CN109880820A

CN109880820A - 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

Info

Publication number: CN109880820A
Application number: CN201910059243.5A
Authority: CN
Inventors: 刘志杰; 殷宏; 赵亚茹; 杨吉飞; 牛庆丽; 刘光远; 罗建勋; 关贵全
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途，文库的构建方法包括以下步骤：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞；提取淋巴细胞总mRNA；以总mRNA为模板，合成全基因cDNA；以全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用连接酶连接后，转化至感受态细胞，加入培养基培养至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。本发明构建的cDNA文库特异性好，可用于筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH，为研究非洲猪瘟病毒的感染机理提供实验依据。

Description

抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)属于双链DNA病毒目中的非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，也是该属的唯一成员。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，长度约170～190k，末端碱基交互连接，形成发夹环，ASFV粒子为呈20面体对称的DNA囊膜病毒，粒子直径为175～215nm，分子量约108Da。ASFV整个基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，能够编码大约200种蛋白质，ASFV分离株中均包含一段位于基因组中心位置的中央保守区(C区)基因，长度约为125kb，该段序列很少有大的基因插入和缺失，其中的一些基因(如P72基因)常常作为ASFV基因的分型依据。在中央保守区还含有一个4kb左右的中央可变区(CVR)，不同基因型或者同一基因型的不同毒株之间的这一区域具有很大的差别。而在基因组两头，大约在右边13-16kb和左边38～47kb的区域内，含有5个多基因家族(MGF)，每个多基因家族都可发生缺失、增加、分化等变异，这种变异在不同毒株间差异很大，主要与病毒抗原变异、免疫逃避等机制有关。非洲猪瘟病毒P30蛋白是其重要的结构蛋白之一，也是在病毒感染早期表达最多的蛋白，研究表明，P30蛋白有很强的免疫原性，是一种重要的非洲猪瘟病毒诊断抗原。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。自2018年8月，非洲猪瘟蔓延至我国各省市，但目前又缺少商品化的非洲猪瘟疫苗，针对该疫情只能选择清群扑杀和封锁，一时间对我国养猪业造成严重的经济损失。

1993年Hamers等报道，骆驼血液中有50％缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体，由于缺失轻链，将这种特殊抗体称之为单链抗体，克隆这种抗体重链的可变区，得到仅有一个结构域的片段，该片段是抗原结合的最小单元，即单域抗体(variable domain of heavychain of heavy 2chain antibody，VHH)，后来又被命名为“纳米抗体”(nanobody)。纳米抗体的大小约15KD，仅为常规的1/10。纳米抗体在极端温度和pH环境中具有良好的稳定性，其水溶性和构象稳定性是常规抗体无法比拟的，且这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。纳米抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易于表达及免疫原性低等特点，其具有广阔的应用前景，尤其在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值。

噬菌体展示技术是将外源的多肽或者蛋白质的编码序列整合到噬菌体基因组中以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的一种技术。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体将得到高度富集。

综上所述，通过建立抗体库筛选具有生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是纳米抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的非洲猪瘟的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途，为筛选抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH提供了平台。

本发明采用的技术方案是：

一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)分离淋巴细胞：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；

(2)提取淋巴细胞总mRNA：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；

(3)合成全基因cDNA：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；

(4)第一轮PCR扩增：以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

CALL001 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTAVAAGG-3’

CALL002 5’GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

扩增的产物大小为600bp，保存备用；

(5)第二轮PCR扩增：以步骤(4)的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

H1 5’-GATGTGCAGGCGCGCGAGTCTGGAGGAGG-3’

H2 5’-CTAGTGATAGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’

扩增的产物大小为400bp，保存备用；

(6)构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用T4DNA连接酶连接后，电击转化至TG1感受态细胞，迅速加入2YT培养基，直接将菌液吸出加入2YT复苏培养基中进行复苏，然后于37℃倒置过夜培养直至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

优选地，所述步骤(3)中，合成全基因cDNA的扩增管由以下反应液组成：

优选地，所述步骤(4)中，第一轮PCR扩增管由以下反应液组成：

优选地，所述步骤(5)中，第二轮PCR扩增管由以下反应液组成：

本发明进一步提供了一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

优选地，所述文库的库容为2.2×10⁸cfu/ml，滴度为7.6×10¹³cfu/ml，文库的阳性插入率为91.2％，经测序比对发现该文库特异性好。

本发明进一步还提供了一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用。

优选地，筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链纯化后的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明成功的构建了抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库，其库容为2.2×10⁸cfu/ml，滴度为7.6×10¹³cfu/ml，文库的阳性插入率为91.2％，经测序比对发现该文库特异性好，可用于筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH，为建立敏感的非洲猪瘟的临床诊断方法及研究病毒的感染机理提供实验依据。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼外周血淋巴细胞总RNA电泳图，图中，M：DL2000相对分子质量标准；1：骆驼外周血淋巴细胞总RNA；

