CN102161703A

CN102161703A - 抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN102161703A
Application number: CN2010106183972A
Authority: CN
Inventors: 颜江华; 李响; 王生育
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2011-08-24

Abstract

抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。涉及单克隆抗体，提供抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。包括：克隆人神经菌毛素1的b1b2结构域基因序列，并将其导入载体，构建重组载体，并将其转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液即得NRP1/b1b2蛋白；用NRP1/b1b2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人神经菌毛素1单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人神经菌毛素1单克隆抗体。所得抗人神经菌毛素1单克隆抗体灵敏性高、特异性强。

Description

抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，特别涉及一种抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。

背景技术

神经菌毛素1(Neuropilin-1，简称NRP1)是细胞表面的I型跨膜糖蛋白，其相对分子质量为130KDa，由位于染色体10p12的基因编码。NRP1基因的开放阅读框由17个外显子和16个内含子组成(1、Rossignol M，Gagnon ML，Klagsbrun M.Genomic organization of human neuropilin-1 and neuropilin-2 genes：identification and distribution of splice variants and soluble isoforms[J].Genomics，2000，70：211-222.)。NRP1在脊椎动物中高度保守，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成，其中胞外段包括860个氨基酸，由3个不同的结构域组成，分别称为a1a2结构域、b1b2结构域和c结构域。a1a2结构域位于第27个到第264个氨基酸，又称为CUB结构域(C1r/C1s，uEGF，and bone morphogenetic protein)，b1b2结构域位于第274个到第583个氨基酸，其与凝血因子V和VIII的结构相似且同源，c结构域位于第650个到803个氨基酸，其中部含有MAM结构域(meprin，A5，and m-phosphatase)。NRP1胞外段的3个结构域能与不同的分子结合，介导不同的信号传导。神经生长抑制因子3A(Sema3A)通过a1a2结构域与NRP1结合，血管生长因子165(Vascular endothelial growth factor，VEGF₁₆₅)能与NRP1的b1b2结构域结合，肝素亦通过b1b2结构域与NRP1结合。NRP1基因缺陷的小鼠在胚胎期就死于严重的神经及心血管系统异常(2、Narazaki M，Tosato G.Ligand-induced internalization selects use of common receptor neuropilin-1 by VEGF₁₆₅ and semaphorin3A[J].Blood，2006，107：3892-3901)。NRP1的跨膜区包括20个氨基酸，胞内区只有40个氨基酸。去除了胞内区的NRP1仍然能与共受体神经丛素2A1(plexins2A1)结合，但是不能够介导信号传导，提示NRP1的C端在保护Sema3A受体功能完整上不可或缺的作用(3、Giordano S，Corso S，Conrotto P，et al.The semaphorin 4D receptor controls invasive growth by coupling with Met[J].N at Cell B iol，2002，10：720-724.)。体外试验亦显示NRP1在细胞间的黏附、相互作用上起着重要的作用(4、Takagi S，Kasuya Y，Shimizu M，et al.Expression of a cell adhesion molecule，neuropilin，in the developing chick nervous system[J].Dev B iol，1995，170：207-222)。

NRP1最早是作为神经细胞导向调节因子的受体而发现，而近年来的大量研究结果显示表达于内皮细胞，可作为VEGF₁₆₅及与血管新生相关的其它几种血管生长因子(VEGF)家族成员的受体，从而在血管新生方面发挥重要调节作用。通过用抗VEGF抗体筛选突变的噬菌体文库得到一段7个氨基酸的多肽ATWLPPR，它能够抑制VEGF₁₆₅与NRP1的结合，但不抑制VEGF₁₆₅与VEGFR-2的结合，结果发现肿瘤血管的发生和肿瘤生长受到抑制，说明NRP1在VEGF₁₆₅调节肿瘤血管的发生和生长过程中，是一个非常重要的受体，因此为肿瘤的药物和基因靶向治疗提供了一个潜在的特异性较高的靶点，它可与其它抗肿瘤药物、毒素、放射性核素等交联，用于肿瘤血管靶向治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。

所述抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

1)克隆人神经菌毛素1的b1b2结构域(人神经菌毛素1的b1b2结构域简称为NRP1/b1b2)基因序列，将其导入载体，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液，即得NRP1/b1b2蛋白；

