CN106946989A

CN106946989A - 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体

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Publication number: CN106946989A
Application number: CN201710120052.6A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 于建立; 刘原源; 李飞; 王欢; 黄琪; 古; 古一; 周宇航; 李婧婵
Original assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2037-03-02
Also published as: CN106946989B

Abstract

本发明公开了一种抗CEA抗原的VHH结构域及单域抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别CEA抗原的不同表位。所述VHH结构域、单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

Description

抗CEA抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学技术领域。

背景技术

癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。

更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法：一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与例如药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。

目前已经针对CEA生成多种单克隆抗体。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691)，随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一种天然缺失轻链的抗体，即，仅有重链的抗体(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，由于该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，因此该类抗体又称为单域抗体。该类抗体不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。VHH结构域的晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体或者单域抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。因此，纳米抗体或单域抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。但是，基于单表位识别抗体存在的结构性缺陷也同时制约着该类抗体的进一步应用。这是因为传统的天然抗体虽然是双价抗体，但是两组相同的重链和轻链组合，只能识别和结合相同的抗原表位，这种单价的线性结合不仅会使识别和结合的能力低下，还会因为结合表位的缺失和变异而难以完成识别和结合的目的。

双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对同一抗原不同表位的双价抗体。

抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研究发现，不同的抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相互契合，可以识别不同的抗原分子或者识别同一抗原的不同表位，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。

基于现有技术中传统抗体在识别和结合CEA抗原中存在的技术问题，本发明的目的就是提供一种能够特异性识别CEA抗原的VHH结构域，即纳米抗体，含有该结构域的单域抗体，以及能够同时针对CEA抗原不同表位的双特异性纳米抗体。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种抗CEA抗原的VHH结构域，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO：1的第21-30、45-61、94-99位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO：3的第21-30、45-61、95-110位氨基酸序列所示。

在一个优选的技术方案中，所述VHH结构域的序列如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列所示；在本发明中纳米抗体11C12即具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH结构域，纳米抗体2C2即具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的VHH结构域。

其次，本发明还提供了一种含有上述VHH结构域的单域抗体，所述抗体的恒定区序列如SEQ ID NO：5所示；所述单域抗体即带有缺失CH1的恒定区序列的VHH结构域序列。

第三，本发明提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列串联而成。

优选地，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列位于所述串联的氨基端。

优选地，所述串联的两条序列不同的重链可变区之间设有连接肽，所述连接肽为(G₄S)n，其中，n为1-6之间的整数。

更为优选地，所述n＝3。

再为优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

尤为优选地，在所述串联的两条序列的羧基端还带有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列恒定区，。

第四，本发明还提供了一种编码上述抗体序列的核苷酸序列，所述编码序列由SEQID NO：7所示。

第五，本发明提供了一种含有上述的核苷酸编码序列的表达载体。

优选地，所述载体为pMES4。

第六，本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。

优选地，所述细胞为大肠杆菌BL₂₁(DE₃)。

最后，本发明提供了前述的任一抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明提供的VHH结构域、单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.pMES4表达载体结构示意图；

图2.提取的总RNA电泳鉴定图；

图3.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图4.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；

图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；

图7.纳米抗体SDS-PAGE鉴定图；

图8.纳米抗体纯化SDS-PAGE鉴定图；

图9.融合表达载体pCDNA3.1(+)-11C12-2C2构建示意图；

图10.双特异性纳米抗体纯化SDS-PAGE图；

图11.融合表达载体pFUSE-hIgG1-Fc-11C12-2C2构建示意图；

图12.具有恒定区的双特异性单域抗体纯化SDS-PAGE图；

图13.单域抗体ADCC效应曲线；

图14.双特异性抗体与纳米抗体在兔体内的代谢曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1抗CEA纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选

1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只，将重组蛋白CEA与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

1.2驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL(总RNA提取电泳鉴定结果见图2)。

1.4反转录合成cDNA：

根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min

使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(第一轮PCR产物鉴定见图3，其中，1：第一轮PCR产物；M：分子量标记)。