图2是本发明实施例1提供的淋巴细胞ds cDNA第一轮PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，图中，M：DL2000相对分子质量标准；1：第一轮PCR扩增DNA；

图3是本发明实施例1提供的淋巴细胞ds cDNA第二轮PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，图中，M：DL2000相对分子质量标准；1：第二轮PCR扩增DNA；

图4是本发明实施例1提供的淋巴细胞噬菌体展示cDNA文库单克隆PCR扩增结果图，图中，M：DL2000相对分子质量标准；1-60：单克隆菌落的PCR结果；

图5是本发明实施例2提供的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH基因的PCR扩增结果图，图中，M：DL2000DNA分子质量标准；1：P30-30VHH PCR扩增产物；2：P30-33VHH PCR扩增产物；

图6是本发明实施例2提供的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH基因的表达纯化结果图，图中，M：蛋白质分子质量标准；1：P30-30VHH结合后菌液；2-3：P30-30VHH纯化；4：P30-33VHH结合后菌液P30-30VHH纯化。

图7是本发明实施例2提供的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH基因的westernblotting检测结果，图中，M 1：蛋白质分子质量标准；1：P30-30；2：P30-33。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

构建抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物、抗原、佐剂

1峰健康双峰驼(购自甘肃金昌)；非洲猪瘟病毒P30蛋白，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。

1.1.2菌株和试剂

限制性内切酶购自Takara，T4DNA连接酶购自NEB、骆驼外周血淋巴细胞的分离试剂盒(产品编号：LTS1076)购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司、镍亲和层析树脂购自金斯瑞生物科技有限公司、DNA片段回收试剂盒为Axygen产品、质粒提取试剂盒为OMEGA产品以及PCR相关试剂购自宝生物公司、分子生物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体效价的测定

在双峰驼的颈部皮下、背部皮下和后腿皮下进行分点接种非洲猪瘟病毒P30蛋白，首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，间接ELISA检测血清抗体效价，抗体效价达预期免疫效果后采集静脉抗凝血。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表1：

表1双峰驼免疫程序和抗原剂量

1.2.2淋巴细胞分离

测定抗体效价达到要求后，颈静脉采集骆驼抗凝血100ml。淋巴细胞分离按照天津灏洋TBD骆驼外周血淋巴细胞分离试剂盒操作说明进行，具体为：取一支15ml的离心管，先加入5ml的分离液。将等量的血液样本小心加于分离液液面上，水平离心机1800g离心25min；按照非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的抗凝血与淋巴细胞分离液等体积的量，中加入等体积量的样本稀释液，混匀，得到抗凝血的稀释液；离心后，此时离心管中由上至下分为四层，用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，往所得离心管中加入10ml清洗液混匀细胞；水平离心机250g离心10min。用清洗液洗涤3次，沉淀用5ml无RNA酶水重悬，随即加入45ml DMEM培养液混匀，1000rpm，18-22℃离心10min，沉淀即为淋巴细胞，并将其重悬于1ml Trizol裂解液中。

1.2.3淋巴细胞总mRNA的提取

吸取上述分离的淋巴细胞混合液后混匀，4℃静置5min；加入200μl三氯甲烷，颠倒混匀，室温静置3min，12000r/min，4℃离心15min；吸取750μl上清，加等量异丙醇，室温静置10min，10000r/min，4℃离心10min；轻弃上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；20μl无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA。

1.2.4cDNA合成双链及纯化

1.2.4.1全基因cDNA合成

以提取的淋巴细胞的总mRNA为模板合成全基因cDNA，在0.5ml的PCR扩增管中依次加入下列组分的反应液：

将0.5ml的RNase-free PCR扩增管置于冰上，小心点到混匀。混合物表面覆盖一层矿物油(Sigma)，67℃金属浴孵育5min。然后将扩增管置于42℃加入2uL RNAsin(Promega)和2.5uL Super RT(HT Biotechnology Ltd,Cambridge,UK)。42℃反应1h后100℃加热3minutes。得到的产物为全基因组cDNA，置-20℃保存备用。