2)用NRP1/b1b2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；

3)筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人神经菌毛素1单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人神经菌毛素1单克隆抗体。

在步骤1)中，所述b1b2结构域基因序列为：

ccatgggcaa atgtatggaa gctctgggca tggaatcagg agaaattcat tctgaccaga 60

tcacagcttc ttcccagtat agcaccaact ggtctgcaga gcgctcccgc ctgaactacc 120

ctgagaatgg gtggactccc ggagaggatt cctaccgaga gtggatacag gtagacttgg 180

gccttctgcg ctttgtcacg gctgtcggga cacagggcgc catttcaaaa gaaaccaaga 240

agaaatatta tgtcaagact tacaagatcg acgttagctc caacggggaa gactggatca 300

ccataaaaga aggaaacaaa cctgttctct ttcagggaaa caccaacccc acagatgttg 360

tggttgcagt attccccaaa ccactgataa ctcgatttgt ccgaatcaag cctgcaactt 420

gggaaactgg catatctatg agatttgaag tatacggttg caagataaca gattatcctt 480

gctctggaat gttgggtatg gtgtctggac ttatttctga ctcccagatc acatcatcca 540

accaagggga cagaaactgg atgcctgaaa acatccgcct ggtaaccagt cgctctggct 600

gggcacttcc acccgcacct cattcctaca tcaatgagtg gctccaaata gacctggggg 660

aggagaagat cgtgaggggc atcatcattc agggtgggaa gcaccgagag aacaaggtgt 720

tcatgaggaa gttcaagatc gggtacagca acaacggctc ggactggaag atgatcatgg 780

atgacagcaa acgcaaggcg aagtcttttg agggcaacaa caactatgat acacctgagc 840

tgcggacttt tccagctctc tccacgcgat tcatcaggat ctaccccgag agagccactc 900

atggcggact ggggctcaga atggagctgc tgggctgtct cgag 944

所述载体可为pET22b(+)，所述宿主细菌可为大肠杆菌BL21，所述分离纯化可采用镍柱纯化；所述NRP1/b1b2蛋白的氨基酸序列为：

Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp

1 5 10 15

Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg

20 25 30

Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser

35 40 45

Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr

50 55 60

Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp

85 90 95

Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr

115 120 125

Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met

130 135 140

Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly

145 150 155 160

Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser

165 170 175

Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val

180 185 190

Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile

195 200 205

Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly

210 215 220

Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg

225 230 235 240

Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile

245 250 255

Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn

260 265 270

Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe

275 280 285

Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg

290 295 300

Met Glu Leu Leu Gly Cys

305 310

在步骤2)中，所述免疫BALB/c小鼠的具体方法如下：

将NRP1/b1b2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，再将油包水抗原乳剂注射到雌性BALB/c小鼠腹腔进行免疫，14天后再用油包水抗原乳剂腹腔注射，共加强免疫3次。

本发明采用RT-PCR技术，获得了NRP1/b1b2的基因序列，并构建了原核表达载体pET22b(+)-NRP1/b1b2，进行NRP1/b1b2蛋白表达、纯化、复性。以NRP1/b1b2蛋白作为免疫原，通过细胞融合技术，制备得到灵敏性高、特异性强的鼠源性抗人NRP1单克隆抗体。

附图说明

图1为NRP1/b1b2基因RT-PCR产物的电泳图。在图1中，1为NRP1/b1b2基因，M为分子量标记物，1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp为分子量大小。

图2为重组质粒pET22b(+)-NRP1/b1b2诱导表达产物的电泳图。在图2中，1～3为经IPTG诱导后的重组质粒pET22b(+)-NRP1/b1b2的表达情况，4为未经IPTG诱导的重组质粒pET22b(+)-NRP1/b1b2的表达情况，M为蛋白分子量标记物，94.0KDa、66.2KDa、66.2KDa、45.0KDa、33.0KDa、26.0KDa、20.0KDa、14.4KDa为蛋白分子量大小。

图3为纯化后的NRP1/b1b2蛋白的电泳图。在图3中，1为经镍柱纯化后的NRP1/b1b2蛋白，2为经高效液相色谱纯化后的NRP1/b1b2蛋白，M为蛋白分子量标记物，94.0KDa、66.2KDa、66.2KDa、45.0KDa、33.0KDa、26.0KDa、20.0KDa、14.4KDa为蛋白分子量大小。