第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，15cycles；72℃7min

使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(第二轮PCR产物鉴定见图4，其中，1：第二轮PCR产物；M：分子量标记)。

1.6载体构建

将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图1)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。图5为pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图(1:pMES4载体双酶切产物；2：pMES4载体；M：分子量标记)。

1.7电转化及库容测定

取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(ECM630电转仪，美国BTX公司)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选24个克隆，进行菌落PCR鉴定(电泳鉴定见图6，其中，1-23：23个转化子；N：阴性对照；M：分子量标记)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×[阳性率]PCR鉴定×10)。

引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG

1.8噬菌体扩增

取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。取出10ml菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30min。4000rpm，常温离心10min，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。

噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.9纳米抗体筛选

通过ELISA方法以重组CEA抗原筛选阳性克隆。以重组CEA抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1h。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1h。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5min，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。

1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达

挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，将上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果参见图7(1：分子量标记；2：pMES4空载体对照；3-5：分别为11C12、15E7(该抗体序列公开于CN201611098964.X的抗体VHH-CEA 1，SEQ ID NO.4)、2C2诱导上清)。并将周质提取物使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。

通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，共筛选出2株抗CEA的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http:// www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementarity determining regions，CDR)。

纳米抗体11C12的重链核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，可变区氨基酸序列为SEQID NO.1所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-30位氨基酸序列为CDR1，第31-44位氨基酸序列为FR2，第45-61位氨基酸序列为CDR2，第62-93位氨基酸序列为FR3，第94-99位氨基酸序列为CDR3，第105-115位氨基酸序列为FR4。

纳米抗体2C2的重链核苷酸序列为SEQ ID NO.4，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.3，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-30位氨基酸序列为CDR1，第31-44位氨基酸序列为FR2，第45-61位氨基酸序列为CDR2，第62-94位氨基酸序列为FR3，第95-110位氨基酸序列为CDR3，第111-121位氨基酸序列为FR4。

实施例2.抗CEA纳米抗体的制备

2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1ul转化于100ul感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热击90s，冰浴冷却3min。向离心管加入600ul LB培养基，37℃振荡培养60min。取上清100ul，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。

2.2纳米抗体的诱导表达和提取

挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3h至菌液OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10min收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2min后，轻柔振荡30s，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30s后，冰浴静置2min，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10min，收集约4.5mL的上清(周质提取物)，将上清进行蛋白电泳分析。

2.3纳米抗体的纯化和鉴定

将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30min，使Sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8s/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤Sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6s/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤Sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6s/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤Sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇以保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(参见图8，1-3：分别为抗体11C12穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白；4：分子量标记；5-7：分别为抗体2C2穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白；8-10：分别为抗体15E7穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白)和Western blot检测。结果表明，本发明提供的纳米抗体对CEA抗原具有高度特异的结合活性，而与NCA抗原(非特异性交叉反应性蛋白)没有反应。

实施例3抗CEA纳米抗体与CEA抗原的亲和活性

3.1芯片抗原偶联

将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH4.0)配制成20ug/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60min。

3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化

采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30uL/min。进样条件均为120s，30uL/min。再生条件均为30s，30uL/min。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200ug/mL，150ug/mL，100ug/mL，50ug/mL，20ug/mL，10ug/mL，2ug/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200ug/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200ug/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200ug/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

3.3亲和力测试

按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30uL/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30uL/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200min。

3.4结果分析

选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。

表1：纳米抗体亲和力数据

样品	亲和力
		11C12	3.20E-09
15E7	2.40E-09
		2C2	1.10E-09

从表1可以看出，本发明获得的这三株抗CEA的纳米抗体与CEA抗原的亲和活性在3.20E-09和1.10E-09之间，具有极高的亲和力，完全可以在诊断试剂和药物制备中得到应用。