1.2.4.2第一轮PCR扩增

以合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

CALL001 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTAVAAGG-3’

CALL002 5’GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分的反应液：

扩增程序：94℃4min；94℃30s，53℃30s，22个循环；72℃10min，将扩增产物1.5％电泳。采用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集600bp产物，-20℃保存备用。

1.2.5.3第二轮PCR扩增

以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

H1 5’-GATGTGCAGGCGCGCGAGTCTGGAGGAGG-3’

H2 5’-CTAGTGATAGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’

在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分的反应液：

扩增程序：4℃4min；94℃30s，55℃30s，14个循环；72℃10min；扩增产物2％电泳，采用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集400bp产物，置-20℃保存备用。

1.2.6文库的构建和收获

将第二轮PCR扩增的胶回收产物用乙醇沉淀法脱盐，将脱盐产物和TG1感受态细胞按照1:30的比例混匀，冰浴15min；将混合物加入冰冷的电击杯中点击，电击结束后取出电击杯，迅速加入900uL 2YT培养基，直接将菌液吸出加入2YT复苏培养基中，37℃，90rpm，复苏1h。

1.2.7文库的质量评价

复苏1h后测定文库的库容，用一次性滴管从瓶中取200-500ul菌液，加入到1.5mLEP管中，取200uL直接涂布氨苄/葡萄糖平板，命名为200uL平板；再取出100uL加入到900uL 2YT培养基中，轻弹混匀后，取200uL涂布，命名为20uL平板；从此管中取出100uL稀释菌加入到900uL 2YT培养基中，轻弹混匀后，取100uL涂布，命名为2uL平板；将涂布板放入37℃培养箱中，第二天根据每板的克隆数计算库容；

测滴度：接种单克隆于2YT无抗培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0；取10uL库噬菌体加入到990uL 2YT培养基中，轻弹混匀，此管标记为10^-2，再从此管吸出10uL加入到990uL 2YT培养基中，轻弹混匀，此管标记为10^-4，依次类推，稀释到10^-10管，从10^-10管取出100uL，加入到200uL培养好的TG1中，37℃培养箱静置30min，300uL全部涂布至氨苄抗性平板上，37℃过夜培养。

2.结果

2.1骆驼外周血淋巴细胞总RNA的提取及mRNA的分离纯化

提取的骆驼外周血淋巴细胞总RNA经紫外分光光度计测定，浓度为5077ng/μl，OD260/OD280为1.98。骆驼外周血淋巴细胞总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，图中可见28S、18S、5S 3条清晰带，28S:18S约为2:1，说明RNA和mRNA纯度较高，满足文库构建的需要。

2.2双链cDNA文库的琼脂糖凝胶电泳

对第一轮PCR扩增的ds cDNA产物和第二轮PCR扩增的ds cDNA产物分别进行电泳，电泳结果如图2和图3所示，分别收集600bp条带和400bp条带。

2.3文库容量及多态性鉴定

对涂布不同稀释度文库的平板进行单菌落计数，根据公式计算文库的库容为2.2×10⁸cfu/ml，文库滴度为7.6×10¹³pfu/mL。文库滴度＝10^-10板上的克隆数*10¹⁰，单位：pfu/mL，经计算文库库容为滴度约为5.5×10⁶cfμ/ml；从平板上随机挑取60个克隆进行菌落PCR，如图4所示，电泳结果显示文库阳性插入片段为55个，阳性插入率为91.2％。经测序比对发现CDR3区多样性好，说明所构建的文库的多样性好。由菌落PCR结果可以得知文库的重组率为91.2％。

实施例2

抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用

1.实验材料及方法

1.1抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH基因的筛选

将抗原加到酶标板上，加入本发明的噬菌体展示cDNA文库进行筛选，通过减少抗原包被浓度和增加Tween20的浓度筛选目的基因，洗脱程序如下：

第一轮筛选用PH9.6NaHCO₃包被10ug/ml P30，然后使用0.1％PBS-Tween20洗脱9times，然后用胰蛋白酶消化。

第二轮筛选选用PH9.6NaHCO₃包被5ug/ml P30，然后使用0.2％PBS-Tween20洗脱9times，然后用胰蛋白酶消化。

第三轮筛选选用PH9.6NaHCO₃包被2ug/ml P30，然后使用0.3％PBS-Tween20洗脱9times，然后用胰蛋白酶消化。

通过ELISA筛选与抗原结合能力强的噬菌粒，然后测序。

1.2抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH基因的扩增纯化

针对VHH测序情况设计扩增引物，并在上下游引物的5′端分别引入EcoRI和XholI酶切位点。

上游引物VF:5’-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGTGGAG、-3’