图4为亲和层析法纯化后的NRP1/b1b2抗体的电泳图。在图4中，1～2为亲和层析法纯化后的NRP1/b1b2抗体，M为蛋白分子量标记物，116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa为蛋白分子量大小。

图5为NRP1/b1b2抗体的效价测定图。在图5中，横坐标为滴度，纵坐标为吸光值OD₄₉₀，◆为腹水，■为纯化后的NRP1/b1b2抗体。

图6为免疫印记检测NRP1/b1b2抗体特异性的电泳图。在图6中，1为BGC-823人类胃癌细胞，2为Anip 973人类肺腺癌细胞，M为蛋白分子量标记物，170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa、15KDa为蛋白分子量大小。

具体实施方式

实施例1NRP1/b1b2基因的克隆及其蛋白的表达、纯化与复性

通过RT-PCR(RT-PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司TOYOBO)从人类胃癌细胞株BGC-823中获取人神经菌毛素1的b1b2结构域(简称NRP1/b1b2)基因序列，NRP1/b1b2基因序列为：

ccatgggcaa atgtatggaa gctctgggca tggaatcagg agaaattcat tctgaccaga 60

tcacagcttc ttcccagtat agcaccaact ggtctgcaga gcgctcccgc ctgaactacc 120

ctgagaatgg gtggactccc ggagaggatt cctaccgaga gtggatacag gtagacttgg 180

gccttctgcg ctttgtcacg gctgtcggga cacagggcgc catttcaaaa gaaaccaaga 240

agaaatatta tgtcaagact tacaagatcg acgttagctc caacggggaa gactggatca 300

ccataaaaga aggaaacaaa cctgttctct ttcagggaaa caccaacccc acagatgttg 360

tggttgcagt attccccaaa ccactgataa ctcgatttgt ccgaatcaag cctgcaactt 420

gggaaactgg catatctatg agatttgaag tatacggttg caagataaca gattatcctt 480

gctctggaat gttgggtatg gtgtctggac ttatttctga ctcccagatc acatcatcca 540

accaagggga cagaaactgg atgcctgaaa acatccgcct ggtaaccagt cgctctggct 600

gggcacttcc acccgcacct cattcctaca tcaatgagtg gctccaaata gacctggggg 660

aggagaagat cgtgaggggc atcatcattc agggtgggaa gcaccgagag aacaaggtgt 720

tcatgaggaa gttcaagatc gggtacagca acaacggctc ggactggaag atgatcatgg 780

atgacagcaa acgcaaggcg aagtcttttg agggcaacaa caactatgat acacctgagc 840

tgcggacttt tccagctctc tccacgcgat tcatcaggat ctaccccgag agagccactc 900

atggcggact ggggctcaga atggagctgc tgggctgtct cgag 944

RT-PCR上行引物序列为：TACCATGGGCAAATGTATGGAAGCTC；下行引物序列为：TACTCGAGACAGCCCAGCAGCTCCAT。

凝胶电泳结果显示，RT-PCR产物中有1条明显的条带(参见图1)，条带大小约为950bp，与预期的NRP1/b1b2基因序列相符，证明RT-PCR产物为NRP1/b1b2基因。

使用限制性内切酶Nco I和Xho I对NRP1/b1b2基因和质粒载体pET22b(+)(购买自Novagen)进行酶切，用T4连接酶将酶切后的NRP1/b1b2基因连接到质粒载体pET22b(+)载体上，获得重组质粒载体pET22b(+)-NRP1/b1b2，其表达的重组NRP1/b1b2蛋白氨基酸序列为：

Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp

1 5 10 15

Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg

20 25 30

Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser

35 40 45

Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr

50 55 60

Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp

85 90 95

Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr

115 120 125

Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met

130 135 140

Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly

145 150 155 160

Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser

165 170 175

Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val

180 185 190

Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile

195 200 205

Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly

210 215 220

Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg

225 230 235 240

Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile

245 250 255

Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn

260 265 270

Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe

275 280 285

Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg

290 295 300

Met Glu Leu Leu Gly Cys

305 310

将重组质粒载体pET22b(+)-NRP1/b1b2转化到大肠杆菌BL21，并将大肠杆菌BL21置于37℃培养箱培养过夜，以体积比1∶100的比例，接种于含新鲜的氨苄西林的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达4h；收集菌体并裂解，取上清液，加入到已预装好的镍柱(购买自GE Healthcare)中，用pH为5.8的8mol/L尿素缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用pH为2.8的8mol/L尿素洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白上样至高效液相色谱仪(购买自Varian)，使用Dior柱(购自GL Science)，以8mol/L尿素洗脱缓冲液为流动相，收集目的蛋白峰，将收集蛋白注入透析袋中，置于梯度尿素(4mol/L、2mol/L、1mol/L、0mol/L)的透析液中，每8h更换一个梯度，待梯度透析复性结束后，将复性蛋白分装保存在-80℃冰箱。

SDS-PAGE电泳结果显示，经IPTG诱导后，重组质粒pET22b(+)-NRP1/b1b2表达的蛋白中有明显的条带(参见图2)，蛋白分子量(39KDa)大小与预期的相符。提示IPTG诱导表达的蛋白是NRP1/b1b2蛋白。NRP1/b1b2经镍柱和高效液相色谱纯化后的纯度及表达量参见图3。

实施例2NRP1单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选

1)SP2/0细胞的处理：复苏冻存的SP2/0细胞，待状态稳定后，继续培养，待细胞长至将70％～80％融合时，收集细胞，用无血清的DMEM培养基悬浮，备用。

2)免疫方案：将纯化复性的NRP1/b1b2蛋白作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂。

再将油包水抗原乳剂于雌性BALB/c小鼠腹腔注射，50μg/只；14天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹腔注射，50μg/只；共加强免疫3次。

剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用；在取小鼠脾脏前3天，尾静脉注射抗原水溶液25μg/只。

3)细胞融合：尾静脉注射抗原水溶液免疫后第3天，无菌取小鼠脾脏并制备脾细胞悬液；将SP2/0骨髓瘤细胞[(1～2)×10⁷个细胞]和免疫的小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)充分混合，离心，尽量吸尽上清并置于40℃水浴中预热；加入预热至40℃的1mL 50％PEG(购自Sigma)助融；融合90s后，缓慢加入无血清的DMEM培养基，离心，用含20％胎牛血清的HAT DMEM培养基(购自Sigma)重悬，将重悬后的悬液直接接种在96孔板上；37℃CO₂培养箱中培养。

4)克隆转移和检测：每天仔细观察步骤3)融合后的细胞，挑出单克隆，做好标记，待单克隆孔的细胞长至覆盖至2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，重复克隆筛选3次，将阳性克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散均匀。选择抗体滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。

5)腹水型抗体的制备：使用液体石蜡对BALB/c小鼠进行预处理。10天后，收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，用无血清DMEM培养基调整至2.5×10⁶个细胞/mL，给予小鼠腹腔注射。7～10天后，待小鼠腹部明显膨大收集腹水。腹水在4℃，2500r/min离心10min，取上清液-20℃冻存备用。

实施例3抗人神经菌毛素1单克隆抗体的纯化

采用亲和层析法纯化抗人神经菌毛素1单克隆抗体。根据GE Healthcare公司提供的操作说明，将收集的腹水加入到已预装好的蛋白A柱中，用pH为8.0的缓冲液A洗去非特异结合的蛋白，再用pH为3.0的缓冲液B洗脱目的抗体，收集目的抗体并加入5％体积的Tris-HCl缓冲液调整pH值，分装保存于-20℃冰箱。抗体纯度较高，无其他杂蛋白条带出现(参见图4)。

