地を利用でき、通常は牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血
清補液を抜いておくのがよい。

融合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定ｍを上
記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥ
Ｇ溶液、例えば平均分子ｆｆ１１０００〜６０００程度
のものを、通常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％のｍ度で加
えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培
地を逐次添加して遠心し、上滑を除去する操作を繰返す
ことにより所望のハイプリドーマが形成される。

得られる所望のハイプリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするバイプ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるバイプリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行な
われる。

該産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌ
ｌ、　　Ｅ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｉｏｌ、、７０．　
４１９〜４３９　（１９８０））、プラーク法、スポッ
ト法、凝集反応法、オクテロニイ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）法、ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出に用いられ
ている種々の方法〔「ハイプリドーマ法とモノクローナ
ル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、１）Ｉ）
３０〜５３、昭和５７年３月５日〕に従って行なわれる
。該検索は、前記した免疫抗原もしくはラット心房組織
切片等を使用して行なうことができる。

かくしてｒＡＮＰをｉ　ｆＪする抗体を産生ずる所望の
ハイプリドーマが得られ、之等は、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存可能である
。

該ハイプリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採
取は、該バイプリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、或いはハイプリドーマをこれと適合性の
ある吐乳初物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。

前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後
者の方法は、抗体の大母生産に適している。

また上記により得られる抗体は更に、塩析、ゲル濾過払
、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の精製手段
により精製することもできる。。

本発明モノクローナル抗体は、これを利用してＡＮＰの
精製を行なうことができ、゛また通常の免疫検定法、例
えばＲ１へ法、酵素免疫測定法゛（Ｅ　ＩＡ）等に従い
、ＡＮＰの測定乃至は組織染色等を行ない得る。それら
の基本操作、手順等は一般に採用されているそれらと特
に異ならず、例えば公知の直接法、間接法、競合法、サ
ンドイツチ法等に準じることができる。　　　　□実　
　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例１ ■　免疫抗原の調整 アリムラ（Ａ　ｒｉｍｕｒａ、　Ａ　）らの方法（Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｏｙ、　　９３　　：　　１０９２
−１０９４（１９７３））に準じて、合成（Ｚ−ｒＡＮ
Ｐ　（カルデイオナトリン：　ＣａｒｄｉＯｎａｔｒｉ
ｎ１蛋白質研究奨励会）１００１Ｊを、０．９％Ｎａ　
ＣＱ液にて５０％に調整したポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ。

分子量４００００、東京化成社製）に加え、Ｖ温で２時
間ゆつ（り撹拌し、次いで、これに等量のフロイントコ
ンプリートアジュバント （Ｆ　ｒｅｕｎｄ　’　ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊ
ｕｖａｎｔ　）を加えて、免疫抗原を得た。

■　６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃｆｌｌ性マウスに、上記
■で得た免疫抗原０．５脱／匹を、腹腔内投与して初回
免疫を行なった。その２及び４週間後に、同ずｄを追加
投与し、最終免疫の３日後に、エーテル麻酔下に牌臓を
摘出し、牌細胞を調製した。

細胞融合操作は、常法（Ｎａｔｕｒｅ　、　２５６゜４
９５−４９７　（１９７５））に従った。即ち、骨髄腫
細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａ１８−６５３と、上記■で調製し
た牌細胞とを１：１０（重量化）の割合で、５０％ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ、分子量４０００）にて、
細胞融合させた。

その後、ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン含
有培地（ＨＡＴ培地）で培養し、ラット心房筋組織の凍
結切片を用いた間接螢光抗体法（後述）にて陽性であっ
たウェルの融合細胞を、限界希釈法に従ってクローニン
グし、後記する特異反応性を有するモノクローナル抗体
（Ｎ−１＞を産生ずる所望のハイブリドーマを得た。