实施例4.三种不同纳米抗体与CEA抗原结合的重叠实验

4.1抗原饱和浓度的确定

以2ug/ml的浓度包被CEA抗原，100ul/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。

4.2位点叠加实验

先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％

A1—第一株抗体读数

A2—第二株抗体读数

A(1+2)--叠加2种抗体读数

表2：抗体抗原表位叠加实验

本实施例的实验结果表明，三株纳米抗体分别针对CEA抗原不同的抗原表位，这预示着在纳米抗体的诊断和治疗应用上，三株纳米抗体可以作为表位互补的组合物联合应用，从而可以增大诊断或治疗的效率。

实施例5.双特异性抗体制备

选取11C12和2C2进行蛋白融合表达，将两个抗体的可变区融合后送往金唯智公司进行基因合成。合成后的基因两端保留HindⅢ和EcoR Ⅰ两个酶切位点，且连接在pUC57载体上获得pUC57-11C12-2C2。合成的抗体核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

将融合抗体载体puc57-11C12-2C2与pCDNA3.1(+)同时利用HindⅢ和EcoR Ⅰ(NEB)进行双酶切，利用T4连接酶(NEB)将双酶切后的载体与双纳米抗体基因连接过夜，构建pCDNA3.1(+)-11C12-2C2(载体构建示意图参见图9)，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根公司)提取质粒。转染人293细胞，采用阴离子交换层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双纳米抗体，参见图10(1：纯化后pCDNA3.1(+)-11C12-2C2；2：分子量标记)。

实施例6.双特异性抗体与11C12或2C2单株抗体的亲和力比较

6.1亲和力测试

按照实施例3的方法优化双特异性抗体、11C12和2C2单株抗体的浓度梯度，按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30uL/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30uL/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200min。

6.2结果分析

表3：双特异性抗体与单株纳米抗体亲和力数据

样品编号	亲和力
		11C12	3.20E-09
2C2	1.99E-09
		11C12-2C2	2.12E-10

从表3可以看出，本发明获得的双特异性抗体与CEA抗原的亲和活性明显高于单株纳米抗体的亲和活性，具有极高的亲和力，完全可以在诊断试剂和药物制备中得到应用。

实施例7.带恒定区的抗CEA双特异性单域抗体的制备及其诱导的ADCC活性测定

利用引物，以pUC57-11C12-2C2为模板，PCR扩增双特异性抗体可变区基因。引物序列如下：

F:CCGAAATTCGAGTCTGGGGGAGG

R:GGAAGATCTCTGGGTCCCCTGGCCC

利用EcoR Ⅰ和Bgl II限制性内切酶(NEB)将PCR产物与融合表达载体pFUSE-hIgG1-Fc(恒定区序列如SEQ ID NO.5所示)分别进行双酶切。利用T4连接酶(NEB)将双酶切后的载体与纳米抗体基因连接过夜(参见图11)，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根公司)提取质粒。转染人293细胞，采用蛋白A亲和层析的方法从293细胞的培养上清中纯化带恒定区的抗CEA双特异性单域抗体，参见图12(1：纯化带恒定区的11C12-2C2；2：分子量标记)。

在96孔细胞微孔板内培养MKN-45和MKN-74细胞(3×10⁴/孔)48小时，然后根据特定比例加入LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killer cells)、带恒定区的抗CEA双特异性单域抗体、11C12、2C2或者IgG抗体对照，LAK细胞与靶细胞的比例为1、5、10、15、20:1，抗体浓度均为2μg/ml。在5％CO2环境下37℃孵育6小时，吸去LAK细胞和死亡的肿瘤细胞，使用MTS方法进行细胞活力测定。

细胞毒性(％)＝[实验靶细胞的OD₄₉₀/对照靶细胞的OD₄₉₀]×100

结果显示，带恒定区的抗CEA双特异性单域抗体、11C12、2C2均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，肿瘤细胞裂解率在45-78％之间，在不表达CEA的MKN-74细胞中未观察到这种裂解现象(参见图13)。

