CN101434653A

CN101434653A - 人armet蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN101434653A
Application number: CN 200810243103
Authority: CN
Inventors: 沈玉先; 方圣云; 王法财; 余永强; 王海萍; 孙爱民; 沈玉君; 黄学桂; 张晶晶
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2009-05-20

Abstract

本发明涉及的是人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒，用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET蛋白的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)－ARMET质粒转化感受态细胞BL21，诱导表达ARMET蛋白，收集菌体，纯化人ARMET蛋白；同时制备了抗ARMET的单克隆，建立了检测ARMET的试剂盒。本发明可用于对ARMET的功能研究、人体生理和病理机制的基础性研究；也可用于对临床疾病的辅助诊断。

Description

人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及的是一种人体蛋白质ARMET(Arginine rich，mutated in early stageof tumors，亦称ARP、MANF)的表达纯化、单克隆抗体制备及其检测的方法。

背景技术：

ARMET(Arginine rich，mutated in early stage of tumors)在公共数据库中也被称为ARP(arginine-rich protein)或MANF(mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor)，其氨基酸序列见图1。最初的研究发现，该基因在早期肿瘤中有单个核苷酸突变(Shridhar et al，1996a and 1996 b)，而随后的研究却发现，ARMET基因中出现的这种突变属于正常基因的多态性，而非肿瘤所特有(Evronet al.，1997；Tanaka et al.，2000)。这一研究结果使人们一度失去了对ARMET的研究兴趣。但Petrova及同事在体外传代的大鼠中脑星形胶质细胞的培养液中分离得到的神经营养因子MANF，其人类的同类物就是ARMET(Petrova et al.，2003)，分子量在20kD左右。他们的研究并发现，重组的人ARMET可选择性地作用于体外培养的多巴胺能神经元，促进其存活，在低剂量时作用优于神经营养因子GDNF和BDNF(Petrova et al，J Mol Neurosci 2003)。2007年《Nature》上的一篇报道格外引人注意，该研究发现，含保守序列的多巴胺能神经元营养因子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor，CDNF)对多巴胺能神经元有保护作用(Paivi Lindholm et al，Nature 2007)。而CDNF是ARMET(MANF)的同类物，都属于含8个半胱氨酸保守序列的蛋白家属，且ARMET与CDNF的氨基酸同源性为59％。

到目前为止，与ARMET相关的报道不超过10篇，其中早期的(90年代中期)4篇是关于它在早期肿瘤中的单基因突变；2篇有关于它与内质网应激的关系；2篇有关对多巴胺能神经元影响的报道(J Mol Neurosci 2003；Neuroreport2006)；还有1篇报道是关于它的类似物CDNF对中脑多巴胺能神经元的保护作用(Nature 2007)。对ARMET的研究目前世界范围内仅限于几个实验室，其功能目前还不清楚。对它的研究目前没有广泛开展的原因与缺乏检测它的方法有关，因为到目前为止还没有市售的商品化的ARMET蛋白及相关抗体。

发明内容：

本发明的目的是提供一种人ARMET蛋白抗体制备方法及检测试剂盒，用于ARMET蛋白的检测。

本发明的的技术方案如下：

人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：

(1)、ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET蛋白的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，诱导表达ARMET蛋白，收集菌体，纯化人ARMET蛋白；

(2)、Anti-ARMET单克隆抗体的制备

用纯化的人ARMET蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合方法制备Anti-ARMET单克隆抗体，选择滴度高的杂交瘤细胞进行扩增、冻存，并注入BALB/c小鼠腹腔生产腹水型抗体；

(3)、抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。

所述的人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：其特征在于：

(1)、所述的ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化是指：

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，置37℃培养箱过夜，以体积比1:100的比例，接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达2-4小时；收集菌体并裂解，取上清液，加入到已预装好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用组份为50mmol/L NaH₂PO₄pH8.0、300mmol/L NaCl、250mmol/L imidazole的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在-80℃冰箱；

(2)、所述的Anti-ARMET单克隆抗体的制备是指：

①SP2/0细胞的处理：复苏冻存的SP2/0细胞，状态稳定后用8-AG进行筛选，继续培养，待细胞长至将70-80％融合时，收集细胞，用无血清的DMEM悬浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待长出实体瘤后，分离培养SP/20细胞，备用；

②免疫方案：将纯化的人ARMET蛋白作为抗原液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂；将此乳剂于雌性BALB/c小鼠背部多点皮下注射，200μg/只；10天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹部多点皮下注射，200μg/只；10天后将纯化的抗原液200μg直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用，融合前三天尾静脉注射抗原液200μg/只；

③细胞融合：冲击免疫后第3天，无菌取脾制备脾细胞悬液；将Sp2/0骨髓瘤细胞[(1～2)×10⁷个细胞]和免疫小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)混合，加入0.8mL 50％PEG4000助融；融合2分钟后，缓慢加入不完全培养基，离心，用含20％胎牛血清的HAT培养液重悬，加入饲养细胞，分在96孔板上；37℃ CO₂培养箱中培养；