得られたハイブリドーマの培養により、本発明のモノク
ローナル抗体Ｎ−１を得た。

該抗体Ｎ−１のサブクラスを、二重拡散法（オフタロニ
ー法、免疫学実験入門、第４版、第５７−５８頁、学会
出版センター、１９８４年１月３０日〕により試験した
ところ、これはＩｑＭクラスに属することが確認された
。

実施例２ ■　正常ラットの心房筋組織の凍結切片を用い、間接螢
光抗体法〔組繊細胞化学の技術、ホルモンと神経伝達物
質、第４９頁、小川相即、中機−穂他４名編集、＃ｌ自
書店、１９８６年１月２０日〕に従い、本発明モノクロ
ーナル抗体Ｎ−１の反応性を次の通り調べた。

即ち、−次抗体として実施例１で得られたＮ−１（培養
上清を１０００（ｆｉ希釈したもの）を、二次抗体とし
てヤギ抗マウスＩ！］Ｇ（１：４０、ＣＯＯＰ　Ｅ　Ｒ
社”！Ｊ　’）をそれぞれ使用し、その染色像を観察し
た。

結果を第１図に示す。第１図は、上記間接螢光抗体法に
よるラット心房筋粗織におけるｒＡＮＰの局在化を調べ
た顕微鏡写真（同左側Ｘ２００゜同右側Ｘ４００）であ
る。

腰回より、心房筋肉組織の核周囲に両極性・紡鍾状にα
−ｒＡＮＰ免疫活性が認められることが判る。

尚、上記においてＮ−１の代りにＰＢＳ又は実施例１に
おけるスクリーニングにて陰性であったハイブリドーマ
の培養上清を用いた場合は、いずれも染色は認められな
かった。

■　上記■において、各種動物の心房筋組織の凍結切片
を使用して、Ｎ−１の特異性を試験した。

結果を下記第１表に示す。

第　　１　　表 供試凍結切片　　　　　　染色性 ラット　　　　　　　　　＋ ヒト　　　　　　　　　　− マウス　　　　　　　　　＋ イヌ　　　　　　　　　　− ウサギ　　　　　　　　　− 上記第１表より、本発明抗体は、ラット及びマウスのＡ
ＮＰを認識し、ヒト、イヌ及びウサギのＡＮＰとは反応
しない抗体であることが判る。

■　上記■において、ポスト・エンベディング法（ｐｏ
ｓｔ−ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ法、改定版　酵素抗体法、第
１５４−１５５頁、渡辺慶−１中根−穂編集、学際企画
）による免疫電顕法によって、Ｎ−１の反応性を調べた
。

結果を第２図（顕微鏡写真、Ｘ４．３００）に示す。

ｍ２図より、心房筋肉細胞に存在するアトリアル　スペ
シフィック　グラニュル＜　ａｔｒｉａｌｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ　ｇｒａｎｕｌｅｓ）に一致してα−ｒＡＮＰ免疫
活性が認められることが判る。

図面の１！！′１Ｉ１１な説明 第１図は、実施例１で得た本発明抗体を用いた正常ラッ
ト心房筋組織の凍結切片の間接螢光抗体法による染色像
を示す。

第２図は、同じくポスト・エンベディング法による免疫
電顕法の所見を示す。

（以　上） ′〈ソ 第　　１　　図 第　　２　　図 手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 昭和６１年特許願第１３７１４３＠ ２　発明の名称 事件との関係　　特許出願人 作中　孜 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル６　補正の対象 代理権を証明する書面及び 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書中「図面の簡単な説明」の項の記載を別紙の
通り訂正する。

（以　上）

【図面の簡単な説明】

添附図面は生物の形態を示す顕微鏡写真であり、第１図
は、実施例１で得られた本発明抗体を用いた正常ラット
心房組織の凍結切片の間接蛍光抗体法による染色像を示
す。また第２図は、同じくポスト・エンベデ騰１ング法
による免疫電顕法の所見を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラット心房性ナトリウム利尿ホルモンに結合性を
   有することを特徴とするモノクローナル抗体。