实施例8.双特异性纳米抗体在家兔血浆中的代谢

本实施例以新西兰兔为对象，进行药物代谢动力学的初步研究，每6只新西兰兔为一组，采取背部皮下给药，双特异性纳米抗体和11C12、2C2、的给药剂量均为1nmol/kg。即双特异性抗体为30μg/kg，11C12与2C2为15μg/kg。给药后不同时间点0.5h,1h，2h，4h，8h，12h，18h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，120h，144h进行耳缘静脉取血，分离血清进行抗体滴度的测定(测定使用自制的ELISA试剂盒)，绘制药物滴度时间曲线，见图14。

结果显示纳米抗体在72h后已经基本代谢完毕，纳米抗体处于较低水平。而双特异性抗体在72h后仍然具有很高的浓度，具有治疗效果。GraphPad Prism软件分析药物代谢动力学参数，结果见下表。

表4.纳米抗体和双特异性抗体的家兔体内药物代谢动力学参数

表4中，t_max是指抗体滴度达到最大时的时间；t_1/2是指抗体达到最大浓度后代谢掉一半时的时间。从表中可以看到，双特异性抗体在新西兰兔体内的半衰期长达48小时，明显长于纳米抗体的24小时。

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 抗CEA抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Trp Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Lys

65 70 75 80

Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala His Asn Gly

85 90 95

Arg Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His

100 105 110

His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro

115 120 125

<210> 2

<211> 1023

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 2

gagtctggag gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

ggattcacct tcagtagcta taccgggagg tgggaccgct tggctccagg gaaggagcgc 120

gagttggtcg caactattac tagtactggt ggtagtacaa attatgcaga ctccgtgaag 180

ggccgattca ccatctccag agacaatgcc aagaacacga tatatctgca aatgacgaaa 240

ctgaaacctg acgacacggc cgtgtattac tgtgtcgccc ataatggtag gggctacttc 300

ggccagggga cccaggtcac cgtctcctcg gcgcaccaca gcgaagaccc cagctccaag 360

tgtcccaaat gcccaggccc tgagctcctt ggagggccca cggtcttcat cttccccccg 420

aaacccaagg acgtcctctc catcacccga aaacctgagg tcacgtgcgt tgtggtggac 480

gtgggtaagg aagaccctga gatcgagttc agctggtccg tggatgacac agaggtacac 540

acggctgaga caaagccaaa ggaggaacag ttcaacagca cgtaccgcgt ggtcagcgtc 600

ctgcccatcc agcaccagga ctggctgacg gggaaggaat tcaagtgcaa ggtcaacaac 660

aaagctctcc cagcccccat cgagaggacc atctccaagg ccaaagggca gacccgggag 720

ccgcaggtgt acgccctggc cccacaccgg gaagagctgg ccaaggacac cgtgagcgta 780

acctgcctgg tcaaaggctt cttcccagct gacatcaacg ttgagtggca gaggaacggg 840

cagccggagt cagagggcac ctacgccacc acgctgcccc agctggacaa cgacgggacc 900

tacttcctct acagcaaact ctccgtggga aagaacacgt ggcagcaggg agaagtcttc 960

acctgtgtgg tgatgcacga ggctctacac aatcactcca cccagaaatc catctcccag 1020

tct 1023

<210> 3

<211> 136

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser His Pro Met Gly Trp Phe

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser Trp

35 40 45

Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser

65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Ala Leu Ser

85 90 95

Glu Arg Thr Pro Ile Ala Thr Met Pro Ser Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro

130 135

<210> 4

<211> 1056

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 4

gagtctgggg gagggttggt gcaggctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

ggacgcacct tcagtagtca tcccatgggg tggttccgcc aggctcccgg gaaggagcgt 120

gaatttgtcg caggtattag ctggagcggt ggtagcacac attatgcaga ctccgtgaag 180

ggccgattca ccatctccag agacaccgcc aagaacacgg tgtatctgca aatgaacagt 240

ctgaaacctg aggacacggc cgtctattac tgtaatgcag ctttgtctga aagaactccg 300

atagcgacta tgccatcaca gtatgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tcggcgcacc acagcgaaga ccccagctcc aagtgtccca aatgcccagg ccctgagctc 420