④克隆转移和检测：融合后每天仔细观察，挑出单克隆，做好标记，待单克隆的孔长至覆盖2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，在显微镜下定位，将单个克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散均匀；

⑤选择抗体滴度高的选择滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。

一种检测人ARMET蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒组成为：

(1)、包被抗体：采用一株杂交瘤细胞产生的抗体；

(2)、固相支持物：采用微孔板，用于包被抗原；

(3)、酶标抗体：用辣根过氧化物酶标记的不同杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体(IgG或IgM)；

(4)、阳性对照血清或阴性对照血清；

(5)、酶标抗体稀释液：PBS；

(6)、底物溶液：A液：0.01％TMB，0.01MpH4.5柠檬酸缓冲液；

B液：0.08％过氧化脲，0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲液；

(7)、洗涤液：PBS，含0.01％吐温-20；

(8)、终止液：2M硫酸。

本发明可既可用于对ARMET的功能研究、人体生理和病理机制的基础性探讨研究，也可用于对临床疾病的辅助诊断，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1.ARMET的氨基酸序列

图2.ARMET的诱导表达

1：分子量标记物；2：pET28a-ARMET；3：pET28a-vector+IPTG；4：pET28a-ARMET+IPTG

图3..ARMET的纯化

图4.杂交瘤细胞的融合

图5.杂交瘤细胞株克隆的形成

图6.不同稀释度的抗体检测原核细胞表达的ARMET

图7.抗ARMET抗体检测真核细胞中的ARMET

图8.免疫荧光双标检测ARMET抗体的特异性

A：DAPI；B：抗ARMET抗体；C：抗FLAG抗体；D：A、B、C叠加后的图片。图9.Western Blot检测ARMET抗体的特异性

1道：转染pCIneo-FLAG-ARMET；2道：转染pCIneo-vector；3道：细胞中加入Lipofectamine 2000；4道：细胞中加入Opti-medium；5道：未转染及未处理的细胞。

具体实施方式

(一)ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白。将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，置37℃培养箱过夜。以1:100(V:V)的比例，接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达。收集菌体并裂解，取上清，加入到已预装好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄pH8.0、300mmol/L NaCl、250mmol/L imidazole)洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在-80℃冰箱。

SDS—PAGE电泳结果显示，经IPTG诱导后，在转化了pET28a-ARMET的细菌表达的蛋白中有一明显的条带(图2)，蛋白分子量的大小与预期的相符。提示IPTG诱导表达的蛋白是目的蛋白ARMET。ARMET经Ni-beads柱纯化后的纯度及表达量见图3。

(二)Anti-ARMET单克隆抗体的制备

1.SP2/0细胞的处理：复苏冻SP2/0细胞，状态稳定后用8-AG进行筛选，继续培养，待细胞长至将70-80％融合时，收集细胞，用无血清的DMEM悬浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待长出实体瘤后，备用。

2.免疫方案：将纯化的抗原液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂。雌性BALB/c小鼠背部多点皮下注射，200μg/只。10天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹部多点皮下注射，200μg/只。10天后将纯化的抗原液200μg直接注射小鼠腹腔。剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用，融合前三天尾静脉注射200μg/只。

3.细胞融合：冲击免疫后第3天，无菌取脾制备脾细胞悬液。将Sp2/0骨髓瘤细胞[(1～2)×10⁷个细胞]和免疫小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)混合，加入0.8mL50％PEG4000助融。融合2分钟后，缓慢加入不完全培养基，离心，用含20％胎牛血清的HAT培养液重悬，加入饲养细胞，分在96孔板上。37℃ CO₂培养箱中培养。

4.克隆转移和检测：融合后每天仔细观察(图4-5)，挑出单克隆，做好标记，待单克隆的孔长至覆盖2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，在显微镜下定位，将单个克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散均匀。选择抗体滴度高的阳性克隆进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。

5.腹水型抗体的制备：使用弗氏不完全佐剂对BALB/c小鼠进行预处理。1周后，收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，用无血清DMEM培养基调整至2×10⁶个细胞/mL，给予小鼠腹腔注射。7～10d后，待小鼠腹部明显膨大收集腹水。腹水在4℃3 000r/min离心10min，取上清液-20℃冻存备用。

(三)ARMET单克隆抗体稀释度的检测

1.原核表达的ARMET：取原核表达的蛋白进行SDS—PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜(PVDF)，用5％脱脂奶的PBS室温封闭1h，去掉封闭缓冲液后，将PVDF膜分别放入1：100、1：200、1：500、1：1000、1：2000稀释的腹水中室温孵育1h，用HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，用ECL显色，暗室曝光显影。图6结果显示，含有ARMET抗体的腹水按1：2000稀释后仍能检测到很强的信号。

2.真核表达的ARMET：将构建的真核表达质粒pCIneo—FLAG-ARMET转染293T细胞，24h后收细胞，然后按上述方法裂解、电泳、转膜。将含ARMET抗体的腹水按1：200稀释后孵育膜1h后显色显影。图7结果中有两条带，较小分子量的是内源性的ARMET，而较大的是转染的质粒表达的融合FLAG的ARMET。