下游引物VR:5’-CGCTCGAGTTGA GGA GAC GGT GAC CTG-3’

扩增体系为50μl：10×PCR Bμffer 5μl，dNTP 4μl，引物2μl，Ex taq酶0.5μl，ddH₂O 32.5μl，模板2μl进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，回收大小正确的目的片段，按Axgen凝胶片段回收试剂盒操作进行。

1.3pET-30a-VHH的构建与鉴定

使用EcoRI和XholI双酶切PCR回收产物和表达载体pET-30a，回收纯化后使用T4DNA连接酶4℃过夜连接回收产物。连接产物转化至Rossata感受态细胞中，涂布于卡纳抗性的LB固体平板上培养直到有菌落出现，在挑单菌落接到卡那抗性的LB液体培养基中，摇床上37℃过夜培养，提质粒做菌夜PCR鉴定并将阳性质粒送去测序验证。

1.4重组目的蛋白的纯化

将阳性菌液按1:100的比例加入到10mL含Kana的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌，测OD₆₀₀值到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导6h，5 000r/min离心10min收集菌体沉淀。加入10mLPBS重悬沉淀，-80℃反复冻融3次，超声破碎后收集上清和沉淀，使用金斯瑞蛋白纯化镍柱纯化VHH蛋白。

1.5Western Blot验证VHH

使用1:4000稀释的兔抗6×His标签的一抗和1:8000稀释的AP标记的山羊抗兔的二抗验证纯化的VHH。

1.6VHH反应活性检测

采用免疫用的重组抗原作为抗原检测单域抗体的活性，1ug/孔包被ELISA反应板，使用1:5000倍稀释的单域抗体作为一抗，1:4000稀释的小鼠抗6×His标签的抗体作为二抗，1:10000倍稀释的山羊抗鼠的二抗作为三抗检测VHH与抗原的活性。

2.结果

2.1抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH基因的PCR扩增

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测得到一条清晰特异性条带，大小约400bp，与预期片段大小一致(见图5)。说明非洲猪瘟病毒P30蛋白成功扩增到了VHH基因上。

2.2表达载体Pet 30a-VHH的构建

重组菌液做菌液PCR验证，条带大小正确，随机挑选3个大小正确的菌液送去测序。序列比对结果表明序列正确。

最终筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.3VHH基因的表达纯化

VHH基因的表达纯化结果如图6所示，由图可知，37℃诱导6h后出现1条大小为25kDa的特异蛋白条带，结果与预期相符，并随诱导时间的延长而变浓，诱导后12h表达量达高峰。筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链纯化后的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.4Western Blot验证

表达产物采用Western-blotting检测的结果如图7所示，图7表明纯化的VHH抗体条带单一，大小正确，其反应原性好。

2.5VHH反应活性检测

间接ELISA结果表明VHH与重组抗原反应很好，反应活性高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2400

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Tyr Ser Asn Ser

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ile Ile Leu Gly Ile Met Tyr

100 105 110

Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Val

115 120 125

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ala Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Ser Lys Met Val Lys Met

145 150 155 160

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Val Val

165 170 175

Val Tyr Thr Ser Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

195 200 205

Val Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Ala

210 215 220

Gly Ser Lys Phe Tyr Ser Ser His Trp Ser Glu Pro Ser Glu Tyr Asn

225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His Val Gln Leu

245 250 255

Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu

260 265 270

Ser Cys Val Ala Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Gly Ser Arg Asn Cys

275 280 285

Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu Ala

290 295 300

Gly Ile Trp Ile Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val Lys

305 310 315 320

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu

325 330 335

Gln Met Asn Ile Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

340 345 350

Ala Asp Arg Thr Ala Cys Phe Glu Asn Ser Trp Ser Tyr Asn Tyr Phe

355 360 365

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

385 390 395 400

Ala Ala Ser Gly Gly Val Tyr Asn Thr Tyr Cys Met Val Trp Phe Arg

405 410 415

Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Thr Gly

420 425 430

Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

435 440 445

Lys Asn Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

450 455 460

Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Val Cys Ala Ala Ser Pro Tyr Val Trp