实施例4抗人神经菌毛素1单克隆抗体稀释度的检测

用间接ELISA法检测诱生腹水抗体及纯化后抗体的免疫学效价。用紫外线照射处理酶标板30min，加10μg/ml抗原溶液4℃包被过夜，用含5％脱脂奶粉的磷酸缓冲液于37℃封闭2h，PBST(于常规磷酸缓冲液中加入吐温20即得，磷酸缓冲液与吐温20的体积比为1000∶1，)冲洗3遍。每个包被孔加稀释腹水或纯化抗体100μl，37℃孵育2h，PBST冲洗3遍，加1∶10000的酶标二抗，37℃孵育1h，最后加底物-1，2-二氨基苯(OPD)、底物-双氧水(H₂O₂)室温显色10min，以PBS为阴性对照。随着抗体浓度的下降，在490nm波长处的吸光值OD₄₉₀逐渐降低，表明腹水抗体及纯化后抗体均能与包被在板上的蛋白进行特异性结合，诱生腹水法获得的抗体效价在1×10^-6～5×10^-6之间，纯化后的抗体效价未提升但纯度提高(参见图5)。

实施例5抗人神经菌毛素1单克隆抗体特异性检测

免疫印迹(Westem Blot)：使用BGC-823人类胃癌细胞，同时用Anip 973人类肺腺癌细胞作对照。收获培养好的细胞、裂解并进行SDS-PAGE电泳。以90V电压转膜1h，用1∶1000稀释的纯化后抗人神经菌毛素1单克隆抗体分别检测细胞中NRP1的表达情况。结果显示，抗人神经菌毛素1单克隆抗体能够检测到BGC-823中的NRP1的表达，且条带位置与预期相符，而Anip 973却未见条带，提示抗人神经菌毛素1单克隆抗体是特异性的(参见图6)。

Claims

1.抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)克隆人神经菌毛素1的b1b2结构域基因序列，将其导入载体，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液，即得NRP1/b1b2蛋白；

2.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述b1b2结构域基因序列为：

ccatgggcaa atgtatggaa gctctgggca tggaatcagg agaaattcat tctgaccaga 60

tcacagcttc ttcccagtat agcaccaact ggtctgcaga gcgctcccgc ctgaactacc 120

ctgagaatgg gtggactccc ggagaggatt cctaccgaga gtggatacag gtagacttgg 180

gccttctgcg ctttgtcacg gctgtcggga cacagggcgc catttcaaaa gaaaccaaga 240

agaaatatta tgtcaagact tacaagatcg acgttagctc caacggggaa gactggatca 300

ccataaaaga aggaaacaaa cctgttctct ttcagggaaa caccaacccc acagatgttg 360

tggttgcagt attccccaaa ccactgataa ctcgatttgt ccgaatcaag cctgcaactt 420

gggaaactgg catatctatg agatttgaag tatacggttg caagataaca gattatcctt 480

gctctggaat gttgggtatg gtgtctggac ttatttctga ctcccagatc acatcatcca 540

accaagggga cagaaactgg atgcctgaaa acatccgcct ggtaaccagt cgctctggct 600

gggcacttcc acccgcacct cattcctaca tcaatgagtg gctccaaata gacctggggg 660

aggagaagat cgtgaggggc atcatcattc agggtgggaa gcaccgagag aacaaggtgt 720

tcatgaggaa gttcaagatc gggtacagca acaacggctc ggactggaag atgatcatgg 780

atgacagcaa acgcaaggcg aagtcttttg agggcaacaa caactatgat acacctgagc 840

tgcggacttt tccagctctc tccacgcgat tcatcaggat ctaccccgag agagccactc 900

atggcggact ggggctcaga atggagctgc tgggctgtct cgag 944。

3.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述载体为pET22b(+)。

4.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述宿主细菌为大肠杆菌BL21。

5.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述分离纯化采用镍柱纯化。

6.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述NRP1/b1b2蛋白的氨基酸序列为：

Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp

1 5 10 15

Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg

20 25 30

Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser

35 40 45

Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr

50 55 60

Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp

85 90 95

Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr

115 120 125

Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met

130 135 140

Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly

145 150 155 160

Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser

165 170 175

Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val

180 185 190

Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile

195 200 205

Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly

210 215 220

Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg

225 230 235 240

Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile

245 250 255

Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn

260 265 270

Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe

275 280 285

Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg

290 295 300

Met Glu Leu Leu Gly Cys

305 310。

7.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述免疫BALB/c小鼠的具体方法为：将NRP1/b1b2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，再将油包水抗原乳剂注射到雌性BALB/c小鼠腹腔进行免疫，14天后再用油包水抗原乳剂腹腔注射，共加强免疫3次。