(四)ARMET单克隆抗体特异性检测

1.免疫荧光双标：将pCIneo-FLAG-ARMET转染293T，用适当稀释度的含ARMET单克隆抗体的腹水和rabbit-anti-FLAG进行免疫荧光双标。图8结果显示，两抗体的染色完全一致，提示ARMET单克隆抗体的特异性很好。

2.Western Blot：将pCIneo-FLAG-ARMET转染293T，同时用空白载体和未转染的细胞作对照。24h后收获细胞、裂解并进行SDS—PAGE电泳。用含ARMET单克隆抗体的腹水(1：200稀释)和rabbit-anti-FLAG分别检测细胞中FLAG-ARMET的表达情况。图9结果显示，抗FALG抗体仅能在转染pCIneo-FLAG-ARMET的细胞中检测到FLAG-ARMET，而抗ARMET抗体既能检测到FLAG-ARMET，又能检测到内源性的ARMET表达，且在未转染FLAG-ARMET的细胞中仅出现一条的带，提示抗ARMET单克隆抗体是特异性的。

(四)Anti-ARMET单克隆抗体的纯化

采用间接ELISA法测定其效价，辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。诱生腹水法获得的抗体效价在1×10^-4～1×10^-5之间，且均有较好的特异性，纯化后的抗体效价不变且纯度较高。

(五)ELISA检测ARMET试剂盒的制备：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法。

试剂盒组成为：

(1)、包被抗体：采用一株杂交瘤细胞产生的抗体；

(2)、固相支持物：采用微孔板，用于包被抗原；

(4)、阳性对照血清或阴性对照血清；

(5)、酶标抗体稀释液：PBS；

(6)、底物溶液：A液：0.01％TMB，0.01MpH4.5柠檬酸缓冲液；

(7)、洗涤液：PBS，含0.01％吐温-20；

(8)、终止液：2M硫酸。

方法举例：已获得多个分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，现以克隆B7和F6为例，简述试剂盒制备方法：将克隆B7产生的单克隆抗体稀释为系列不同浓度后包被ELISA板，洗涤后加入稀释成一定浓度的ARMET蛋白或含ARMET的样本与B7型单抗结合，同时设立空白对照。用HRP标记的F6克隆株产生的单抗与样本中的ARMET蛋白结合，以形成双抗体夹心，然后加入底物显色，最后用酶标仪测量OD450nm值。

(六)ARMET检测标准的建立与评价：为了进一步优化上述检测方法，对不同个体的血清样本进行检测，将各组的敏感性、特异性和交叉反应性平行比较，以探讨检测方法的最适条件、血清最适稀释度，从而实现试剂盒的标准化。最后对试剂盒成品的重复性、检测效率、稳定性和检测费用进行评估，以期作为产品化的试剂盒。

Claims

1、人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

(1)、ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化

(2)、Anti-ARMET单克隆抗体的制备

用纯化的人ARMET蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合方法制备Anti-ARMET单克隆抗体，选择滴度高的单克隆杂交瘤细胞株进行扩增、冻存，并注入BALB/c小鼠腹腔生产腹水型抗体；

(3)、抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。

2、根据权利要求1所述的人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：其特征在于：

(1)、所述的ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化是指：

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，置37℃培养箱过夜，以体积比1:100的比例，接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达2-4小时；收集菌体并裂解，取上清液，加入到已预装好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用组份为50mmol/L NaH₂PO₄ pH8.0、300mmol/L NaCl、250mmol/L imidazole的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在-80℃冰箱；

(2)、所述的Anti-ARMET单克隆抗体的制备是指：

②免疫方案：将纯化的人ARMET蛋白作为抗原，并与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂；将此乳剂于雌性BALB/c小鼠背部多点皮下注射，200μg/只；10天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹部多点皮下注射，200μg/只；10天后将纯化的抗原液(200μg)直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用；在取脾脏前三天尾静脉注射抗原液200μg/只；

③细胞融合：冲击免疫后第3天，无菌取脾制备脾细胞悬液；将Sp2/0骨髓瘤细胞[(1～2)×10⁷个细胞]和免疫的小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)混合，加入0.8mL 50％PEG4000助融；融合2分钟后，缓慢加入不完全培养基，离心，用含20％胎牛血清的HAT培养液重悬，加入饲养细胞，种在96孔板上；37℃ CO₂培养箱中培养。

⑤选择抗体滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。

3、一种检测人ARMET蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒组成为：

(1)、包被抗体：采用一株杂交瘤细胞产生的抗体；

(2)、固相支持物：采用微孔板，用于包被抗原；

(4)、阳性对照血清或阴性对照血清；

(5)、酶标抗体稀释液：PBS；

(6)、底物溶液：A液：0.01％TMB，0.01MpH4.5柠檬酸缓冲液；

(7)、洗涤液：PBS，含0.01％吐温-20；

(8)、终止液：2M硫酸。