cttggagggc ccacggtctt catcttcccc ccgaaaccca aggacgtcct ctccatcacc 480

cgaaaacctg aggtcacgtg cgttgtggtg gacgtgggta aggaagaccc tgagatcgag 540

ttcagctggt ccgtggatga cacagaggta cacacggctg agacaaagcc aaaggaggaa 600

cagttcaaca gcacgtaccg cgtggtcagc gtcctgccca tccagcacca ggactggctg 660

acggggaagg aattcaagtg caaggtcaac aacaaagctc tcccagcccc catcgagagg 720

accatctcca aggccaaagg gcagacccgg gagccgcagg tgtacgccct ggccccacac 780

cgggaagagc tggccaagga caccgtgagc gtaacctgcc tggtcaaagg cttcttccca 840

gctgacatca acgttgagtg gcagaggaac gggcagccgg agtcagaggg cacctacgcc 900

accacgctgc cccagctgga caacgacggg acctacttcc tctacagcaa actctccgtg 960

ggaaagaaca cgtggcagca gggagaagtc ttcacctgtg tggtgatgca cgaggctcta 1020

cacaatcact ccacccagaa atccatctcc cagtct 1056

<210> 5

<211> 216

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 5

Gly Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser

35 40 45

Val Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu

115 120 125

Ala Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro

130 135 140

Ala Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu

145 150 155 160

Gly Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr

165 170 175

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly

180 185 190

Glu Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser

195 200 205

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Gln Ser

210 215

<210> 6

<211> 247

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 6

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Trp Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Lys

65 70 75 80

Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala His Asn Gly

85 90 95

Arg Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val

115 120 125

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser His Pro Met

145 150 155 160

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly

165 170 175

Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

210 215 220

Ala Leu Ser Glu Arg Thr Pro Ile Ala Thr Met Pro Ser Gln Tyr Asp

225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

245

<210> 7

<211> 741

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 7

gagtctggag gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

ggattcacct tcagtagcta taccgggagg tgggaccgct tggctccagg gaaggagcgc 120

gagttggtcg caactattac tagtactggt ggtagtacaa attatgcaga ctccgtgaag 180

ggccgattca ccatctccag agacaatgcc aagaacacga tatatctgca aatgacgaaa 240

ctgaaacctg acgacacggc cgtgtattac tgtgtcgccc ataatggtag gggctacttc 300

ggccagggga cccaggtgac cgtgtcctcc tcaggtggtg gcggttcagg cggaggtggc 360

tctggcggtg gcggatcgga cgtgcagctg caggagtctg ggggagggtt ggtgcaggct 420

ggggggtctc tgagactctc ctgtgcagcc tctggacgca ccttcagtag tcatcccatg 480

gggtggttcc gccaggctcc cgggaaggag cgtgaatttg tcgcaggtat tagctggagc 540

ggtggtagca cacattatgc agactccgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacacc 600

gccaagaaca cggtgtatct gcaaatgaac agtctgaaac ctgaggacac ggccgtctat 660

tactgtaatg cagctttgtc tgaaagaact ccgatagcga ctatgccatc acagtatgac 720

tactggggcc aggggaccca g 741

Claims

1.一种抗CEA抗原的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO：1的第21-30、45-61、94-99位氨基酸序列所示，或者如SEQ IDNO：3的第21-30、45-61、95-110位氨基酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的序列如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列所示。

3.一种含有权利要求1或2所述VHH结构域的单域抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区序列如SEQ ID NO：5所示。

4.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列串联而成。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列位于所述串联的氨基端。

6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述串联的两条序列不同的重链可变区之间设有连接肽，所述连接肽为(G₄S)n，其中，n为1-6之间的整数。

7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述n＝3。

8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，在所述串联的两条序列的羧基端还带有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列恒定区。

10.一种编码权利要求8所述抗体序列的核苷酸序列，所述序列由SEQ ID NO：7所示。

11.一种含有权利要求10所述的核苷酸编码序列的表达载体。

12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于，所述载体为pMES4。

13.一种含有权利要求12所述表达载体的宿主细胞。

14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL₂₁(DE₃)。

15.权利要求1-9任一所述抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。