465 470 475 480

Ala Asn Arg Phe Cys Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln

485 490 495

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

500 505 510

Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

515 520 525

Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Gly Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr

530 535 540

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Leu Ile Cys Ser Gly Gly Gly

545 550 555 560

Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

565 570 575

Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

580 585 590

Asp Asp Thr Ala Met Tyr Val Cys Ala Ala Arg Pro Asn Phe Val Ser

595 600 605

Gly Arg Trp Tyr Asp Pro Asp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

610 615 620

Gln Val Thr Val Ser Ser His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

625 630 635 640

Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly

645 650 655

Asp Ala Ala Ser Arg Tyr Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

660 665 670

Lys Glu Arg Glu Gly Val Gly Gly Ile Ser Pro Gly Gly Ile Thr Ser

675 680 685

Gly Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn

690 695 700

Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp

705 710 715 720

Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Gly Arg Leu Gly Trp Cys Gly

725 730 735

Leu Leu Thr Thr Asp Phe Tyr Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

740 745 750

Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

755 760 765

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Asp Thr

770 775 780

Thr Ser Gln Lys Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

785 790 795 800

Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Tyr Tyr

805 810 815

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Arg

820 825 830

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

835 840 845

Met Tyr Tyr Cys Ala Val Ala Leu Arg Phe Trp Val Gly Glu Pro Leu

850 855 860

Asn Thr Gly Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val

865 870 875 880

Ser Ser His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala

885 890 895

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Ser Thr Thr Ser

900 905 910

Gln Lys Arg Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

915 920 925

Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Tyr Tyr Ala Asp

930 935 940

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Arg Asn Thr

945 950 955 960

Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr

965 970 975

Tyr Cys Ala Val Ala Leu Arg Phe Trp Val Gly Ala Pro Leu Asn Thr

980 985 990

Ala Asp Tyr Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

995 1000 1005

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1010 1015 1020

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

1025 1030 1035 1040

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val

1045 1050 1055

Ala Arg Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1060 1065 1070

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

1075 1080 1085

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

1090 1095 1100

Ala Asp Arg Arg Arg Tyr Cys Arg Phe Gln Gly Pro Gly Asp Gly Met

1105 1110 1115 1120

Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Val Gln

1125 1130 1135

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1140 1145 1150

Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Gly Trp Phe Arg

1155 1160 1165

Gln Ala Pro Gly Gly Glu Arg Glu Gly Val Ala Leu Ile Tyr Ser Ser

1170 1175 1180

Asp Arg Gln Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

1185 1190 1195 1200

Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Ser Ser Leu

1205 1210 1215

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ala His Thr Thr

1220 1225 1230

Arg Thr Phe Arg Ile Ser Ala Met Gln Ala Arg Gly Val Phe Pro Pro

1235 1240 1245

Pro Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1250 1255 1260

Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly

1265 1270 1275 1280

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Phe Gly Pro

1285 1290 1295

Asn Cys Lys Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala

1300 1305 1310

Val Ala Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Asp Ser

1315 1320 1325

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

1330 1335 1340

Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

1345 1350 1355 1360

Cys Ala Ala Glu Thr Arg Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ser Gln Tyr Lys

1365 1370 1375

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu

1380 1385 1390

Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu

1395 1400 1405

Ser Cys Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Lys Arg Val Gly Trp

1410 1415 1420

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr

1425 1430 1435 1440

Thr Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

1445 1450 1455

Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser

1460 1465 1470

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Ala Leu

1475 1480 1485

Arg Phe Trp Val Gly Ala Pro Leu Asn Ala Gly Asp Tyr Asn Tyr Trp

1490 1495 1500

Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

1505 1510 1515 1520

Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

1525 1530 1535

Val Ala Ser Thr Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Cys Ile Thr Trp Phe Arg

1540 1545 1550

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Thr Tyr Thr Gly

1555 1560 1565

Gly Glu Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

1570 1575 1580

Ser Gln Asp Asn Ala Gln Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

1585 1590 1595 1600

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Leu Leu Trp

1605 1610 1615

Arg Trp Gly Asn Arg Pro Pro Arg Leu Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly

1620 1625 1630

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

1635 1640 1645

Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

1650 1655 1660

Ala Ser Gly Gly Val Tyr Asn Thr Tyr Cys Met Val Trp Phe Arg Gln

1665 1670 1675 1680

Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Thr Gly Gly

1685 1690 1695

Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys

1700 1705 1710

Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

1715 1720 1725

Glu Asp Ser Ala Met Tyr Val Cys Ala Ala Ser Pro Tyr Val Trp Ala

1730 1735 1740

Asn Arg Phe Cys Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly

1745 1750 1755 1760

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

1765 1770 1775

Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

1780 1785 1790

Ala Tyr Ala Asn Ser Met Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

1795 1800 1805

Arg Glu Gly Val Ala Ile Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr

1810 1815 1820

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

1825 1830 1835 1840

Asn Thr Ile Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

1845 1850 1855

Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Arg Pro Tyr Gln Arg Thr Trp Phe Glu

1860 1865 1870

Ala Leu Asp Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

1875 1880 1885

Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly

1890 1895 1900

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly His Thr Ser Ser Thr

1905 1910 1915 1920

Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Arg

1925 1930 1935

Val Ala Ala Phe Asp Thr Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1940 1945 1950

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Glu Asn Thr Val

1955 1960 1965

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

1970 1975 1980

Cys Ala Ala Ala Trp Val Gly Gly Gly Val Cys Pro Pro Ser Trp Arg

1985 1990 1995 2000

Met Glu Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His Val

2005 2010 2015

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

2020 2025 2030

Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Ala Cys Met

2035 2040 2045

Gly Trp Phe Arg Arg Ala Val Gly Ala Glu Arg Glu Gly Val Val Thr

2050 2055 2060

Ile Asp Ala Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly

2065 2070 2075 2080

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ala Asn Lys Val Tyr Leu Gln

2085 2090 2095

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly

2100 2105 2110

Leu Pro Gln Gly Thr Gly Val Asn Cys Asn Tyr Phe Leu Ser Arg Pro

2115 2120 2125

Arg Leu Ala Glu Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

2130 2135 2140

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

2145 2150 2155 2160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asp Asp Ala Ser Arg Tyr

2165 2170 2175

Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

2180 2185 2190

Ala Gly Ile Ser Pro Gly Gly Ile Thr Ser Gly Tyr Ala Asp Ala Val

2195 2200 2205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Asn Asn Thr Leu Tyr

2210 2215 2220

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Lys Tyr Tyr Cys

2225 2230 2235 2240

Ala Ala Ala Gly Arg Leu Gly Trp Cys Gly Leu Leu Thr Ala Asp Phe

2245 2250 2255

Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His Val

2260 2265 2270

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

2275 2280 2285

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ser Ser Lys Cys Met

2290 2295 2300

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Thr

2305 2310 2315 2320

Phe Tyr Thr Gly Ser Gly Met Thr Phe Tyr Asp Arg Ser Val Lys Gly

2325 2330 2335

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

2340 2345 2350

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

2355 2360 2365

Asp Arg Pro Gly Gly Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Cys Ala Leu Val Ala

2370 2375 2380

Ser Asp Asp Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser Ser

2385 2390 2395 2400

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ala Tyr Ala Asn Ser Met Gly

20 25 30

Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ile Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Phe Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser

85 90 95

Arg Pro Tyr Gln Arg Thr Trp Phe Glu Ala Leu Asp Arg Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ser Ser Gly His Thr Ser Ser Thr Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Arg Val Ala Ala Phe Asp Thr Asp

165 170 175

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser His Asp Arg Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Trp Val Gly

210 215 220

Gly Gly Val Cys Pro Pro Ser Trp Arg Met Glu Tyr Trp Gly Lys Gly

225 230 235 240

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245

Claims

1.一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

CALL001 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTAVAAGG-3’

CALL002 5’GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

扩增的产物大小为600bp，保存备用；

H1 5’-GATGTGCAGGCGCGCGAGTCTGGAGGAGG-3’

H2 5’-CTAGTGATAGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’

扩增的产物大小为400bp，保存备用；

(6)构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用T4 DNA连接酶连接后，电击转化至TG1感受态细胞，迅速加入2YT培养基，直接将菌液吸出加入2YT复苏培养基中进行复苏，然后于37℃倒置过夜培养直至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

2.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，合成全基因cDNA的扩增管反应液的组成如下：

3.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，第一轮PCR扩增管反应液的组成如下：

4.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中，第二轮PCR扩增管反应液的组成如下：

5.一种如权利要求1～4任一项所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

6.如权利要求5所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库，其特征在于，所述文库的库容为2.2×10⁸cfu/ml，滴度为7.6×10¹³cfu/ml，文库的阳性插入率为91.2％。

7.一种如权利要求5所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用。

8.如权利要求7所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用，其特征在于，筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

9.如权利要求8所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用，其特征在于，所述筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链纯化后的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。